一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒的制作方法
一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检测领域，具体涉及一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒是全球婴幼儿严重腹泻病最常见的病原体之一，其主要感染小肠上皮细 胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪一口途径， 临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2~3天， 腹泻5天，严重出现脱水症状。
[0003] 轮状病毒总共有七种，分别以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G等。人类主要是 受到轮状病毒A种、B种与C种的感染，而其中最常见的是轮状病毒A种的感染。而这七种 轮状病毒都会在其他动物身上造成疾病。
[0004] 在轮状病毒A种之中有不同的病毒株，称之为血清变异株（serovar)。与流行性 感冒病毒类似，轮状病毒使用了双重的分类系统，依据病毒体表面的两个结构性蛋白质来 作分类的。糖蛋白VP7定义了 G型。而对于蛋白酶敏感的蛋白质VP4则定义了 P型。P型 会以一个数字来标示出P血清型，并用方括弧内部的一个数字来标示所对应的P基因型。G 血清型的表示方法也很类似，但是G基因型的数字会与G血清型的数字相同。举个例来说， "轮状病毒Wa病毒株"（rotavirus strain Wa)就会被标示成"P1A[8]G1"。因为这两个决 定G型跟P型的基因可以被分开传送而产生后代，所以两基因不同的组合就会产生各种不 同的病毒株。
[0005] 轮状病毒在世界各地均有分布，A、B、C组轮状病毒能引起人类和动物腹泻，D-G组 只引起动物腹泻。A组主要流行的血清型为G1P8、G2P4、G3P8和G4P8,在所有就诊病例中占 到80%以上。年长儿童和成人常呈无症状感染，通常称病毒携带者。无论在发达或发展中 国家，A组RV引起的腹泻都有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的重要病因。在发展中国 家，为婴幼儿致死的仅次于呼吸道感染的第二位病因。粪-口是RV传播的主要途径，此外 水源污染，呼吸道空气传播，院内和幼托所及家庭成员中的密切接触均可造成流行，还有人 推测，动物可能是作为人感染RV的重要传染源。病毒侵入人体后在小肠粘膜绒毛细胞内增 殖，病毒外壳蛋白VP4为主要致病因子，它造成细胞溶解死亡，微绒毛萎缩、变短、脱落；腺 窝细胞增生、分泌增多，导致严重腹泻，水和电解质的丧失。病毒的潜伏期只有一到两天，然 后突然发烧、水样腹泻、呕吐脱水，凭自身免疫可完全恢复。但当婴儿营养不良或已有脱水， 若不及时治疗，就会导致婴儿死亡。由于病毒本身变异较大，针对性疫苗难以实现产业化， 世界卫生组织（WHO)推荐以预防为主，注意婴幼儿营养和卫生状况来达到降低病毒的感染 率。
[0006] 传统检测RV感染的方法主要依赖于电镜（EM)或免疫学测定，如酶联免疫吸附 (ELlSA)等等。近年随着分子遗传学等的发展，建立了更为特异和敏感的检测方法，如RNA 核酸杂交，RT-PCR等用于检测核酸的方法。
[0007] 核酸适体（Aptamer，又称适配体，适配子）是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适 体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别 功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多 优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿 透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生 物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒。
[0009] 本发明提供的核酸适体，是如下（a)或（b):
[0010] (a)序列表的序列1所示的单链DNA ;
[0011] (b)序列表的序列2所示的单链DNA。
[0012] 所述核酸适体与轮状病毒VP4蛋白具有较好的亲和能力。
[0013] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0014] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
[0015] a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物；
[0016] b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物；
[0017] c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物；
[0018] d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物；
[0019] e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0020] 固定有所述核酸适体的酶标板（如96孔板）也属于本发明的保护范围。可采用 酶联放大法检测待测样本中的轮状病毒VP4蛋白，从而实现临床中轮状病毒的检测。
[0021] 所述核酸适体可用于制备检测轮状病毒的试剂盒。
[0022] 本发明还保护一种辅助检测轮状病毒患者的试剂盒，包括所述核酸适体。所述试 剂盒还可包括包被有轮状病毒VP4蛋白单克隆抗体的酶标板（如96孔板）。所述包被有轮 状病毒VP4蛋白单克隆抗体的酶标板具体可为具有肝炎病毒VP4蛋白单克隆抗体的96孔 板。利用本发明的核酸适体，可以在轮状病毒感染初期，通过检测轮状病毒VP4抗原而不是 抗体实现对轮状病毒的检测。本发明的核酸适体将有利发展轮状病毒检测的新方法。
[0023] 本发明还保护固定有所述核酸适体的酶标板在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒 可以辅助检测轮状病毒VP4蛋白和/或辅助检测轮状病毒患者。
[0024] 利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的轮状病毒VP4蛋白，也可以检测溶液 中的轮状病毒，将有利于轮状病毒血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适体，部分代 替单克隆抗体捕获VP4蛋白进行轮状病毒检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优 点。本发明具有很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] Nl-NTA琼脂糖微珠购自Qlagen公司。链霉亲和素修饰的96孔板（购于pierce 公司）。辣根过氧化物酶（HRP)标记的链霉亲和素购自pierce公司。大肠杆菌（E. coll) DH5a菌株购自北京鼎国公司。大肠杆菌（E.coll)BL21(DE3)菌株购自Invltrogen公 司。原核表达载体PLMl ;公众可以从中国科学院化学研宄所获得；参考文献：SodeokaM， Larson C，Chen L, et al. A multifunctional plasmid for protelnexpresslonby ECPCR ! overproduction of the p50subunlt of NF-k B. B loorg Med ChemLett. 1993， 3 ：1089_1094〇
[0027] 实施例1、相关蛋白和相关溶液的制备
[0028] -、带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白（靶标蛋白）的制备
[0029] I、VP4蛋白的编码基因的扩增
[0030] VP4蛋白的序列是本领域已经公知的。如：Genbank :SEG_DQ005115S。
[0031] 以轮状病毒，特别是A病毒为模板，作为PCR扩增的模板，用引物1和引物2组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0032] 引物 1 (上游引物）：5' -atggc ttcgctcatt tataga-3' ；
[0033] 引物 2 (下游引物）：5,-tcacagtttacactgcagtat-3' ；
[0034] 上、下游引物的5'端分别引入EcoRl酶切位点和BamHl酶切位点。
[0035] PCR 扩增条件：95°C 2mln ;95°C 30s，66°C 30s，72°C lmln，35 个循环；72°C 7mln。
[0036] 2、原核表达载体的构建
[0037] ①用限制性酶EcoRl和BamHl双酶切步骤I的PCR扩增产物，得到酶切产物。
[0038] ②用限制性酶EcoRl和BamHl双酶切原核表达载体pLMl，回收载体骨架。
[0039] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。
[0040] ④将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含氨苄青霉素（Amp)的LB平板 筛选阳性克隆，提取质粒依次进行酶切鉴定和测序鉴定。
[0041] 测序结果表明，得到了重组质粒pLMl-VP4 (骨架质粒为原核表达载体pLMl，在 EcoRl和BamHl酶切识别位点之间插入了轮状病毒VP4蛋白的编码基因与载体上的组氨酸 标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白）。
[0042] 3、带组氣酸标签的轮状病毒VP4蛋白的原核表达鉴定
[0043] ①将重组质粒PLM1-VP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的 LB平板筛选阳性克隆。
[0044] ②挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入1PTG(终浓度lmmol/L)继 续培养诱导IOh。
[0045] ③ 13000rpm 离心 lmln，收集菌体进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot。 Westernblot的一抗为antl-hls (购自Slgma公司）。Western blot的结果表明，菌体中含 有带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白。
[0046] 4、带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白的大量表达、纯化及检测
[0047] ①将重组质粒pLMl-VP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，得到重组菌。
[0048] ②将步骤①得到的重组菌接种LB培养基，37°C振荡培养过夜，按1 : 50的体积比 转接到含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振摇培养约2h (使0D600为0. 6-0. 8)， 加入1PTG(终浓度lmmol/L)继续培养诱导12h。
[0049] ③3500rpm离心收集菌体，在含100ug/ml溶菌酶的start buffer (0· 02M磷酸钠， 0. 5M NaCl，pH7. 4)中超声破碎（频率120w，每个循环内超声3s停3s，400个循环，在冰浴 上进行），4°C、1000 Orpm离心lOmln，收集裂解上清。
[0050] ④将裂解上清上样于Nl-NTA偶联的琼脂糖黏附柱（购自GE公司），用 washlngbuffer (0. 02M 磷酸钠，0. 5M NaCl，0. 05M 咪唑，P H7 · 4)洗涤去除杂蛋白，用 elutlonbuffer(0· 02M磷酸钠，0· 5M NaCl，0. 5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脱目的蛋白，得到带组氨酸 标签的轮状病毒VP4蛋白（用轮状病毒VP4抗原检测试剂盒检测为阳性）。
[0051] 实施例2、核酸适体的筛选和制备
[0052] -、蛋白的固定
[0053] 1、取Nl-NTA琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液洗涤三次；
[0054] 2、将步骤1的微珠分散于靶标蛋白（或对照蛋白为大肠杆菌空载体蛋白）中，室 温孵育Ih，PBS缓冲液离心洗涤三次；
[0055] 3、将步骤2的微珠重新分散于Iml PBS缓冲液中，置于4°C备用。
[0056] 二、随机核酸文库的设计
[0057] 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下：
[0058] 5 ' -ATGCTCGGATCGCACTAAAGG (MO) ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3 ' ；N40 代表 40 个随机 核苷酸。
[0059] 三、核酸适体的筛选
[0060] UDNA文库预处理
[0061] 将随机核酸文库溶于结合缓冲液中。
[0062] 2、反筛
[0063] 将随机核酸文库与固定有对照蛋白的微珠混合，37°C孵育1-2小时；经结合缓冲 液洗涤后，将微珠通过超滤离心。
[0064] 3、正筛
[0065] 将反筛过程中超滤离心的溶液加入固定有靶标蛋白的微珠中，37°C孵育1-2小 时。将微珠通过超滤离心洗涤后，用灭菌水将微珠转移到离心管中。将微珠经95°C加热 10mln、冰上冷却10mln、高速离心后，收集上清液并以其中的DNA为模板，利用引物（F1TC- 扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR产物，然后利用0. 2M的氢氧化钠 使双链DNA变性解链，收集FlTC标记的DNA单链，这些DNA单链脱盐后用于下一轮筛选。
[0066] 为了获得高亲和性和特异性结合靶标蛋白的核酸适体，在筛选的过程中逐步改变 反筛和正筛的蛋白量、筛选时间、含量以及正筛洗涤次数，以增加筛选压力。
[0067] 10轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物（5' -ATGCTCGGATCGCACTAAAGG-3'和 5' -CGCATGAAAACGTCCAGCAT-3,）进行 PCR 扩增，将 PCR 产物进行测序。
[0068] 最终选择的核酸适体序列如下（见序列表的序列1和2):
[0069] 序列 I (LZBD-I) :ATGCTCGGATCGCACTAAAGGATACGCTCCAATTACCAGCTTACCACCTACGAC AGATCTC ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3,；
[0070] 序列 2 (LZBD-2) :ATGCTCGGATCGCACTAAAGGAGATCTTACATTCAATCGCCTATACATACTATC CGCTATG ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3' ；
[0071] 实施例3、核酸适体的特异性（通过荧光素检测）
[0072] -、核酸适体的FlTC标记
[0073] 用异硫氰酸荧光素（FlTC)标记实施例2制备的核酸适体LZBD-I和LZBD-2。
[0074] 二、核酸适体的特异性
[0075] 1、蛋白的固定
[0076] (1)靶标蛋白的固定
[0077] ①取200ul Nl-NTA琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液洗涤三 次；
[0078] ②将步骤①的微珠分散于ImL靶标蛋白中，室温孵育lh，PBS缓冲液离心洗涤三 次；
[0079] ③将步骤①的微珠重新分散于Iml PBS缓冲液中，置于4°C备用。
[0080] ⑵对照蛋白的固定
[0081] 用对照蛋白代替靶标蛋白，其它同步骤（1)。其中所述对照蛋白分别为轮状病毒 VP6蛋白、VP2蛋白、BSA、人血红蛋白、流感HA蛋白，gpl20蛋白。
[0082] 2、核酸适体与靶标蛋白结合的特异性
[0083] 设置以下3组处理：
[0084] 第1组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-I用结合缓冲液溶解，与50ul固 定有靶标蛋白的微珠孵育Ih ;
[0085] 第2组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-2用结合缓冲液溶解，与50ul固 定有靶标蛋白的微珠孵育Ih ;
[0086] 第3组：将Iul IOuM FITC标记的随机文库用结合缓冲液溶解，与50ul固定有靶 标蛋白的微珠孵育Ih ;
[0087] 第4-9组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-I用结合缓冲液溶解，与50ul 分别固定有6种对照蛋白的微珠孵育Ih ;
[0088] 第10-15组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-2用结合缓冲液溶解，与 50ul分别固定有6种对照蛋白的微珠孵育Ih ;
[0089] 各组均在刚刚加入微珠的时刻（结合前）和孵育1小时的时刻（结合后）取上清 液，测量荧光强度。
[0090] 结合率=(结合前荧光强度-结合后清液荧光强度）/结合前荧光强度X 100%。
[0091]
[0092] 结果表明：核酸适体LZBD-I和LZBD-2对靶标蚩白具有很好的特异性。核酸适体 LZBD-I和LZBD-2与对照蛋白均不能结合，表现出较好的特异性。随机文库的适体也不能与 靶标蛋白结合。
[0093] 另外通过常规的结合性试验，得出其解离常数Kd分别为LZBD-I为15nM，LZBD-2 为 12nM。
[0094] 实施例4、采用核酸适体板检测血清中的轮状病毒
[0095] 取SOul含有轮状病毒的血清；与结合缓冲液等体积混合，加入到核酸适体板， 200ul每孔，37°C孵育1小时（1-2小时均可）；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的轮状病毒 VP4蛋白单克隆抗体，37°C孵育0. 5小时（0. 5-1小时均可）；经洗涤液洗涤后，加入显色液 A+B，显色10分钟；设置对照。
[0096] 显色后检测450nm下的光吸收值。计算核酸适体板的相对吸光强度。结果表明，核 酸适体LZBD-I和核酸适体LZBD-I可以检测血清中的靶标病毒。通过PCR检验病毒滴度， 发现采用适体检测的效果反而强于PCR检测的方法。
[0097] 实施例5稳定性试验
[0098] 将核酸适体LZBD-I和核酸适体LZBD-2分别置于常温的血清中，3周后，通过PCR 检测其残留量，发现仍然有90%保持活性。活性检测发现，其活性基本没有变化。说明，该 适体具有较好的稳定性。
【主权项】
1. 核酸适体，其特征在于：能与病毒特异性结合。2. 如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于：能与轮状病毒特异性结合。3. 如权利要求2所述的核酸适体，其特征在于：其序列为序列表的序列1所示的单链 DNA;或序列表的序列2所示的单链DNA。4. 一种轮状病毒特异性检测试剂盒，其含有权利要求1-3所述的核酸适体。5. 权利要求1-3所述核酸适体在制备用于检测轮状病毒的试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒。本发明提供的核酸适体SEQ ID No.1-2，与轮状病毒VP4蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的轮状病毒，也可以检测溶液中轮状病毒的VP4蛋白，将其制备成为相应的试剂盒，将有利于轮状病毒血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适体进行轮状病毒检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。
【IPC分类】C12R1/93, C12N15/115, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN104894136
【申请号】CN201510284321
【发明人】刘慧 , 蒋玉红, 张璐
【申请人】刘慧
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月23日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检测领域，具体涉及一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒是全球婴幼儿严重腹泻病最常见的病原体之一，其主要感染小肠上皮细 胞，从而造成细胞损伤，引起腹泻。轮状病毒每年在夏秋冬季流行，感染途径为粪一口途径， 临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2~3天， 腹泻5天，严重出现脱水症状。
[0003] 轮状病毒总共有七种，分别以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G等。人类主要是 受到轮状病毒A种、B种与C种的感染，而其中最常见的是轮状病毒A种的感染。而这七种 轮状病毒都会在其他动物身上造成疾病。
[0004] 在轮状病毒A种之中有不同的病毒株，称之为血清变异株（serovar)。与流行性 感冒病毒类似，轮状病毒使用了双重的分类系统，依据病毒体表面的两个结构性蛋白质来 作分类的。糖蛋白VP7定义了 G型。而对于蛋白酶敏感的蛋白质VP4则定义了 P型。P型 会以一个数字来标示出P血清型，并用方括弧内部的一个数字来标示所对应的P基因型。G 血清型的表示方法也很类似，但是G基因型的数字会与G血清型的数字相同。举个例来说， "轮状病毒Wa病毒株"（rotavirus strain Wa)就会被标示成"P1A[8]G1"。因为这两个决 定G型跟P型的基因可以被分开传送而产生后代，所以两基因不同的组合就会产生各种不 同的病毒株。
[0005] 轮状病毒在世界各地均有分布，A、B、C组轮状病毒能引起人类和动物腹泻，D-G组 只引起动物腹泻。A组主要流行的血清型为G1P8、G2P4、G3P8和G4P8,在所有就诊病例中占 到80%以上。年长儿童和成人常呈无症状感染，通常称病毒携带者。无论在发达或发展中 国家，A组RV引起的腹泻都有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的重要病因。在发展中国 家，为婴幼儿致死的仅次于呼吸道感染的第二位病因。粪-口是RV传播的主要途径，此外 水源污染，呼吸道空气传播，院内和幼托所及家庭成员中的密切接触均可造成流行，还有人 推测，动物可能是作为人感染RV的重要传染源。病毒侵入人体后在小肠粘膜绒毛细胞内增 殖，病毒外壳蛋白VP4为主要致病因子，它造成细胞溶解死亡，微绒毛萎缩、变短、脱落；腺 窝细胞增生、分泌增多，导致严重腹泻，水和电解质的丧失。病毒的潜伏期只有一到两天，然 后突然发烧、水样腹泻、呕吐脱水，凭自身免疫可完全恢复。但当婴儿营养不良或已有脱水， 若不及时治疗，就会导致婴儿死亡。由于病毒本身变异较大，针对性疫苗难以实现产业化， 世界卫生组织（WHO)推荐以预防为主，注意婴幼儿营养和卫生状况来达到降低病毒的感染 率。
[0006] 传统检测RV感染的方法主要依赖于电镜（EM)或免疫学测定，如酶联免疫吸附 (ELlSA)等等。近年随着分子遗传学等的发展，建立了更为特异和敏感的检测方法，如RNA 核酸杂交，RT-PCR等用于检测核酸的方法。
[0007] 核酸适体（Aptamer，又称适配体，适配子）是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适 体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别 功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多 优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿 透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生 物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒。
[0009] 本发明提供的核酸适体，是如下（a)或（b):
[0010] (a)序列表的序列1所示的单链DNA ;
[0011] (b)序列表的序列2所示的单链DNA。
[0012] 所述核酸适体与轮状病毒VP4蛋白具有较好的亲和能力。
[0013] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0014] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
[0015] a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物；
[0016] b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物；
[0017] c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物；
[0018] d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物；
[0019] e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0020] 固定有所述核酸适体的酶标板（如96孔板）也属于本发明的保护范围。可采用 酶联放大法检测待测样本中的轮状病毒VP4蛋白，从而实现临床中轮状病毒的检测。
[0021] 所述核酸适体可用于制备检测轮状病毒的试剂盒。
[0022] 本发明还保护一种辅助检测轮状病毒患者的试剂盒，包括所述核酸适体。所述试 剂盒还可包括包被有轮状病毒VP4蛋白单克隆抗体的酶标板（如96孔板）。所述包被有轮 状病毒VP4蛋白单克隆抗体的酶标板具体可为具有肝炎病毒VP4蛋白单克隆抗体的96孔 板。利用本发明的核酸适体，可以在轮状病毒感染初期，通过检测轮状病毒VP4抗原而不是 抗体实现对轮状病毒的检测。本发明的核酸适体将有利发展轮状病毒检测的新方法。
[0023] 本发明还保护固定有所述核酸适体的酶标板在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒 可以辅助检测轮状病毒VP4蛋白和/或辅助检测轮状病毒患者。
[0024] 利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的轮状病毒VP4蛋白，也可以检测溶液 中的轮状病毒，将有利于轮状病毒血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适体，部分代 替单克隆抗体捕获VP4蛋白进行轮状病毒检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优 点。本发明具有很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] Nl-NTA琼脂糖微珠购自Qlagen公司。链霉亲和素修饰的96孔板（购于pierce 公司）。辣根过氧化物酶（HRP)标记的链霉亲和素购自pierce公司。大肠杆菌（E. coll) DH5a菌株购自北京鼎国公司。大肠杆菌（E.coll)BL21(DE3)菌株购自Invltrogen公 司。原核表达载体PLMl ;公众可以从中国科学院化学研宄所获得；参考文献：SodeokaM， Larson C，Chen L, et al. A multifunctional plasmid for protelnexpresslonby ECPCR ! overproduction of the p50subunlt of NF-k B. B loorg Med ChemLett. 1993， 3 ：1089_1094〇
[0027] 实施例1、相关蛋白和相关溶液的制备
[0028] -、带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白（靶标蛋白）的制备
[0029] I、VP4蛋白的编码基因的扩增
[0030] VP4蛋白的序列是本领域已经公知的。如：Genbank :SEG_DQ005115S。
[0031] 以轮状病毒，特别是A病毒为模板，作为PCR扩增的模板，用引物1和引物2组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0032] 引物 1 (上游引物）：5' -atggc ttcgctcatt tataga-3' ；
[0033] 引物 2 (下游引物）：5,-tcacagtttacactgcagtat-3' ；
[0034] 上、下游引物的5'端分别引入EcoRl酶切位点和BamHl酶切位点。
[0035] PCR 扩增条件：95°C 2mln ;95°C 30s，66°C 30s，72°C lmln，35 个循环；72°C 7mln。
[0036] 2、原核表达载体的构建
[0037] ①用限制性酶EcoRl和BamHl双酶切步骤I的PCR扩增产物，得到酶切产物。
[0038] ②用限制性酶EcoRl和BamHl双酶切原核表达载体pLMl，回收载体骨架。
[0039] ③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。
[0040] ④将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含氨苄青霉素（Amp)的LB平板 筛选阳性克隆，提取质粒依次进行酶切鉴定和测序鉴定。
[0041] 测序结果表明，得到了重组质粒pLMl-VP4 (骨架质粒为原核表达载体pLMl，在 EcoRl和BamHl酶切识别位点之间插入了轮状病毒VP4蛋白的编码基因与载体上的组氨酸 标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白）。
[0042] 3、带组氣酸标签的轮状病毒VP4蛋白的原核表达鉴定
[0043] ①将重组质粒PLM1-VP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的 LB平板筛选阳性克隆。
[0044] ②挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入1PTG(终浓度lmmol/L)继 续培养诱导IOh。
[0045] ③ 13000rpm 离心 lmln，收集菌体进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot。 Westernblot的一抗为antl-hls (购自Slgma公司）。Western blot的结果表明，菌体中含 有带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白。
[0046] 4、带组氨酸标签的轮状病毒VP4蛋白的大量表达、纯化及检测
[0047] ①将重组质粒pLMl-VP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，得到重组菌。
[0048] ②将步骤①得到的重组菌接种LB培养基，37°C振荡培养过夜，按1 : 50的体积比 转接到含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振摇培养约2h (使0D600为0. 6-0. 8)， 加入1PTG(终浓度lmmol/L)继续培养诱导12h。
[0049] ③3500rpm离心收集菌体，在含100ug/ml溶菌酶的start buffer (0· 02M磷酸钠， 0. 5M NaCl，pH7. 4)中超声破碎（频率120w，每个循环内超声3s停3s，400个循环，在冰浴 上进行），4°C、1000 Orpm离心lOmln，收集裂解上清。
[0050] ④将裂解上清上样于Nl-NTA偶联的琼脂糖黏附柱（购自GE公司），用 washlngbuffer (0. 02M 磷酸钠，0. 5M NaCl，0. 05M 咪唑，P H7 · 4)洗涤去除杂蛋白，用 elutlonbuffer(0· 02M磷酸钠，0· 5M NaCl，0. 5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脱目的蛋白，得到带组氨酸 标签的轮状病毒VP4蛋白（用轮状病毒VP4抗原检测试剂盒检测为阳性）。
[0051] 实施例2、核酸适体的筛选和制备
[0052] -、蛋白的固定
[0053] 1、取Nl-NTA琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液洗涤三次；
[0054] 2、将步骤1的微珠分散于靶标蛋白（或对照蛋白为大肠杆菌空载体蛋白）中，室 温孵育Ih，PBS缓冲液离心洗涤三次；
[0055] 3、将步骤2的微珠重新分散于Iml PBS缓冲液中，置于4°C备用。
[0056] 二、随机核酸文库的设计
[0057] 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下：
[0058] 5 ' -ATGCTCGGATCGCACTAAAGG (MO) ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3 ' ；N40 代表 40 个随机 核苷酸。
[0059] 三、核酸适体的筛选
[0060] UDNA文库预处理
[0061] 将随机核酸文库溶于结合缓冲液中。
[0062] 2、反筛
[0063] 将随机核酸文库与固定有对照蛋白的微珠混合，37°C孵育1-2小时；经结合缓冲 液洗涤后，将微珠通过超滤离心。
[0064] 3、正筛
[0065] 将反筛过程中超滤离心的溶液加入固定有靶标蛋白的微珠中，37°C孵育1-2小 时。将微珠通过超滤离心洗涤后，用灭菌水将微珠转移到离心管中。将微珠经95°C加热 10mln、冰上冷却10mln、高速离心后，收集上清液并以其中的DNA为模板，利用引物（F1TC- 扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的PCR产物，然后利用0. 2M的氢氧化钠 使双链DNA变性解链，收集FlTC标记的DNA单链，这些DNA单链脱盐后用于下一轮筛选。
[0066] 为了获得高亲和性和特异性结合靶标蛋白的核酸适体，在筛选的过程中逐步改变 反筛和正筛的蛋白量、筛选时间、含量以及正筛洗涤次数，以增加筛选压力。
[0067] 10轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物（5' -ATGCTCGGATCGCACTAAAGG-3'和 5' -CGCATGAAAACGTCCAGCAT-3,）进行 PCR 扩增，将 PCR 产物进行测序。
[0068] 最终选择的核酸适体序列如下（见序列表的序列1和2):
[0069] 序列 I (LZBD-I) :ATGCTCGGATCGCACTAAAGGATACGCTCCAATTACCAGCTTACCACCTACGAC AGATCTC ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3,；
[0070] 序列 2 (LZBD-2) :ATGCTCGGATCGCACTAAAGGAGATCTTACATTCAATCGCCTATACATACTATC CGCTATG ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3' ；
[0071] 实施例3、核酸适体的特异性（通过荧光素检测）
[0072] -、核酸适体的FlTC标记
[0073] 用异硫氰酸荧光素（FlTC)标记实施例2制备的核酸适体LZBD-I和LZBD-2。
[0074] 二、核酸适体的特异性
[0075] 1、蛋白的固定
[0076] (1)靶标蛋白的固定
[0077] ①取200ul Nl-NTA琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，PBS缓冲液洗涤三 次；
[0078] ②将步骤①的微珠分散于ImL靶标蛋白中，室温孵育lh，PBS缓冲液离心洗涤三 次；
[0079] ③将步骤①的微珠重新分散于Iml PBS缓冲液中，置于4°C备用。
[0080] ⑵对照蛋白的固定
[0081] 用对照蛋白代替靶标蛋白，其它同步骤（1)。其中所述对照蛋白分别为轮状病毒 VP6蛋白、VP2蛋白、BSA、人血红蛋白、流感HA蛋白，gpl20蛋白。
[0082] 2、核酸适体与靶标蛋白结合的特异性
[0083] 设置以下3组处理：
[0084] 第1组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-I用结合缓冲液溶解，与50ul固 定有靶标蛋白的微珠孵育Ih ;
[0085] 第2组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-2用结合缓冲液溶解，与50ul固 定有靶标蛋白的微珠孵育Ih ;
[0086] 第3组：将Iul IOuM FITC标记的随机文库用结合缓冲液溶解，与50ul固定有靶 标蛋白的微珠孵育Ih ;
[0087] 第4-9组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-I用结合缓冲液溶解，与50ul 分别固定有6种对照蛋白的微珠孵育Ih ;
[0088] 第10-15组：将Iul IOuM FITC标记的核酸适体LZBD-2用结合缓冲液溶解，与 50ul分别固定有6种对照蛋白的微珠孵育Ih ;
[0089] 各组均在刚刚加入微珠的时刻（结合前）和孵育1小时的时刻（结合后）取上清 液，测量荧光强度。
[0090] 结合率=(结合前荧光强度-结合后清液荧光强度）/结合前荧光强度X 100%。
[0091]
[0092] 结果表明：核酸适体LZBD-I和LZBD-2对靶标蚩白具有很好的特异性。核酸适体 LZBD-I和LZBD-2与对照蛋白均不能结合，表现出较好的特异性。随机文库的适体也不能与 靶标蛋白结合。
[0093] 另外通过常规的结合性试验，得出其解离常数Kd分别为LZBD-I为15nM，LZBD-2 为 12nM。
[0094] 实施例4、采用核酸适体板检测血清中的轮状病毒
[0095] 取SOul含有轮状病毒的血清；与结合缓冲液等体积混合，加入到核酸适体板， 200ul每孔，37°C孵育1小时（1-2小时均可）；经洗涤液洗涤后，加入HRP修饰的轮状病毒 VP4蛋白单克隆抗体，37°C孵育0. 5小时（0. 5-1小时均可）；经洗涤液洗涤后，加入显色液 A+B，显色10分钟；设置对照。
[0096] 显色后检测450nm下的光吸收值。计算核酸适体板的相对吸光强度。结果表明，核 酸适体LZBD-I和核酸适体LZBD-I可以检测血清中的靶标病毒。通过PCR检验病毒滴度， 发现采用适体检测的效果反而强于PCR检测的方法。
[0097] 实施例5稳定性试验
[0098] 将核酸适体LZBD-I和核酸适体LZBD-2分别置于常温的血清中，3周后，通过PCR 检测其残留量，发现仍然有90%保持活性。活性检测发现，其活性基本没有变化。说明，该 适体具有较好的稳定性。
【主权项】
1. 核酸适体，其特征在于：能与病毒特异性结合。2. 如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于：能与轮状病毒特异性结合。3. 如权利要求2所述的核酸适体，其特征在于：其序列为序列表的序列1所示的单链 DNA;或序列表的序列2所示的单链DNA。4. 一种轮状病毒特异性检测试剂盒，其含有权利要求1-3所述的核酸适体。5. 权利要求1-3所述核酸适体在制备用于检测轮状病毒的试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种能特异性检测轮状病毒的核酸适体及试剂盒。本发明提供的核酸适体SEQ ID No.1-2，与轮状病毒VP4蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获溶液中的轮状病毒，也可以检测溶液中轮状病毒的VP4蛋白，将其制备成为相应的试剂盒，将有利于轮状病毒血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适体进行轮状病毒检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。
【IPC分类】C12R1/93, C12N15/115, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN104894136
【申请号】CN201510284321
【发明人】刘慧 , 蒋玉红, 张璐
【申请人】刘慧
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月23日
最新回复(0)