一种改造后的犬α1-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法
一种改造后的犬α1-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域。更具体地，涉及一种改造后的犬α 1-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]干扰素(IFN)是在特定的诱导剂作用下，由细胞产生的一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，当它再次作用于其他细胞可以使其立即获得抗病毒，抗肿瘤等多方面的免疫力。大量体外和体内试验表明，犬α 1-干扰素对生产中具重大威胁的病毒传染病均具有防御和抑制作用。干扰素以其作用广泛、残留小等特点，有较广阔的应用前景。但是由于干扰素成本价格高和动物经济价值的问题，在兽医临床的应用还主要局限于宠物疾病的治疗，在产业动物的治疗主要局限在试验阶段，而且主要辅助治疗病毒病和寄生虫病。因此，犬α 1-干扰素的高效表达以及成本的降低意义重大。
[0003]目前，利用酵母和大肠杆菌表达干扰素的工作取得了一些成果，例如专利申请号200310109820.6公开了一种含大肠杆菌偏嗜密码子的猪α -干扰素。本发明人课题组前期的专利申请200810027952.7公开了一种经修饰的猪α -干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法，对于猪α-干扰素的制备取得了较好的成果。
[0004]虽然，利用酵母表达干扰素的工作取得了一些成果，但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因(基因的序列和性质等具有差别)，如何修饰干扰素基因，致使其与酵母的偏嗜性匹配，以提高干扰素的表达量；表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以及活性的测定等均有较大的差异，没有形成一个稳定的、完整的技术方案，不利于发展犬α 1-干扰素的工业化生产，不能从根本上解决犬α 1-干扰素的成本问题，影响其推广应用。
[0005]为了提高犬α 1-干扰素在毕赤酵母中的表达水平，降低生产成本，形成工业化生产条件，有必要探索一种针对犬α 1-干扰素基因进行修饰、确定修饰位点、修饰数量的方法，有必要对其诱导表达的关键条件进行改进和优化设置。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有犬α 1-干扰素制备技术的缺陷和不足，提供一种经修饰的可与毕赤酵母匹配的犬α 1-干扰素基因、建立一种可在毕赤酵母中稳定、高效表达犬α 1-干扰素的技术方法，为企业化生产犬α 1-干扰素，提高生产效率、降低生产成本奠定技术基础。
[0007]鉴于密码子的兼并性和酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，本发明对犬α 1-干扰素基因的14种关健密码子进行了修饰，使其能满足酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，但并没有改变干扰素蛋白的氨基酸和氨基酸的排列顺序，从而大大地提高了该基因在毕赤酵母中的表达水来。本发明对犬α 1-对干扰素的表达条件进行了优化，其中包括溶氧量的控制，减少污染的措施，甲醇的添加时间和添加量，诱导表达的温度和收获蛋白的时间，蛋白含量的测定方法，蛋白活性的测定扩大培养条件等。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种经修饰改造的犬α 1-干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]具体地，上述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因是对犬α 1_干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰后得到，所述14个关键密码子为Cys、Pro、Leu、Thr、Gly、Val、Gin、Ala、Ser、Asn、Phe、Asp、Lys 和 Arg 对应的密码子。
[0010]更具体地，所述14个关键密码子为为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子⑶C，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU。
[0011]一种犬α 1-干扰素表达载体，其构建使用了分泌型的表达载体PPICZa C，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOXl启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
[0012]其中，所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由Iys-Arg -Glu-Ala- Glu-Ala氨基酸序列组成，Iys-ArgC端由膜结合蛋白酶ΚΕΧ2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。
[0013]一种上述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质(即犬α 1_干扰素)的制备方法，包括以下步骤:
51.根据犬α1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；所述引物序列如下:
上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ；
下游引物 P2:5’_ GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’ ；
上游引物Pl在其3’端加入了&…I限制性内切酶位点，下游引物Ρ2在其5’端加入了 Xba I限制性内切酶位点；并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G ；
犬α 1-干扰素基因测序正确后，对犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行修饰改造，改造的位点主要是:为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子CUC，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU ；
本发明参照酵母密码子偏爱性改造去除信号肽后的犬α 1-干扰素密码子，首先确保编码蛋白的氨基酸不会改变，在此基础上选择酵母表达系统偏爱的密码子，将原稀有密码子替换，同时考虑Α+Τ含量和G+C含量，两者过高或过低都会降低蛋白翻译效率甚至导致蛋白表达，而且不能出现提前终止的序列，综合考虑各方面因素合理的对原基因成功进行了修饰；
52.将经修饰的犬α1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验； 53.收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；
54.测定蛋白的含量及活性。
[0014]其中，步骤S2包括以下步骤:
521.用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5 ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，细胞处于对数生长期；
522.将步骤S21获得的细胞在3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5 ml的BMMY培养基中，控制溶氧量和防止污染，在15 ml的试管中继续振荡培养；所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY、采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5?20% ；
523.每间隔24h加入100%甲醇至终浓度为1%，加入量为每毫升BMMY培养基加10微升，进行诱导培养。
[0015]步骤S2所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，所述镜检是直接涂片镜检或用复红染色镜检。
[0016]步骤S3所述收获蛋白为培养96?120h后室温下1500?3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存；步骤S3所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。
[0017]由述制备方法制备得到的经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质，即犬α 1-干扰素，也在本发明的保护范围之内。
[0018]本发明对溶氧量的控制和减少污染的措施，是在实验表达过程中，不断摸索在保证酵母不受污染的情况下如何能更好地保持酵母的通气的前提下，通过采用四层干净纱布外加两层报纸包裹摇瓶口或试管口，既保证了通气性又保证了酵母不受污染。在摇床使用过程中还需经常进行酒精喷雾消毒以尽可能保证外界环境的无菌。同时，培养基的体积只能占培养器皿的5?20%，最高不能超过20%。
[0019]本发明对无菌检验的方法的改进包括:蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，乳白色是酵母菌正常的颜色；在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，可以直接涂片镜检，也可以用复红染色镜检。在显微镜下，没有染色的酵母菌是白色圆型的菌体，染色的酵母菌是红色圆型的菌体，没有其它形态的菌体出现，这说明培养的酵母菌没有污染。收获过程中闻酵母发酵的味道，甜的是没有污染的，如果出现很臭的味道，并且菌液颜色是暗黑的，则说明在培养过程中污染了大肠杆菌；用SDS-PAGE进行检测，干扰素蛋白只有I条20KD左右的条带，如果污染了除了目的条带之外还会出现很多其它的蛋白条带。 [0020]本发明对甲醇的添加时间和添加量的控制是，每间隔24h加一次甲醇，加100%甲醇至终浓度为1%，即每毫升加10 μ I。
[0021]本发明对诱导表达的温度和收获蛋白的时间的改进，为28?30°C震荡培养96?120h就可以收获蛋白，蛋白收获的方法是室温下1500?3000转/min离心5min收集上清，弃菌体。这样减少了培养时间相应的减少生产成本；本发明对蛋白含量的测定方法为，采用分光光度计根据吸光值计算，计算公式为:
蛋白质浓度(mg/mL) = (l.55XA280nm-0.76XA260nm) X 稀释倍数。
[0022]本发明对蛋白活性的测定采用细胞病变抑制法测定，参照现有技术进行。
[0023]本发明对扩大培养条件进行改进，挑选合适的培养容器，按照1:50?1: 100的比例稀释，相应扩大甲醇的添加量，提高震荡培养的速度。具体的改进如下:
在扩大培养表达的过程中按照1:50?1: 100的比例进行诱导表达，即挑5?6个菌落在55?65 ml BMGY中激活，30°C 200转/min震荡培养16?18 h，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，少量的甘油不会影响蛋白的表达，并且减少一次离心，减少污染的几率。为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，稀释之后甲醇的添加量仍然按照小量诱导表达的添加量，即每间隔24h加一次甲醇，加100%甲醇至终浓度为0.5?1%，即每毫升加5?10 μ I ;诱导过程中容器的选择，不能使用容量过大的三角瓶，如果超过2L则加大操作的难度以及增加污染的几率，因此，扩大培养使用IL的三角瓶，培养体积为500 ml左右，30°C 300转/min震荡培养96?120h收获蛋白。虽然菌体培养基体积为容器总容积的50%，但是因为接种的比例为1:50?1:100，所以仍然能够满足表达需要的溶氧量，收获的蛋白活性可以达到16 U/mlo
[0024]本发明具有以下有益效果:
(I)本发明针对犬α 1-干扰素基因，解决了如何对其序列进行合理的修饰改造，主要涉及犬α 1-干扰素密码子对酵母密码子偏嗜性的匹配、改造，实现了 α 1-干扰素基因序列的毕赤酵母高效表达。
[0025](2)本发明解决了避免污染的措施、添加甲醇的时间以及添加甲醇的量、对蛋白表达时间的控制、高效生产犬α 1-干扰素的培养方法、即蛋白收获时间、无菌检验、蛋白含量以及活性测定、扩大培养条件等关键技术，从而使犬α 1-干扰素在毕赤酵母中得到稳定高效的表达，干扰素的抗病毒活性提高了 300倍。
[0026](3)本发明表达的犬α 1-干扰素对犬病毒性传染病有显著的治疗作用。
[0027](4)本发明方法简单易行，成本较低，具备了在生产中广泛使用的基础，有着广阔的市场前景。
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施中表达载体的多克隆位点示意图，参考Invitrogen的毕赤酵母操作手册(www.1nvitrogen.com)。
[0029]图2为本发明实施中表达载体的物理图谱，参考Invitrogen的毕赤酵母操作手册(www.1nvitrogen.com)。
[0030]图3为本发明实施中犬α 1-干扰素基因毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果。
[0031]图4为本发明实施例犬α1-对干扰素基因毕赤酵母表达产物的Western-blotting 分析结果。
【具体实施方式】
[0032]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0033]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0034]实施例1
1、根据犬α 1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；
本发明参照文献(Gurkan C，2005 ;赵翔，2000)分析巴斯德毕赤酵母表达系统对密码子的偏嗜性，将Genbank中公布的(Α33693)犬α I干扰素的全基因序列进行偏嗜性改造，同时在上下游分别添加EcoR I和Xba I酶切位点(下划线部分)及保护碱基，并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G。改造基因由上海生物工程有限公司全基因合成，并将改造后的犬α 1-干扰素基因插入质粒pUC57的多克隆位点，重组质粒命名为pUC57-CaIFN_a I。根据改造后犬a I干扰素的核苷酸序列，设计一对引物并合成:
所述引物序列如下:
上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ；
下游引物 P2:5’ - GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’。
[0035]根据Genbank公布的犬α 1-干扰素基因序列(Α33693)显示，犬α I干扰素全基因为564 bp，编码187个氨基酸，其中N端前23个氨基酸为信号肽，成熟蛋白含164个氨基酸。参照酵母密码子偏爱性改造去除信号肽后的犬α 1-干扰素密码子，首先确保编码蛋白的氨基酸不会改变，在此基础上选择酵母表达系统偏爱的密码子，将原稀有密码子替换，同时考虑Α+Τ含量和G+C含量，两者过高或过低都会降低蛋白翻译效率甚至导致蛋白表达，而且不能出现提前终止的序列，综合考虑各方面因素合理的对原基因成功进行了修饰，其中涉及到 Cys Pro Leu Thr Gly Val Gln Ala Ser Asn Phe Asp Lys Argl4 种氨基酸密码子的改造。
[0036]改造后的犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其编码氨基酸的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0037]2、将改造后的犬α 1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验；
具体步骤如下:
(a)用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5 ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，此时细胞处于对数生长期。
[0038](b) 3000转/min室温离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5 ml的BMMY中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在15 ml的试管中振荡培养。
[0039](c)每间隔24 h加入100%甲醇至终浓度为1%，进行诱导培养。
[0040](3)收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；
(c)步骤培养96?120h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存。
[0041]3、本实施例犬α 1-干扰素基因毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果如附图3所示。其中M为预染Marker，I为pPICZ a C -1FN转化的重组酵母，2为pPICZ a C空载体表达。
[0042]4、测定蛋白的含量及活性
(O制胶与跑胶:参照《蛋白质技术手册》(汪家政等，2000)进行。
[0043]I)配制12%分离胶，10.01毫升:
30%丙烯酰胺贮存液 4.0 mL 4 X分离胶缓冲液2.5 mL
10%过硫酸铵100 UL
TEMED10 μ L
双蒸水3.4 mL。
[0044]在安装好的玻璃平板中，缓缓加入分离胶溶液至距离玻璃板顶端约1.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1.0cm的水层，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用，约30min凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水冲洗凝胶上部几次后用滤纸尽可能吸干凝胶顶端的水。
[0045]2 )灌制 4% 浓缩胶，4.008ml:
30%丙烯酰胺贮存液 0.54 mL 4 X浓缩胶缓冲液LOmL
10%过硫酸铵80 μ L
TEMED8 μ L
双蒸水2.38 mL。
[0046]缓缓加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，快速插入梳子，避免产生气泡，约30 min浓缩胶聚合后，小心拔出梳子。加入适量Tris-甘氨酸电泳缓冲液，上样前用电泳缓冲液冲洗梳子孔。组装好电泳设备，将蛋白样品与2X样品缓冲液(1yL +10 μ L)在一个Eppendorf管中混合，用移液器小心加入样品孔中。接通电源，恒压电泳:堆积胶阶段120V，分离胶阶段150V，直至染料前沿迀移至凝胶底部。
[0047](2)染色与脱色:
电泳完毕后，小心剥离电泳胶，用至少5倍凝胶体积的考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色摇床上缓慢振摇I h，取出凝胶在水中漂洗数次，再用考马斯亮蓝脱色液中脱色lh，为了脱色完全，其间需更换脱色液2?3次。蛋白条带清晰后，观察结果。如果在相应分子量处只有I条蛋白条带，说明干扰素蛋白得到表达，并且没有污染；如果在目的条带以外还有其它蛋白条带，说明干扰素蛋白污染了，那么这些蛋白就不能使用了，使用的话也没有效果，只会增加对畜体的刺激。
[0048]本实施例犬α 1-对干扰素基因毕赤酵母表达产物的Wes tern-blotting分析结果如附图4所示，其中M为预染Marker，l为pPICZαC-1FN转化的重组酵母，2为pPICZαC转化的酵母。
[0049](3)蛋白含量的测定
蛋白浓度测定:将待测蛋白溶液适当稀释，用GeneRAY
UV-Photometer核酸蛋白质分光光度计上分别测出波长A260nm和A280nm处的值，根据以下公式计算蛋白浓度:
蛋白质浓度(mg/mL) = (l.55XA280nm-0.76XA260nm) X 稀释倍数，
(4)活性的检测具体步骤如下:
I)铺板:弃去Vero细胞培养瓶中的培养液，用胰酶消化收集细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL，37°C、5% C02条件下培养过夜，使细胞贴壁为单层。
[0050]2 )制备干扰素溶液:取表达上清经青霉素、氯霉素室温处理半小时后，接种于无任何抗生素的LB培养液中，作无菌检验。检验合格后用细胞维持液作连续4倍梯度稀释。
[0051]3)加样:取预先培养好的Ve1 96孔细胞培养板，将不同稀释度的干扰素样品移入96孔细胞培养板，每孔100 μ Lo每个浓度作6个重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。37°C、5%C02条件下培养过夜。
[0052]4)制备病毒液:攻毒剂量100 μ L TCID50，取保存的VSV用细胞维持液稀释至工作浓度。
[0053]5)攻毒:弃去Veix)96孔细胞培养板培养液，甩干，加入工作浓度的病毒液，每孔10yLo细胞对照孔不加病毒液。37°C、5% C02条件下培养约24 h至36 h。
[0054]6)细胞病变判定:待病毒对照孔出现完全细胞病变时，判断结果，并根据细胞的病变程度，按5分级制进行打分，记录不同浓度时的保护性。
[0055]细胞病变的保护程度划为5等分:
4:无明显的细胞病变
3:细胞病变在25%左右 2:有约50%的细胞病变
1:细胞病变在75%左右
O:有100%病变。
[0056]7)结果计算:根据Reed-Muench法计算。50%细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为I个干扰素单位。
[0057](5)扩大培养
(a)用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的5个单菌落，挑于5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，300C，200转/min振荡培养16?18 h，至0D600=2?6，此时细胞处于对数生长期。
[0058](b)在无菌条件下，将未经离心的含有菌体的5毫升BMGY液体培养基，直接加入到500ml BMMY中，瓶口用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在IL的三角瓶中300转/min振荡培养。
[0059](c)每间隔24h加入100%甲醇至终浓度为1%，进行诱导培养，即500 ml BMMY中添加甲醇10 ml O
[0060](d)培养至96h收集蛋白，放置于4°C冰箱备用。
[0061](6)密码子改造之后的干扰素含量测定
电泳后，用薄层扫描仪对干扰素蛋白区带进行扫描，然后与Bradford蛋白总量测定的方法结合。
[0062]结果表明，基因修饰后，犬α I干扰素融合蛋白的含量为0.453 mg/mL，与没有经过改造的菌株表达量0.08mg/mL比较，干扰素的蛋白含量有了明显的提高。
【主权项】
1.一种经修饰改造的犬α 1-干扰素基因，其特征在于，修饰改造后的犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.根据权利要求1所述经修饰改造的犬α1-干扰素基因，其特征在于，对犬α?-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰，所述14个关键密码子为Cys、Pr0、Leu、Thr、Gly、Val、Gin、Ala、Ser、Asn、Phe、Asp、Lys 和 Arg 对应的密码子。3.根据权利要求1所述经修饰改造的犬α1-干扰素基因，其特征在于，对犬α?-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰，所述14个关键密码子为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子⑶C，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU。4.一种犬α 1-干扰素表达载体，其特征在于，其构建使用了分泌型的表达载体pPICZaC，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOXl启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。5.根据权利要求3所述犬α1-干扰素表达载体，其特征在于，所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由Iys-Arg -Glu-Ala- Glu-Ala氨基酸序列组成，Iys-ArgC端由膜结合蛋白酶ΚΕΧ2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。6.一种权利要求1所述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.根据犬α1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；所述引物序列如下:上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ； 下游引物 P2:5’_ GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’ ； 在上游引物Pl的3’端加入了 EcoR I限制性内切酶位点，在下游引物Ρ2的5’端加入了 Xba I限制性内切酶位点；并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G ； 犬α 1-干扰素基因测序正确后，对犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行修饰改造，改造的位点主要是:Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子CUC，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU ； 52.将经修饰的犬α1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验； 53.收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验； 54.测定蛋白的含量及活性。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤: 521.用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，细胞处于对数生长期； 522.将步骤S21获得的细胞在3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于BMMY培养基中，控制溶氧量和防止污染，在试管中继续振荡培养，所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY及采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5?20% ； S23.每间隔24 h加入100%甲醇至终浓度为1%，加入量为每毫升BMMY培养基加10微升，进行诱导培养。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，所述镜检是直接涂片镜检或用复红染色镜检。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述收获蛋白为培养96?120h后室温下1500?3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存；步骤S3所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。10.一种由权利要求6所述制备方法制备得到的经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质。
【专利摘要】本发明公开了一种经修饰改造的犬α1-干扰素基因及犬α1-干扰素的制备方法。修饰改造后的犬α1-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明具体涉及犬α1-干扰素密码子对酵母密码子偏嗜性的匹配、改造，高效生产犬α1-干扰素的培养方法、避免污染的措施、确定加甲醇的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验、蛋白含量以及活性测定、扩大培养条件等操作方法的优化控制，本发明方法简单易行，成本较低，实现了犬α1-干扰素在毕赤酵母中稳定高效的表达，表达的犬α1-干扰素对犬病毒性传染病有显著的疗效，可以增强狂犬疫苗的免疫效果。
【IPC分类】C12N15/21, C12N1/19, C07K14/56, C12N15/81
【公开号】CN104894139
【申请号】CN201510264937
【发明人】郭霄峰, 杨谦, 王玉, 彭娇娇
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域。更具体地，涉及一种改造后的犬α 1-干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]干扰素(IFN)是在特定的诱导剂作用下，由细胞产生的一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，当它再次作用于其他细胞可以使其立即获得抗病毒，抗肿瘤等多方面的免疫力。大量体外和体内试验表明，犬α 1-干扰素对生产中具重大威胁的病毒传染病均具有防御和抑制作用。干扰素以其作用广泛、残留小等特点，有较广阔的应用前景。但是由于干扰素成本价格高和动物经济价值的问题，在兽医临床的应用还主要局限于宠物疾病的治疗，在产业动物的治疗主要局限在试验阶段，而且主要辅助治疗病毒病和寄生虫病。因此，犬α 1-干扰素的高效表达以及成本的降低意义重大。
[0003]目前，利用酵母和大肠杆菌表达干扰素的工作取得了一些成果，例如专利申请号200310109820.6公开了一种含大肠杆菌偏嗜密码子的猪α -干扰素。本发明人课题组前期的专利申请200810027952.7公开了一种经修饰的猪α -干扰素基因、表达载体的构建及其蛋白的制备方法，对于猪α-干扰素的制备取得了较好的成果。
[0004]虽然，利用酵母表达干扰素的工作取得了一些成果，但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因(基因的序列和性质等具有差别)，如何修饰干扰素基因，致使其与酵母的偏嗜性匹配，以提高干扰素的表达量；表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以及活性的测定等均有较大的差异，没有形成一个稳定的、完整的技术方案，不利于发展犬α 1-干扰素的工业化生产，不能从根本上解决犬α 1-干扰素的成本问题，影响其推广应用。
[0005]为了提高犬α 1-干扰素在毕赤酵母中的表达水平，降低生产成本，形成工业化生产条件，有必要探索一种针对犬α 1-干扰素基因进行修饰、确定修饰位点、修饰数量的方法，有必要对其诱导表达的关键条件进行改进和优化设置。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有犬α 1-干扰素制备技术的缺陷和不足，提供一种经修饰的可与毕赤酵母匹配的犬α 1-干扰素基因、建立一种可在毕赤酵母中稳定、高效表达犬α 1-干扰素的技术方法，为企业化生产犬α 1-干扰素，提高生产效率、降低生产成本奠定技术基础。
[0007]鉴于密码子的兼并性和酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，本发明对犬α 1-干扰素基因的14种关健密码子进行了修饰，使其能满足酵母菌对氨基酸密码子的偏嗜性，但并没有改变干扰素蛋白的氨基酸和氨基酸的排列顺序，从而大大地提高了该基因在毕赤酵母中的表达水来。本发明对犬α 1-对干扰素的表达条件进行了优化，其中包括溶氧量的控制，减少污染的措施，甲醇的添加时间和添加量，诱导表达的温度和收获蛋白的时间，蛋白含量的测定方法，蛋白活性的测定扩大培养条件等。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种经修饰改造的犬α 1-干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]具体地，上述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因是对犬α 1_干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰后得到，所述14个关键密码子为Cys、Pro、Leu、Thr、Gly、Val、Gin、Ala、Ser、Asn、Phe、Asp、Lys 和 Arg 对应的密码子。
[0010]更具体地，所述14个关键密码子为为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子⑶C，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU。
[0011]一种犬α 1-干扰素表达载体，其构建使用了分泌型的表达载体PPICZa C，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOXl启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
[0012]其中，所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由Iys-Arg -Glu-Ala- Glu-Ala氨基酸序列组成，Iys-ArgC端由膜结合蛋白酶ΚΕΧ2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。
[0013]一种上述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质(即犬α 1_干扰素)的制备方法，包括以下步骤:
51.根据犬α1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；所述引物序列如下:
上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ；
下游引物 P2:5’_ GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’ ；
上游引物Pl在其3’端加入了&…I限制性内切酶位点，下游引物Ρ2在其5’端加入了 Xba I限制性内切酶位点；并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G ；
犬α 1-干扰素基因测序正确后，对犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行修饰改造，改造的位点主要是:为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子CUC，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU ；
本发明参照酵母密码子偏爱性改造去除信号肽后的犬α 1-干扰素密码子，首先确保编码蛋白的氨基酸不会改变，在此基础上选择酵母表达系统偏爱的密码子，将原稀有密码子替换，同时考虑Α+Τ含量和G+C含量，两者过高或过低都会降低蛋白翻译效率甚至导致蛋白表达，而且不能出现提前终止的序列，综合考虑各方面因素合理的对原基因成功进行了修饰；
52.将经修饰的犬α1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验； 53.收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；
54.测定蛋白的含量及活性。
[0014]其中，步骤S2包括以下步骤:
521.用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5 ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，细胞处于对数生长期；
522.将步骤S21获得的细胞在3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5 ml的BMMY培养基中，控制溶氧量和防止污染，在15 ml的试管中继续振荡培养；所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY、采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5?20% ；
523.每间隔24h加入100%甲醇至终浓度为1%，加入量为每毫升BMMY培养基加10微升，进行诱导培养。
[0015]步骤S2所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，所述镜检是直接涂片镜检或用复红染色镜检。
[0016]步骤S3所述收获蛋白为培养96?120h后室温下1500?3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存；步骤S3所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。
[0017]由述制备方法制备得到的经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质，即犬α 1-干扰素，也在本发明的保护范围之内。
[0018]本发明对溶氧量的控制和减少污染的措施，是在实验表达过程中，不断摸索在保证酵母不受污染的情况下如何能更好地保持酵母的通气的前提下，通过采用四层干净纱布外加两层报纸包裹摇瓶口或试管口，既保证了通气性又保证了酵母不受污染。在摇床使用过程中还需经常进行酒精喷雾消毒以尽可能保证外界环境的无菌。同时，培养基的体积只能占培养器皿的5?20%，最高不能超过20%。
[0019]本发明对无菌检验的方法的改进包括:蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，乳白色是酵母菌正常的颜色；在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，可以直接涂片镜检，也可以用复红染色镜检。在显微镜下，没有染色的酵母菌是白色圆型的菌体，染色的酵母菌是红色圆型的菌体，没有其它形态的菌体出现，这说明培养的酵母菌没有污染。收获过程中闻酵母发酵的味道，甜的是没有污染的，如果出现很臭的味道，并且菌液颜色是暗黑的，则说明在培养过程中污染了大肠杆菌；用SDS-PAGE进行检测，干扰素蛋白只有I条20KD左右的条带，如果污染了除了目的条带之外还会出现很多其它的蛋白条带。 [0020]本发明对甲醇的添加时间和添加量的控制是，每间隔24h加一次甲醇，加100%甲醇至终浓度为1%，即每毫升加10 μ I。
[0021]本发明对诱导表达的温度和收获蛋白的时间的改进，为28?30°C震荡培养96?120h就可以收获蛋白，蛋白收获的方法是室温下1500?3000转/min离心5min收集上清，弃菌体。这样减少了培养时间相应的减少生产成本；本发明对蛋白含量的测定方法为，采用分光光度计根据吸光值计算，计算公式为:
蛋白质浓度(mg/mL) = (l.55XA280nm-0.76XA260nm) X 稀释倍数。
[0022]本发明对蛋白活性的测定采用细胞病变抑制法测定，参照现有技术进行。
[0023]本发明对扩大培养条件进行改进，挑选合适的培养容器，按照1:50?1: 100的比例稀释，相应扩大甲醇的添加量，提高震荡培养的速度。具体的改进如下:
在扩大培养表达的过程中按照1:50?1: 100的比例进行诱导表达，即挑5?6个菌落在55?65 ml BMGY中激活，30°C 200转/min震荡培养16?18 h，然后直接将激活培养的菌体和BMGY培养基加入到BMMY中加甲醇进行诱导表达，少量的甘油不会影响蛋白的表达，并且减少一次离心，减少污染的几率。为了保证足够的溶氧量要控制甲醇的添加量，稀释之后甲醇的添加量仍然按照小量诱导表达的添加量，即每间隔24h加一次甲醇，加100%甲醇至终浓度为0.5?1%，即每毫升加5?10 μ I ;诱导过程中容器的选择，不能使用容量过大的三角瓶，如果超过2L则加大操作的难度以及增加污染的几率，因此，扩大培养使用IL的三角瓶，培养体积为500 ml左右，30°C 300转/min震荡培养96?120h收获蛋白。虽然菌体培养基体积为容器总容积的50%，但是因为接种的比例为1:50?1:100，所以仍然能够满足表达需要的溶氧量，收获的蛋白活性可以达到16 U/mlo
[0024]本发明具有以下有益效果:
(I)本发明针对犬α 1-干扰素基因，解决了如何对其序列进行合理的修饰改造，主要涉及犬α 1-干扰素密码子对酵母密码子偏嗜性的匹配、改造，实现了 α 1-干扰素基因序列的毕赤酵母高效表达。
[0025](2)本发明解决了避免污染的措施、添加甲醇的时间以及添加甲醇的量、对蛋白表达时间的控制、高效生产犬α 1-干扰素的培养方法、即蛋白收获时间、无菌检验、蛋白含量以及活性测定、扩大培养条件等关键技术，从而使犬α 1-干扰素在毕赤酵母中得到稳定高效的表达，干扰素的抗病毒活性提高了 300倍。
[0026](3)本发明表达的犬α 1-干扰素对犬病毒性传染病有显著的治疗作用。
[0027](4)本发明方法简单易行，成本较低，具备了在生产中广泛使用的基础，有着广阔的市场前景。
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施中表达载体的多克隆位点示意图，参考Invitrogen的毕赤酵母操作手册(www.1nvitrogen.com)。
[0029]图2为本发明实施中表达载体的物理图谱，参考Invitrogen的毕赤酵母操作手册(www.1nvitrogen.com)。
[0030]图3为本发明实施中犬α 1-干扰素基因毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果。
[0031]图4为本发明实施例犬α1-对干扰素基因毕赤酵母表达产物的Western-blotting 分析结果。
【具体实施方式】
[0032]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0033]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0034]实施例1
1、根据犬α 1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；
本发明参照文献(Gurkan C，2005 ;赵翔，2000)分析巴斯德毕赤酵母表达系统对密码子的偏嗜性，将Genbank中公布的(Α33693)犬α I干扰素的全基因序列进行偏嗜性改造，同时在上下游分别添加EcoR I和Xba I酶切位点(下划线部分)及保护碱基，并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G。改造基因由上海生物工程有限公司全基因合成，并将改造后的犬α 1-干扰素基因插入质粒pUC57的多克隆位点，重组质粒命名为pUC57-CaIFN_a I。根据改造后犬a I干扰素的核苷酸序列，设计一对引物并合成:
所述引物序列如下:
上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ；
下游引物 P2:5’ - GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’。
[0035]根据Genbank公布的犬α 1-干扰素基因序列(Α33693)显示，犬α I干扰素全基因为564 bp，编码187个氨基酸，其中N端前23个氨基酸为信号肽，成熟蛋白含164个氨基酸。参照酵母密码子偏爱性改造去除信号肽后的犬α 1-干扰素密码子，首先确保编码蛋白的氨基酸不会改变，在此基础上选择酵母表达系统偏爱的密码子，将原稀有密码子替换，同时考虑Α+Τ含量和G+C含量，两者过高或过低都会降低蛋白翻译效率甚至导致蛋白表达，而且不能出现提前终止的序列，综合考虑各方面因素合理的对原基因成功进行了修饰，其中涉及到 Cys Pro Leu Thr Gly Val Gln Ala Ser Asn Phe Asp Lys Argl4 种氨基酸密码子的改造。
[0036]改造后的犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其编码氨基酸的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0037]2、将改造后的犬α 1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验；
具体步骤如下:
(a)用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于1.5 ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，此时细胞处于对数生长期。
[0038](b) 3000转/min室温离心5分钟收集沉淀，重悬于1.5 ml的BMMY中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在15 ml的试管中振荡培养。
[0039](c)每间隔24 h加入100%甲醇至终浓度为1%，进行诱导培养。
[0040](3)收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验；
(c)步骤培养96?120h收集样品，离心，取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存。
[0041]3、本实施例犬α 1-干扰素基因毕赤酵母表达的SDS-PAGE结果如附图3所示。其中M为预染Marker，I为pPICZ a C -1FN转化的重组酵母，2为pPICZ a C空载体表达。
[0042]4、测定蛋白的含量及活性
(O制胶与跑胶:参照《蛋白质技术手册》(汪家政等，2000)进行。
[0043]I)配制12%分离胶，10.01毫升:
30%丙烯酰胺贮存液 4.0 mL 4 X分离胶缓冲液2.5 mL
10%过硫酸铵100 UL
TEMED10 μ L
双蒸水3.4 mL。
[0044]在安装好的玻璃平板中，缓缓加入分离胶溶液至距离玻璃板顶端约1.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1.0cm的水层，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用，约30min凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水冲洗凝胶上部几次后用滤纸尽可能吸干凝胶顶端的水。
[0045]2 )灌制 4% 浓缩胶，4.008ml:
30%丙烯酰胺贮存液 0.54 mL 4 X浓缩胶缓冲液LOmL
10%过硫酸铵80 μ L
TEMED8 μ L
双蒸水2.38 mL。
[0046]缓缓加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，快速插入梳子，避免产生气泡，约30 min浓缩胶聚合后，小心拔出梳子。加入适量Tris-甘氨酸电泳缓冲液，上样前用电泳缓冲液冲洗梳子孔。组装好电泳设备，将蛋白样品与2X样品缓冲液(1yL +10 μ L)在一个Eppendorf管中混合，用移液器小心加入样品孔中。接通电源，恒压电泳:堆积胶阶段120V，分离胶阶段150V，直至染料前沿迀移至凝胶底部。
[0047](2)染色与脱色:
电泳完毕后，小心剥离电泳胶，用至少5倍凝胶体积的考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色摇床上缓慢振摇I h，取出凝胶在水中漂洗数次，再用考马斯亮蓝脱色液中脱色lh，为了脱色完全，其间需更换脱色液2?3次。蛋白条带清晰后，观察结果。如果在相应分子量处只有I条蛋白条带，说明干扰素蛋白得到表达，并且没有污染；如果在目的条带以外还有其它蛋白条带，说明干扰素蛋白污染了，那么这些蛋白就不能使用了，使用的话也没有效果，只会增加对畜体的刺激。
[0048]本实施例犬α 1-对干扰素基因毕赤酵母表达产物的Wes tern-blotting分析结果如附图4所示，其中M为预染Marker，l为pPICZαC-1FN转化的重组酵母，2为pPICZαC转化的酵母。
[0049](3)蛋白含量的测定
蛋白浓度测定:将待测蛋白溶液适当稀释，用GeneRAY
UV-Photometer核酸蛋白质分光光度计上分别测出波长A260nm和A280nm处的值，根据以下公式计算蛋白浓度:
蛋白质浓度(mg/mL) = (l.55XA280nm-0.76XA260nm) X 稀释倍数，
(4)活性的检测具体步骤如下:
I)铺板:弃去Vero细胞培养瓶中的培养液，用胰酶消化收集细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL，37°C、5% C02条件下培养过夜，使细胞贴壁为单层。
[0050]2 )制备干扰素溶液:取表达上清经青霉素、氯霉素室温处理半小时后，接种于无任何抗生素的LB培养液中，作无菌检验。检验合格后用细胞维持液作连续4倍梯度稀释。
[0051]3)加样:取预先培养好的Ve1 96孔细胞培养板，将不同稀释度的干扰素样品移入96孔细胞培养板，每孔100 μ Lo每个浓度作6个重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。37°C、5%C02条件下培养过夜。
[0052]4)制备病毒液:攻毒剂量100 μ L TCID50，取保存的VSV用细胞维持液稀释至工作浓度。
[0053]5)攻毒:弃去Veix)96孔细胞培养板培养液，甩干，加入工作浓度的病毒液，每孔10yLo细胞对照孔不加病毒液。37°C、5% C02条件下培养约24 h至36 h。
[0054]6)细胞病变判定:待病毒对照孔出现完全细胞病变时，判断结果，并根据细胞的病变程度，按5分级制进行打分，记录不同浓度时的保护性。
[0055]细胞病变的保护程度划为5等分:
4:无明显的细胞病变
3:细胞病变在25%左右 2:有约50%的细胞病变
1:细胞病变在75%左右
O:有100%病变。
[0056]7)结果计算:根据Reed-Muench法计算。50%细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为I个干扰素单位。
[0057](5)扩大培养
(a)用灭菌牙签细挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的5个单菌落，挑于5ml的BMGY液体培养基中进行激活培养，300C，200转/min振荡培养16?18 h，至0D600=2?6，此时细胞处于对数生长期。
[0058](b)在无菌条件下，将未经离心的含有菌体的5毫升BMGY液体培养基，直接加入到500ml BMMY中，瓶口用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，在IL的三角瓶中300转/min振荡培养。
[0059](c)每间隔24h加入100%甲醇至终浓度为1%，进行诱导培养，即500 ml BMMY中添加甲醇10 ml O
[0060](d)培养至96h收集蛋白，放置于4°C冰箱备用。
[0061](6)密码子改造之后的干扰素含量测定
电泳后，用薄层扫描仪对干扰素蛋白区带进行扫描，然后与Bradford蛋白总量测定的方法结合。
[0062]结果表明，基因修饰后，犬α I干扰素融合蛋白的含量为0.453 mg/mL，与没有经过改造的菌株表达量0.08mg/mL比较，干扰素的蛋白含量有了明显的提高。
【主权项】
1.一种经修饰改造的犬α 1-干扰素基因，其特征在于，修饰改造后的犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.根据权利要求1所述经修饰改造的犬α1-干扰素基因，其特征在于，对犬α?-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰，所述14个关键密码子为Cys、Pr0、Leu、Thr、Gly、Val、Gin、Ala、Ser、Asn、Phe、Asp、Lys 和 Arg 对应的密码子。3.根据权利要求1所述经修饰改造的犬α1-干扰素基因，其特征在于，对犬α?-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行了修饰，所述14个关键密码子为Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子⑶C，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU。4.一种犬α 1-干扰素表达载体，其特征在于，其构建使用了分泌型的表达载体pPICZaC，所述表达载体含有EcoR I和Xba I酶切位点，一个强启动子AOXl启动子，一个Zeocin抗性选择位点，强分泌信号α因子信号肽如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。5.根据权利要求3所述犬α1-干扰素表达载体，其特征在于，所述α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽和间隔肽，所述间隔肽由Iys-Arg -Glu-Ala- Glu-Ala氨基酸序列组成，Iys-ArgC端由膜结合蛋白酶ΚΕΧ2基因产物识别，-Glu-Ala-外侧由STE13基因产物识别。6.一种权利要求1所述经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.根据犬α1-干扰素的核苷酸序列设计合成一对引物，合成犬α 1-干扰素基因；所述引物序列如下:上游引物 Pl:5’-CCGGAATTCCATGTGTCA -3’ ； 下游引物 P2:5’_ GCTCTAGATTACTTTCTTCTTCTGA-3’ ； 在上游引物Pl的3’端加入了 EcoR I限制性内切酶位点，在下游引物Ρ2的5’端加入了 Xba I限制性内切酶位点；并在EcoR I酶切位点的上游增加一个碱基G ； 犬α 1-干扰素基因测序正确后，对犬α 1-干扰素基因的核苷酸序列中14个关键密码子进行修饰改造，改造的位点主要是:Cys的密码子UGU，Pro的密码子CCG，Leu的密码子CUC，Thr的密码子ACG，Gly的密码子GGU，Val的密码子GUG，Gln的密码子CAG，Ala的密码子GCC，Ser的密码子AGC，Asn的密码子AAU，Phe的密码子UUC，Asp的密码子GAC，Lys的密码子AAA，Arg的密码子CGU ； 52.将经修饰的犬α1-干扰素基因克隆入酵母表达载体pPICZa C中，用Zeocin +YPDS平板筛选，激活培养，经甲醇诱导表达，并进行无菌检验； 53.收获蛋白，收获过程中进行蛋白无菌检验； 54.测定蛋白的含量及活性。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤: 521.用灭菌牙签挑YPDS平板上生长的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28?30°C，200转/min振荡过夜，至0D600=2?6，细胞处于对数生长期； 522.将步骤S21获得的细胞在3000转/min和室温条件下离心5分钟收集沉淀，重悬于BMMY培养基中，控制溶氧量和防止污染，在试管中继续振荡培养，所述控制溶氧量和防止污染是用四层干净的纱布外加两层报纸包扎BMMY及采用进行酒精喷雾消毒和/或控制培养基的体积占培养器皿容积的5?20% ； S23.每间隔24 h加入100%甲醇至终浓度为1%，加入量为每毫升BMMY培养基加10微升，进行诱导培养。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述无菌检验是在蛋白表达过程中，观察菌液的颜色，保证菌液为乳白色；或在培养过程中取菌液进行镜检，观察酵母菌的形态，所述镜检是直接涂片镜检或用复红染色镜检。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述收获蛋白为培养96?120h后室温下1500?3000转/分离心5分钟收集上清，弃菌体；所取上清立即作SDS-PAGE分析或置于_70°C保存；步骤S3所述无菌检验采用闻酵母发酵的味道和观察菌液颜色；或利用SDS-PAGE进行检测。10.一种由权利要求6所述制备方法制备得到的经修饰改造的犬α 1-干扰素基因编码的蛋白质。
【专利摘要】本发明公开了一种经修饰改造的犬α1-干扰素基因及犬α1-干扰素的制备方法。修饰改造后的犬α1-干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明具体涉及犬α1-干扰素密码子对酵母密码子偏嗜性的匹配、改造，高效生产犬α1-干扰素的培养方法、避免污染的措施、确定加甲醇的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验、蛋白含量以及活性测定、扩大培养条件等操作方法的优化控制，本发明方法简单易行，成本较低，实现了犬α1-干扰素在毕赤酵母中稳定高效的表达，表达的犬α1-干扰素对犬病毒性传染病有显著的疗效，可以增强狂犬疫苗的免疫效果。
【IPC分类】C12N15/21, C12N1/19, C07K14/56, C12N15/81
【公开号】CN104894139
【申请号】CN201510264937
【发明人】郭霄峰, 杨谦, 王玉, 彭娇娇
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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