一种提高番茄抗氧化能力的基因及其应用
一种提高番茄抗氧化能力的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种提高番茄果实抗氧化能力的基因 片段及其具体应用方法，该片段的基因序列物SEQ ID NO :1所示，可以赋予植物更多的积累 类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷等，以及咖啡酰奎尼酸等物质，并提高番茄抗氧化能力。
【背景技术】
[0002] 类黄酮（Flavonoids)，指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一 系列化合物。自然界分布广泛，常以游离态或糖苷的形式存在于高等植物及羊齿植物的根、 莖、叶、花、果实，是许多中草药的有效成分（Graf et al·，2005; Hertog et al·，1995)。 不同的类黄酮类化合物在植物中具有不同的生物学功能，通常被分为黄酮类、黄酮醇类、黄 酮酮类、儿茶精类、异黄酮类、花青素类。由于广泛存在于植物中，生理活性多样，近年来引 起了国内外的广泛关注，在农业、医药、饲料、化工等领域都有重要的应用价值。
[0003] 类黄酮是一类天然的植物次生代谢产物，对人类健康起到促进作用，并且可以减 少一些疾病的风险。作为抗氧化剂、自由基清除剂和二价阳离子鳌合剂，可以抗菌消炎， 抗癌以及抑制血小板凝集（Simona et al·，2010; Zhen et al·，2010)，每天定量食用 类黄酮可以降低7-31%的癌症发生率，30-40%的心脏病发生率（（Hertog et al.，1993; Soobrattee et al. , 2006)〇
[0004] 类黄酮也作为信号分子、植物抗毒素和化感物质在植物与微生物相互作用中发挥 作用（Mol et al·，1998; Harborne et al·，2000; Pietta, 2000; Winkel-Shirley, 2001)，花青素类物质还影响着植物的颜色(唐传核，2005)等。类黄酮的生物活性大体概括 为以下几个方面：（1)抗氧化和清除自由基作用；（2)抑菌和抗病毒作用；（3)抗炎和抗过 敏作用。
[0005] 咖啡酰奎尼酸（Caffeoyl quinic acid)是一类由奎尼酸和不同数目咖啡酸通过 酯化反应综合而成的酚酸类天然化合物，主要存在于茄科植物，以及咖啡，苹果，及梨中。近 20年来，国内外学者就咖啡酰奎尼酸的植物化学和药理学进行了深入研究，发现这类化合 物具有一些重要的生物活性，极具临床价值。
[0006] 绿原酸（Chlorogenic acid),是由咖啡酸（Caffeic acid)与奎尼酸（Quinic acid，1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生 的一种苯丙素类化合物。根据咖啡酰在奎尼酸上的数目不同，从理论上讲，可分为一咖啡 酰奎尼酸，二咖啡酰奎尼酸和三咖啡酰奎尼酸，根据咖啡酰在奎尼酸上的位置不同，又存在 许多异构体。
[0007] 在人体中，绿原酸主要直接被小肠吸收（Williamson et al·，2000)，限制低密度 脂肪的氧化从而降低动脉粥样硬化的可能性，通过清除烷基过氧自由基降低体内毒性，组 织DNA破坏从而防止癌症发生（Sawa et al.，1999)。据报道，绿原酸的主要生物活性有 (1)对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（2)对自由基的清除及抗脂质过氧化作 用；（3)抗诱变作用；（4)保肝利胆作用；（5)抗菌、抗病毒及解痉等作用。
[0008] 目前主要通过常规手段利用天然材料(银杏叶、洋葱、柠檬、各种中药材等）为基础 的化学方法获得，受到原材料来源不足、含量偏低、初提物成份复杂及相关药理毒性不清等 因素的严重限制，由少数公司控制下游产品的生产和销售，价格居高不下。
[0009] 目前广泛种植的番茄仅含有少量的类黄酮和咖啡酰奎尼酸。利用番茄作为生物反 应器生产植物疫苗、化合物等正成为基因工程研究的一个热点。番茄是重要的转基因受体 植物，农杆菌介导的番茄叶盘转化法从报道之后一直得到广泛应用。但是如何能够提高番 茄体内类黄酮和咖啡酰奎尼酸的含量，进而提高番茄果实抗氧化能力一直是现有常规技术 无法解决的问题。
【发明内容】
[0010] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种可以赋予番茄强抗氧化能 力的DNA片段。
[0011] 发明人首先提供了一种包含也基因的DNA片段，其也基因的基因 序列如SEQ ID NO :1所示，上述DNA片段具有提高番茄果实抗氧化能力的作用。
[0012] 本发明的发明人首先通过特异引物也F1，其基因序列如SEQ ID NO :2所 示，和也R1，其基因序列如SEQ ID N0:3所示，采用现有技术高保真扩增全长 招Μλ. 7基因，获得基因序列如SEQ ID NO :1所示的基因片段。
[0013] 之后发明人通过特异引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示，和E8PR1，其基 因序列如SEQ ID NO :5所示，以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，组合扩增出编码E8 启动子的DNA序列，其基因序列如SEQ ID NO: 6所不。
[0014] 在获得上述两段基因片段之后，采用办〇 7-分e 7?酶切后去掉GFP片段并用上 述两段基因片段替换掉常用植物表达载体PX6-GFP中的GFP基因，最终即可获得植物表达 载体 pX6_E8:
[0015] 最终获得的植物表达载体pX6-E8-2: : 导入农杆菌工程菌株AGL1。通过 叶盘法转化番茄品种CSL，获得PCR转基因植株，通过PX6载体引物PX6F1，其基因序列 如SEQ ID N0:7所示，和PX6F2,其基因序列如SEQ ID N0:8所示，扩增转入载体的E8-2及 也7整体序列，验证转基因阳性植株。利用HPLC对转基因阳性株系的番茄果实进行 了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，转基因材料的果实果皮中以上物质的含量都有明显的 提高，通过ABTS +方法测量番茄果实的抗氧化能力相比野生型有明显的提高。
[0016] 在上述技术的基础上，根据已经克隆的也基因作探针，从cDNA和基因组文 库中筛选可得到本发明的基因或同源基因。同样，米用PCR(polymerase chain reaction) 技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的也基因以及任何感兴趣 的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含也基因的序 列包括基因片段的基本上相当于SEQ ID NO :1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO :1所示序列的亚片段，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因 植物。
[0017] 综上所述，本发明的发明人首次提供了一种通过赋予茄科植物积累类黄酮包括芦 丁、山奈酚芸香苷等，以及咖啡酰奎尼酸能力进而大幅度提高茄科植物抗氧化能力的DNA 片段，该片段从拟南芥中获得，包含提高番茄果实抗氧化能力基因也发明人提供了 该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子 E8-2,驱动在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼 酸含量，其中，类黄酮包括芦丁提高18. 2倍、山奈酚芸香苷提高33. 1倍，以及一咖啡酰奎尼 酸提高18. 1倍、二咖啡酰奎尼酸提高68. O倍、三咖啡酰奎尼酸提高108. 4倍，并将番茄果 实抗氧化能力提高3倍以上；从而验证了拟南芥基因具有提高番茄果实抗氧化能 力的功能；同时建立在此基础上，以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮和咖啡酰 奎尼酸生物制品，实行产业化；也可以此获得番茄的工程细胞，通过细胞培养方式生产类黄 酮和咖啡酰奎尼酸。同时本发明番茄中使用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除筛 选标记，得到具有食用安全性的抗氧化番茄品种，进行品种培育。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的全过程流程图； 图2a为E8-2启动子PCR扩增后电泳图； 图 2a 中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 为 E8-2 启动子； 图2b为也基因 PCR扩增后电泳图； 图 2b 中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 为也基因； 图3为E8-2启动子TA克隆经及^7? J酶切后电泳图； 图中M为Trans2K DNA Marker，1为E8-2启动子阳性克隆； 图4为过渡载体pX6-E8-2经通〇 J-分e I酶切后电泳图， 图中M为rans2K DNA 1&^1?51'，2为口乂648-2阴性克隆，3、4和5为构建口乂648-2阳性 克隆； 图5为pX6- E8-2::也重组质粒酶切鉴定电泳图， 图中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 为 pX6- E8-2::也阳性克隆 图6为番茄遗传转化不同时期的示意图； 图中A为愈伤组织诱导后示意图；B为分化产生不定芽时示意图；C为再生苗生根示意 图；D为转基因苗移栽大田后植株不意图；E为Ttl代转基因果实不意图； 图7为转基因植株中目的基因也的PCR检测结果示意图， 图中M为TaKaRa DNA Marker DL 2, 000，P1为阳性对照，P9为阴性对照，2-8为转基因 植株； 图8为野生型（CSL)和转基因果实果皮（CSLll-I)提取液HPLC分析结果示意图， 图9为转基因番茄果实（CSL)和转基因果实果肉（CSLll-I)提取液HPLC分析结果示 意图， 图中Sl为绿原酸；S2为芦丁；S3为1，5-二咖啡酰奎尼酸；S4为山奈酚芸香苷；S5为 3,4, 5-三咖啡酰奎尼酸； 图10为野生型（CSL)和三个不同转基因1\代株系果实果皮及果肉（CSL11-1，CSL2-1， CSL13-1)提取液抗氧化能力分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人 员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明 作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本 领域现有技术； 本发明中所涉及的多种培养基具体如下： MS 培养基：100 mL 10XMSmax，10 mL 100XMSmin，10 mL 100XFe2-EDTA，1 0 mL IOOXTomato Vitamin, 30 g鹿糖，氢氧化钾或盐酸调pH至5.7-5. 8,定容至I L。若为MS 固体培养基，加入0. 8%琼脂粉。
[0020] 番茄预、共、后培养基：在上述MS培养基基础上，添加生长素(吲哚三乙酸）和玉米 素，终浓度分别为〇· 2 mg/L和2 mg/L。
[0021] 番茄分化培养基：在上述MS培养基基础上，使用前添加羧苄青霉素和卡那霉素， 终浓度分别为400 mg/L和30 mg/L。
[0022] 番茄生根培养基：在MS培养基基础上，添加生长素和羧苄青霉素，终浓度分别为 0· I mg/L和 400 mg/L。
[0023] 实施例1 1.番茄果实特异性E8-2启动子和基因 DNA的克隆 以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示， 和E8PR1，其基因序列如如SEQ ID NO :5所示，组合扩增，得到预期I. I kb片段（图2 a所 示)。进而将E8PF1/R1组合扩增产物进行TA克隆，连接到PCR产物克隆载体pGEM-T Easy 载体。转化大肠杆菌DH5a，获得大量克隆。利用特异性引物组合E8PF1/R1对随机挑选的 12个克隆进行菌落PCR鉴定，得到8个有目标片段插入的克隆。随机挑选两个克隆提取质 粒并使用EcoR I酶切验证，确认其携带目标片段（图3所示)，该片段经测序其序列为SEQ ID NO :6。
[0024] 根据PCR方法，以拟南芥Col-I来源的DNA为模板，通过特异引物也F1，其 序列如SEQ ID NO :2所示，和也Rl，其序列如SEQ ID NO :3所示，高保真扩增全长 也基因，约1.8 kb (图2 b所示）。测序结果显示其序列如SEQ ID NO :1。
[0025] pX6载体选用现有的PX6-GFP，通过常规的Xho I-Spe I双酶切后去掉GFP片段后 备用，以与上述E8-2启动子克隆以及也基因连接构建pX6-E8-2::也载体。
[0026] 试验中用到的引物序列及说明见表1所示。
[0027] 表1引物说明表
2.植物表达载体pX6-E8-2::J/?ii(〇rZ 7的构建 将克隆到TA克隆的E8-2启动子片段，经通〇 J-分e 7?酶切后电泳回收，并与相同酶 切回收的PX6-GFP载体连接。转化大肠杆菌后随机挑取重组子，经通〇 J-分e 7?酶切后 电泳检测，重组子酶切结果中含有目标片段，大小约I. I kb，表明过渡载体pX6-E8-2构建 成功(如图4)。该过渡载体进一步用E8启动子特异引物E8PF1/R1进行PCR验证，再次证实 过渡载体PX6-E8-2构建成功。
[0028] PX6-E8-2过渡载体经分e J酶切后，去磷酸化处理，同时胶回收的片 段。连接转化后采用菌落PCR筛选到1个携带有目标基因片段且通过测序验证插入方向正 确的克隆(如图5)。该重组载体经测序重复验证后导入农杆菌菌株GV3101并进行番茄遗传 转化。
[0029] 实施例2 农杆菌介导的番茄遗传转化及转基因植株PCR检测 1.农杆菌介导的番茄遗传转化 利用番茄子叶为外植体，采用农杆菌（GV3101菌株）介导的叶盘转化法，将植物表达载 体PX6-E8-2: : 转化CSL受体材料。一切操作均在严格的无菌环境下进行，转基因 操作基本程序如下： 1)种子经75%乙醇消毒I min，有效氯2% NaOCl处理15 min，无菌蒸馏水洗涤4-5次， 播种于1/2MS培养基，间距适宜，24-26°C暗培养3-4 d后转移到16 h光照/8 h黑暗下培 养至子叶完全展开。
[0030] 2)刀片切除子叶前后两段，留取中间约0. 5 cm叶片，近轴面朝上置于预培养基， 24-26°C暗培养2 d。外植体预培养的同时，采用平板划线法，28°C大规模培养含有重组表达 载体的农杆菌菌株。
[0031] 3) MS培养液重悬农杆菌，浓度0D600=0. 4-0. 6浸泡侵染25-30 min。无菌滤纸吸 干菌液，近轴面朝上24-26°C黑暗条件共培养2 d。
[0032] 4)无菌蒸馈水洗漆外植体4-5次，每次30 min，最后用浓度为250 ppm羧节青霉 素水洗30 min，无菌滤纸吸干，近轴面朝上24-26°C 16 h光照/8 h黑暗条件后培养3 d。
[0033] 5)外植体转移到分化培养基，每2周继代一次至抗性芽分化。
[0034] 6)当抗性芽长到2-3 cm时，切下并插入生根培养基。当有大量根长出时，洗净根 部培养基并移栽到温室。
[0035] CSL作为受体材料获得15株独立的TO代转基因植株（图6)。再生苗生根后移栽 温室，加强对飞虱、蚜虫、红蜘蛛、潜叶蝇等番茄常见虫害的管理和防治，挂果时期适当追施 肥料。
[0036] 2.转基因植株PCR检测 选取幼嫩番茄叶片，利用CTAB法提取转基因和非转基因植株基因组DNA，以包含 也iiozZ 7基因全长DNA在内的外侧载体引物PX6F1/R1进行PCR检测。PCR产物经1%琼 脂糖凝胶电泳分析，扩增出与PX6-E8-2: : 质粒扩增同样大小约3 kp片段（图7) 为阳性植株，阳性植株有10株，阳性率为：67%。
[0037] 实施例3番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析 转基因番茄在营养生长时期与非转基因植株并无明显差异，从变色期开始，转基因果 实的果皮逐渐趋向桔红色或深黄色，对照果实仍然维持相应的红色，后续HPLC分析证明了 转基因果实的颜色变化与芦丁等类黄酮物质和咖啡酰奎尼酸含量的增加（图8、图9)存在 一定联系。番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析方法如下：待通过上述步骤获得 的番茄成熟收获后，用冷冻干燥机（EYELA FDU-1100，Τ0Κ0Υ0 RIKAKIAI CO. LTD)冷冻干燥 后研成粉末。以每mg冻干粉末溶于30μ1 70%甲醇的比例溶解后，置于-20°C 3h进行类 黄酮提取，提取液经1600g离心后使用0. 45 μ m滤膜过滤上清液，取20 μ 1过滤液用于HPLC 分析，按照Luo等（2009)设置HPLC条件，标准品为芦丁、绿原酸和山奈酚芸香苷(分别购自 Sigma和Extrasynthese公司），1，5-二咖啡酰奎尼酸和3, 4, 5-三咖啡酰奎尼酸购于成都 普瑞法科技开发有限公司。
[0038] 利用HPLC对阳性转基因株系进行了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，转基因材 料均有明显提1?。
[0039] 转基因果实果皮绿原酸含量最高达到304. 44 Pg/g DW，与对照相比提高了 18. 1 倍；二咖啡酰奎尼酸及三咖啡酰奎尼酸分别与对照相比提高了 68. 0和108. 4倍；另外，芦 丁和山奈酚芸香苷的含量也分别提高了 18. 2倍和33. 1倍，如表2所示。
[0040] 表2 CSL转基因番茄TO代类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计
在10株转基因株系中选取了 3株（CSL-2, CSL-11，CSL-13)利用HPLC进行T1代阳性 转基因株系中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，转基因阳性材料含量与Ttl代相比均稳定遗 传，具体见表3所示。
[0041] 表3. CSL转基因番茄T1代类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计
实施例4转基因番茄果实抗氧化能力分析 上述HPLC分析证明了转基因果实中类黄酮物质和咖啡酰奎尼酸含量的增加（图8、图 9,表2,表3)。番茄果实抗氧化分析方法如下：待通过上述步骤获得的番茄成熟收获后，用 冷冻干燥机（EYELA FDU-1100，TOKOYO RIKAKIAI CO. LTD)冷冻干燥后研成粉末。以每50mg 冻干粉末溶于70%甲醇的溶解后，用测定抗氧化活性的ABTS+法对转基因及野生型番茄果 实果皮和果肉分别进行抗氧化分析能力测定。在酶标板上以Trolox为标准对照，能过酶标 仪（SYNERGY MX全波长多功能酶标仪，ΒΙ0ΤΕΚ)测定抗氧化物质对预先制备的自由基ABTS+ 的清除能力，将待测物质的清除自由基能力与Trolox清除自由基的能力相对比，确定相对 抗氧化活性，单位为抗氧化量TEAC，即可反应出果实中提取抗氧化活性物质的效率。
[0042] 利用ABTS+方法测定T i代阳性转基因果实果皮及果肉抗氧化能力，转基因材料果 皮抗氧化能力时显增强，其中CSLl 1-1阳性株系抗氧化能力上升了 3倍左右，其他两个转基 因株系提高倍数在2-2. 5倍（图10)。这与HPLC测定阳性转基因株系中芦丁的含量差异有 很明显的对应关系(表3)。
【主权项】
1. 一种提1?番爺抗氧化能力的基因，其核昔酸序列如SEQIDNO:1所不。2. -种权利要求1所述基因的番茄果实特异性启动子E8-2,其核苷酸序列如SEQID NO:6所示。3. -种含有权利要求1所述的核苷酸序列的番爺果实表达载体 pX6_E8_2:4. 权利要求1所述的一种提高番茄抗氧化能力的基因在提高番茄中类黄酮和多种咖 啡酰奎尼酸含量中的应用。5. 权利要求1所述的一种提1?番爺抗氧化能力的基因在提1?番爺抗氧化能力中的应 用。6. 权利要求3所述的表达载体pX6-E8-2: : 在提高番爺抗氧化能力中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种提高番茄抗氧化能力的基因AntioxL1，该基因片段从拟南芥中获得，发明人提供了该片段的分离、克隆、功能验证和应用的具体方法，利用番茄果实特异性表达启动子E8-2，驱动该基因在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄植物中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，其中，类黄酮包括芦丁提高18.2倍、山奈酚芸香苷提高33.1倍，以及一咖啡酰奎尼酸提高18.1倍、二咖啡酰奎尼酸提高68.0倍、三咖啡酰奎尼酸提高108.4倍，并将番茄果实抗氧化能力提高3倍以上。
【IPC分类】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/84, C12N15/29
【公开号】CN104894140
【申请号】CN201510173048
【发明人】丁新华, 储昭辉, 李洋
【申请人】安徽拜森生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月14日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种提高番茄果实抗氧化能力的基因 片段及其具体应用方法，该片段的基因序列物SEQ ID NO :1所示，可以赋予植物更多的积累 类黄酮包括芦丁、山奈酚芸香苷等，以及咖啡酰奎尼酸等物质，并提高番茄抗氧化能力。
【背景技术】
[0002] 类黄酮（Flavonoids)，指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的一 系列化合物。自然界分布广泛，常以游离态或糖苷的形式存在于高等植物及羊齿植物的根、 莖、叶、花、果实，是许多中草药的有效成分（Graf et al·，2005; Hertog et al·，1995)。 不同的类黄酮类化合物在植物中具有不同的生物学功能，通常被分为黄酮类、黄酮醇类、黄 酮酮类、儿茶精类、异黄酮类、花青素类。由于广泛存在于植物中，生理活性多样，近年来引 起了国内外的广泛关注，在农业、医药、饲料、化工等领域都有重要的应用价值。
[0003] 类黄酮是一类天然的植物次生代谢产物，对人类健康起到促进作用，并且可以减 少一些疾病的风险。作为抗氧化剂、自由基清除剂和二价阳离子鳌合剂，可以抗菌消炎， 抗癌以及抑制血小板凝集（Simona et al·，2010; Zhen et al·，2010)，每天定量食用 类黄酮可以降低7-31%的癌症发生率，30-40%的心脏病发生率（（Hertog et al.，1993; Soobrattee et al. , 2006)〇
[0004] 类黄酮也作为信号分子、植物抗毒素和化感物质在植物与微生物相互作用中发挥 作用（Mol et al·，1998; Harborne et al·，2000; Pietta, 2000; Winkel-Shirley, 2001)，花青素类物质还影响着植物的颜色(唐传核，2005)等。类黄酮的生物活性大体概括 为以下几个方面：（1)抗氧化和清除自由基作用；（2)抑菌和抗病毒作用；（3)抗炎和抗过 敏作用。
[0005] 咖啡酰奎尼酸（Caffeoyl quinic acid)是一类由奎尼酸和不同数目咖啡酸通过 酯化反应综合而成的酚酸类天然化合物，主要存在于茄科植物，以及咖啡，苹果，及梨中。近 20年来，国内外学者就咖啡酰奎尼酸的植物化学和药理学进行了深入研究，发现这类化合 物具有一些重要的生物活性，极具临床价值。
[0006] 绿原酸（Chlorogenic acid),是由咖啡酸（Caffeic acid)与奎尼酸（Quinic acid，1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生 的一种苯丙素类化合物。根据咖啡酰在奎尼酸上的数目不同，从理论上讲，可分为一咖啡 酰奎尼酸，二咖啡酰奎尼酸和三咖啡酰奎尼酸，根据咖啡酰在奎尼酸上的位置不同，又存在 许多异构体。
[0007] 在人体中，绿原酸主要直接被小肠吸收（Williamson et al·，2000)，限制低密度 脂肪的氧化从而降低动脉粥样硬化的可能性，通过清除烷基过氧自由基降低体内毒性，组 织DNA破坏从而防止癌症发生（Sawa et al.，1999)。据报道，绿原酸的主要生物活性有 (1)对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（2)对自由基的清除及抗脂质过氧化作 用；（3)抗诱变作用；（4)保肝利胆作用；（5)抗菌、抗病毒及解痉等作用。
[0008] 目前主要通过常规手段利用天然材料(银杏叶、洋葱、柠檬、各种中药材等）为基础 的化学方法获得，受到原材料来源不足、含量偏低、初提物成份复杂及相关药理毒性不清等 因素的严重限制，由少数公司控制下游产品的生产和销售，价格居高不下。
[0009] 目前广泛种植的番茄仅含有少量的类黄酮和咖啡酰奎尼酸。利用番茄作为生物反 应器生产植物疫苗、化合物等正成为基因工程研究的一个热点。番茄是重要的转基因受体 植物，农杆菌介导的番茄叶盘转化法从报道之后一直得到广泛应用。但是如何能够提高番 茄体内类黄酮和咖啡酰奎尼酸的含量，进而提高番茄果实抗氧化能力一直是现有常规技术 无法解决的问题。
【发明内容】
[0010] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种可以赋予番茄强抗氧化能 力的DNA片段。
[0011] 发明人首先提供了一种包含也基因的DNA片段，其也基因的基因 序列如SEQ ID NO :1所示，上述DNA片段具有提高番茄果实抗氧化能力的作用。
[0012] 本发明的发明人首先通过特异引物也F1，其基因序列如SEQ ID NO :2所 示，和也R1，其基因序列如SEQ ID N0:3所示，采用现有技术高保真扩增全长 招Μλ. 7基因，获得基因序列如SEQ ID NO :1所示的基因片段。
[0013] 之后发明人通过特异引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示，和E8PR1，其基 因序列如SEQ ID NO :5所示，以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，组合扩增出编码E8 启动子的DNA序列，其基因序列如SEQ ID NO: 6所不。
[0014] 在获得上述两段基因片段之后，采用办〇 7-分e 7?酶切后去掉GFP片段并用上 述两段基因片段替换掉常用植物表达载体PX6-GFP中的GFP基因，最终即可获得植物表达 载体 pX6_E8:
[0015] 最终获得的植物表达载体pX6-E8-2: : 导入农杆菌工程菌株AGL1。通过 叶盘法转化番茄品种CSL，获得PCR转基因植株，通过PX6载体引物PX6F1，其基因序列 如SEQ ID N0:7所示，和PX6F2,其基因序列如SEQ ID N0:8所示，扩增转入载体的E8-2及 也7整体序列，验证转基因阳性植株。利用HPLC对转基因阳性株系的番茄果实进行 了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，转基因材料的果实果皮中以上物质的含量都有明显的 提高，通过ABTS +方法测量番茄果实的抗氧化能力相比野生型有明显的提高。
[0016] 在上述技术的基础上，根据已经克隆的也基因作探针，从cDNA和基因组文 库中筛选可得到本发明的基因或同源基因。同样，米用PCR(polymerase chain reaction) 技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的也基因以及任何感兴趣 的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含也基因的序 列包括基因片段的基本上相当于SEQ ID NO :1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO :1所示序列的亚片段，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因 植物。
[0017] 综上所述，本发明的发明人首次提供了一种通过赋予茄科植物积累类黄酮包括芦 丁、山奈酚芸香苷等，以及咖啡酰奎尼酸能力进而大幅度提高茄科植物抗氧化能力的DNA 片段，该片段从拟南芥中获得，包含提高番茄果实抗氧化能力基因也发明人提供了 该片段的分离克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用番茄果实特异性表达启动子 E8-2,驱动在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄果实中类黄酮和咖啡酰奎尼 酸含量，其中，类黄酮包括芦丁提高18. 2倍、山奈酚芸香苷提高33. 1倍，以及一咖啡酰奎尼 酸提高18. 1倍、二咖啡酰奎尼酸提高68. O倍、三咖啡酰奎尼酸提高108. 4倍，并将番茄果 实抗氧化能力提高3倍以上；从而验证了拟南芥基因具有提高番茄果实抗氧化能 力的功能；同时建立在此基础上，以栽培型小果番茄作为生物反应器生产类黄酮和咖啡酰 奎尼酸生物制品，实行产业化；也可以此获得番茄的工程细胞，通过细胞培养方式生产类黄 酮和咖啡酰奎尼酸。同时本发明番茄中使用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除筛 选标记，得到具有食用安全性的抗氧化番茄品种，进行品种培育。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的全过程流程图； 图2a为E8-2启动子PCR扩增后电泳图； 图 2a 中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 为 E8-2 启动子； 图2b为也基因 PCR扩增后电泳图； 图 2b 中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 为也基因； 图3为E8-2启动子TA克隆经及^7? J酶切后电泳图； 图中M为Trans2K DNA Marker，1为E8-2启动子阳性克隆； 图4为过渡载体pX6-E8-2经通〇 J-分e I酶切后电泳图， 图中M为rans2K DNA 1&^1?51'，2为口乂648-2阴性克隆，3、4和5为构建口乂648-2阳性 克隆； 图5为pX6- E8-2::也重组质粒酶切鉴定电泳图， 图中 M 为 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 为 pX6- E8-2::也阳性克隆 图6为番茄遗传转化不同时期的示意图； 图中A为愈伤组织诱导后示意图；B为分化产生不定芽时示意图；C为再生苗生根示意 图；D为转基因苗移栽大田后植株不意图；E为Ttl代转基因果实不意图； 图7为转基因植株中目的基因也的PCR检测结果示意图， 图中M为TaKaRa DNA Marker DL 2, 000，P1为阳性对照，P9为阴性对照，2-8为转基因 植株； 图8为野生型（CSL)和转基因果实果皮（CSLll-I)提取液HPLC分析结果示意图， 图9为转基因番茄果实（CSL)和转基因果实果肉（CSLll-I)提取液HPLC分析结果示 意图， 图中Sl为绿原酸；S2为芦丁；S3为1，5-二咖啡酰奎尼酸；S4为山奈酚芸香苷；S5为 3,4, 5-三咖啡酰奎尼酸； 图10为野生型（CSL)和三个不同转基因1\代株系果实果皮及果肉（CSL11-1，CSL2-1， CSL13-1)提取液抗氧化能力分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人 员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明 作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本 领域现有技术； 本发明中所涉及的多种培养基具体如下： MS 培养基：100 mL 10XMSmax，10 mL 100XMSmin，10 mL 100XFe2-EDTA，1 0 mL IOOXTomato Vitamin, 30 g鹿糖，氢氧化钾或盐酸调pH至5.7-5. 8,定容至I L。若为MS 固体培养基，加入0. 8%琼脂粉。
[0020] 番茄预、共、后培养基：在上述MS培养基基础上，添加生长素(吲哚三乙酸）和玉米 素，终浓度分别为〇· 2 mg/L和2 mg/L。
[0021] 番茄分化培养基：在上述MS培养基基础上，使用前添加羧苄青霉素和卡那霉素， 终浓度分别为400 mg/L和30 mg/L。
[0022] 番茄生根培养基：在MS培养基基础上，添加生长素和羧苄青霉素，终浓度分别为 0· I mg/L和 400 mg/L。
[0023] 实施例1 1.番茄果实特异性E8-2启动子和基因 DNA的克隆 以番茄品种中蔬4号基因组DNA为模版，引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示， 和E8PR1，其基因序列如如SEQ ID NO :5所示，组合扩增，得到预期I. I kb片段（图2 a所 示)。进而将E8PF1/R1组合扩增产物进行TA克隆，连接到PCR产物克隆载体pGEM-T Easy 载体。转化大肠杆菌DH5a，获得大量克隆。利用特异性引物组合E8PF1/R1对随机挑选的 12个克隆进行菌落PCR鉴定，得到8个有目标片段插入的克隆。随机挑选两个克隆提取质 粒并使用EcoR I酶切验证，确认其携带目标片段（图3所示)，该片段经测序其序列为SEQ ID NO :6。
[0024] 根据PCR方法，以拟南芥Col-I来源的DNA为模板，通过特异引物也F1，其 序列如SEQ ID NO :2所示，和也Rl，其序列如SEQ ID NO :3所示，高保真扩增全长 也基因，约1.8 kb (图2 b所示）。测序结果显示其序列如SEQ ID NO :1。
[0025] pX6载体选用现有的PX6-GFP，通过常规的Xho I-Spe I双酶切后去掉GFP片段后 备用，以与上述E8-2启动子克隆以及也基因连接构建pX6-E8-2::也载体。
[0026] 试验中用到的引物序列及说明见表1所示。
[0027] 表1引物说明表
2.植物表达载体pX6-E8-2::J/?ii(〇rZ 7的构建 将克隆到TA克隆的E8-2启动子片段，经通〇 J-分e 7?酶切后电泳回收，并与相同酶 切回收的PX6-GFP载体连接。转化大肠杆菌后随机挑取重组子，经通〇 J-分e 7?酶切后 电泳检测，重组子酶切结果中含有目标片段，大小约I. I kb，表明过渡载体pX6-E8-2构建 成功(如图4)。该过渡载体进一步用E8启动子特异引物E8PF1/R1进行PCR验证，再次证实 过渡载体PX6-E8-2构建成功。
[0028] PX6-E8-2过渡载体经分e J酶切后，去磷酸化处理，同时胶回收的片 段。连接转化后采用菌落PCR筛选到1个携带有目标基因片段且通过测序验证插入方向正 确的克隆(如图5)。该重组载体经测序重复验证后导入农杆菌菌株GV3101并进行番茄遗传 转化。
[0029] 实施例2 农杆菌介导的番茄遗传转化及转基因植株PCR检测 1.农杆菌介导的番茄遗传转化 利用番茄子叶为外植体，采用农杆菌（GV3101菌株）介导的叶盘转化法，将植物表达载 体PX6-E8-2: : 转化CSL受体材料。一切操作均在严格的无菌环境下进行，转基因 操作基本程序如下： 1)种子经75%乙醇消毒I min，有效氯2% NaOCl处理15 min，无菌蒸馏水洗涤4-5次， 播种于1/2MS培养基，间距适宜，24-26°C暗培养3-4 d后转移到16 h光照/8 h黑暗下培 养至子叶完全展开。
[0030] 2)刀片切除子叶前后两段，留取中间约0. 5 cm叶片，近轴面朝上置于预培养基， 24-26°C暗培养2 d。外植体预培养的同时，采用平板划线法，28°C大规模培养含有重组表达 载体的农杆菌菌株。
[0031] 3) MS培养液重悬农杆菌，浓度0D600=0. 4-0. 6浸泡侵染25-30 min。无菌滤纸吸 干菌液，近轴面朝上24-26°C黑暗条件共培养2 d。
[0032] 4)无菌蒸馈水洗漆外植体4-5次，每次30 min，最后用浓度为250 ppm羧节青霉 素水洗30 min，无菌滤纸吸干，近轴面朝上24-26°C 16 h光照/8 h黑暗条件后培养3 d。
[0033] 5)外植体转移到分化培养基，每2周继代一次至抗性芽分化。
[0034] 6)当抗性芽长到2-3 cm时，切下并插入生根培养基。当有大量根长出时，洗净根 部培养基并移栽到温室。
[0035] CSL作为受体材料获得15株独立的TO代转基因植株（图6)。再生苗生根后移栽 温室，加强对飞虱、蚜虫、红蜘蛛、潜叶蝇等番茄常见虫害的管理和防治，挂果时期适当追施 肥料。
[0036] 2.转基因植株PCR检测 选取幼嫩番茄叶片，利用CTAB法提取转基因和非转基因植株基因组DNA，以包含 也iiozZ 7基因全长DNA在内的外侧载体引物PX6F1/R1进行PCR检测。PCR产物经1%琼 脂糖凝胶电泳分析，扩增出与PX6-E8-2: : 质粒扩增同样大小约3 kp片段（图7) 为阳性植株，阳性植株有10株，阳性率为：67%。
[0037] 实施例3番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析 转基因番茄在营养生长时期与非转基因植株并无明显差异，从变色期开始，转基因果 实的果皮逐渐趋向桔红色或深黄色，对照果实仍然维持相应的红色，后续HPLC分析证明了 转基因果实的颜色变化与芦丁等类黄酮物质和咖啡酰奎尼酸含量的增加（图8、图9)存在 一定联系。番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析方法如下：待通过上述步骤获得 的番茄成熟收获后，用冷冻干燥机（EYELA FDU-1100，Τ0Κ0Υ0 RIKAKIAI CO. LTD)冷冻干燥 后研成粉末。以每mg冻干粉末溶于30μ1 70%甲醇的比例溶解后，置于-20°C 3h进行类 黄酮提取，提取液经1600g离心后使用0. 45 μ m滤膜过滤上清液，取20 μ 1过滤液用于HPLC 分析，按照Luo等（2009)设置HPLC条件，标准品为芦丁、绿原酸和山奈酚芸香苷(分别购自 Sigma和Extrasynthese公司），1，5-二咖啡酰奎尼酸和3, 4, 5-三咖啡酰奎尼酸购于成都 普瑞法科技开发有限公司。
[0038] 利用HPLC对阳性转基因株系进行了类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，转基因材 料均有明显提1?。
[0039] 转基因果实果皮绿原酸含量最高达到304. 44 Pg/g DW，与对照相比提高了 18. 1 倍；二咖啡酰奎尼酸及三咖啡酰奎尼酸分别与对照相比提高了 68. 0和108. 4倍；另外，芦 丁和山奈酚芸香苷的含量也分别提高了 18. 2倍和33. 1倍，如表2所示。
[0040] 表2 CSL转基因番茄TO代类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计
在10株转基因株系中选取了 3株（CSL-2, CSL-11，CSL-13)利用HPLC进行T1代阳性 转基因株系中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量检测，转基因阳性材料含量与Ttl代相比均稳定遗 传，具体见表3所示。
[0041] 表3. CSL转基因番茄T1代类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量统计
实施例4转基因番茄果实抗氧化能力分析 上述HPLC分析证明了转基因果实中类黄酮物质和咖啡酰奎尼酸含量的增加（图8、图 9,表2,表3)。番茄果实抗氧化分析方法如下：待通过上述步骤获得的番茄成熟收获后，用 冷冻干燥机（EYELA FDU-1100，TOKOYO RIKAKIAI CO. LTD)冷冻干燥后研成粉末。以每50mg 冻干粉末溶于70%甲醇的溶解后，用测定抗氧化活性的ABTS+法对转基因及野生型番茄果 实果皮和果肉分别进行抗氧化分析能力测定。在酶标板上以Trolox为标准对照，能过酶标 仪（SYNERGY MX全波长多功能酶标仪，ΒΙ0ΤΕΚ)测定抗氧化物质对预先制备的自由基ABTS+ 的清除能力，将待测物质的清除自由基能力与Trolox清除自由基的能力相对比，确定相对 抗氧化活性，单位为抗氧化量TEAC，即可反应出果实中提取抗氧化活性物质的效率。
[0042] 利用ABTS+方法测定T i代阳性转基因果实果皮及果肉抗氧化能力，转基因材料果 皮抗氧化能力时显增强，其中CSLl 1-1阳性株系抗氧化能力上升了 3倍左右，其他两个转基 因株系提高倍数在2-2. 5倍（图10)。这与HPLC测定阳性转基因株系中芦丁的含量差异有 很明显的对应关系(表3)。
【主权项】
1. 一种提1?番爺抗氧化能力的基因，其核昔酸序列如SEQIDNO:1所不。2. -种权利要求1所述基因的番茄果实特异性启动子E8-2,其核苷酸序列如SEQID NO:6所示。3. -种含有权利要求1所述的核苷酸序列的番爺果实表达载体 pX6_E8_2:4. 权利要求1所述的一种提高番茄抗氧化能力的基因在提高番茄中类黄酮和多种咖 啡酰奎尼酸含量中的应用。5. 权利要求1所述的一种提1?番爺抗氧化能力的基因在提1?番爺抗氧化能力中的应 用。6. 权利要求3所述的表达载体pX6-E8-2: : 在提高番爺抗氧化能力中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种提高番茄抗氧化能力的基因AntioxL1，该基因片段从拟南芥中获得，发明人提供了该片段的分离、克隆、功能验证和应用的具体方法，利用番茄果实特异性表达启动子E8-2，驱动该基因在番茄果实中特异表达，大大提高了番茄植物中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量，其中，类黄酮包括芦丁提高18.2倍、山奈酚芸香苷提高33.1倍，以及一咖啡酰奎尼酸提高18.1倍、二咖啡酰奎尼酸提高68.0倍、三咖啡酰奎尼酸提高108.4倍，并将番茄果实抗氧化能力提高3倍以上。
【IPC分类】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/84, C12N15/29
【公开号】CN104894140
【申请号】CN201510173048
【发明人】丁新华, 储昭辉, 李洋
【申请人】安徽拜森生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月14日
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