一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,编码蛋白及其应用
一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,编码蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,编码蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]根结线虫是一种重要的专性寄生植物线虫，同时也是危害最为严重的植物寄生线虫之一，在全球范围内能侵染不同科的超过3000种植物(Sasser, 1980)，并造成巨大的经济损失。其中爪哇根结线虫是世界上分布范围最广的根结线虫之一，在多个国家都是农业生产中重要的有害生物(Sasser, 1980)。因此对爪哇根结线虫的特性研宄，以及其与寄主相互作用的研宄是一个非常重要且亟待研宄的课题。
[0003]在对根结线虫寄生作用的研宄中，对其产生的效应蛋白的研宄是一项非常关键且具有重大意义的课题。TTL蛋白(Transthyretin-like Proteins)家族是一类只在线虫中存在的蛋白，该蛋白家族都含有一个保守的类甲状腺素运载蛋白结构域(Transthyretin-like domain,DUF290,McCarter et al., 2003)。自从第一个 TTL 蛋白从秀丽小杆线虫(C中分离(Sonnhammer et al., 1997)，目前已从南方根结线虫{M.1ncognita，Bellaf1re et al., 2008)、大豆抱囊线虫(/Z glycines, Gao et al.,2003 )、松材线虫(Bursaphelenchusxylophi Ius,王宝文，2011)、马来布鲁线虫(Brugiamalayi, Hewitson et al., 2008)、奥氏奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi, Saverwynset al., 2008)等多种线虫中发现了 TTL蛋白。
[0004]正如名称所不，TTL蛋白与 TTR (Transthyretin)和 TRP (Transthyretin-likeproteins)序列存在相似性(Saverwyns et al., 2008)。TTR是一类只在脊椎动物中发现的蛋白，该蛋白主要存在于血液和细胞外液中，负责运输甲状腺激素和维生素A (Hennebryet al., 2006) ;TRP广泛分布在不同生物中，如细菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物，参与调节各种生理代谢(Eneqvist et al., 2003; Lundberg et al., 2006; Sauer-Eriksson etal., 2009)，如在细菌和脊椎动物中TRP与嘌呤的代谢相关(Lee et al., 2006; Mat1lloet al., 2009)，但在植物中TRP与油菜素内酯的代谢相关(Nam et al., 2004; Li, 2005)；相反，只在线虫中发现的TTL蛋白确切的功能尚不清楚，但由于TTL与TTR和TRP存在相似性，所以推测TTL可能与激素转运和代谢(McElwee et al., 2004; Parkinson et al.,2004; Bellaf1re et al., 2008)、营养物质的消化和吸收(Furlanetto et al., 2005)或神经系统的功能(Jacob et al., 2007)有关。但是Saverwyns通过实验证实，奥氏奥斯特线虫的TTL蛋白不能实现TTR的功能(Saverwyns et al., 2008)，而且Sauer通过生物信息的方法预测，虽然TTL蛋白与TTR和TRP有同源性，但它们的功能似乎没有相似性(Sauer-Eriksson et al., 2009)。
[0005]因此，目前对于线虫TTL蛋白的认识几乎是一项空白。对于其是否能够作用于线虫寄生植物的过程、有什么作用以及作用过程和机制仍然不清楚(Bellaf1re，2008)。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有根结线虫防治技术不足以及根结线虫效应蛋白TTL的研宄不足，提供一种与爪哇根结线虫感病性相关的效应基因及其编码蛋白，为抗线虫品种植物的培育提供新靶标，对培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。
[0007]本发明的目的是提供一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl。
[0008]本发明另一目的是提供所述爪哇根结线虫效应基因的编码蛋白。
[0009]本发明再一目的是提供所述爪哇根结线虫效应基因及其编码蛋白的应用。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,其DNA全长核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]本发明还公开了一种上述效应基因编码的蛋白MJ-TTL，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
[0012]在严格条件下与基因杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子、与基因Mj-ttl^ 90%以上同源性且编码爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子均在本发明的保护范围之内。
[0013]一种重组载体，由基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]优选地，所述植物表达载体可以是一般表达载体或RNAi载体，可以根据需要进行选择。作为RNAi载体，优选为pTRV2载体；作为过表达载体，优选为pCambial300。
[0015]一种重组菌，包含上述重组载体。
[0016]对于含有上述爪哇根结线虫效应基因的重组基因表达盒、转基因细胞系等，也都应属于本发明的保护范围。
[0017]本发明还提供基因Mj-ttm蛋白MJ-TTL在提高植物抗根结线虫能力中的应用。包括基因在构建抗根结线虫植物中的应用。
[0018]所述构建抗根结线虫植物的具体步骤为:
51.重组表达载体pTRV2-ttl构建:
SI 1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫RNAJf RNA反转录为cDNA ；
512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，PCR扩增程序为95°C2min ；95°C 10s，60°C 15s，68°C lmin，30个循环；将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶feci和ZhI进行酶切，并纯化回收；
513.同时使用限制性内切酶feci和ZhI酶切载体pTRV2，并纯化回收；
514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体5^1和ZhI酶切位点之间插入了双链DNA片段，DNA片段的序列为基因的cDNA序列的79bp?428bp，如SEQ ID NO:4所示；
52.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照；
53.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物；
引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示；
引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O
[0019]本发明通过大量的研宄和探索，获得了一种爪哇根结线虫效应蛋白编码基因并明确了其功能和作用机制。该基因cDNA全长456bp，编码151个氨基酸残基的
MJ-TTL蛋白，该蛋白预测分子量为17.28KDa，等电点为5.04，含信号肽，含有一个保守的DUF290结构域；Southern杂交结果表明，在爪哇根结线虫基因组中以单拷贝形式存在。
[0020]MJ-TTL蛋白特异的在爪哇根结线虫亚腹食道腺中表达，并在寄生过程中被分泌到寄主组织中，定位在细胞质中。MJ-TTL效应蛋白的作用机理是:MJ-TTL被线虫分泌到植物中，然后与植物中的FTRc相互作用，加速植物细胞内H2O2的降解，抑制ROS的积累，从而抑制植物PTI反应的产生来促进根结线虫的侵染和寄生。因此，可以利用根结线虫基因或植物/irc基因为靶标，构建抗根结线虫转基因植物。
[0021]本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因编码蛋白及其应用。该效应基因的序列如SEQ ID NO:1?2所示，其编码蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO:
3所示。
[0022]本发明明确了基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，并被分泌到寄主组织中。同时确定了 MJ-TTL的作用机理，即该蛋白通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了 ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性。
[0023]本发明为抗线虫品种植物的培育提供了一个新的靶标一一基因，对实践中培育广谱抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。同时明确的MJ-TTL的作用机理均是线虫寄生研宄中的首次 发现，为根结线虫寄生机制的研宄提供了新的思路和研宄方向，具有显著的理论价值。
【附图说明】
[0024]图1为经过Ni2+-NTA凝胶纯化的重组MJ-TTL蛋白的SDS-PAGE结果。
[0025]图2为Western杂交检测MJ-TTL抗血清特异性；图中pre_J2和TOR分别表示从侵染前2龄幼虫和健康番茄根获得的总蛋白，M为蛋白标准分子量；每个泳道上样量为10 μ g总蛋白。
[0026]图3为MJ-TTL蛋白在爪哇根结线虫上的免疫定位结果；A、B分别为经抗MJ-TTL血清和未免疫的兔血清处理后的侵染前2龄幼虫，SvG表示亚腹食道腺，比例尺为10 μ m。
[0027]图4为基因在不同发育阶段相对表达水平的差异；图中y轴表示的是基因变化的倍数，通过使用2_ΛΛ %法并定义成熟雌虫的表达量为I的情况下计算获得。图中X轴表示的是线虫的不同发育阶段，dpi表示的是接种线虫后的天数，pre-J2表示的是侵染前2龄幼虫；y轴表示的是基因变化的倍数；每个样品的数值是3次重复中获得的结果的平均值，误差线是三次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0028]图5为i/? plan ta RNAi方法沉默Mj_t?7基因的沉默效果，相对表达量数值通过使用2_ΛΛσ法并定义CK处理的幼虫的相关基因表达量为I的情况下计算获得；每个样品的数值是3次重复中获得的结果的平均值，误差线是3次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0029]图6为i/? Planta RNAi方法沉默基因后根结线虫寄生能力的差异；图中CK表示没有农杆菌侵染的处理，TRV::CK为使用含有pTRV2空载体的农杆菌侵染的处理，TRV::ttl为使用含有pTRV2-ttl载体的农杆菌侵染的处理；星号表示该处理获得的数据经过student检验后差异显著(Ρ〈0.05)。
[0030]图7实时定量PCR检测过表达基因的拟南芥中基因的表达量?’每个样品的数值是3次重复中获得的结果的平均值，误差线是3次重复的标准误(standarddeviat1n)。
[0031]图8为过表达基因植株的株高与野生型之间的差异；每个样品的数值是10次重复中获得的结果的平均值，误差线是10次重复的SD，星号表示该组数值经过student~t test检验后与野生型(Col-O)植株的数值差异显著(P〈0.05)。
[0032]图9为过表达基因的拟南芥植株对爪哇根结线虫感病性的影响(感病性更高);每个样品的数值是10次重复中获得的结果的平均值，误差线是10次重复的SD，星号表示该组数值经过student-t test检验后与野生型(Col-O)植株的数值差异显著(P〈0.05)。
[0033]图10为MJ-TTL与FTRc相互作用；图A表示在含有和/irc载体的酵母菌AH109、以及含有SV40和p53 (阳性对照)载体的酵母菌AH109都能正常的在非筛选(左)和筛选培养基(右)中生长，而含有和SV40、SV40和LamC、FTRc和LamC的酵母菌只能在非筛选培养基中生长表示Χ-α -Gal酶活性测试，含有图中相应载体组合的酵母菌ΑΗ109在非筛选培养基中培养3d后，挑取5个菌落混合后测试Χ-α -Gal酶的活性，其中只有SV40+p53和TTL+FTRc的能检测到较高酶的活性，其他组别的活性都显著低于它们。图中数值为三次重复获得数据的平均值土SD，不同字母表示经DMRT检验后差异显著(p〈0.05)。
[0034]图11为免疫共沉淀验证MJ-TTL与FTRc的相互作用；图中TTL-HA、GFP-HA和FTRc-MYC分别表示表达相应蛋白，Input表示从烟草中提取的总蛋白，1.P表示的是免疫共沉淀后获得的蛋白，表示不含该种蛋白，“ + ”表示含有该种蛋白；Ant1-HA表示使用HRP标记的抗HA-tag的抗体进行检测，Ant1-myc表示使用抗MYC-tag抗体进行检测，比例尺为
50μ m0
[0035]图12为过表达基因的拟南芥植株抑制由FLG22介导的PTI反应；图A和B分别表示在转基因植株中PTI反应关键基因CYP81F2和FRKl在受到FLG22诱导后表达量与与野生型表达量变化的倍数，图中y轴表示的是基因变化的倍数，通过使用2_λλ CT法并定义野生型中没诱导的情况下表达量为I ;每个样品的数值是5次重复中获得的结果的平均值，误差线是5次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0036]图13为过表达基因的拟南芥植株抑制由FLG22介导的PTI反应；图C和D分别表示在转基因植株中PTI反应关键基因WRKY29和WRKY33在受到FLG22诱导后表达量与与野生型表达量变化的倍数，图中y轴表示的是基因变化的倍数，通过使用2_λλ 9去并定义野生型中没诱导的情况下表达量为I ;每个样品的数值是5次重复中获得的结果的平均值，误差线是5次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0037]图14为本生烟中过表达MJ-TTL可以抑制由FLG22诱导的ROS生成；含有Mj-Ul(TTL)或空载体(CK)的农杆菌菌株GV3101注射到苗龄为3周的烟草叶片中，48 h收集叶片进行ROS实验；纵坐标为每个叶盘的荧光值，即18-24个叶盘的相对荧光强度的平均值土标准误，实验重复两次并获得类似的结果。
[0038]图15为过表达的拟南芥与野生型拟南芥中H 202含量的差异。
[0039]图16为MJ-TTL对拟南芥中H2O2的影响；EX buffer表示只含提取拟南芥总蛋白的buffer ；EX buffer+TTL表示含有提取拟南芥总蛋白的buffer+纯化后的TTL蛋白；AT表示提取的拟南芥总蛋白；AT+PET28表示提取的拟南芥总蛋白+对照的蛋白；AT+TTL拟南芥总蛋白加入加入纯化的MJ-TTL蛋白；图中数值为8-10次重复获得的数据的平均值土SD。
【具体实施方式】
[0040]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0041]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。内切酶均购自NEB。
[0042]实施例1基因全长序列的获得、序列分析
1、基因中间片段的获得
根据NCBI基因库中同源基因，设计简并引物ttlestF (序列如SEQ ID NO:5所示)和ttlestR (序列如SEQ ID NO:6所示)，以爪哇根结线虫cDNA为模板进行PCR扩增。
[0043]PCR 反应体系为 25μ?:cDNA ?μ?, ddH20 17.875μ?, dNTP Mixture (2.5mmoL/Leach) 2.5M-L, 10XPCR Buffer 2.5M-L, ttlestF(ΙθΜ-moL/L) 0.5M-L, ttlestR(1MmoL/L)
0.5μ?, Ex Taq(5U/^L) 0.125μ?。
[0044]PCR 反应程序为:94°C lmin ；94°C 30s，60°C 50s，72°C lmin，30 个循环；72°ClOmin，4°C，00。
[0045]基因 3’ RACE 的扩增
(I)引物:根据已扩得的基因EST设计2条特异引物ttl3rl (序列如SEQ IDNO:7所示)和ttl3r2 (序列如SEQ ID NO:8所示)；反向引物分别为Clontech RACE试剂盒的锚定引物UPM和NUP。
[0046](2)第一轮PCR反应体系 50μ?:ddH20 32pL，dNTP Mixture (2.5mmoL/L each) 5μ?,10XK0D Buffer 5μ?, MgSO4 3PL，Kod plus Neo (5U/^L) lPL，ttl3rl Primer (10MmoL/L)和UPM Primer (lOMmoL/L)各 1.5M-L, 3? ready cDNA IKL0
[0047]PCR 反应程序:94 °C 3min ；94 °C 30s, 65 °C 30s, 72 °C 3min，30 个循环；72 °C1min ；4°C，00。
[0048](3)第二轮(nest) PCR反应以第一轮PCR产物为模板，引物NUP和ttl3r2，反应体系如第一轮PCR反应。
[0049]PCR反应程序如第一轮PCR反应。
[0050]3、Mj~t ?7基因5 ’端序列的获得 (I)引物:根据已扩得的基因中间片段序列设计2条特异引物ttl5rl (序列如SEQ ID NO:9所示)和ttl5r2 (序列如SEQ ID NO: 10所示)，反向引物分别为UPM和NUP(购自clontech公司)。
[0051](2)第一轮PCR反应以5’ ready cDNA为模板，引物Upm和ttl5rl，反应体系如3’ RACE的第一轮PCR反应。
[0052]PCR 反应程序:94°C 3min ；94°C 30s，65°C 30s, 72°C 3min，72°C 3min，30 个循环；4°C，°°o
[0053](3)第2轮PCR以第一轮PCR产物为模板，引物为ACl Primer (序列如文章Liuet al., 2007所示)和ttl5r2，反应体系如上。
[0054]PCR反应程序如第一轮PCR反应。
[ 0055]以上I?3中PCR反应结束后，均用1%琼脂糖进行电泳检测，_20°C保存。
[0056]4、基因全长序列的获得和序列分析
利用Seqman软件将已扩得的基因中间片段、5’和3’序列进行拼接，设计覆盖OFR 的引物 ttlcdsF (序列如 SEQ ID NO:11 所示)和 ttlcdsR (序列如 SEQ ID N0:12 所示)，分别以cDNA和DNA作为模板获得ii/-1基因全长序列。
[0057]结果显示，基因的DNA全长为1051bp (如SEQ ID NO:1所示)，cDNA全长456bp (如SEQ ID N0:2所示)。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，预测等电点(pi)为5.04，分子量为和17.28KDa。该蛋白有一个位于第35到第109个氨基酸之间的保守结构域DUF290。通过Signal IP 4.0预测MJ-TTL蛋白含有信号肽。
[0058]实施例2基因在线虫体内的免疫定位
本实施例免疫定位所用的一抗为使用pET28a进行原核表达纯化得到的MJ-TTL蛋白，免疫兔子得到的抗血清。二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(由北京博奥森生物技术有限公司提供)。
[0059]1、一抗的制备:
(I)载体构建:使用引物ttlFYEcorl (序列如SEQ ID NO: 13所示)和ttlRYHind (序列如SEQ ID NO:14所示)扩增片段，使用EcroR I Hind III进行酶切，连接到经相同酶酶切的pET28a载体中，测序验证正确后获得pET28-ttl载体，然后转化至大肠杆菌 BL21 (DE3)中。
[0060](2)蛋白纯化:使用Ni2+-NTA凝胶对获得的总蛋白进行纯化，具体方法参照Qiagen公司的蛋白纯化说明书(The QIAexpress1nist?)进行。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析。
[0061]结果如附图1所示，纯化的MJ-TTL蛋白在PAGE胶上只有一条清晰的主条带(ISKDa附近，与预测分子量接近)，没有非特异性条带，获得的蛋白纯度较高，满足下一步制作抗血清的纯度要求。
[0062](3)抗血清的制备:首次免疫使用0.5mL (2(^g)纯化的蛋白与0.5mL弗氏完全佐剂混合，在兔子皮下多点注射，每个注射点注射0.2mL混合液。1d后，进行第二次注射，使用0.5mL (1Pg)纯化的蛋白与0.5mL弗氏不完全佐剂混合，在兔子皮下多点注射，每个注射点注射0.2mL混合液。以后每隔7d?1d进行一次加强注射，一共注射4次。在最后一次注射抗原后7d，进行颈动脉取血。血液用三角瓶收集，倾斜置于37°C培养箱，待血清完全析出后，用灭菌的胶头滴管把血清小心的吸出。如血清与红血球分离不充分，则需把血清置于干净的离心管中3000rpm离心20min，然后分装，置于_70°C备用。
[0063](4)抗血清特异性检测:使用Western杂交实验验证所获得的抗MJ-TTL血清的特异性，具体步骤如下:
收集新鲜孵化的爪哇根结线虫2龄幼虫，置于干净的1.5mL离心管中；置于液氮中研磨均勾后，加入10PL Lys buffer ;置于振荡器上震荡lOmin，4°C 14000rpm离心lOmin，上清液为所需的蛋白。取约1Pg线虫总蛋白进行SDS-PAGE电泳，作为对照同时加入l(^g番茄根的总蛋白进行SDS-PAGE(15%)电泳，然后使用半干法把蛋白从PAGE凝胶中转移至硝化纤维素膜上(NitrocelluloseMembranes);用PBS溶液浸泡薄膜3次，每次Imin ;然后加入5%的BSA (PBS溶解)浸泡薄膜30?60min ;加入1:5000倍的抗血清，4°C孵育8h ；PBS清洗5次，每次5min ;加入1:10000倍的HRP标记的山羊抗兔抗体，室温孵育Ih ；PBS清洗5次，每次5min ;用清水冲洗薄膜后，加入2mL Pro-Light HRP化学发光检测试剂，室温孵育5min，然后于暗示中进行曝光。
[0064]结果显示，在加入抗MJ-TTL血清的薄膜、侵染前2龄幼虫的总蛋白的泳道中，在15KDa的位置有清晰的蛋白杂交条带，与预测分子量相同，其他位置没有杂交信号，在加入健康番茄根总蛋白以及未免疫的兔血清的薄膜的泳道中均没有杂交条带(如附图2所示)，这表明获得的抗血清特异性非常好。
[0065]2、免疫定位
(O以免疫前的兔血清为对照血清，使用抗MJ-TTL的血清对该蛋白在线虫的组织定位进行分析，具体实验步骤如下:
51.收集发育阶段的根结线虫，灭菌水清洗3次，BufferA清洗一次，5min ；
52.加入BufferA，25°C固定4?8h，然后4°C固定16?24h ；
53.用BufferC清洗3次后，加入Buffer B室温反应20?25min，再用Buffer C清洗3次后，把离心管置于液氮中，用手术刀切割虫体10次；
54.加入BufferA，4°C处理30min后，用Buffer C清洗I次，再加入Buffer D反应10 ?15min ；
55.加入浓度为10%没免疫的山羊血清，25°C反应Ih ；
56.加入5yL —抗，25°C反应24h后，用Buffer D清洗3次，每次10?15min ；
57.加入Iμ L 二抗，25°C反应4h后，用Buffer D清洗3次，每次10?15min，再用清水清洗两次；
58.显色:按照TIANGEN的增强型HRP-DAB底物显色试剂盒操作；
59.Buffer C清洗后，显微镜观察。
[0066]其中，相关溶液的配制方法为:
Buffer A:4% 甲酸，使用 Buffer C 配置；Buffer B:0.5mg/mL 蛋白酶 K，使用 Buffer C配置；Buffer C:0.0lM PBS, pH7.5灭菌后，加入终浓度为20%的DMSO ;如果虫体变形适当降低 DMSO 浓度或不加，另外所有 BufferWA0.1% 吐温-20 ；Buffer D:0.1% Triton 100，
0.1%BSA，用 Buffer C 配。
[0067](2)结果显示，在经过抗MJ-TTL血清处理的侵染前2龄幼虫(pre_J2)的亚腹食道腺中有明显的杂交信号(如附图3A所示)，而在使用对照血清处理的pre-J2中没有观察到杂交信号(如附图3B所示)，表明基因编码的MJ-TTL蛋白特异的在爪哇根结线虫的亚腹食道腺中表达，MJ-TTL蛋白属于效应蛋白，且在根结线虫侵染的早期发挥重要的作用。
[0068]实施例3基因在线虫体内发育表达分析
1、不同龄期爪哇根结线虫的收集
2龄幼虫:取新鲜根结，利用解剖镜挑取色泽淡黄、或黄色的单卵块，于28°C温箱中恒温培养7d,移至试管中离心收集线虫备用。
[0069]不同发育阶段根结线虫:把新鲜孵化的2龄幼虫接种至4周的番茄根上，24h后把番茄连根拔出，用清水洗净根部，把番茄苗重新栽种到新的灭菌土中，分别在不同时间段把番茄拔出，收集线虫于离心管中备用。
[0070]2、模板cDNA:参照TIANGEN的RNApr印Micro Kit试剂盒中的动物组织总RNA的提取方法，提取总 RNA。参照 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover Kit(T0Y0B0)的说明书进行操作，合成cDNA。
[0071]3、qRT_PCR:参照 TOYOBO 的 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 试剂盒，使用引物 qttlF(如 SEQ ID NO:15 所示)和 qttlR (如 SEQ ID NO:16 所示)扩增基因，qactinF (如SEQ ID NO:17 所示)和 qactinR (如 SEQ ID NO: 18 所示)扩增内参基因 #j.-卢-acii/?。
[0072]相对表达量计算参照Livak的方法(Livak et al., 2001)。
[0073]4、通过以上实时定量PCR (Real-time RT-PCR)对基因在不同发育阶段的表达变化的研宄，结果显示，该基因在侵染前的2龄幼虫和侵染的早期的线虫中表达量上升，在侵染2d后的2龄幼虫(par-J2)表达量最高，随着线虫的发育，表达量缓慢下降，表达最低点在成熟雌虫阶段，在该阶段? U的表达量仅为侵染2d后阶段表达量的八分之一(如附图4所示)。
[0074]这一结果也证实了基因及其编码的MJ-TTL蛋白在根结线虫侵染的早期发挥重要的作用。
[0075]实施例基因在根结线虫寄生中的作用 1、in plan ta RNAi 分析
为了确定基因在爪哇根结线虫寄生植物过程中的作用，用烟草花叶病毒(TRV)介导的Planta RNAi方法来沉默爪哇根结线虫的基因，构建了沉默#六《7基因转基因番茄，然后观察爪哇根结线虫在该基因沉默后寄生能力的变化。
[0076]( I)构建沉默基因的转基因番茄，步骤如下:
S1.重组表达载体pTRV2-ttl构建:
SI1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫!?應，将RNA反转录为cDNA ；
512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，PCR扩增程序为95°C2min ； 95°C 10s，60°C 15s，68°C lmin, 30个循环；将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶feci和ZhI进行酶切，并纯化回收；
513.同时使用限制性内切酶feci和ZhI酶切载体pTRV2，并纯化回收；
514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体5^1和ZhI酶切位点之间插入了双链DNA片段，DNA片段的序列为基因的cDNA序列的79bp?428bp，如SEQ ID NO:4所示。
[0077]S2.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A ;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照；
S3.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；参照Ryu (2004)的方法，将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物；引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示；
引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O
[0078](2)线虫接种:接种农杆菌21d后，接种新鲜孵化的爪哇根结线虫2龄幼虫，每株番茄接种200条。接种线虫后5d后，提取RNA，用引物qTTLF(序列如SEQ ID NO:23所示)和qTTLR (序列如SEQ ID NO:24所示)进行定量PCR，检测基因沉默效率。
[0079]接种后30d，取番茄根洗净后进行染色，参照冯志新(2000)介绍的次氯酸钠-酸性品红染色法，统计番茄根部线虫(包括各个龄期的线虫)的数量。检测沉默后爪哇根结线虫侵染能力的变化。
[0080](3)#六《7基因沉默效率如附图5所示，爪哇根结线虫的基因表达量明显下降。基因沉默后爪哇根结线虫的寄生能力检测结果如附图6所示，沉默后，爪哇根结线虫的寄生能力受到了明显的抑制，根结线虫数量比对照的下降了 45%。
[0081]2、为了更进一步的确定基因在根结线虫的作用，本研宄还构建了过表达? U的拟南芥株系。
[0082](I)载体构建:以cDNA为模板，使用引物ttlFsal (如SEQ ID NO:25所示)和ttlRSPH (如SEQ ID NO:26所示)进行PCR，纯化回收，然后用内切酶Sal I和Sph I酶切，得到的片段连接插入到经相同内切酶酶切过的PGFP载体，并测序验证。得到的质粒用引物 35sBam (如 SEQ ID NO:27 所示)和 nosBam (如 SEQ ID NO:28 所示)进行 PCR,纯化回收后用内切酶BanRl酶切，得到的片段连接插入BanRl酶切过的pCambial300载体，构建pCambia-nulg载体，测序验证并转化农杆菌EHA-105。
[0083](2)转化拟南芥:准备开花阶段的拟南芥。转化和筛选参照Zhang (2006)的方法进行。子代的植株经过抗生素筛选后，取叶片进行PCR检测，使用引物qTTLF (序列如SEQID NO:23所示)和qTTLR (序列如SEQ ID NO:24所示)进行PCR检测，确定其是否带有目标基因。检测方法按照KOD FX的说明书进行。从T2代拟南芥中收获的T3代种子经过基因分离检测和PCR验证，确定是纯合株后，继续进一步的实验。
[0084](3)线虫接种:待转基因拟南芥生长30d后，接种新鲜孵化的爪哇根结线虫2龄幼虫，每株接种500条。接种后30d，取番茄根洗净后进行染色，参照冯志新(2000)介绍的次氯酸钠-酸性品红染色法，统计番茄根部线虫(包括各个龄期的线虫)的数量。
[0085](4)通过实时定量PCR检测证明了《7基因能在拟南芥中表达后(如附图7所示)，对该拟南芥进行表型分析，结果显示过表达的拟南芥植株比野生型生长和发育更快(如附图8所示)。线虫侵染实验结果显示，过表达的拟南芥中根结线虫的数量比野生型多40?60% (如附图9所示)。
[0086]上述结果均表明了基因在根结线虫的侵染和寄生中发挥着很重要的作用。
[0087]实施例5拟南芥中与MJ-TTL蛋白相互作用蛋白的筛选
1、酵母双杂交筛选拟南芥中与MJ-TTL互作蛋白
(I)载体构建:以爪哇根结线虫cDNA为模板，使用引物ttlFNco (如SEQ ID NO:29所示)和ttlRSal (如SEQ ID NO:30所示)扩增基因，纯化后，用内切酶Nco I和Sal I进行酶切纯化后，连接到经相同酶酶切的PGBKT7载体中，测序验证正确后获得pGBKT7-ttl载体，并转化至酵母菌(51 cerevisiae) AH109。
[0088](2)酵母双杂交
酵母双杂交的具体方法参考 Matchmaker ? Gold Yeast Two-Hybrid System UserManual 进行。
[0089]含有表达MJ-TTL蛋白诱饵质粒的AH109与拟南芥的cDNA酵母文库(本实验室构建保存)杂交后，通过筛选获得了 10个正常的酵母菌菌落。对其所含质粒进行测序获得8个候选的与MJ-TTL相互作用的蛋白的编码基因(NP_199834、NP_001119099、NM_126500、NP_001119099、NP_199834、NM_128119、AYl 14022 和 ΝΜ_001203612)。
[0090](3)互作蛋白筛选
为了验证获得的蛋白是否能真正的与MJ-TTL相互作用，设计覆盖上述8个候选基因的引物，通过PCR后再连接到pGBKT7载体，与含有的诱饵载体共转化ΑΗ109，然后经过SD/-Leu/-Trp/-His/_Ade/+X-a -gal筛选，确定只有同时含有编码拟南芥铁硫氧还蛋白还原酶基因和基因的酵母菌才能正常在该筛选培养基上生长和变蓝，分别将含有Sv40载体和p53载体(阳性对照)、Sv40载体和LamC载体(阴性对照1)、载体和LamC载体(阴性对照2)、Sv40载体和载体(阴性对照3)的酵母菌也一起进行筛选。结果表明，只有同时含有和基因的酵母菌才能激活报告基因表达(如附图1OA所示)。本研宄还测定了这些酵母菌中α-半乳糖苷酶的活性，证明了在同时含有A t-ftrcM基因的酵母菌中，该酶的活性显著高于阴性对照(如附图1OB所示)。因此证明了，在酿酒酵母中AT-FTRc与MJ-TTL能相互作用。
[0091]2、验证MJ-TTL与拟南芥的FTRc相互作用
为了克服酵母双杂交存在的假阳性，本文还采用免疫共沉淀(CO-1P)方法来进一步验证两者之间的相互作用。
[0092]CO-1P结果显示，只有在同时表达FTRc和TTL蛋白的时候才能从洗脱液中检测到FTRc蛋白，而表达GFP和FTRc蛋白的洗脱液则检测不到FTRc (如附图11所示)。综上所述，只有FTRc与TTL能发生相互作用。
[0093]实施例6 MJ-TTL对寄主防卫反应的作用
1、防卫反应相关基因的检测
(O消毒后的拟南芥种子播种于0.5 X MS培养基(0.8%琼脂，20g/L蔗糖，pH5.8) ；14d后取叶片，浸泡于含有10 μ M FLG22的PBS溶液中(0.01Μ，ρΗ5.8)，对照组不加入FLG22，Ih后收集叶片，提取RNA，并反转录为cDNA。
[0094]以上述cDNA 为模板，检测的基因包括 WRKY33(AT2G38470)，WRKY29 (AT4G23550)，CYP81F2 (AT5G57220)和 FRKl (AT2G19190)，基因表达变化的倍数参照 Jaouannet (2013)的方法进行。
[0095]检测WRKY33 (AT2G38470)所用引物为:WRKY3F 和 WRKY3R。
[0096]检测WRKY29 (AT4G23550)所用引物为:WRKY2F 和 WRKY2R。
[0097]检测CYP81F2 (AT5G57220)所用引物为:CYP8F 和 CYP8R。
[0098]检测FRKl (AT2G19190)所用引物为:FRK1F 和 FRK1R。
[0099]拟南芥的UBI基因作为内参，所用引物为:UBIF和UBIR(参考Jaouannet et al.，2013)。
[0100]所述几对引物的序列如下:
引物 WRKY3F: GCTGCTATTGCTGGTCACTCC ；
引物 WRKY3R:GGTCTCCTCGTTTGGTTCTTCC ο
[0101]引物WRKY2F:ATCCAACGGATCAAGAGCTG ；
引物 WRKY2R:GCGTCCGACAACAGATTCTC ο
[0102]引物CYP8F: GTGAAAGCACTAGGCGAAGC ；
引物 CYP8R:ATCCGTTCCAGCTAGCATCA。
[0103]引物FRKlF:TGCAGCGCAAGGACTAGAG ；
引物 FRKlR:ATCTTCGCTTGGAGCTTCT C。
[0104]引物UBIF:GCCAAAGCTGTGGAGAAAAG ；
引物 UBIR: TGTTTAGGCGGAACGGATAC ο
[0105](2)结果显示，上述与植物防卫反应相关的关键基因在受到PAMPs FLG22刺激前后表达量具有很大的差别。
[0106]与预期类似，在野生型的拟南芥中10 μΜ FLG22可以强烈的诱导上述关键基因的表达，相反，在表达的转基因拟南芥中这些关键基因就没有受到诱导或者诱导后表达量增加的较少，在调查的基因中，转基因系诱导后的表达量比野生型低10?50%(如附图12和13所示)。例如，关键基因在野生型中受到诱导后基因表达量增加2000%，但在转基因系中，受到诱导后表达量平均最高只增加了 1000%(如附图12A所示)。MXTJJ基因的情况类似，在野生型中受到FLG22诱导后表达量增加了 600%，但在转基因T01-02、T02-08和Τ05-01系中，该基因受到诱导后表达量只增加了 200?300%(如附图13D所示)，显著的低于对照的野生型。
[0107]2、ROS生成量的检测
(I)方法参考Segonzac (2011)所述进行，具体如下:
培养含有pMD 1-111-HA载体和pMD 1-HA载体(pMD 1-111-HA载体和pMD 1-HA载体由美国康奈尔大学王晓红线虫研宄室提供)的农杆菌C58，第2d离心收集菌体，用2-(N-吗啉)乙磺酸(MES，1mM,pH5.5)清洗3次后，定容至OD6tltl=0.3，加入终浓度为ΙΟΟμΜ的乙酰丁香酮，室温孵育4h ;然后注射到3周苗龄的烟草叶片(Λ知中，对照为将含有pMDl-HA载体的农杆菌C58注射到烟草中，其他条件同实验组；48h后，用打孔器取叶盘，并把叶盘置于微孔板中(每孔先加入200μ?灭菌超纯水)，叶面向上，盖上保鲜膜后静置16h ;用排枪吸干净孔里面的水分后，向每个孔中加入10PL ROS反应液，反应液配置按如下进行(每8孔需要的量):灭菌超纯水，ImL ；Luminol, 2M-L ；Horseradish peroxidase, 2M-L ;FLG22，IM-L0 接着把微孔板置于酶标仪中进行检测，测定荧光反应的强度。
[0108](2)结果如附图14所示。植物在受到FLG22刺激后，对照组在处理后约7min时荧光强度增加率明显增高，而实验组则在处理Smin后荧光强度增加率开始升高，而且对照组在处理后约15min荧光读数最大为30000，而实验组荧光读数在约18min最大为15000，明显小于对照组。由于在luminol-based assay的测定方法中，焚光强度与体系中ROS的含量成正比，因此可见，在植物中表达MJ-TTL蛋白可以抑制寄主ROS爆发的产生。又由于ROS爆发是植物对病原物产生PTI反应的标志事件之一，因此可以得出结论:MJ-TTL蛋白能抑制拟南芥的PTI反应。
[0109]3、测定过表达的拟南芥体内H2O2与野生型拟南芥之间含量的差异，结果显示，在野生型拟南芥根部H2O2的含量为9 μ g/g (鲜重)，而在转基因的拟南芥根部H 202的含量为I?6 μ g/g (鲜重)，H2O2的含量比野生型的低30?89% (如附图15所示)。结果表明了，在植物体内，TTL与FTRc相互作用后，会增加FTRc的活性从而促进植物体内ROS的降解。
[0110]4、另外通过H2O2的体外降解实验进一步确定TTL蛋白的作用是加速植物中ROS的降解速度。把10ng纯化的MJ-TTL蛋白与从拟南芥中提取的粗蛋白混合后，加入到含有80 yg H2O2的溶液中，然后置于22°C条件下反应，在O、5、10、15min分别取样测定溶液中H2O2的量。作为对照，提取蛋白的Buffer和pET28a蛋白分别与拟南芥粗蛋白进行混合后加入到相同的H2O2的溶液中，其他处理与实验组相同。
[0111]结果显不，在Omin时各组处理的H2O2的含量相差不大。而处理后在5、10、15min时，只加了提取buffer (EXbuffer组)和含有提取buffer+纯化TTL蛋白(EX buffer+TTL组)的处理H2O2的含量基本在80 μ g，说明H2O2在该处理条件下比较稳定，不会自发的降解。加拟南芥粗蛋白或对照蛋白的(AT和AT+PET28)的处理H2O2的含量随着时间的增加逐步的下降，说明了拟南芥的粗蛋白中含有能降解H2O2的的酶类。而在加入TTL和拟南芥粗蛋白混合物的处理中(AT+TTL)，H2O2的含量也是随着时间的增加逐步下降，但是下降的速度明显的快于AT+EP buffer和AT+PET28两种处理，在处理后15min，加入TTL蛋白的处理H2O2的含量大约为O?3 μ g，而AT和AT+PET28两种处理H2O2的含量大约为40 μ g，显著的高于加入TTL的组别。这表示了，往野生型拟南芥总蛋白中加入纯化的MJ-TTL蛋白后，混合蛋白对H2O2的降解速度增加了(如附图16所示)。
[0112]综上所述，基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，并被分泌到寄主组织中，通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了 ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性，为抗线虫品种植物的培育提供了新靶标。Mj-t?7基因是一个非常好的构建培育抗根结线虫作物的靶标基因。
【主权项】
1.一种爪哇根结线虫效应基因Mj-Ul,其特征在于，所述效应基因DNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0:l所示；效应基因#J.-??7的cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种权利要求1所述效应基因编码的蛋白MJ-TTL，其特征在于，所述蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种重组载体，其特征在于，由基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为PTRV2或pCambial300o5.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述重组载体。6.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因或权利要求2所述蛋白MJ-TTL在提高植物抗根结线虫能力中的应用。7.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因在构建抗根结线虫植物中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为: 51.重组表达载体pTRV2-ttl构建: SI 1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫RNAJf RNA反转录为cDNA ； 512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶Sac I和Xba I进行酶切，并纯化回收； 513.同时使用限制性内切酶SacI和Xba I酶切载体pTRV2，并纯化回收； 514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体Sac I和Xba I酶切位点之间插入了基因Mj-Ul的双链DNA片段； 52.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照； 53.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物； 引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示； 引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，S12所述PCR扩增的程序为95°C2min ；95°C10s,60°C 15s,68°C lmin，30 个循环。10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，S14所述DNA片段的序列为基因Mj-ttmcDNA 序列的 79 ?428bp，如 SEQ ID NO:4 所示。
【专利摘要】本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl，编码蛋白及其应用，属于生物基因工程技术领域。所述效应基因Mj-ttl的序列如SEQ ID NO：1～2所示，其编码蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明明确了Mj-ttl基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，是爪哇根结线虫的效应蛋白，通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性。本发明为抗线虫品种植物的培育提供了新靶标，对实践中培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。
【IPC分类】C12N15/12, C07K14/435, C12N1/21, A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN104894138
【申请号】CN201510207786
【发明人】廖金铃, 林柏荣, 卓侃
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月28日
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程技术领域。更具体地，涉及一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,编码蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]根结线虫是一种重要的专性寄生植物线虫，同时也是危害最为严重的植物寄生线虫之一，在全球范围内能侵染不同科的超过3000种植物(Sasser, 1980)，并造成巨大的经济损失。其中爪哇根结线虫是世界上分布范围最广的根结线虫之一，在多个国家都是农业生产中重要的有害生物(Sasser, 1980)。因此对爪哇根结线虫的特性研宄，以及其与寄主相互作用的研宄是一个非常重要且亟待研宄的课题。
[0003]在对根结线虫寄生作用的研宄中，对其产生的效应蛋白的研宄是一项非常关键且具有重大意义的课题。TTL蛋白(Transthyretin-like Proteins)家族是一类只在线虫中存在的蛋白，该蛋白家族都含有一个保守的类甲状腺素运载蛋白结构域(Transthyretin-like domain,DUF290,McCarter et al., 2003)。自从第一个 TTL 蛋白从秀丽小杆线虫(C中分离(Sonnhammer et al., 1997)，目前已从南方根结线虫{M.1ncognita，Bellaf1re et al., 2008)、大豆抱囊线虫(/Z glycines, Gao et al.,2003 )、松材线虫(Bursaphelenchusxylophi Ius,王宝文，2011)、马来布鲁线虫(Brugiamalayi, Hewitson et al., 2008)、奥氏奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi, Saverwynset al., 2008)等多种线虫中发现了 TTL蛋白。
[0004]正如名称所不，TTL蛋白与 TTR (Transthyretin)和 TRP (Transthyretin-likeproteins)序列存在相似性(Saverwyns et al., 2008)。TTR是一类只在脊椎动物中发现的蛋白，该蛋白主要存在于血液和细胞外液中，负责运输甲状腺激素和维生素A (Hennebryet al., 2006) ;TRP广泛分布在不同生物中，如细菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物，参与调节各种生理代谢(Eneqvist et al., 2003; Lundberg et al., 2006; Sauer-Eriksson etal., 2009)，如在细菌和脊椎动物中TRP与嘌呤的代谢相关(Lee et al., 2006; Mat1lloet al., 2009)，但在植物中TRP与油菜素内酯的代谢相关(Nam et al., 2004; Li, 2005)；相反，只在线虫中发现的TTL蛋白确切的功能尚不清楚，但由于TTL与TTR和TRP存在相似性，所以推测TTL可能与激素转运和代谢(McElwee et al., 2004; Parkinson et al.,2004; Bellaf1re et al., 2008)、营养物质的消化和吸收(Furlanetto et al., 2005)或神经系统的功能(Jacob et al., 2007)有关。但是Saverwyns通过实验证实，奥氏奥斯特线虫的TTL蛋白不能实现TTR的功能(Saverwyns et al., 2008)，而且Sauer通过生物信息的方法预测，虽然TTL蛋白与TTR和TRP有同源性，但它们的功能似乎没有相似性(Sauer-Eriksson et al., 2009)。
[0005]因此，目前对于线虫TTL蛋白的认识几乎是一项空白。对于其是否能够作用于线虫寄生植物的过程、有什么作用以及作用过程和机制仍然不清楚(Bellaf1re，2008)。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有根结线虫防治技术不足以及根结线虫效应蛋白TTL的研宄不足，提供一种与爪哇根结线虫感病性相关的效应基因及其编码蛋白，为抗线虫品种植物的培育提供新靶标，对培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。
[0007]本发明的目的是提供一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl。
[0008]本发明另一目的是提供所述爪哇根结线虫效应基因的编码蛋白。
[0009]本发明再一目的是提供所述爪哇根结线虫效应基因及其编码蛋白的应用。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl,其DNA全长核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]本发明还公开了一种上述效应基因编码的蛋白MJ-TTL，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
[0012]在严格条件下与基因杂交且编码与爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子、与基因Mj-ttl^ 90%以上同源性且编码爪哇根结线虫寄生相关蛋白的DNA分子均在本发明的保护范围之内。
[0013]一种重组载体，由基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]优选地，所述植物表达载体可以是一般表达载体或RNAi载体，可以根据需要进行选择。作为RNAi载体，优选为pTRV2载体；作为过表达载体，优选为pCambial300。
[0015]一种重组菌，包含上述重组载体。
[0016]对于含有上述爪哇根结线虫效应基因的重组基因表达盒、转基因细胞系等，也都应属于本发明的保护范围。
[0017]本发明还提供基因Mj-ttm蛋白MJ-TTL在提高植物抗根结线虫能力中的应用。包括基因在构建抗根结线虫植物中的应用。
[0018]所述构建抗根结线虫植物的具体步骤为:
51.重组表达载体pTRV2-ttl构建:
SI 1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫RNAJf RNA反转录为cDNA ；
512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，PCR扩增程序为95°C2min ；95°C 10s，60°C 15s，68°C lmin，30个循环；将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶feci和ZhI进行酶切，并纯化回收；
513.同时使用限制性内切酶feci和ZhI酶切载体pTRV2，并纯化回收；
514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体5^1和ZhI酶切位点之间插入了双链DNA片段，DNA片段的序列为基因的cDNA序列的79bp?428bp，如SEQ ID NO:4所示；
52.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照；
53.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物；
引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示；
引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O
[0019]本发明通过大量的研宄和探索，获得了一种爪哇根结线虫效应蛋白编码基因并明确了其功能和作用机制。该基因cDNA全长456bp，编码151个氨基酸残基的
MJ-TTL蛋白，该蛋白预测分子量为17.28KDa，等电点为5.04，含信号肽，含有一个保守的DUF290结构域；Southern杂交结果表明，在爪哇根结线虫基因组中以单拷贝形式存在。
[0020]MJ-TTL蛋白特异的在爪哇根结线虫亚腹食道腺中表达，并在寄生过程中被分泌到寄主组织中，定位在细胞质中。MJ-TTL效应蛋白的作用机理是:MJ-TTL被线虫分泌到植物中，然后与植物中的FTRc相互作用，加速植物细胞内H2O2的降解，抑制ROS的积累，从而抑制植物PTI反应的产生来促进根结线虫的侵染和寄生。因此，可以利用根结线虫基因或植物/irc基因为靶标，构建抗根结线虫转基因植物。
[0021]本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因编码蛋白及其应用。该效应基因的序列如SEQ ID NO:1?2所示，其编码蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO:
3所示。
[0022]本发明明确了基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，并被分泌到寄主组织中。同时确定了 MJ-TTL的作用机理，即该蛋白通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了 ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性。
[0023]本发明为抗线虫品种植物的培育提供了一个新的靶标一一基因，对实践中培育广谱抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。同时明确的MJ-TTL的作用机理均是线虫寄生研宄中的首次 发现，为根结线虫寄生机制的研宄提供了新的思路和研宄方向，具有显著的理论价值。
【附图说明】
[0024]图1为经过Ni2+-NTA凝胶纯化的重组MJ-TTL蛋白的SDS-PAGE结果。
[0025]图2为Western杂交检测MJ-TTL抗血清特异性；图中pre_J2和TOR分别表示从侵染前2龄幼虫和健康番茄根获得的总蛋白，M为蛋白标准分子量；每个泳道上样量为10 μ g总蛋白。
[0026]图3为MJ-TTL蛋白在爪哇根结线虫上的免疫定位结果；A、B分别为经抗MJ-TTL血清和未免疫的兔血清处理后的侵染前2龄幼虫，SvG表示亚腹食道腺，比例尺为10 μ m。
[0027]图4为基因在不同发育阶段相对表达水平的差异；图中y轴表示的是基因变化的倍数，通过使用2_ΛΛ %法并定义成熟雌虫的表达量为I的情况下计算获得。图中X轴表示的是线虫的不同发育阶段，dpi表示的是接种线虫后的天数，pre-J2表示的是侵染前2龄幼虫；y轴表示的是基因变化的倍数；每个样品的数值是3次重复中获得的结果的平均值，误差线是三次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0028]图5为i/? plan ta RNAi方法沉默Mj_t?7基因的沉默效果，相对表达量数值通过使用2_ΛΛσ法并定义CK处理的幼虫的相关基因表达量为I的情况下计算获得；每个样品的数值是3次重复中获得的结果的平均值，误差线是3次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0029]图6为i/? Planta RNAi方法沉默基因后根结线虫寄生能力的差异；图中CK表示没有农杆菌侵染的处理，TRV::CK为使用含有pTRV2空载体的农杆菌侵染的处理，TRV::ttl为使用含有pTRV2-ttl载体的农杆菌侵染的处理；星号表示该处理获得的数据经过student检验后差异显著(Ρ〈0.05)。
[0030]图7实时定量PCR检测过表达基因的拟南芥中基因的表达量?’每个样品的数值是3次重复中获得的结果的平均值，误差线是3次重复的标准误(standarddeviat1n)。
[0031]图8为过表达基因植株的株高与野生型之间的差异；每个样品的数值是10次重复中获得的结果的平均值，误差线是10次重复的SD，星号表示该组数值经过student~t test检验后与野生型(Col-O)植株的数值差异显著(P〈0.05)。
[0032]图9为过表达基因的拟南芥植株对爪哇根结线虫感病性的影响(感病性更高);每个样品的数值是10次重复中获得的结果的平均值，误差线是10次重复的SD，星号表示该组数值经过student-t test检验后与野生型(Col-O)植株的数值差异显著(P〈0.05)。
[0033]图10为MJ-TTL与FTRc相互作用；图A表示在含有和/irc载体的酵母菌AH109、以及含有SV40和p53 (阳性对照)载体的酵母菌AH109都能正常的在非筛选(左)和筛选培养基(右)中生长，而含有和SV40、SV40和LamC、FTRc和LamC的酵母菌只能在非筛选培养基中生长表示Χ-α -Gal酶活性测试，含有图中相应载体组合的酵母菌ΑΗ109在非筛选培养基中培养3d后，挑取5个菌落混合后测试Χ-α -Gal酶的活性，其中只有SV40+p53和TTL+FTRc的能检测到较高酶的活性，其他组别的活性都显著低于它们。图中数值为三次重复获得数据的平均值土SD，不同字母表示经DMRT检验后差异显著(p〈0.05)。
[0034]图11为免疫共沉淀验证MJ-TTL与FTRc的相互作用；图中TTL-HA、GFP-HA和FTRc-MYC分别表示表达相应蛋白，Input表示从烟草中提取的总蛋白，1.P表示的是免疫共沉淀后获得的蛋白，表示不含该种蛋白，“ + ”表示含有该种蛋白；Ant1-HA表示使用HRP标记的抗HA-tag的抗体进行检测，Ant1-myc表示使用抗MYC-tag抗体进行检测，比例尺为
50μ m0
[0035]图12为过表达基因的拟南芥植株抑制由FLG22介导的PTI反应；图A和B分别表示在转基因植株中PTI反应关键基因CYP81F2和FRKl在受到FLG22诱导后表达量与与野生型表达量变化的倍数，图中y轴表示的是基因变化的倍数，通过使用2_λλ CT法并定义野生型中没诱导的情况下表达量为I ;每个样品的数值是5次重复中获得的结果的平均值，误差线是5次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0036]图13为过表达基因的拟南芥植株抑制由FLG22介导的PTI反应；图C和D分别表示在转基因植株中PTI反应关键基因WRKY29和WRKY33在受到FLG22诱导后表达量与与野生型表达量变化的倍数，图中y轴表示的是基因变化的倍数，通过使用2_λλ 9去并定义野生型中没诱导的情况下表达量为I ;每个样品的数值是5次重复中获得的结果的平均值，误差线是5次重复的标准误(standard deviat1n)。
[0037]图14为本生烟中过表达MJ-TTL可以抑制由FLG22诱导的ROS生成；含有Mj-Ul(TTL)或空载体(CK)的农杆菌菌株GV3101注射到苗龄为3周的烟草叶片中，48 h收集叶片进行ROS实验；纵坐标为每个叶盘的荧光值，即18-24个叶盘的相对荧光强度的平均值土标准误，实验重复两次并获得类似的结果。
[0038]图15为过表达的拟南芥与野生型拟南芥中H 202含量的差异。
[0039]图16为MJ-TTL对拟南芥中H2O2的影响；EX buffer表示只含提取拟南芥总蛋白的buffer ；EX buffer+TTL表示含有提取拟南芥总蛋白的buffer+纯化后的TTL蛋白；AT表示提取的拟南芥总蛋白；AT+PET28表示提取的拟南芥总蛋白+对照的蛋白；AT+TTL拟南芥总蛋白加入加入纯化的MJ-TTL蛋白；图中数值为8-10次重复获得的数据的平均值土SD。
【具体实施方式】
[0040]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0041]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。内切酶均购自NEB。
[0042]实施例1基因全长序列的获得、序列分析
1、基因中间片段的获得
根据NCBI基因库中同源基因，设计简并引物ttlestF (序列如SEQ ID NO:5所示)和ttlestR (序列如SEQ ID NO:6所示)，以爪哇根结线虫cDNA为模板进行PCR扩增。
[0043]PCR 反应体系为 25μ?:cDNA ?μ?, ddH20 17.875μ?, dNTP Mixture (2.5mmoL/Leach) 2.5M-L, 10XPCR Buffer 2.5M-L, ttlestF(ΙθΜ-moL/L) 0.5M-L, ttlestR(1MmoL/L)
0.5μ?, Ex Taq(5U/^L) 0.125μ?。
[0044]PCR 反应程序为:94°C lmin ；94°C 30s，60°C 50s，72°C lmin，30 个循环；72°ClOmin，4°C，00。
[0045]基因 3’ RACE 的扩增
(I)引物:根据已扩得的基因EST设计2条特异引物ttl3rl (序列如SEQ IDNO:7所示)和ttl3r2 (序列如SEQ ID NO:8所示)；反向引物分别为Clontech RACE试剂盒的锚定引物UPM和NUP。
[0046](2)第一轮PCR反应体系 50μ?:ddH20 32pL，dNTP Mixture (2.5mmoL/L each) 5μ?,10XK0D Buffer 5μ?, MgSO4 3PL，Kod plus Neo (5U/^L) lPL，ttl3rl Primer (10MmoL/L)和UPM Primer (lOMmoL/L)各 1.5M-L, 3? ready cDNA IKL0
[0047]PCR 反应程序:94 °C 3min ；94 °C 30s, 65 °C 30s, 72 °C 3min，30 个循环；72 °C1min ；4°C，00。
[0048](3)第二轮(nest) PCR反应以第一轮PCR产物为模板，引物NUP和ttl3r2，反应体系如第一轮PCR反应。
[0049]PCR反应程序如第一轮PCR反应。
[0050]3、Mj~t ?7基因5 ’端序列的获得 (I)引物:根据已扩得的基因中间片段序列设计2条特异引物ttl5rl (序列如SEQ ID NO:9所示)和ttl5r2 (序列如SEQ ID NO: 10所示)，反向引物分别为UPM和NUP(购自clontech公司)。
[0051](2)第一轮PCR反应以5’ ready cDNA为模板，引物Upm和ttl5rl，反应体系如3’ RACE的第一轮PCR反应。
[0052]PCR 反应程序:94°C 3min ；94°C 30s，65°C 30s, 72°C 3min，72°C 3min，30 个循环；4°C，°°o
[0053](3)第2轮PCR以第一轮PCR产物为模板，引物为ACl Primer (序列如文章Liuet al., 2007所示)和ttl5r2，反应体系如上。
[0054]PCR反应程序如第一轮PCR反应。
[ 0055]以上I?3中PCR反应结束后，均用1%琼脂糖进行电泳检测，_20°C保存。
[0056]4、基因全长序列的获得和序列分析
利用Seqman软件将已扩得的基因中间片段、5’和3’序列进行拼接，设计覆盖OFR 的引物 ttlcdsF (序列如 SEQ ID NO:11 所示)和 ttlcdsR (序列如 SEQ ID N0:12 所示)，分别以cDNA和DNA作为模板获得ii/-1基因全长序列。
[0057]结果显示，基因的DNA全长为1051bp (如SEQ ID NO:1所示)，cDNA全长456bp (如SEQ ID N0:2所示)。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，预测等电点(pi)为5.04，分子量为和17.28KDa。该蛋白有一个位于第35到第109个氨基酸之间的保守结构域DUF290。通过Signal IP 4.0预测MJ-TTL蛋白含有信号肽。
[0058]实施例2基因在线虫体内的免疫定位
本实施例免疫定位所用的一抗为使用pET28a进行原核表达纯化得到的MJ-TTL蛋白，免疫兔子得到的抗血清。二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(由北京博奥森生物技术有限公司提供)。
[0059]1、一抗的制备:
(I)载体构建:使用引物ttlFYEcorl (序列如SEQ ID NO: 13所示)和ttlRYHind (序列如SEQ ID NO:14所示)扩增片段，使用EcroR I Hind III进行酶切，连接到经相同酶酶切的pET28a载体中，测序验证正确后获得pET28-ttl载体，然后转化至大肠杆菌 BL21 (DE3)中。
[0060](2)蛋白纯化:使用Ni2+-NTA凝胶对获得的总蛋白进行纯化，具体方法参照Qiagen公司的蛋白纯化说明书(The QIAexpress1nist?)进行。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE分析。
[0061]结果如附图1所示，纯化的MJ-TTL蛋白在PAGE胶上只有一条清晰的主条带(ISKDa附近，与预测分子量接近)，没有非特异性条带，获得的蛋白纯度较高，满足下一步制作抗血清的纯度要求。
[0062](3)抗血清的制备:首次免疫使用0.5mL (2(^g)纯化的蛋白与0.5mL弗氏完全佐剂混合，在兔子皮下多点注射，每个注射点注射0.2mL混合液。1d后，进行第二次注射，使用0.5mL (1Pg)纯化的蛋白与0.5mL弗氏不完全佐剂混合，在兔子皮下多点注射，每个注射点注射0.2mL混合液。以后每隔7d?1d进行一次加强注射，一共注射4次。在最后一次注射抗原后7d，进行颈动脉取血。血液用三角瓶收集，倾斜置于37°C培养箱，待血清完全析出后，用灭菌的胶头滴管把血清小心的吸出。如血清与红血球分离不充分，则需把血清置于干净的离心管中3000rpm离心20min，然后分装，置于_70°C备用。
[0063](4)抗血清特异性检测:使用Western杂交实验验证所获得的抗MJ-TTL血清的特异性，具体步骤如下:
收集新鲜孵化的爪哇根结线虫2龄幼虫，置于干净的1.5mL离心管中；置于液氮中研磨均勾后，加入10PL Lys buffer ;置于振荡器上震荡lOmin，4°C 14000rpm离心lOmin，上清液为所需的蛋白。取约1Pg线虫总蛋白进行SDS-PAGE电泳，作为对照同时加入l(^g番茄根的总蛋白进行SDS-PAGE(15%)电泳，然后使用半干法把蛋白从PAGE凝胶中转移至硝化纤维素膜上(NitrocelluloseMembranes);用PBS溶液浸泡薄膜3次，每次Imin ;然后加入5%的BSA (PBS溶解)浸泡薄膜30?60min ;加入1:5000倍的抗血清，4°C孵育8h ；PBS清洗5次，每次5min ;加入1:10000倍的HRP标记的山羊抗兔抗体，室温孵育Ih ；PBS清洗5次，每次5min ;用清水冲洗薄膜后，加入2mL Pro-Light HRP化学发光检测试剂，室温孵育5min，然后于暗示中进行曝光。
[0064]结果显示，在加入抗MJ-TTL血清的薄膜、侵染前2龄幼虫的总蛋白的泳道中，在15KDa的位置有清晰的蛋白杂交条带，与预测分子量相同，其他位置没有杂交信号，在加入健康番茄根总蛋白以及未免疫的兔血清的薄膜的泳道中均没有杂交条带(如附图2所示)，这表明获得的抗血清特异性非常好。
[0065]2、免疫定位
(O以免疫前的兔血清为对照血清，使用抗MJ-TTL的血清对该蛋白在线虫的组织定位进行分析，具体实验步骤如下:
51.收集发育阶段的根结线虫，灭菌水清洗3次，BufferA清洗一次，5min ；
52.加入BufferA，25°C固定4?8h，然后4°C固定16?24h ；
53.用BufferC清洗3次后，加入Buffer B室温反应20?25min，再用Buffer C清洗3次后，把离心管置于液氮中，用手术刀切割虫体10次；
54.加入BufferA，4°C处理30min后，用Buffer C清洗I次，再加入Buffer D反应10 ?15min ；
55.加入浓度为10%没免疫的山羊血清，25°C反应Ih ；
56.加入5yL —抗，25°C反应24h后，用Buffer D清洗3次，每次10?15min ；
57.加入Iμ L 二抗，25°C反应4h后，用Buffer D清洗3次，每次10?15min，再用清水清洗两次；
58.显色:按照TIANGEN的增强型HRP-DAB底物显色试剂盒操作；
59.Buffer C清洗后，显微镜观察。
[0066]其中，相关溶液的配制方法为:
Buffer A:4% 甲酸，使用 Buffer C 配置；Buffer B:0.5mg/mL 蛋白酶 K，使用 Buffer C配置；Buffer C:0.0lM PBS, pH7.5灭菌后，加入终浓度为20%的DMSO ;如果虫体变形适当降低 DMSO 浓度或不加，另外所有 BufferWA0.1% 吐温-20 ；Buffer D:0.1% Triton 100，
0.1%BSA，用 Buffer C 配。
[0067](2)结果显示，在经过抗MJ-TTL血清处理的侵染前2龄幼虫(pre_J2)的亚腹食道腺中有明显的杂交信号(如附图3A所示)，而在使用对照血清处理的pre-J2中没有观察到杂交信号(如附图3B所示)，表明基因编码的MJ-TTL蛋白特异的在爪哇根结线虫的亚腹食道腺中表达，MJ-TTL蛋白属于效应蛋白，且在根结线虫侵染的早期发挥重要的作用。
[0068]实施例3基因在线虫体内发育表达分析
1、不同龄期爪哇根结线虫的收集
2龄幼虫:取新鲜根结，利用解剖镜挑取色泽淡黄、或黄色的单卵块，于28°C温箱中恒温培养7d,移至试管中离心收集线虫备用。
[0069]不同发育阶段根结线虫:把新鲜孵化的2龄幼虫接种至4周的番茄根上，24h后把番茄连根拔出，用清水洗净根部，把番茄苗重新栽种到新的灭菌土中，分别在不同时间段把番茄拔出，收集线虫于离心管中备用。
[0070]2、模板cDNA:参照TIANGEN的RNApr印Micro Kit试剂盒中的动物组织总RNA的提取方法，提取总 RNA。参照 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover Kit(T0Y0B0)的说明书进行操作，合成cDNA。
[0071]3、qRT_PCR:参照 TOYOBO 的 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 试剂盒，使用引物 qttlF(如 SEQ ID NO:15 所示)和 qttlR (如 SEQ ID NO:16 所示)扩增基因，qactinF (如SEQ ID NO:17 所示)和 qactinR (如 SEQ ID NO: 18 所示)扩增内参基因 #j.-卢-acii/?。
[0072]相对表达量计算参照Livak的方法(Livak et al., 2001)。
[0073]4、通过以上实时定量PCR (Real-time RT-PCR)对基因在不同发育阶段的表达变化的研宄，结果显示，该基因在侵染前的2龄幼虫和侵染的早期的线虫中表达量上升，在侵染2d后的2龄幼虫(par-J2)表达量最高，随着线虫的发育，表达量缓慢下降，表达最低点在成熟雌虫阶段，在该阶段? U的表达量仅为侵染2d后阶段表达量的八分之一(如附图4所示)。
[0074]这一结果也证实了基因及其编码的MJ-TTL蛋白在根结线虫侵染的早期发挥重要的作用。
[0075]实施例基因在根结线虫寄生中的作用 1、in plan ta RNAi 分析
为了确定基因在爪哇根结线虫寄生植物过程中的作用，用烟草花叶病毒(TRV)介导的Planta RNAi方法来沉默爪哇根结线虫的基因，构建了沉默#六《7基因转基因番茄，然后观察爪哇根结线虫在该基因沉默后寄生能力的变化。
[0076]( I)构建沉默基因的转基因番茄，步骤如下:
S1.重组表达载体pTRV2-ttl构建:
SI1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫!?應，将RNA反转录为cDNA ；
512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，PCR扩增程序为95°C2min ； 95°C 10s，60°C 15s，68°C lmin, 30个循环；将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶feci和ZhI进行酶切，并纯化回收；
513.同时使用限制性内切酶feci和ZhI酶切载体pTRV2，并纯化回收；
514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体5^1和ZhI酶切位点之间插入了双链DNA片段，DNA片段的序列为基因的cDNA序列的79bp?428bp，如SEQ ID NO:4所示。
[0077]S2.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A ;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照；
S3.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；参照Ryu (2004)的方法，将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物；引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示；
引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O
[0078](2)线虫接种:接种农杆菌21d后，接种新鲜孵化的爪哇根结线虫2龄幼虫，每株番茄接种200条。接种线虫后5d后，提取RNA，用引物qTTLF(序列如SEQ ID NO:23所示)和qTTLR (序列如SEQ ID NO:24所示)进行定量PCR，检测基因沉默效率。
[0079]接种后30d，取番茄根洗净后进行染色，参照冯志新(2000)介绍的次氯酸钠-酸性品红染色法，统计番茄根部线虫(包括各个龄期的线虫)的数量。检测沉默后爪哇根结线虫侵染能力的变化。
[0080](3)#六《7基因沉默效率如附图5所示，爪哇根结线虫的基因表达量明显下降。基因沉默后爪哇根结线虫的寄生能力检测结果如附图6所示，沉默后，爪哇根结线虫的寄生能力受到了明显的抑制，根结线虫数量比对照的下降了 45%。
[0081]2、为了更进一步的确定基因在根结线虫的作用，本研宄还构建了过表达? U的拟南芥株系。
[0082](I)载体构建:以cDNA为模板，使用引物ttlFsal (如SEQ ID NO:25所示)和ttlRSPH (如SEQ ID NO:26所示)进行PCR，纯化回收，然后用内切酶Sal I和Sph I酶切，得到的片段连接插入到经相同内切酶酶切过的PGFP载体，并测序验证。得到的质粒用引物 35sBam (如 SEQ ID NO:27 所示)和 nosBam (如 SEQ ID NO:28 所示)进行 PCR,纯化回收后用内切酶BanRl酶切，得到的片段连接插入BanRl酶切过的pCambial300载体，构建pCambia-nulg载体，测序验证并转化农杆菌EHA-105。
[0083](2)转化拟南芥:准备开花阶段的拟南芥。转化和筛选参照Zhang (2006)的方法进行。子代的植株经过抗生素筛选后，取叶片进行PCR检测，使用引物qTTLF (序列如SEQID NO:23所示)和qTTLR (序列如SEQ ID NO:24所示)进行PCR检测，确定其是否带有目标基因。检测方法按照KOD FX的说明书进行。从T2代拟南芥中收获的T3代种子经过基因分离检测和PCR验证，确定是纯合株后，继续进一步的实验。
[0084](3)线虫接种:待转基因拟南芥生长30d后，接种新鲜孵化的爪哇根结线虫2龄幼虫，每株接种500条。接种后30d，取番茄根洗净后进行染色，参照冯志新(2000)介绍的次氯酸钠-酸性品红染色法，统计番茄根部线虫(包括各个龄期的线虫)的数量。
[0085](4)通过实时定量PCR检测证明了《7基因能在拟南芥中表达后(如附图7所示)，对该拟南芥进行表型分析，结果显示过表达的拟南芥植株比野生型生长和发育更快(如附图8所示)。线虫侵染实验结果显示，过表达的拟南芥中根结线虫的数量比野生型多40?60% (如附图9所示)。
[0086]上述结果均表明了基因在根结线虫的侵染和寄生中发挥着很重要的作用。
[0087]实施例5拟南芥中与MJ-TTL蛋白相互作用蛋白的筛选
1、酵母双杂交筛选拟南芥中与MJ-TTL互作蛋白
(I)载体构建:以爪哇根结线虫cDNA为模板，使用引物ttlFNco (如SEQ ID NO:29所示)和ttlRSal (如SEQ ID NO:30所示)扩增基因，纯化后，用内切酶Nco I和Sal I进行酶切纯化后，连接到经相同酶酶切的PGBKT7载体中，测序验证正确后获得pGBKT7-ttl载体，并转化至酵母菌(51 cerevisiae) AH109。
[0088](2)酵母双杂交
酵母双杂交的具体方法参考 Matchmaker ? Gold Yeast Two-Hybrid System UserManual 进行。
[0089]含有表达MJ-TTL蛋白诱饵质粒的AH109与拟南芥的cDNA酵母文库(本实验室构建保存)杂交后，通过筛选获得了 10个正常的酵母菌菌落。对其所含质粒进行测序获得8个候选的与MJ-TTL相互作用的蛋白的编码基因(NP_199834、NP_001119099、NM_126500、NP_001119099、NP_199834、NM_128119、AYl 14022 和 ΝΜ_001203612)。
[0090](3)互作蛋白筛选
为了验证获得的蛋白是否能真正的与MJ-TTL相互作用，设计覆盖上述8个候选基因的引物，通过PCR后再连接到pGBKT7载体，与含有的诱饵载体共转化ΑΗ109，然后经过SD/-Leu/-Trp/-His/_Ade/+X-a -gal筛选，确定只有同时含有编码拟南芥铁硫氧还蛋白还原酶基因和基因的酵母菌才能正常在该筛选培养基上生长和变蓝，分别将含有Sv40载体和p53载体(阳性对照)、Sv40载体和LamC载体(阴性对照1)、载体和LamC载体(阴性对照2)、Sv40载体和载体(阴性对照3)的酵母菌也一起进行筛选。结果表明，只有同时含有和基因的酵母菌才能激活报告基因表达(如附图1OA所示)。本研宄还测定了这些酵母菌中α-半乳糖苷酶的活性，证明了在同时含有A t-ftrcM基因的酵母菌中，该酶的活性显著高于阴性对照(如附图1OB所示)。因此证明了，在酿酒酵母中AT-FTRc与MJ-TTL能相互作用。
[0091]2、验证MJ-TTL与拟南芥的FTRc相互作用
为了克服酵母双杂交存在的假阳性，本文还采用免疫共沉淀(CO-1P)方法来进一步验证两者之间的相互作用。
[0092]CO-1P结果显示，只有在同时表达FTRc和TTL蛋白的时候才能从洗脱液中检测到FTRc蛋白，而表达GFP和FTRc蛋白的洗脱液则检测不到FTRc (如附图11所示)。综上所述，只有FTRc与TTL能发生相互作用。
[0093]实施例6 MJ-TTL对寄主防卫反应的作用
1、防卫反应相关基因的检测
(O消毒后的拟南芥种子播种于0.5 X MS培养基(0.8%琼脂，20g/L蔗糖，pH5.8) ；14d后取叶片，浸泡于含有10 μ M FLG22的PBS溶液中(0.01Μ，ρΗ5.8)，对照组不加入FLG22，Ih后收集叶片，提取RNA，并反转录为cDNA。
[0094]以上述cDNA 为模板，检测的基因包括 WRKY33(AT2G38470)，WRKY29 (AT4G23550)，CYP81F2 (AT5G57220)和 FRKl (AT2G19190)，基因表达变化的倍数参照 Jaouannet (2013)的方法进行。
[0095]检测WRKY33 (AT2G38470)所用引物为:WRKY3F 和 WRKY3R。
[0096]检测WRKY29 (AT4G23550)所用引物为:WRKY2F 和 WRKY2R。
[0097]检测CYP81F2 (AT5G57220)所用引物为:CYP8F 和 CYP8R。
[0098]检测FRKl (AT2G19190)所用引物为:FRK1F 和 FRK1R。
[0099]拟南芥的UBI基因作为内参，所用引物为:UBIF和UBIR(参考Jaouannet et al.，2013)。
[0100]所述几对引物的序列如下:
引物 WRKY3F: GCTGCTATTGCTGGTCACTCC ；
引物 WRKY3R:GGTCTCCTCGTTTGGTTCTTCC ο
[0101]引物WRKY2F:ATCCAACGGATCAAGAGCTG ；
引物 WRKY2R:GCGTCCGACAACAGATTCTC ο
[0102]引物CYP8F: GTGAAAGCACTAGGCGAAGC ；
引物 CYP8R:ATCCGTTCCAGCTAGCATCA。
[0103]引物FRKlF:TGCAGCGCAAGGACTAGAG ；
引物 FRKlR:ATCTTCGCTTGGAGCTTCT C。
[0104]引物UBIF:GCCAAAGCTGTGGAGAAAAG ；
引物 UBIR: TGTTTAGGCGGAACGGATAC ο
[0105](2)结果显示，上述与植物防卫反应相关的关键基因在受到PAMPs FLG22刺激前后表达量具有很大的差别。
[0106]与预期类似，在野生型的拟南芥中10 μΜ FLG22可以强烈的诱导上述关键基因的表达，相反，在表达的转基因拟南芥中这些关键基因就没有受到诱导或者诱导后表达量增加的较少，在调查的基因中，转基因系诱导后的表达量比野生型低10?50%(如附图12和13所示)。例如，关键基因在野生型中受到诱导后基因表达量增加2000%，但在转基因系中，受到诱导后表达量平均最高只增加了 1000%(如附图12A所示)。MXTJJ基因的情况类似，在野生型中受到FLG22诱导后表达量增加了 600%，但在转基因T01-02、T02-08和Τ05-01系中，该基因受到诱导后表达量只增加了 200?300%(如附图13D所示)，显著的低于对照的野生型。
[0107]2、ROS生成量的检测
(I)方法参考Segonzac (2011)所述进行，具体如下:
培养含有pMD 1-111-HA载体和pMD 1-HA载体(pMD 1-111-HA载体和pMD 1-HA载体由美国康奈尔大学王晓红线虫研宄室提供)的农杆菌C58，第2d离心收集菌体，用2-(N-吗啉)乙磺酸(MES，1mM,pH5.5)清洗3次后，定容至OD6tltl=0.3，加入终浓度为ΙΟΟμΜ的乙酰丁香酮，室温孵育4h ;然后注射到3周苗龄的烟草叶片(Λ知中，对照为将含有pMDl-HA载体的农杆菌C58注射到烟草中，其他条件同实验组；48h后，用打孔器取叶盘，并把叶盘置于微孔板中(每孔先加入200μ?灭菌超纯水)，叶面向上，盖上保鲜膜后静置16h ;用排枪吸干净孔里面的水分后，向每个孔中加入10PL ROS反应液，反应液配置按如下进行(每8孔需要的量):灭菌超纯水，ImL ；Luminol, 2M-L ；Horseradish peroxidase, 2M-L ;FLG22，IM-L0 接着把微孔板置于酶标仪中进行检测，测定荧光反应的强度。
[0108](2)结果如附图14所示。植物在受到FLG22刺激后，对照组在处理后约7min时荧光强度增加率明显增高，而实验组则在处理Smin后荧光强度增加率开始升高，而且对照组在处理后约15min荧光读数最大为30000，而实验组荧光读数在约18min最大为15000，明显小于对照组。由于在luminol-based assay的测定方法中，焚光强度与体系中ROS的含量成正比，因此可见，在植物中表达MJ-TTL蛋白可以抑制寄主ROS爆发的产生。又由于ROS爆发是植物对病原物产生PTI反应的标志事件之一，因此可以得出结论:MJ-TTL蛋白能抑制拟南芥的PTI反应。
[0109]3、测定过表达的拟南芥体内H2O2与野生型拟南芥之间含量的差异，结果显示，在野生型拟南芥根部H2O2的含量为9 μ g/g (鲜重)，而在转基因的拟南芥根部H 202的含量为I?6 μ g/g (鲜重)，H2O2的含量比野生型的低30?89% (如附图15所示)。结果表明了，在植物体内，TTL与FTRc相互作用后，会增加FTRc的活性从而促进植物体内ROS的降解。
[0110]4、另外通过H2O2的体外降解实验进一步确定TTL蛋白的作用是加速植物中ROS的降解速度。把10ng纯化的MJ-TTL蛋白与从拟南芥中提取的粗蛋白混合后，加入到含有80 yg H2O2的溶液中，然后置于22°C条件下反应，在O、5、10、15min分别取样测定溶液中H2O2的量。作为对照，提取蛋白的Buffer和pET28a蛋白分别与拟南芥粗蛋白进行混合后加入到相同的H2O2的溶液中，其他处理与实验组相同。
[0111]结果显不，在Omin时各组处理的H2O2的含量相差不大。而处理后在5、10、15min时，只加了提取buffer (EXbuffer组)和含有提取buffer+纯化TTL蛋白(EX buffer+TTL组)的处理H2O2的含量基本在80 μ g，说明H2O2在该处理条件下比较稳定，不会自发的降解。加拟南芥粗蛋白或对照蛋白的(AT和AT+PET28)的处理H2O2的含量随着时间的增加逐步的下降，说明了拟南芥的粗蛋白中含有能降解H2O2的的酶类。而在加入TTL和拟南芥粗蛋白混合物的处理中(AT+TTL)，H2O2的含量也是随着时间的增加逐步下降，但是下降的速度明显的快于AT+EP buffer和AT+PET28两种处理，在处理后15min，加入TTL蛋白的处理H2O2的含量大约为O?3 μ g，而AT和AT+PET28两种处理H2O2的含量大约为40 μ g，显著的高于加入TTL的组别。这表示了，往野生型拟南芥总蛋白中加入纯化的MJ-TTL蛋白后，混合蛋白对H2O2的降解速度增加了(如附图16所示)。
[0112]综上所述，基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，并被分泌到寄主组织中，通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了 ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性，为抗线虫品种植物的培育提供了新靶标。Mj-t?7基因是一个非常好的构建培育抗根结线虫作物的靶标基因。
【主权项】
1.一种爪哇根结线虫效应基因Mj-Ul,其特征在于，所述效应基因DNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0:l所示；效应基因#J.-??7的cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.一种权利要求1所述效应基因编码的蛋白MJ-TTL，其特征在于，所述蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种重组载体，其特征在于，由基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为PTRV2或pCambial300o5.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述重组载体。6.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因或权利要求2所述蛋白MJ-TTL在提高植物抗根结线虫能力中的应用。7.权利要求1所述爪哇根结线虫效应基因在构建抗根结线虫植物中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用的具体步骤为: 51.重组表达载体pTRV2-ttl构建: SI 1.使用TRIZOL法提取爪哇根结线虫RNAJf RNA反转录为cDNA ； 512.使用引物ttlFRnaiSac和ttlRRnaiXba进行PCR扩增，将得到的PCR产物纯化回收，使用限制性内切酶Sac I和Xba I进行酶切，并纯化回收； 513.同时使用限制性内切酶SacI和Xba I酶切载体pTRV2，并纯化回收； 514.将S12和S13得到的产物进行连接，获得重组表达载体pTRV2-ttl;重组表达载体pTRV2-ttl的骨架为pTRV2，在骨架载体Sac I和Xba I酶切位点之间插入了基因Mj-Ul的双链DNA片段； 52.将载体pTRVl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌A;将重组表达载体pTRV2-ttl转染根癌农杆菌EHA105得到重组农杆菌B ;以pTRV2空载体作对照； 53.将番茄夏红一号种子进行表面消毒后播种到灭菌的沙壤土中，14天后，幼苗长出第4或第5片真叶；将重组农杆菌A、B使用0.0lM KH2PO4重悬浮并混合后接种到幼苗的根部，生长14天后取新长出的叶片，利用引物pTRVCPF和pTRVCPR进行PCR检测TRV病毒是否表达，成功表达TRV病毒的植株即为RNAi沉默转基因植物； 引物ttlFRnaiSac的序列如SEQ ID NO: 19所示，引物ttlRRnaiXba的序列如SEQ IDNO:20所示； 引物pTRVCPF的序列如SEQ ID NO:21所示，引物pTRVCPR的序列如SEQ ID NO:22所不O9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，S12所述PCR扩增的程序为95°C2min ；95°C10s,60°C 15s,68°C lmin，30 个循环。10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，S14所述DNA片段的序列为基因Mj-ttmcDNA 序列的 79 ?428bp，如 SEQ ID NO:4 所示。
【专利摘要】本发明公开了一种爪哇根结线虫效应基因Mj-ttl，编码蛋白及其应用，属于生物基因工程技术领域。所述效应基因Mj-ttl的序列如SEQ ID NO：1～2所示，其编码蛋白MJ-TTL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明明确了Mj-ttl基因特异的在根结线虫亚腹食道腺中表达，是爪哇根结线虫的效应蛋白，通过与植物中FTRc相互作用，增强植株对ROS的降解能力，抑制了ROS在线虫侵染初期在植物细胞内的积累，进而抑制了植物PTI反应的发生，从而使植物对爪哇根结线虫表现出更高的感病性。本发明为抗线虫品种植物的培育提供了新靶标，对实践中培育抗根结线虫作物具有很好的理论和指导意义。
【IPC分类】C12N15/12, C07K14/435, C12N1/21, A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN104894138
【申请号】CN201510207786
【发明人】廖金铃, 林柏荣, 卓侃
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月28日
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