调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D的制作方法
调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种调控花青素合成与代谢的小麦新基 因 TaMYB7D〇
【背景技术】
[0002] 花青素是植物中重要的次生代谢产物，参与了广泛的生物学过程（Beckwith et al.，2004 ;Downs and Siegelman，1963 ;Lo and Nicholson，1998 ;Vinterhalter et al.， 2007;Zhou and Singh，2002)。作为食物，花青素不仅是优良的食品添加剂，而且具有抗心 率失调，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖症，糖尿病的发病率（Lietti et al.，1976)。因 此人们需要更多来自水果、蔬菜以及粮食中的花青素（Boyd，2000)，但由于饮食习惯和经济 方面的原因，水果和蔬菜并不能为人们提供足够的花青素 （Butelli et al.，2008)。
[0003] 植物体内花青素合成与代谢的控制主要是通过调控结构基因的表达量来实现的 (Davies and Schwinn，2003)。转录因子WD40、bHLH和MYB形成一个转录调控复合体，调控 着结构基因的表达量，从而控制花青素的合成与代谢（Hernandez et al.，2004)。
[0004] MYB类转录因子是一类DNA结合蛋白，它们在结构上都有一段保守的MYB结构域。 MYB结构域是一段序列特异的能够结合DNA的区域，约由52个氨基酸构成，呈现螺旋-转 角-螺旋的构象。根据MYB结构域数目的差异将MYB类转录因子分为，（1)单一 MYB结构域 汊1/2)蛋白；（2)2个重复1^8结构域〇?21?3)蛋白；（3)3个重复1^8结构域〇?11?21?3)蛋白。 植物中绝大多数的MYB蛋白有2个重复MYB结构域（R2R3) (Martin and Paz-Ares，1997)。 这些MYB蛋白调控了植物中多种生理过程，如毛状体发育（GhMYB109)(Suo et al.，2003)， 圆锥细胞发育（AmMYBMIXTA) (Sugimoto et al·，2000)，茎形态发生（AtMYB13) (Kirik et al.，1998)，赤霉素信号转导（AtMYB33, AtMYB65, AtMYBlOl) (Gocal et al.，2001)，脱水反 应与 ABA 调节（AtMYB2) (Abe et al·，2003 ;Urao et al·，1996)，色氨酸生物合成（ATRl) (Celenza et al.，2005)，调节细胞周期（AtCDC5) (Lin et al.，2007)等。其中的一个分支 调控了花青素合成代谢的生理过程，如ZmCl，PhAN2(Hsuchen and Coe，1973;Shimada et al.，2007) 〇
[0005] MYB类基因对花青素生物合成结构基因的调控一般需要bHLH基因家族成员的参 加。例如，ZmCl和ZmPL对花青素合成代谢的调节需要bHLH基因 ZmR或ZmB参加。ZmCl和 ZmR编码的蛋白通过与BZl (花青素合成代谢的结构基因）启动子的顺式元件直接结合，从 而实现对BZl基因表达的调控（Roth et al.，1991)。虽然单独的ZmCl蛋白能够结合到结 构基因启动子序列的转录元件上，但是只有ZmCl并不能产生转录活性。它还需要ZmR存在， 才能产生转录活性（Lloyd et al.，1992)。bHLH转录因子是通过激活某种未知的能够结合 到结构基因的CIS元件，或者通过从抑制因子上释放ZmCl，从而达到调控花青素合成的目 的（Heine et al.，2004)。也有极少数的MYB转录因子只要其自身过表达就能够诱导花青 素的合成，而不需要bHLH转录因子的协作，如VvMYBAI。利用基因枪介导的瞬时表达技术 单独将VvMYBAI在葡萄的胚性愈伤组织中表达时，能够诱导花青素的合成（Cutanda-Perez et al.，2009)。这一过程不依赖于bHLH转录因子。
[0006] 调控花青素合成的MYB类调控蛋白的DNA结合序列虽然高度相似，但具有特异性。 玉米的ZmCl和ZmR不能够诱导番前果实产生花青素 （Bovy et al.，2002)，而金鱼草中的 AmDel (bHLH) and AmROSEAl(MYB)确能够使得果实呈现紫色。玉米中花青素类化合物生物 合成需要两个早期结构基因 CHSXHI和一个后期结构基因 DFR的表达。这三个结构基因不 受ZmCl和ZmR或ZmCl和ZmB调控，而受单拷贝MYB基因 ZmP的调节（Grotewold et al.， 1991 ;Grotewoldet al.，1994)。研宄发现ZmP蛋白所结合的DNA序列为CCT/AACC，与动物 MYB蛋白的结合序列（C/TAA)有显著差别。P蛋白对DFR启动子激活的前提是有蛋白质的 结合位点。玉米的BZl启动子含有ZmCl结合点，可以被ZmCl激活，但不能被P蛋白活化 (Grotewold et al·，1991 ;Grotewold et al·，1994)。不同植物中的结构基因启动子序列 也有所差异。玉米ZmCl和ZmB基因能够诱导玉米悬浮细胞合成花青素，但是不能够诱导葡 萄胚性愈伤组织细胞产生花青素。这种调控花青素合成与代谢的MYB类转录因子的功能分 化给基因工程改变植物体内的花青素含量和认识自然中与花青素相关性状的变异提供了 机遇和挑战。在小麦中控制红粒性状的主效基因定位于3AL、3BL和3DL染色体，蓝粒性状 定位于4E染色体，紫粒性状定位于2AL和7BL染色体，紫杆性状定位于7BS和7DS，紫色胚 芽鞘定位于7AS，7BS和7DS染色体，紫色花药性状定位于7DS染色体上，紫色叶耳和叶基定 位于10、20、48、68染色体上（刘宝龙，2009)。更多1^8类转录因子的克隆与功能验证将为 解释自然界中颜色性状的差异，和基因工程改良作物提供更多的选择。
【附图说明】
[0007] 图1为PCR扩增Rc位点MYB基因电泳图；
[0008] 图2为高原115、中国春（CS)、Opata、W7984中Rc位点存在的MYB基因的基因组 序列；
[0009] 图3为保守引物TaMYB7-ATG和TaMYB7-TAA PCR扩增高原115、中国春、Opata以 及W7984胚芽鞘cDNA电泳图；
[0010] 图4为TaMYB7D编码区序列及推测的氨基酸序列（阴影部分为保守的R2R3-MYB 结构域，字体大一号的W为MYB结构域保守的色氨酸残基，横线部分表示与bHLH蛋白作用 的D/ELx2R/Kx 3Lx6Lx3Rg构元件，虚线部分为可能的转录激活区）
[0011] 图 5 为植物中 MYB 蛋白系统进化树（AmMIXTA，CAA55725 ;AmR0SEAl，ABB83826 ; AmR0SEA2, ABB83827 ;AmVEN0SA，ABB83828 ;AtCPC，NP_182164 ;AtETC，NP_171645 ;AtFLP， NP_563948 ；AtGLl, AAC97387 ；AtMYB12, ABB03913 ；AtMYB61, NP_172425 ；AtPAPl, ABB03879 ； AtTRY， NP_200132 ;AtTT2, Q9FJA2;AtWER， AAF18939 ;CaA， CAE75745 ;DcMYBl， BAE54312 ; FaMYBl，AAK84064 ;GMYB10, CAD87010 ;LeANTl，AAQ55181 ;MdMYBl-l，ABK58136 ;MdMYBl-2， ABK58137 ;MdMYBl-3, ABK58138 ;NtMYB2, BAA88222 ;PhAN2, AAF66727 ;Ph0D01，AAV98200 ; VvMYB5a, AAS68190 ；VvMYBAl, BAD18977 ；VvMYBA2, BAD18978 ；ZmCl, AAA33482 ；and ZmPL AAA19821 JaMYB-DL KP136432)；
[0012] 图6为植物中部分与花青素合成相关的MYB基因结构图（VvMYBAl，ABllllOl ; ZmCl, AF320613 ；MdMYBl, DQ222406 ；AtTT2, NC 003076 ；VvMYB5a, NC_012014. 3 ；and AtTRIPTYCHON，NC_003076. 8 ;TaMYB-7D，KP136432);
[0013] 图7为TaMYB_7D在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位示意图；
[0014] 图8为高原115不同时期的胚芽鞘TaMYB-7D及结构基因表达分析图（Light表示 光照条件下，Dark表示暗处理条件下，数字2-6代表种子萌发后的天数）
[0015] 图9为Opata不同时期的胚芽鞘TaMYB_7A及结构基因表达分析图（Light表示光 照条件下，Dark表示暗处理条件下，数字2-6代表种子萌发后的天数）
[0016] 图10为小麦胚芽鞘中的瞬时表达示意图；
[0017] 图11为RIL群体胚芽鞘颜色与TaMYB_7D表达的连锁分析图。
【发明内容】
[0018] 本发明通过拟南芥和玉米中与花青素合成相关的MYB基因 AtTT2和ZmCl序列在 普通小麦基因组测序数据库、乌拉尔图小麦（AA)基因组数据库和节节麦（DD)基因组数据 库中进行同源搜索，7AS、7BS、7DS上各存在一个与MYB基因高度同源的重叠群序列。针对 7AS、7BS、7DS上MYB基因的特异引物设计MYB基因第7同源群的保守引物TaMYB7-ATG (A TGGGGAGGAGGGCGTGCTGTGCCAAGGA)和 TaMYB7-TAA(TTAACCGGCCATGTGCAGGGACTTGAGCC)，从 小麦品种高原115基因组中分离了 3个MYB基因并定位于7A、7B、7D染色体，即TaMYB-7A、 TaMYB-7B、TaMYB-7D，而白色胚芽鞘品种中国春和Opata中仅分离到TaMYB-7A。RT-PCR分析 表明小麦品种高原115紫色胚芽鞘中仅TaMYB_7D基因表达，而在小麦品种中国春和Opata 白色胚芽鞘中没有检测到Rc (紫色胚芽鞘性状位点）基因的表达。同时TaMYB-7D还在高 原115紫色种皮中表达，而在无花青素合成的根、茎、叶中不表达。生物信息学分析表明 TaMYB-7D仅含有1个内含子，其编码蛋白含有2个连续的MYB结构域，为典型的R2R3-MYB 蛋白。植物MYB蛋白系统进化分析表明TaMYB-7D从属于调控花青素生物合成的MYB基因 分支，与玉米中调控花青素代谢的ZmCl亲缘关系较近，具有MYB DNA结合域和转录激活结 构域。
[0019] 亚细胞定位分析表明TaMYB_7D蛋白主要定位于细胞核。瞬时表达功能验证表明 单一的TaMYB-7D能够诱导白色胚芽鞘细胞产生少量花青素，但是单一的ZmR或ZmCl不能 使白色胚芽鞘细胞产生花青素。TaMYB-7D能在玉米的ZmR协同作用下使胚芽鞘细胞产生 大 量的花青素，并且在功能上可与ZmCl相互替代。
[0020] 通过对比光照下高原115和Opata不同时期胚芽鞘以及暗处理胚芽鞘中花青素的 积累量、TaMYB-7D以及结构酶基因的表达模式，发现TaMYB-7D的表达与胚芽鞘中花青素的 合成以及DFR(二羟基黄酮醇还原酶）的表达成正相关。因此很有可能光诱导了 TaMYB-7D 基因的表达，TaMYB-7D蛋白进入细胞核激活DFR基因的转录，从而促进高原115胚芽鞘中花 青素的合成。利用OpataX高原115重组自交系F8代群体研宄了紫色胚芽鞘性状的遗传 规律，表明紫色和白色胚芽鞘品系的分离比为1 : 1，符合F8代理论分离比例，由此推测高 原115紫色胚芽鞘性状由完全显性的单基因控制，同时发现胚芽鞘的颜色与TaMYB-7D的表 达之间呈现共分离现象，说明它们之间是连锁的。以上结果表明TaMYB-7D是控制高原115 紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0021] 本发明揭示了光诱导的小麦TaMYB7D基因具有调控花青素合成代谢的MYB类转录 因子的转录活性，并且是小麦品种高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
[0022] 具体地，在一方面，本发明涉及调控花青素合成与代谢的小麦新基因 TaMYB7D，其 核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示的序列。
[0023] 优选地，基因 TaMYB7D的编码序列为SEQ ID NO :2所示的序列。
[0024] 在本发明的另一个方面，涉及基因 TaMYB7D所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3所示的序列。
[0025] 在本发明的又一个方面，涉及一种重组载体，其包含权利要求1或2所述的基因 TaMYB7D〇
[0026] 在本发明的另一个方面，涉及一种宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的基因 TaMYB7D或权利要求4所述的重组载体，所述宿主细胞是植物细胞或微生物细胞。
[0027] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求1或2所述的基因在转化植物获得转基因 植物中的应用。
[0028] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求1或2的基因在调控花青素合成与代谢中 的应用，其中载体pBract214的序列号为SEQ ID N0:4。
[0029] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求3所述的蛋白在调控花青素合成与代谢中 的应用，其中载体pBract214的序列号为SEQ ID N0:4。
[0030] 在本发明的另一个方面，涉及一种调控小麦中花青素合成与代谢的方法，包括将 权利要求1或2所述的基因与ZmR基因共转染到小麦中，使权利要求1或2所述的基因和 ZmR基因进行表达，其中所述ZmR基因与pBract214载体的序列为SEQ ID NO :5所示的序 列。
[0031] 在本发明的另一个方面，涉及一种培育转染权利要求1或2所述基因的植株的方 法，包括构建含权利要求1或2所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化小麦 细胞；和将转化的小麦细胞培育成转基因小麦。
[0032] 本发明的有益效果如下：本发明将TaMYB7D定位于小麦7D染色体上，蛋白质产 物亚细胞定位于细胞核。推导的氨基酸序列表明TaMYB3编码一个调控花青素合成代谢的 MYB类转录因子。紫色籽粒小麦品种高原115胚芽鞘中TaMYB7D能够在光的诱导下表达量 上调。瞬时表达时，TaMYB7D高原115籽粒的果皮细胞合成花青素。此外，胚芽鞘的颜色与 TaMYB-7D的表达之间呈现共分离现象，这表明TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的转录活 性，并且是高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
【具体实施方式】
[0033] 下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例 仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。
[0034] 实施例1 :TaMYB7D基因的克隆
[0035] 所有的实验材料购自中国科学院西北高原生物研宄所。所有用于DNA和RNA提取 的样品都在取样后，液氮迅速冷冻并保存在-80冰箱中。所有的核苷酸序列测定都是在深 圳华大基因有限公司完成。DNA的提取采用CTAB法（Murray and Thompson，1980)，RNA的 提取采用改进的Trizon法（Li and Trick，2005)。质粒提取使用北京博大泰克生物基因 技术有限公司的试剂盒（中国）。核苷酸和蛋白序列比对使用软件Vector NTI Advance 10. 0(http ://www. invitrogen. com/)。蛋白系统发生树构建使用软件 MEGA 4. 0(http :// www. megasoftware· net/)。基因图绘制使用 GSDS 软件（http ://gsds. cbi. pku. edu. cn/ help.php)〇
[0036] 本发明通过拟南芥和玉米中与花青素合成相关的MYB基因 AtTT2和ZmCl序列在 普通小麦基因组测序数据库、乌拉尔图小麦（AA)基因组数据库和节节麦（DD)基因组数据 库中进行同源搜索，7AS、7BS、7DS上各存在一个与MYB基因高度同源的重叠群序列。针对 7AS、7BS、7DS上MYB基因的特异引物设计MYB基因第7同源群的保守引物TaMYB7-ATG (ATG GGGAGGAGGGCGTGCTGTGCCAAGGA)和 TaMYB7-TAA(TTAACCGGCCATGTGCAGGGACTTGAGCC)。
[0037] 在小麦品种高原115(紫色胚芽鞘）、中国春（白色胚芽鞘）、Opata(白色胚芽鞘） 和W7984基因组DNA(紫色胚芽鞘）中进行PCR扩增，琼脂糖电泳后均得到了一条约850bp 左右的条带（图1)。分别进行目的带的回收、T-载体克隆，每个品种分别送20个阳性克隆 进行测序。
[0038] 测序后序列经过拼接比对，发现在小麦品种高原115中存在三个高度同源的Rc基 因序列，而在中国春、Opata和W7984中只测到一个基因序列，在NCBI中进行blast表明 它们均为MYB基因序列。在中国春和Opata中得到的序列与高原115中的一个序列几乎 完全一致，而在W7984中得到的序列与高原115中另一个序列完全一致。为了确定该结果 是否准确，该实验从PCR扩增基因组DNA开始到最后测序均重复一次，得到的结果依然如 此。通过与基因组数据库中拿到的重叠群进行比对，将其分别命名为TaMYB-7A、TaMYB-7B、 TaMYB-7D。其中存在于高原115、中国春和Opata中的TaMYB-7A基因组序列均为866bp，且 高度相似，相似度达到99. 96%，只在第81个碱基处出现了一个G/C突变；存在于高原115 中的TaMYB-7B基因组序列为852bp ;存在于高原115和W7984中的TaMYB-7D基因组序列 完全相同，大小为872bp (图1)。
[0039] 在小麦种子萌发后3d剪取胚芽鞘并提取RNA，反转成cDNA，以微管蛋白基因 Tubulin为内标基因，利用保守全长引物TaMYB7-ATG和TaMYB7-TAA PCR扩增高原115、中 国春、Opata以及W7984胚芽鞘cDNA(图3)。从图中可以看出在高原115和W7984胚芽鞘 cDNA中扩增得到了一条750bp左右的条带，而在中国春和Opata胚芽鞘cDNA中没有扩增出 任何条带。
[0040] 实施例2 :TaMYB7D生物信息学分析
[0041] TaMYB7D的⑶S序列全长759bp，编码252个氨基酸（图4)。在其N-端有一个典 型的R2R3-MYB结构域，在R2结构域中规则分布3个色氨酸残基W，在R3结构域中规则分布 2个色氨酸残基W，同时在R3结构域中存在一个不完全相同的与bHLH蛋白作用的D/ELx 2R/ Kx3Lx6Lx3R结构元件；在C-端存在一个可能的转录激活区域。这表明TaMYB-7D有可能是一 个正调控的R2R3-MYB转录因子。
[0042] 择了已知的并进行了功能验证的MYB基因进行系统发生树分析，构建了包括金 鱼草、拟南芥、辣椒、胡萝卜、草莓、非洲菊、番茄、苹果、烟草、矮牵牛、葡萄、玉米以及小麦 中MYB转录因子的系统进化树（图5)。在系统进化树上TaMYB-7D与AtMYB12、AtTT2、 ZmCl、TaMYB10-A、TaMYB10-B、TaMYB10-D、TaMYB3、TaMYB320 聚为一类，所有这些基因均调 控植物中黄酮醇或花青素的生物合成。AtMYB12分别调控烟草咖啡酰奎宁酸和番茄黄酮 醇的合成（Luo et al.，2008)，同时也能够诱导小麦胚芽鞘中花青素的合成（Gao et al.， 2011) ;AtTT2是调控拟南芥中种皮原花青素生物合成的关键基因；TaMYB10-A、TaMYB10-B、 TaMYBlO-D与小麦红色种皮性状相关；ZmCl是玉米中发现的第一个与花青素合成有关的 MYB转录因子。这说明TaMYB-7D属于调控花青素合成类的MYB类转录因子。
[0043] TaMYB_7D的基因结构与其它植物的同源基因差异较大，在其基因结构内只含有1 个内含子，除了 TaMYB3基因外，其它调控花青素合成的MYB基因含有2个内含子（图6)。 TaMYB-7D-个内含子的丢失可能伴随着外显子区域部分编码区的删除，这可能就是导致其 编码的氨基酸序列变短的原因。TaMYB3和TaMYB-7D同时存在于小麦基因组中，分别定位于 第4和第7同源群，它们的基因结构以及在系统进化树上聚类关系都非常相似，基因编码区 序列的一致性达到74. 70%。
[0044] 实施例3 :TaMYB3蛋白的亚细胞定位
[0045] 利用带有GFP和35S启动子的pk7FWG2-R载体，将TaMYB-7D基因构建到pk7FWG2-R 载体上，通过基因枪转化法，将构建好的pk7FWG2-R-TaMYB-7D融合表达载体转入洋葱表皮 细胞。结果表明，在转化空载体pk7FWG2-R的洋葱表皮细胞中，GFP表达后激发的绿色荧光 分布于整个洋葱表皮细胞中；当转化重组质粒pk7FWG2-R-TaMYB-7D进入洋葱表皮细胞时， 只在细胞核和细胞膜上观察到绿色荧光（图7)。这表明TaMYB-7D除了定位于细胞核外，还 有可能定位于细胞膜。
[0046] 实施例4 :TaMYB3的表达受到光的诱导
[0047] 分别在恒温光照培养箱和暗培养箱中培养高原115和Opata的种子，在种子萌发 后，每隔24h观察胚芽鞘的颜色并照相。在光照条件下，高原115的种子在萌发后2d观察到 胚芽鞘中有紫色色素的积累，萌发后5d色素积累达到最大值；暗处理的高原115胚芽鞘中 几乎没有色素的积累（图8)。以微管蛋白基因 Tubulin为内标，通过RT-PCR分析了在高原 115不同时段的胚芽鞘中TaMYB-7D基因的表达模式，发现在光照条件下种子萌发后2d开始 TaMYB-7D基因均有非常强烈的表达，萌发后5d开始减弱；同时在暗处理3d的胚芽鞘中没 有TaMYB-7D基因的表达，这表明TaMYB-7D基因的表达是由光照控制的。从图8可以看出 TaMYB-7D的表达 模式与胚芽鞘中花青素的积累模式非常相似，暗示它们之间有一定的内在 联系。
[0048] RT-PCR分析了高原115和Opata不同时段的胚芽鞘中结构基因（CHS、CHI、F3H、 DFR)基因（表1)的表达模式（图8和图9)。结果发现在高原115和Opata中，光照和暗 处理胚芽鞘中CHS、CHI、F3H均表达且表达量较为一致；DFR在高原115的光照的胚芽鞘中 超量表达，其表达模式与TaMYB-7D非常相似，即萌发后2d开始有非常强烈的表达，萌发后 5d开始减弱，在暗处理的胚芽鞘中几乎没有表达（图9);在Opata中，DFR只在萌发后2d 和3d有微量的表达，几乎观察不到，其它时期没有DFR基因的表达（图9)。以上结果表明 光照调控TaMYB-7D基因的表达，而超量表达的TaMYB-7D转录因子进入细胞核与DFR基因 启动子区域的顺式作用元件结合激活下游DFR基因编码区的转录，从而调控胚芽鞘中花青 素的生物合成。
[0049] 表1实验所用引物名称和序列
[0050]
[0052] 实施例5 :TaMYB3基因调控花青素合成代谢的转录活性功能验证
[0053] 在MYB基因的进化关系上，TaMYB-7D与ZmCl、AtTT2等调控花青素合成的MYB 转录因子较近。大量文献资料表明ZmCl等MYB基因需要在bHLH的协同作用下才能够 调控花青素代谢（Ahmed et al.，2003;Himi&Noda，2005)。因此本发明中，将 TaMYB-7D、 211￡1、21]11?(玉米13!11^)构建到含有1113丨911；[1:;[11启动子的口1^^(^214瞬时表达载体上，利 用基因枪法转化小麦胚芽鞘进行瞬时表达。从图10可以看出，pBract214-TaMYB7D或者 pBract214-ZmCl与pBract214-ZmR共转时，Opata胚芽鞘细胞均有大量花青素斑点的产 生；单转 PBract214-TaMYB7D也能够诱导胚芽鞘细胞产生少量的花青素斑点；但是单转 pBract214_ZmCl、pBract214_ZmR或空载体pBract214均不能诱导Opata胚芽鞘细胞的花 青素合成。同时为了检测基因枪轰击时是否将质粒转化进入胚芽鞘细胞，用GUS染液侵泡 轰击后的胚芽鞘，发现在轰击后的胚芽鞘上均能观察到蓝色斑点的存在（图10)，表明质粒 均转化进胚芽鞘细胞。TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的功能，并且可能是小麦品种高原 115紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0054] 实施例6 :TaMYB7D的表达与紫色胚芽鞘的关联分析
[0055] F8代RIL(OpataX高原115)品系中紫色和白色的理论分离比例应该为 129 : 127,接近1 : 1，说明高原115的紫色胚芽鞘性状是由完全显性的单基因控制。这说 明高原115胚芽鞘中花青素的合成由一个完全显性的单基因控制。RIL群体胚芽鞘颜色与 TaMYB-7D表达之间的连锁分析，发现紫色胚芽鞘品系中均能用特异引物检测到TaMYB-7D 基因的表达，白色胚芽鞘品系中没有TaMYB-7D的表达（图11)，将PCR产物送样测序后表明 它们均是TaMYB-7D基因，胚芽鞘颜色的表现型与TaMYB-7D基因的表达之间出现共分离现 象说明TaMYB-7D与胚芽鞘颜色之间是连锁的。所有这些结果表明TaMYB-7D是Rc位点控 制小麦紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0056] 主要参考文献：
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【主权项】
1. 一种调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D，其特征在于：基因TaMYB7D的核 苷酸序列为SEQIDNO:1所示的序列。2. 根据权利要求1所述的一种调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D，其特征 在于：基因TaMYB7D的编码序列为SEQIDNO:2所示的序列。3. 根据权利要求1或2的所述的基因TaMYB7D所编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸 序列为SEQIDNO:3所不的序列。4. 一种重组载体，包含权利要求1或2所述的基因TaMYB7D。5. -种宿主细胞，包含权利要求1或2所述的基因TaMYB7D或权利要求4所述的重组 载体，所述宿主细胞是植物细胞或微生物细胞。6. 权利要求1或2所述的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。7. 权利要求1或2的基因在调控花青素合成与代谢中的应用，其中载体pBract214的 序列号为SEQIDNO:4。8. 权利要求3所述的蛋白在调控花青素合成与代谢中的应用，其中载体pBract214的 序列号为SEQIDNO:4。9. 一种调控小麦中花青素合成与代谢的方法，包括将权利要求1或2所述的基因与 ZmR基因共转染到小麦中，使权利要求1或2所述的基因和ZmR基因进行表达，其中所述ZmR 基因与pBract214载体的序列为SEQIDN0:5所不的序列。10. -种培育转染权利要求1或2所述基因的植株的方法，包括构建含权利要求1或2 所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化小麦细胞；和将转化的小麦细胞培 育成转基因小麦。
【专利摘要】本发明公开了一种从紫色籽粒小麦品种高原115中分离到的调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D，属于植物基因工程领域，TaMYB7D定位于小麦7D染色体上，蛋白质产物亚细胞定位于细胞核。推导的氨基酸序列表明TaMYB3编码一个调控花青素合成代谢的MYB类转录因子。紫色籽粒小麦品种高原115胚芽鞘中TaMYB7D能够在光的诱导下表达量上调。瞬时表达时，TaMYB7D高原115籽粒的果皮细胞合成花青素。此外，胚芽鞘的颜色与TaMYB-7D的表达之间呈现共分离现象，这表明TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的转录活性，并且是高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
【IPC分类】C12N1/15, C12N1/21, C12N1/19, C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00, C12N15/63, C12N5/10, C07K14/415
【公开号】CN104894142
【申请号】CN201510318786
【发明人】刘宝龙, 张怀刚, 刘登才, 张波, 陈文杰, 刘瑞娟, 魏乐, 李建民, 王延谦
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种调控花青素合成与代谢的小麦新基 因 TaMYB7D〇
【背景技术】
[0002] 花青素是植物中重要的次生代谢产物，参与了广泛的生物学过程（Beckwith et al.，2004 ;Downs and Siegelman，1963 ;Lo and Nicholson，1998 ;Vinterhalter et al.， 2007;Zhou and Singh，2002)。作为食物，花青素不仅是优良的食品添加剂，而且具有抗心 率失调，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖症，糖尿病的发病率（Lietti et al.，1976)。因 此人们需要更多来自水果、蔬菜以及粮食中的花青素（Boyd，2000)，但由于饮食习惯和经济 方面的原因，水果和蔬菜并不能为人们提供足够的花青素 （Butelli et al.，2008)。
[0003] 植物体内花青素合成与代谢的控制主要是通过调控结构基因的表达量来实现的 (Davies and Schwinn，2003)。转录因子WD40、bHLH和MYB形成一个转录调控复合体，调控 着结构基因的表达量，从而控制花青素的合成与代谢（Hernandez et al.，2004)。
[0004] MYB类转录因子是一类DNA结合蛋白，它们在结构上都有一段保守的MYB结构域。 MYB结构域是一段序列特异的能够结合DNA的区域，约由52个氨基酸构成，呈现螺旋-转 角-螺旋的构象。根据MYB结构域数目的差异将MYB类转录因子分为，（1)单一 MYB结构域 汊1/2)蛋白；（2)2个重复1^8结构域〇?21?3)蛋白；（3)3个重复1^8结构域〇?11?21?3)蛋白。 植物中绝大多数的MYB蛋白有2个重复MYB结构域（R2R3) (Martin and Paz-Ares，1997)。 这些MYB蛋白调控了植物中多种生理过程，如毛状体发育（GhMYB109)(Suo et al.，2003)， 圆锥细胞发育（AmMYBMIXTA) (Sugimoto et al·，2000)，茎形态发生（AtMYB13) (Kirik et al.，1998)，赤霉素信号转导（AtMYB33, AtMYB65, AtMYBlOl) (Gocal et al.，2001)，脱水反 应与 ABA 调节（AtMYB2) (Abe et al·，2003 ;Urao et al·，1996)，色氨酸生物合成（ATRl) (Celenza et al.，2005)，调节细胞周期（AtCDC5) (Lin et al.，2007)等。其中的一个分支 调控了花青素合成代谢的生理过程，如ZmCl，PhAN2(Hsuchen and Coe，1973;Shimada et al.，2007) 〇
[0005] MYB类基因对花青素生物合成结构基因的调控一般需要bHLH基因家族成员的参 加。例如，ZmCl和ZmPL对花青素合成代谢的调节需要bHLH基因 ZmR或ZmB参加。ZmCl和 ZmR编码的蛋白通过与BZl (花青素合成代谢的结构基因）启动子的顺式元件直接结合，从 而实现对BZl基因表达的调控（Roth et al.，1991)。虽然单独的ZmCl蛋白能够结合到结 构基因启动子序列的转录元件上，但是只有ZmCl并不能产生转录活性。它还需要ZmR存在， 才能产生转录活性（Lloyd et al.，1992)。bHLH转录因子是通过激活某种未知的能够结合 到结构基因的CIS元件，或者通过从抑制因子上释放ZmCl，从而达到调控花青素合成的目 的（Heine et al.，2004)。也有极少数的MYB转录因子只要其自身过表达就能够诱导花青 素的合成，而不需要bHLH转录因子的协作，如VvMYBAI。利用基因枪介导的瞬时表达技术 单独将VvMYBAI在葡萄的胚性愈伤组织中表达时，能够诱导花青素的合成（Cutanda-Perez et al.，2009)。这一过程不依赖于bHLH转录因子。
[0006] 调控花青素合成的MYB类调控蛋白的DNA结合序列虽然高度相似，但具有特异性。 玉米的ZmCl和ZmR不能够诱导番前果实产生花青素 （Bovy et al.，2002)，而金鱼草中的 AmDel (bHLH) and AmROSEAl(MYB)确能够使得果实呈现紫色。玉米中花青素类化合物生物 合成需要两个早期结构基因 CHSXHI和一个后期结构基因 DFR的表达。这三个结构基因不 受ZmCl和ZmR或ZmCl和ZmB调控，而受单拷贝MYB基因 ZmP的调节（Grotewold et al.， 1991 ;Grotewoldet al.，1994)。研宄发现ZmP蛋白所结合的DNA序列为CCT/AACC，与动物 MYB蛋白的结合序列（C/TAA)有显著差别。P蛋白对DFR启动子激活的前提是有蛋白质的 结合位点。玉米的BZl启动子含有ZmCl结合点，可以被ZmCl激活，但不能被P蛋白活化 (Grotewold et al·，1991 ;Grotewold et al·，1994)。不同植物中的结构基因启动子序列 也有所差异。玉米ZmCl和ZmB基因能够诱导玉米悬浮细胞合成花青素，但是不能够诱导葡 萄胚性愈伤组织细胞产生花青素。这种调控花青素合成与代谢的MYB类转录因子的功能分 化给基因工程改变植物体内的花青素含量和认识自然中与花青素相关性状的变异提供了 机遇和挑战。在小麦中控制红粒性状的主效基因定位于3AL、3BL和3DL染色体，蓝粒性状 定位于4E染色体，紫粒性状定位于2AL和7BL染色体，紫杆性状定位于7BS和7DS，紫色胚 芽鞘定位于7AS，7BS和7DS染色体，紫色花药性状定位于7DS染色体上，紫色叶耳和叶基定 位于10、20、48、68染色体上（刘宝龙，2009)。更多1^8类转录因子的克隆与功能验证将为 解释自然界中颜色性状的差异，和基因工程改良作物提供更多的选择。
【附图说明】
[0007] 图1为PCR扩增Rc位点MYB基因电泳图；
[0008] 图2为高原115、中国春（CS)、Opata、W7984中Rc位点存在的MYB基因的基因组 序列；
[0009] 图3为保守引物TaMYB7-ATG和TaMYB7-TAA PCR扩增高原115、中国春、Opata以 及W7984胚芽鞘cDNA电泳图；
[0010] 图4为TaMYB7D编码区序列及推测的氨基酸序列（阴影部分为保守的R2R3-MYB 结构域，字体大一号的W为MYB结构域保守的色氨酸残基，横线部分表示与bHLH蛋白作用 的D/ELx2R/Kx 3Lx6Lx3Rg构元件，虚线部分为可能的转录激活区）
[0011] 图 5 为植物中 MYB 蛋白系统进化树（AmMIXTA，CAA55725 ;AmR0SEAl，ABB83826 ; AmR0SEA2, ABB83827 ;AmVEN0SA，ABB83828 ;AtCPC，NP_182164 ;AtETC，NP_171645 ;AtFLP， NP_563948 ；AtGLl, AAC97387 ；AtMYB12, ABB03913 ；AtMYB61, NP_172425 ；AtPAPl, ABB03879 ； AtTRY， NP_200132 ;AtTT2, Q9FJA2;AtWER， AAF18939 ;CaA， CAE75745 ;DcMYBl， BAE54312 ; FaMYBl，AAK84064 ;GMYB10, CAD87010 ;LeANTl，AAQ55181 ;MdMYBl-l，ABK58136 ;MdMYBl-2， ABK58137 ;MdMYBl-3, ABK58138 ;NtMYB2, BAA88222 ;PhAN2, AAF66727 ;Ph0D01，AAV98200 ; VvMYB5a, AAS68190 ；VvMYBAl, BAD18977 ；VvMYBA2, BAD18978 ；ZmCl, AAA33482 ；and ZmPL AAA19821 JaMYB-DL KP136432)；
[0012] 图6为植物中部分与花青素合成相关的MYB基因结构图（VvMYBAl，ABllllOl ; ZmCl, AF320613 ；MdMYBl, DQ222406 ；AtTT2, NC 003076 ；VvMYB5a, NC_012014. 3 ；and AtTRIPTYCHON，NC_003076. 8 ;TaMYB-7D，KP136432);
[0013] 图7为TaMYB_7D在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位示意图；
[0014] 图8为高原115不同时期的胚芽鞘TaMYB-7D及结构基因表达分析图（Light表示 光照条件下，Dark表示暗处理条件下，数字2-6代表种子萌发后的天数）
[0015] 图9为Opata不同时期的胚芽鞘TaMYB_7A及结构基因表达分析图（Light表示光 照条件下，Dark表示暗处理条件下，数字2-6代表种子萌发后的天数）
[0016] 图10为小麦胚芽鞘中的瞬时表达示意图；
[0017] 图11为RIL群体胚芽鞘颜色与TaMYB_7D表达的连锁分析图。
【发明内容】
[0018] 本发明通过拟南芥和玉米中与花青素合成相关的MYB基因 AtTT2和ZmCl序列在 普通小麦基因组测序数据库、乌拉尔图小麦（AA)基因组数据库和节节麦（DD)基因组数据 库中进行同源搜索，7AS、7BS、7DS上各存在一个与MYB基因高度同源的重叠群序列。针对 7AS、7BS、7DS上MYB基因的特异引物设计MYB基因第7同源群的保守引物TaMYB7-ATG (A TGGGGAGGAGGGCGTGCTGTGCCAAGGA)和 TaMYB7-TAA(TTAACCGGCCATGTGCAGGGACTTGAGCC)，从 小麦品种高原115基因组中分离了 3个MYB基因并定位于7A、7B、7D染色体，即TaMYB-7A、 TaMYB-7B、TaMYB-7D，而白色胚芽鞘品种中国春和Opata中仅分离到TaMYB-7A。RT-PCR分析 表明小麦品种高原115紫色胚芽鞘中仅TaMYB_7D基因表达，而在小麦品种中国春和Opata 白色胚芽鞘中没有检测到Rc (紫色胚芽鞘性状位点）基因的表达。同时TaMYB-7D还在高 原115紫色种皮中表达，而在无花青素合成的根、茎、叶中不表达。生物信息学分析表明 TaMYB-7D仅含有1个内含子，其编码蛋白含有2个连续的MYB结构域，为典型的R2R3-MYB 蛋白。植物MYB蛋白系统进化分析表明TaMYB-7D从属于调控花青素生物合成的MYB基因 分支，与玉米中调控花青素代谢的ZmCl亲缘关系较近，具有MYB DNA结合域和转录激活结 构域。
[0019] 亚细胞定位分析表明TaMYB_7D蛋白主要定位于细胞核。瞬时表达功能验证表明 单一的TaMYB-7D能够诱导白色胚芽鞘细胞产生少量花青素，但是单一的ZmR或ZmCl不能 使白色胚芽鞘细胞产生花青素。TaMYB-7D能在玉米的ZmR协同作用下使胚芽鞘细胞产生 大 量的花青素，并且在功能上可与ZmCl相互替代。
[0020] 通过对比光照下高原115和Opata不同时期胚芽鞘以及暗处理胚芽鞘中花青素的 积累量、TaMYB-7D以及结构酶基因的表达模式，发现TaMYB-7D的表达与胚芽鞘中花青素的 合成以及DFR(二羟基黄酮醇还原酶）的表达成正相关。因此很有可能光诱导了 TaMYB-7D 基因的表达，TaMYB-7D蛋白进入细胞核激活DFR基因的转录，从而促进高原115胚芽鞘中花 青素的合成。利用OpataX高原115重组自交系F8代群体研宄了紫色胚芽鞘性状的遗传 规律，表明紫色和白色胚芽鞘品系的分离比为1 : 1，符合F8代理论分离比例，由此推测高 原115紫色胚芽鞘性状由完全显性的单基因控制，同时发现胚芽鞘的颜色与TaMYB-7D的表 达之间呈现共分离现象，说明它们之间是连锁的。以上结果表明TaMYB-7D是控制高原115 紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0021] 本发明揭示了光诱导的小麦TaMYB7D基因具有调控花青素合成代谢的MYB类转录 因子的转录活性，并且是小麦品种高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
[0022] 具体地，在一方面，本发明涉及调控花青素合成与代谢的小麦新基因 TaMYB7D，其 核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示的序列。
[0023] 优选地，基因 TaMYB7D的编码序列为SEQ ID NO :2所示的序列。
[0024] 在本发明的另一个方面，涉及基因 TaMYB7D所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3所示的序列。
[0025] 在本发明的又一个方面，涉及一种重组载体，其包含权利要求1或2所述的基因 TaMYB7D〇
[0026] 在本发明的另一个方面，涉及一种宿主细胞，其包含权利要求1或2所述的基因 TaMYB7D或权利要求4所述的重组载体，所述宿主细胞是植物细胞或微生物细胞。
[0027] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求1或2所述的基因在转化植物获得转基因 植物中的应用。
[0028] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求1或2的基因在调控花青素合成与代谢中 的应用，其中载体pBract214的序列号为SEQ ID N0:4。
[0029] 在本发明的另一个方面，涉及权利要求3所述的蛋白在调控花青素合成与代谢中 的应用，其中载体pBract214的序列号为SEQ ID N0:4。
[0030] 在本发明的另一个方面，涉及一种调控小麦中花青素合成与代谢的方法，包括将 权利要求1或2所述的基因与ZmR基因共转染到小麦中，使权利要求1或2所述的基因和 ZmR基因进行表达，其中所述ZmR基因与pBract214载体的序列为SEQ ID NO :5所示的序 列。
[0031] 在本发明的另一个方面，涉及一种培育转染权利要求1或2所述基因的植株的方 法，包括构建含权利要求1或2所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化小麦 细胞；和将转化的小麦细胞培育成转基因小麦。
[0032] 本发明的有益效果如下：本发明将TaMYB7D定位于小麦7D染色体上，蛋白质产 物亚细胞定位于细胞核。推导的氨基酸序列表明TaMYB3编码一个调控花青素合成代谢的 MYB类转录因子。紫色籽粒小麦品种高原115胚芽鞘中TaMYB7D能够在光的诱导下表达量 上调。瞬时表达时，TaMYB7D高原115籽粒的果皮细胞合成花青素。此外，胚芽鞘的颜色与 TaMYB-7D的表达之间呈现共分离现象，这表明TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的转录活 性，并且是高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
【具体实施方式】
[0033] 下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例 仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。
[0034] 实施例1 :TaMYB7D基因的克隆
[0035] 所有的实验材料购自中国科学院西北高原生物研宄所。所有用于DNA和RNA提取 的样品都在取样后，液氮迅速冷冻并保存在-80冰箱中。所有的核苷酸序列测定都是在深 圳华大基因有限公司完成。DNA的提取采用CTAB法（Murray and Thompson，1980)，RNA的 提取采用改进的Trizon法（Li and Trick，2005)。质粒提取使用北京博大泰克生物基因 技术有限公司的试剂盒（中国）。核苷酸和蛋白序列比对使用软件Vector NTI Advance 10. 0(http ://www. invitrogen. com/)。蛋白系统发生树构建使用软件 MEGA 4. 0(http :// www. megasoftware· net/)。基因图绘制使用 GSDS 软件（http ://gsds. cbi. pku. edu. cn/ help.php)〇
[0036] 本发明通过拟南芥和玉米中与花青素合成相关的MYB基因 AtTT2和ZmCl序列在 普通小麦基因组测序数据库、乌拉尔图小麦（AA)基因组数据库和节节麦（DD)基因组数据 库中进行同源搜索，7AS、7BS、7DS上各存在一个与MYB基因高度同源的重叠群序列。针对 7AS、7BS、7DS上MYB基因的特异引物设计MYB基因第7同源群的保守引物TaMYB7-ATG (ATG GGGAGGAGGGCGTGCTGTGCCAAGGA)和 TaMYB7-TAA(TTAACCGGCCATGTGCAGGGACTTGAGCC)。
[0037] 在小麦品种高原115(紫色胚芽鞘）、中国春（白色胚芽鞘）、Opata(白色胚芽鞘） 和W7984基因组DNA(紫色胚芽鞘）中进行PCR扩增，琼脂糖电泳后均得到了一条约850bp 左右的条带（图1)。分别进行目的带的回收、T-载体克隆，每个品种分别送20个阳性克隆 进行测序。
[0038] 测序后序列经过拼接比对，发现在小麦品种高原115中存在三个高度同源的Rc基 因序列，而在中国春、Opata和W7984中只测到一个基因序列，在NCBI中进行blast表明 它们均为MYB基因序列。在中国春和Opata中得到的序列与高原115中的一个序列几乎 完全一致，而在W7984中得到的序列与高原115中另一个序列完全一致。为了确定该结果 是否准确，该实验从PCR扩增基因组DNA开始到最后测序均重复一次，得到的结果依然如 此。通过与基因组数据库中拿到的重叠群进行比对，将其分别命名为TaMYB-7A、TaMYB-7B、 TaMYB-7D。其中存在于高原115、中国春和Opata中的TaMYB-7A基因组序列均为866bp，且 高度相似，相似度达到99. 96%，只在第81个碱基处出现了一个G/C突变；存在于高原115 中的TaMYB-7B基因组序列为852bp ;存在于高原115和W7984中的TaMYB-7D基因组序列 完全相同，大小为872bp (图1)。
[0039] 在小麦种子萌发后3d剪取胚芽鞘并提取RNA，反转成cDNA，以微管蛋白基因 Tubulin为内标基因，利用保守全长引物TaMYB7-ATG和TaMYB7-TAA PCR扩增高原115、中 国春、Opata以及W7984胚芽鞘cDNA(图3)。从图中可以看出在高原115和W7984胚芽鞘 cDNA中扩增得到了一条750bp左右的条带，而在中国春和Opata胚芽鞘cDNA中没有扩增出 任何条带。
[0040] 实施例2 :TaMYB7D生物信息学分析
[0041] TaMYB7D的⑶S序列全长759bp，编码252个氨基酸（图4)。在其N-端有一个典 型的R2R3-MYB结构域，在R2结构域中规则分布3个色氨酸残基W，在R3结构域中规则分布 2个色氨酸残基W，同时在R3结构域中存在一个不完全相同的与bHLH蛋白作用的D/ELx 2R/ Kx3Lx6Lx3R结构元件；在C-端存在一个可能的转录激活区域。这表明TaMYB-7D有可能是一 个正调控的R2R3-MYB转录因子。
[0042] 择了已知的并进行了功能验证的MYB基因进行系统发生树分析，构建了包括金 鱼草、拟南芥、辣椒、胡萝卜、草莓、非洲菊、番茄、苹果、烟草、矮牵牛、葡萄、玉米以及小麦 中MYB转录因子的系统进化树（图5)。在系统进化树上TaMYB-7D与AtMYB12、AtTT2、 ZmCl、TaMYB10-A、TaMYB10-B、TaMYB10-D、TaMYB3、TaMYB320 聚为一类，所有这些基因均调 控植物中黄酮醇或花青素的生物合成。AtMYB12分别调控烟草咖啡酰奎宁酸和番茄黄酮 醇的合成（Luo et al.，2008)，同时也能够诱导小麦胚芽鞘中花青素的合成（Gao et al.， 2011) ;AtTT2是调控拟南芥中种皮原花青素生物合成的关键基因；TaMYB10-A、TaMYB10-B、 TaMYBlO-D与小麦红色种皮性状相关；ZmCl是玉米中发现的第一个与花青素合成有关的 MYB转录因子。这说明TaMYB-7D属于调控花青素合成类的MYB类转录因子。
[0043] TaMYB_7D的基因结构与其它植物的同源基因差异较大，在其基因结构内只含有1 个内含子，除了 TaMYB3基因外，其它调控花青素合成的MYB基因含有2个内含子（图6)。 TaMYB-7D-个内含子的丢失可能伴随着外显子区域部分编码区的删除，这可能就是导致其 编码的氨基酸序列变短的原因。TaMYB3和TaMYB-7D同时存在于小麦基因组中，分别定位于 第4和第7同源群，它们的基因结构以及在系统进化树上聚类关系都非常相似，基因编码区 序列的一致性达到74. 70%。
[0044] 实施例3 :TaMYB3蛋白的亚细胞定位
[0045] 利用带有GFP和35S启动子的pk7FWG2-R载体，将TaMYB-7D基因构建到pk7FWG2-R 载体上，通过基因枪转化法，将构建好的pk7FWG2-R-TaMYB-7D融合表达载体转入洋葱表皮 细胞。结果表明，在转化空载体pk7FWG2-R的洋葱表皮细胞中，GFP表达后激发的绿色荧光 分布于整个洋葱表皮细胞中；当转化重组质粒pk7FWG2-R-TaMYB-7D进入洋葱表皮细胞时， 只在细胞核和细胞膜上观察到绿色荧光（图7)。这表明TaMYB-7D除了定位于细胞核外，还 有可能定位于细胞膜。
[0046] 实施例4 :TaMYB3的表达受到光的诱导
[0047] 分别在恒温光照培养箱和暗培养箱中培养高原115和Opata的种子，在种子萌发 后，每隔24h观察胚芽鞘的颜色并照相。在光照条件下，高原115的种子在萌发后2d观察到 胚芽鞘中有紫色色素的积累，萌发后5d色素积累达到最大值；暗处理的高原115胚芽鞘中 几乎没有色素的积累（图8)。以微管蛋白基因 Tubulin为内标，通过RT-PCR分析了在高原 115不同时段的胚芽鞘中TaMYB-7D基因的表达模式，发现在光照条件下种子萌发后2d开始 TaMYB-7D基因均有非常强烈的表达，萌发后5d开始减弱；同时在暗处理3d的胚芽鞘中没 有TaMYB-7D基因的表达，这表明TaMYB-7D基因的表达是由光照控制的。从图8可以看出 TaMYB-7D的表达 模式与胚芽鞘中花青素的积累模式非常相似，暗示它们之间有一定的内在 联系。
[0048] RT-PCR分析了高原115和Opata不同时段的胚芽鞘中结构基因（CHS、CHI、F3H、 DFR)基因（表1)的表达模式（图8和图9)。结果发现在高原115和Opata中，光照和暗 处理胚芽鞘中CHS、CHI、F3H均表达且表达量较为一致；DFR在高原115的光照的胚芽鞘中 超量表达，其表达模式与TaMYB-7D非常相似，即萌发后2d开始有非常强烈的表达，萌发后 5d开始减弱，在暗处理的胚芽鞘中几乎没有表达（图9);在Opata中，DFR只在萌发后2d 和3d有微量的表达，几乎观察不到，其它时期没有DFR基因的表达（图9)。以上结果表明 光照调控TaMYB-7D基因的表达，而超量表达的TaMYB-7D转录因子进入细胞核与DFR基因 启动子区域的顺式作用元件结合激活下游DFR基因编码区的转录，从而调控胚芽鞘中花青 素的生物合成。
[0049] 表1实验所用引物名称和序列
[0050]
[0052] 实施例5 :TaMYB3基因调控花青素合成代谢的转录活性功能验证
[0053] 在MYB基因的进化关系上，TaMYB-7D与ZmCl、AtTT2等调控花青素合成的MYB 转录因子较近。大量文献资料表明ZmCl等MYB基因需要在bHLH的协同作用下才能够 调控花青素代谢（Ahmed et al.，2003;Himi&Noda，2005)。因此本发明中，将 TaMYB-7D、 211￡1、21]11?(玉米13!11^)构建到含有1113丨911；[1:;[11启动子的口1^^(^214瞬时表达载体上，利 用基因枪法转化小麦胚芽鞘进行瞬时表达。从图10可以看出，pBract214-TaMYB7D或者 pBract214-ZmCl与pBract214-ZmR共转时，Opata胚芽鞘细胞均有大量花青素斑点的产 生；单转 PBract214-TaMYB7D也能够诱导胚芽鞘细胞产生少量的花青素斑点；但是单转 pBract214_ZmCl、pBract214_ZmR或空载体pBract214均不能诱导Opata胚芽鞘细胞的花 青素合成。同时为了检测基因枪轰击时是否将质粒转化进入胚芽鞘细胞，用GUS染液侵泡 轰击后的胚芽鞘，发现在轰击后的胚芽鞘上均能观察到蓝色斑点的存在（图10)，表明质粒 均转化进胚芽鞘细胞。TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的功能，并且可能是小麦品种高原 115紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0054] 实施例6 :TaMYB7D的表达与紫色胚芽鞘的关联分析
[0055] F8代RIL(OpataX高原115)品系中紫色和白色的理论分离比例应该为 129 : 127,接近1 : 1，说明高原115的紫色胚芽鞘性状是由完全显性的单基因控制。这说 明高原115胚芽鞘中花青素的合成由一个完全显性的单基因控制。RIL群体胚芽鞘颜色与 TaMYB-7D表达之间的连锁分析，发现紫色胚芽鞘品系中均能用特异引物检测到TaMYB-7D 基因的表达，白色胚芽鞘品系中没有TaMYB-7D的表达（图11)，将PCR产物送样测序后表明 它们均是TaMYB-7D基因，胚芽鞘颜色的表现型与TaMYB-7D基因的表达之间出现共分离现 象说明TaMYB-7D与胚芽鞘颜色之间是连锁的。所有这些结果表明TaMYB-7D是Rc位点控 制小麦紫色胚芽鞘性状的主效基因。
[0056] 主要参考文献：
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【主权项】
1. 一种调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D，其特征在于：基因TaMYB7D的核 苷酸序列为SEQIDNO:1所示的序列。2. 根据权利要求1所述的一种调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D，其特征 在于：基因TaMYB7D的编码序列为SEQIDNO:2所示的序列。3. 根据权利要求1或2的所述的基因TaMYB7D所编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸 序列为SEQIDNO:3所不的序列。4. 一种重组载体，包含权利要求1或2所述的基因TaMYB7D。5. -种宿主细胞，包含权利要求1或2所述的基因TaMYB7D或权利要求4所述的重组 载体，所述宿主细胞是植物细胞或微生物细胞。6. 权利要求1或2所述的基因在转化植物获得转基因植物中的应用。7. 权利要求1或2的基因在调控花青素合成与代谢中的应用，其中载体pBract214的 序列号为SEQIDNO:4。8. 权利要求3所述的蛋白在调控花青素合成与代谢中的应用，其中载体pBract214的 序列号为SEQIDNO:4。9. 一种调控小麦中花青素合成与代谢的方法，包括将权利要求1或2所述的基因与 ZmR基因共转染到小麦中，使权利要求1或2所述的基因和ZmR基因进行表达，其中所述ZmR 基因与pBract214载体的序列为SEQIDN0:5所不的序列。10. -种培育转染权利要求1或2所述基因的植株的方法，包括构建含权利要求1或2 所述基因的植物表达载体；用所述构建的表达载体转化小麦细胞；和将转化的小麦细胞培 育成转基因小麦。
【专利摘要】本发明公开了一种从紫色籽粒小麦品种高原115中分离到的调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D，属于植物基因工程领域，TaMYB7D定位于小麦7D染色体上，蛋白质产物亚细胞定位于细胞核。推导的氨基酸序列表明TaMYB3编码一个调控花青素合成代谢的MYB类转录因子。紫色籽粒小麦品种高原115胚芽鞘中TaMYB7D能够在光的诱导下表达量上调。瞬时表达时，TaMYB7D高原115籽粒的果皮细胞合成花青素。此外，胚芽鞘的颜色与TaMYB-7D的表达之间呈现共分离现象，这表明TaMYB7D具有调控花青素合成代谢的转录活性，并且是高原115紫色胚芽鞘的主效基因。
【IPC分类】C12N1/15, C12N1/21, C12N1/19, C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00, C12N15/63, C12N5/10, C07K14/415
【公开号】CN104894142
【申请号】CN201510318786
【发明人】刘宝龙, 张怀刚, 刘登才, 张波, 陈文杰, 刘瑞娟, 魏乐, 李建民, 王延谦
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
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