棉花的固醇载体蛋白基因及其应用
棉花的固醇载体蛋白基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及棉花的固醇载体蛋白基因及其应用。 技术背景
[0002] 棉花作为世界性的重要经济作物，产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。由于 纺织工业发展的不断加快，要求适应各种需求的更整齐的棉纤维，再加上人们保健意识的 增强和生活水平的提高，对棉纤维品质改良的要求愈加迫切。
[0003] 近10年来，棉花育种从侧重外在品质转变为侧重内在品质。目前，国内外除了利 用常规育种手段外，还逐步运用遗传工程对棉纤维品质进行遗传改良，而此项工作的展开 首先依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的识别与分离。
[0004] 棉纤维发育过程有几千个基因表达，其相关基因的分离鉴定以及调控研宄起步较 晚，但进展很快。自从John和Cr 〇w(1992)首次报道运用CDNA文库差异筛选方法克隆纤维 特异表达基因 E6后，先后有数十个纤维发育相关基因被分离出来。目前大部分的纤维发育 相关基因主要是通过DNA或cDNA克隆的随机测序、文库差异筛选和mRNA差异显示等方法 获得。从目前国内外的研宄进展来看，已克隆的棉纤维发育相关基因有100多个，且多数是 在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异表达，利用分子生物学方法改良棉纤维的尽管有一定的 进展，但是潜力还远没有发挥。
[0005] 固醇载体蛋白（SCP2)是作为一个蛋白结构域，在体外能提高脂类在膜之间的转 运。最初人们认为固醇载体蛋白只是一类固醇结合蛋白，但是最近的研宄发现它也能结合 憐脂、脂肪酸和脂醜CoA。动物和昆虫的固醇载体蛋白最初存在5个标准的β折萱和5个 α螺旋。C-端的部分β折叠和4个α螺旋形成疏水通道，有利于与脂类结合（Choinowski et al·，2000 ;Haapalainen et al·，2001 ;Dyer et al·，2003)。尽管固醇载体蛋白在哺乳 动物细胞中研宄了很多，但是其生物学功能到现在还不是很清楚（Gallegos et al.，2001 ; Seedorf et al. , 2000 ；Stolowich et al. , 2002) 〇 一种假说认为固醇载体蛋白参与胆固 醇在细胞质中的转移，然而还有些人认为固醇载体蛋白参与脂肪酸的过氧化物酶体氧化。 在其他真核生物中也发现了含有SCP2的多结构域蛋白。UNC-24线虫中的含有SCP2结构 域的溴化丙胺太林基因 （Barnes et al.，1996)。在丛枝菌根真菌中的DBP中发现了 SCP2 结构域（Requena et al.，1999)。在黄热病蚊子埃及伊蚊中发现在SCP-X基因中发现了非 融合的 SCP2 结构域（Krebs and Lan, 2003 ;Lan and Wessely, 2004)。在植物（Edqvist et al.，2〇〇4)，酵母（Szabo et al.，I989 ;Hwang et al.，1"1)，古菌（Kawashima et al.，2000)和细菌中，SCP2作为单独的一个基因存在。
[0006] Johan Edqvist等（2004)首先从拟南芥中克隆到第一个与哺乳动物具有高度相 似的固醇载体蛋白，命名为AtSCP2。该蛋白与人类D型双功能蛋白（DBP)中的SCP2-like 具有35%的相似度和56%相似性。与人类SCP2具有30%的相似度和54%相似性。通 过研宄AtSCP2晶体结构发现，它具有一个特别适合脂类结合的疏水性的配体结合位点。 AtSCP2在体外具有转移氟硼二吡咯-卵磷脂（B0DIPY-PC)的活性。但是这种转移活性被 1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱或麦角留醇完全抑制。而二肉豆蔻酰磷脂酸（Dimyristoyl phosphatidic acid)、豆留醇（stigmasterol)、固醇葡糖苷（steryl glucoside)和胆固醇 (cholesterol)对于这种转移能力的影响较弱。而单链棕榈酸（single chain palmitic acid)和硬脂酰辅酶A对转移没有影响。AtSCP2的mRNA在拟南芥的大部分组织中都积累。 亚细胞定位结果显示该蛋白定位于过氧化物酶体（Edqvist et al.，2004)。
[0007] Zheng等人（2010)研宄拟南芥中固醇载体蛋白（AtSCP2)的突变体时发现，AtSCP2 对于拟南芥的种子发育和幼苗的建成具有重要的作用。他们在不添加蔗糖培养基上， AtSCP2突变体与野生型相比，根和下胚轴明显变短，子叶莲座直径也明显变小。而在添加蔗 糖的情况下，AtSCP2突变体与野生型相比生长情况几乎没有差别。他们还发现AtSCP2在拟 南芥中的表达部位主要有胚乳、胚、48小时子叶的维管束，莲座叶的绒毛、花托、萼片和花瓣 的维管束、心皮的柱头和雌蕊、花丝和花粉，并且这个基因在幼苗时期受蔗糖诱导表达。但 该基因在棉花纤维中的作用尚未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供棉花的固醇载体蛋白基因。
[0009] 本发明的另一目的是提供该基因的应用。
[0010] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0011] 固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D，该基因 ORF序列为：SEQ ID NO. 1 ;该基因基因组序 列为 SEQ ID NO. 2。
[0012] 含有本发明所述的固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D的重组表达载体。
[0013] 本发明所述的固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运 输中的应用。
[0014] 本发明所述的固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D在改良棉花纤维伸长中的应用。
[0015] 有益效果：
[0016] (1)本发明所克隆的基因编码固醇载体蛋白，固醇载体蛋白与棉纤维伸长时期的 蔗糖运输密切相关，是碳运输途径中的关键基因。这样本发明所克隆的基因与棉纤维的品 质有着直接的联系。由于蔗糖是在纤维伸长时期是维持细胞膨压的可溶性糖来源，又是合 成细胞壁的原料。因此，过量表达该基因理论上可使纤维素含量增加，纤维品质得到改变， 打破传统的产量品质相关性。通过过表达该基因可以提高纤维细胞中的蔗糖含量，可促进 棉纤维伸长。由此推断，以本发明棉花固醇载体蛋白基因作为靶基因进行转基因研宄，有望 改善棉纤维品质。
[0017] (2)本发明基因组全长序列是PCR(TAIL-PCR)技术获得的，该技术具有起始模板 量小，试验步骤简单易行而且灵敏度高的优点。
[0018] (3)本发明所克隆的基因从结构上来看更类似于拟南芥的固醇载体蛋白基因，在 棉花中前人还未探讨过其功能。
[0019] (4)定量RT-PCR结果表明该基因在纤维发育特异表达，在不同时期表达量有差 异，该基因在根，茎，叶，子叶和花器官中不表达，在纤维起始时期即开始表达，在纤维快速 伸长时期表达量最高（5、10天），但是到了纤维快速伸长和次生壁增厚时期表达量逐渐下 降（15、20和25天），这一结果证明了该基因与纤维发育过程密切相关。
[0020] (5)构建植物反义表达载体对陆地棉进行转基因研宄，表达分析发现该基因的 表达被显著抑制，转基因植株出现绒长变短的表型，反义转基因植株纤维平均比对照短 2. 7mm，使该基因与棉纤维发育相关的功能得到直接验证。
[0021] (6)总糖和各种糖含量测定发现，转基因植株中的总糖含量，葡萄糖，果糖和蔗糖 含量都明显降低，特别是蔗糖含量降低显著，说明这个基因与蔗糖运输的密切相关，使该基 因参与蔗糖运输的功能得到直接验证。
【附图说明】
[0022] 图I 28k_178_All和AtSCP2的氨基酸序列比对和分析，说明GhSCP2D 属于固醇载 体蛋白家族基因。
[0023] AtSCP2(NC_003076.8)为拟南芥固醇载体蛋白基因，固醇载体蛋白（SCP)结构域 和过氧化物酶体信号肽I(PTSl)分别使用蓝色和红色框标注。
[0024] 图2组织表达分析，定量RT-PCR检测棉花固醇载体基因（GhSCP2D)在棉花不同组 织表达特点。
[0025] 1-5分别为棉花根、茎、叶、子叶和花器官；6-10分别为棉花5、10、15、20、2?ΡΑ的 纤维；11-16分别为0、5、10、15、20、2?ΡΑ的胚珠，平均值和标准差根据三个重复计算。
[0026] 图3转基因植株PCR检测，卡那和目的基因的双重检测初步表明该基因反义载体 已导入棉花。
[0027] NPT-II基因为卡那抗性标记基因；M、P、C分别为分子量Marker、质粒阳性对照、受 体阴性对照；1-6是以35S为启动子的反义表达载体的转基因植株。
[0028] 图4 GhSCP2D在转基因棉花中的表达分析。
[0029] 受体WO为对照，103, 108和150分别为转基因纯合株系。1-4分别为ODPA胚珠、 OTPA纤维、10DPA纤维和15DPA纤维。平均值和标准差根据三个重复计算，**表示在0. 01 水平的显著差异。
[0030] 图5转基因植株和受体WO的纤维长度比较，表明反义转基因植株的纤维长度变 短。
[0031] 103,108和150分别是三个转基因纯合株系，NPT II和WO分别表示转pBI 121空质 粒的转基因植株和非转基因受体WO。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1棉花固醇载体蛋白全长序列的获得：
[0033] 本实验利用 SAM (Significant Analysis of Microarray)软件的 multiclass 方 法对28k棉花芯片上10, 902个基因不同时期的信号强度分析，得到了 6, 186个时期差异表 达基因（q-value < 5% )。对6, 186个时期差异表达基因的11个时期平均最高信号强度 值和次之信号值利用t-test方法（P〈0. 05)和1. 5倍差异标准筛选，最终得到了 192个时 期特异表达的基因。其中有一个CDS序列28k_178_All，在纤维不同发育时期差异表达异常 显著。根据这个CDS序列，我们设计引物，从陆地棉中分别扩增该基因的ORF全长和基因组 序列。扩增所用引物见表1。
[0034] 表1:扩增所用引物
[0035]
[0036] 实施例2棉花固醇载体蛋白的生物信息学初步分析
[0037] 生物信息学的初步分析发现28k_178_All的ORF推断氨基酸序列经 BLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)比较，发现其与拟南芥固醇载体蛋白基因 (AtSCP2)氨基酸序列具有很高同源性（77%)，命名为GhSCP2D。纤维发育的研宄表明糖的 运输和代谢在纤维发育中起着至关重要的作用。据此，我们推测棉花中的固醇载体蛋白基 因 GhSCP2D与棉纤维发育密切相关。
[0038] 在 NCBI 网站 CD Search 中（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)对该基因的保守结构域预测发现，GhSCP2D具有完整的固醇载体蛋白结构域。 在过氧化物酶体信号肽预测网站预测其信号肽（http://mendel. imp. ac. at/mendeljsp/ sat/ptsl/PTSlpredictor. jsp)发现，该基因具有过氧化物酶体信号肽I (PTSl)。
[0039] 实施例3棉花固醇载体蛋白基因的定量RT-PCR分析
[0040] 设计特异引物：
[0041] F2:5'-AAGGAGATGTTATCAAAGGTGAAT-3'（SEQ ID NO. 5)
[0042] R2:5'-AACCCCTCATAAAAGCAACC-3'（SEQ ID NO. 6)
[0043] 进行定量RT-PCR检测，结果表明该基因在根，茎，叶，子叶和花器官不表达，在纤 维发育各不同时期差异表达（图1)，在纤维起始即开始表达（开花前3天），随后表达量逐 渐提高，在纤维快速伸长期（开花后5和10天）表达量最高，随后表达量逐渐下降。
[0044] 实施例4棉花固醇载体蛋白基因的转基因功能验证
[0045] pBI121是一种传统的植物双元表达载体，其启动子为35S启动子。以此为基础构 建了 35S启动子的反义双元载体，反义片段的插入位置为35S - P (启动子）与Nos-T (终 止子）之间。
[0046] 以本发明基因 SEQ NO ID. 1序列全长片段构建反义植物表达载体，具体过程如 下：
[0047] 1.含有366bp目的片段的克隆载体经BamH I，SacI酶切，回收片段；pBI121表达 载体经BamH I，SacI酶切，切除Gus基因，回收大片段（约13kb)。由于BamH I和SmaI均 为平末端，366bp目的片段和经酶切回收的pBI121表达载体大片段连接就将反义片段构建 到了 PBI121载体上。
[0048] 2.通过农杆菌介导法转化棉花进行功能验证，获得35S启动子反义转基因植株。 反义转基因植株均已通过PCR鉴定：35S启动子反义转基因植株扩增得到289bp阳性条带， (图4)。表达分析发现在转基因植株中该基因的表达被显著抑制，纤维长度变短，反义转基 因植株纤维平均比对照短3. 7mm，使该基因与棉纤维发育相关的功能得到直接验证（图5)。
[0049] 实施例5棉花固醇载体蛋白基因的转基因植株中糖含量测定
[0050] 取转基因植株和受体的开花后5天和10天的纤维，参照Xiang等人（2008)的方 法，测定转基因植株中的糖含量，发现转基因植株中的总糖含量，葡萄糖，果糖和蔗糖含量 都明显降低，特别是蔗糖含量降低显著，在三个转基因株系中分别降低25. 11%，26. 06% 和29. 98%，说明这个基因与蔗糖运输的密切相关（表2)。
[0051] 表 2
[0052]
【主权项】
1. 固醇载体蛋白基因GhSCP2D，其特征在于该基因ORF序列为：SEQIDNO. 1。2. 根据权利要求1固醇载体蛋白基因GhSCP2D，其特征在于该基因基因组序列为SEQ IDNO. 2 〇3. 含有权利要求1所述的固醇载体蛋白基因GhSCP2D的重组表达载体。4. 权利要求1所述的固醇载体蛋白基因GhSCP2D在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖 运输中的应用。5. 权利要求1所述的固醇载体蛋白基因GhSCP2D在改良棉花纤维伸长中的应用。
【专利摘要】本发明公开了棉花的固醇载体蛋白基因及其应用。固醇载体蛋白基因Gh SCP2D，该基因ORF序列为：SEQ ID NO.1；该基因基因组序列为SEQ ID NO.2。构建植物反义表达载体对陆地棉进行转基因研究，表达分析发现该基因的表达被显著抑制，转基因植株出现绒长变短的表型，蔗糖含量降低显著。说明本发明固醇载体蛋白基因Gh SCP2D可在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运输和改良棉花纤维伸长中应用。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN104894141
【申请号】CN201510254831
【发明人】张天真, 张志远
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及棉花的固醇载体蛋白基因及其应用。 技术背景
[0002] 棉花作为世界性的重要经济作物，产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。由于 纺织工业发展的不断加快，要求适应各种需求的更整齐的棉纤维，再加上人们保健意识的 增强和生活水平的提高，对棉纤维品质改良的要求愈加迫切。
[0003] 近10年来，棉花育种从侧重外在品质转变为侧重内在品质。目前，国内外除了利 用常规育种手段外，还逐步运用遗传工程对棉纤维品质进行遗传改良，而此项工作的展开 首先依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的识别与分离。
[0004] 棉纤维发育过程有几千个基因表达，其相关基因的分离鉴定以及调控研宄起步较 晚，但进展很快。自从John和Cr 〇w(1992)首次报道运用CDNA文库差异筛选方法克隆纤维 特异表达基因 E6后，先后有数十个纤维发育相关基因被分离出来。目前大部分的纤维发育 相关基因主要是通过DNA或cDNA克隆的随机测序、文库差异筛选和mRNA差异显示等方法 获得。从目前国内外的研宄进展来看，已克隆的棉纤维发育相关基因有100多个，且多数是 在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异表达，利用分子生物学方法改良棉纤维的尽管有一定的 进展，但是潜力还远没有发挥。
[0005] 固醇载体蛋白（SCP2)是作为一个蛋白结构域，在体外能提高脂类在膜之间的转 运。最初人们认为固醇载体蛋白只是一类固醇结合蛋白，但是最近的研宄发现它也能结合 憐脂、脂肪酸和脂醜CoA。动物和昆虫的固醇载体蛋白最初存在5个标准的β折萱和5个 α螺旋。C-端的部分β折叠和4个α螺旋形成疏水通道，有利于与脂类结合（Choinowski et al·，2000 ;Haapalainen et al·，2001 ;Dyer et al·，2003)。尽管固醇载体蛋白在哺乳 动物细胞中研宄了很多，但是其生物学功能到现在还不是很清楚（Gallegos et al.，2001 ; Seedorf et al. , 2000 ；Stolowich et al. , 2002) 〇 一种假说认为固醇载体蛋白参与胆固 醇在细胞质中的转移，然而还有些人认为固醇载体蛋白参与脂肪酸的过氧化物酶体氧化。 在其他真核生物中也发现了含有SCP2的多结构域蛋白。UNC-24线虫中的含有SCP2结构 域的溴化丙胺太林基因 （Barnes et al.，1996)。在丛枝菌根真菌中的DBP中发现了 SCP2 结构域（Requena et al.，1999)。在黄热病蚊子埃及伊蚊中发现在SCP-X基因中发现了非 融合的 SCP2 结构域（Krebs and Lan, 2003 ;Lan and Wessely, 2004)。在植物（Edqvist et al.，2〇〇4)，酵母（Szabo et al.，I989 ;Hwang et al.，1"1)，古菌（Kawashima et al.，2000)和细菌中，SCP2作为单独的一个基因存在。
[0006] Johan Edqvist等（2004)首先从拟南芥中克隆到第一个与哺乳动物具有高度相 似的固醇载体蛋白，命名为AtSCP2。该蛋白与人类D型双功能蛋白（DBP)中的SCP2-like 具有35%的相似度和56%相似性。与人类SCP2具有30%的相似度和54%相似性。通 过研宄AtSCP2晶体结构发现，它具有一个特别适合脂类结合的疏水性的配体结合位点。 AtSCP2在体外具有转移氟硼二吡咯-卵磷脂（B0DIPY-PC)的活性。但是这种转移活性被 1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱或麦角留醇完全抑制。而二肉豆蔻酰磷脂酸（Dimyristoyl phosphatidic acid)、豆留醇（stigmasterol)、固醇葡糖苷（steryl glucoside)和胆固醇 (cholesterol)对于这种转移能力的影响较弱。而单链棕榈酸（single chain palmitic acid)和硬脂酰辅酶A对转移没有影响。AtSCP2的mRNA在拟南芥的大部分组织中都积累。 亚细胞定位结果显示该蛋白定位于过氧化物酶体（Edqvist et al.，2004)。
[0007] Zheng等人（2010)研宄拟南芥中固醇载体蛋白（AtSCP2)的突变体时发现，AtSCP2 对于拟南芥的种子发育和幼苗的建成具有重要的作用。他们在不添加蔗糖培养基上， AtSCP2突变体与野生型相比，根和下胚轴明显变短，子叶莲座直径也明显变小。而在添加蔗 糖的情况下，AtSCP2突变体与野生型相比生长情况几乎没有差别。他们还发现AtSCP2在拟 南芥中的表达部位主要有胚乳、胚、48小时子叶的维管束，莲座叶的绒毛、花托、萼片和花瓣 的维管束、心皮的柱头和雌蕊、花丝和花粉，并且这个基因在幼苗时期受蔗糖诱导表达。但 该基因在棉花纤维中的作用尚未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供棉花的固醇载体蛋白基因。
[0009] 本发明的另一目的是提供该基因的应用。
[0010] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0011] 固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D，该基因 ORF序列为：SEQ ID NO. 1 ;该基因基因组序 列为 SEQ ID NO. 2。
[0012] 含有本发明所述的固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D的重组表达载体。
[0013] 本发明所述的固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运 输中的应用。
[0014] 本发明所述的固醇载体蛋白基因 Gh SCP2D在改良棉花纤维伸长中的应用。
[0015] 有益效果：
[0016] (1)本发明所克隆的基因编码固醇载体蛋白，固醇载体蛋白与棉纤维伸长时期的 蔗糖运输密切相关，是碳运输途径中的关键基因。这样本发明所克隆的基因与棉纤维的品 质有着直接的联系。由于蔗糖是在纤维伸长时期是维持细胞膨压的可溶性糖来源，又是合 成细胞壁的原料。因此，过量表达该基因理论上可使纤维素含量增加，纤维品质得到改变， 打破传统的产量品质相关性。通过过表达该基因可以提高纤维细胞中的蔗糖含量，可促进 棉纤维伸长。由此推断，以本发明棉花固醇载体蛋白基因作为靶基因进行转基因研宄，有望 改善棉纤维品质。
[0017] (2)本发明基因组全长序列是PCR(TAIL-PCR)技术获得的，该技术具有起始模板 量小，试验步骤简单易行而且灵敏度高的优点。
[0018] (3)本发明所克隆的基因从结构上来看更类似于拟南芥的固醇载体蛋白基因，在 棉花中前人还未探讨过其功能。
[0019] (4)定量RT-PCR结果表明该基因在纤维发育特异表达，在不同时期表达量有差 异，该基因在根，茎，叶，子叶和花器官中不表达，在纤维起始时期即开始表达，在纤维快速 伸长时期表达量最高（5、10天），但是到了纤维快速伸长和次生壁增厚时期表达量逐渐下 降（15、20和25天），这一结果证明了该基因与纤维发育过程密切相关。
[0020] (5)构建植物反义表达载体对陆地棉进行转基因研宄，表达分析发现该基因的 表达被显著抑制，转基因植株出现绒长变短的表型，反义转基因植株纤维平均比对照短 2. 7mm，使该基因与棉纤维发育相关的功能得到直接验证。
[0021] (6)总糖和各种糖含量测定发现，转基因植株中的总糖含量，葡萄糖，果糖和蔗糖 含量都明显降低，特别是蔗糖含量降低显著，说明这个基因与蔗糖运输的密切相关，使该基 因参与蔗糖运输的功能得到直接验证。
【附图说明】
[0022] 图I 28k_178_All和AtSCP2的氨基酸序列比对和分析，说明GhSCP2D 属于固醇载 体蛋白家族基因。
[0023] AtSCP2(NC_003076.8)为拟南芥固醇载体蛋白基因，固醇载体蛋白（SCP)结构域 和过氧化物酶体信号肽I(PTSl)分别使用蓝色和红色框标注。
[0024] 图2组织表达分析，定量RT-PCR检测棉花固醇载体基因（GhSCP2D)在棉花不同组 织表达特点。
[0025] 1-5分别为棉花根、茎、叶、子叶和花器官；6-10分别为棉花5、10、15、20、2?ΡΑ的 纤维；11-16分别为0、5、10、15、20、2?ΡΑ的胚珠，平均值和标准差根据三个重复计算。
[0026] 图3转基因植株PCR检测，卡那和目的基因的双重检测初步表明该基因反义载体 已导入棉花。
[0027] NPT-II基因为卡那抗性标记基因；M、P、C分别为分子量Marker、质粒阳性对照、受 体阴性对照；1-6是以35S为启动子的反义表达载体的转基因植株。
[0028] 图4 GhSCP2D在转基因棉花中的表达分析。
[0029] 受体WO为对照，103, 108和150分别为转基因纯合株系。1-4分别为ODPA胚珠、 OTPA纤维、10DPA纤维和15DPA纤维。平均值和标准差根据三个重复计算，**表示在0. 01 水平的显著差异。
[0030] 图5转基因植株和受体WO的纤维长度比较，表明反义转基因植株的纤维长度变 短。
[0031] 103,108和150分别是三个转基因纯合株系，NPT II和WO分别表示转pBI 121空质 粒的转基因植株和非转基因受体WO。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1棉花固醇载体蛋白全长序列的获得：
[0033] 本实验利用 SAM (Significant Analysis of Microarray)软件的 multiclass 方 法对28k棉花芯片上10, 902个基因不同时期的信号强度分析，得到了 6, 186个时期差异表 达基因（q-value < 5% )。对6, 186个时期差异表达基因的11个时期平均最高信号强度 值和次之信号值利用t-test方法（P〈0. 05)和1. 5倍差异标准筛选，最终得到了 192个时 期特异表达的基因。其中有一个CDS序列28k_178_All，在纤维不同发育时期差异表达异常 显著。根据这个CDS序列，我们设计引物，从陆地棉中分别扩增该基因的ORF全长和基因组 序列。扩增所用引物见表1。
[0034] 表1:扩增所用引物
[0035]
[0036] 实施例2棉花固醇载体蛋白的生物信息学初步分析
[0037] 生物信息学的初步分析发现28k_178_All的ORF推断氨基酸序列经 BLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)比较，发现其与拟南芥固醇载体蛋白基因 (AtSCP2)氨基酸序列具有很高同源性（77%)，命名为GhSCP2D。纤维发育的研宄表明糖的 运输和代谢在纤维发育中起着至关重要的作用。据此，我们推测棉花中的固醇载体蛋白基 因 GhSCP2D与棉纤维发育密切相关。
[0038] 在 NCBI 网站 CD Search 中（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)对该基因的保守结构域预测发现，GhSCP2D具有完整的固醇载体蛋白结构域。 在过氧化物酶体信号肽预测网站预测其信号肽（http://mendel. imp. ac. at/mendeljsp/ sat/ptsl/PTSlpredictor. jsp)发现，该基因具有过氧化物酶体信号肽I (PTSl)。
[0039] 实施例3棉花固醇载体蛋白基因的定量RT-PCR分析
[0040] 设计特异引物：
[0041] F2:5'-AAGGAGATGTTATCAAAGGTGAAT-3'（SEQ ID NO. 5)
[0042] R2:5'-AACCCCTCATAAAAGCAACC-3'（SEQ ID NO. 6)
[0043] 进行定量RT-PCR检测，结果表明该基因在根，茎，叶，子叶和花器官不表达，在纤 维发育各不同时期差异表达（图1)，在纤维起始即开始表达（开花前3天），随后表达量逐 渐提高，在纤维快速伸长期（开花后5和10天）表达量最高，随后表达量逐渐下降。
[0044] 实施例4棉花固醇载体蛋白基因的转基因功能验证
[0045] pBI121是一种传统的植物双元表达载体，其启动子为35S启动子。以此为基础构 建了 35S启动子的反义双元载体，反义片段的插入位置为35S - P (启动子）与Nos-T (终 止子）之间。
[0046] 以本发明基因 SEQ NO ID. 1序列全长片段构建反义植物表达载体，具体过程如 下：
[0047] 1.含有366bp目的片段的克隆载体经BamH I，SacI酶切，回收片段；pBI121表达 载体经BamH I，SacI酶切，切除Gus基因，回收大片段（约13kb)。由于BamH I和SmaI均 为平末端，366bp目的片段和经酶切回收的pBI121表达载体大片段连接就将反义片段构建 到了 PBI121载体上。
[0048] 2.通过农杆菌介导法转化棉花进行功能验证，获得35S启动子反义转基因植株。 反义转基因植株均已通过PCR鉴定：35S启动子反义转基因植株扩增得到289bp阳性条带， (图4)。表达分析发现在转基因植株中该基因的表达被显著抑制，纤维长度变短，反义转基 因植株纤维平均比对照短3. 7mm，使该基因与棉纤维发育相关的功能得到直接验证（图5)。
[0049] 实施例5棉花固醇载体蛋白基因的转基因植株中糖含量测定
[0050] 取转基因植株和受体的开花后5天和10天的纤维，参照Xiang等人（2008)的方 法，测定转基因植株中的糖含量，发现转基因植株中的总糖含量，葡萄糖，果糖和蔗糖含量 都明显降低，特别是蔗糖含量降低显著，在三个转基因株系中分别降低25. 11%，26. 06% 和29. 98%，说明这个基因与蔗糖运输的密切相关（表2)。
[0051] 表 2
[0052]
【主权项】
1. 固醇载体蛋白基因GhSCP2D，其特征在于该基因ORF序列为：SEQIDNO. 1。2. 根据权利要求1固醇载体蛋白基因GhSCP2D，其特征在于该基因基因组序列为SEQ IDNO. 2 〇3. 含有权利要求1所述的固醇载体蛋白基因GhSCP2D的重组表达载体。4. 权利要求1所述的固醇载体蛋白基因GhSCP2D在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖 运输中的应用。5. 权利要求1所述的固醇载体蛋白基因GhSCP2D在改良棉花纤维伸长中的应用。
【专利摘要】本发明公开了棉花的固醇载体蛋白基因及其应用。固醇载体蛋白基因Gh SCP2D，该基因ORF序列为：SEQ ID NO.1；该基因基因组序列为SEQ ID NO.2。构建植物反义表达载体对陆地棉进行转基因研究，表达分析发现该基因的表达被显著抑制，转基因植株出现绒长变短的表型，蔗糖含量降低显著。说明本发明固醇载体蛋白基因Gh SCP2D可在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运输和改良棉花纤维伸长中应用。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN104894141
【申请号】CN201510254831
【发明人】张天真, 张志远
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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