一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法
一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，特别涉及一种利用代谢工程策略，转化丹参SmWRKY70转录 因子提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。
【背景技术】
[0002] 丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge)，是一种多年生的双子叶草本植物，作为一种 传统中药，丹参在临床上主要用于对心脑血管疾病的治疗。丹参中的有效成分主要包括两 大类，一类是脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮 IIA等等；还有一类是水溶性的丹酚酸类化合物。大量研宄已经证明，丹参酮具有多种药理 活性，分别是心脑血管保护、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，因此具有巨大的市场 需求。但是，在传统的栽培模式下，丹参生长周期较长、品质严重退化的弊端；而在化学合成 过程中，由于丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污 染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞，其药用活性成分积累量很低而且稳定性很 差，远达不到商业化开发利用的要求。代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟 为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。
[0003] 据文献检索分析，WRKY转录因子是植物界中最大的一类转录因子之一，是调控许 多植物过程信号网络必不可少的部分。WRKY转录因子最显著的特征是其DNA结合域中都 至少含有1个WRKY结构域。WRKY蛋白参与植物的许多生理过程，主要包括：生物胁迫、非 生物胁迫、种子的形成、种子的休眠与萌发、植物的衰老和发育。利用代谢工程手段，将丹参 SmWRKY70转录因子转化丹参，获得高产丹参酮的丹参毛状根，为商业化生产丹参酮提供新 型优质药源，目前尚未发现与本发明主题所提及的利用丹参SmWRKY70转录因子提高丹参 毛状根中丹参酮含量的相关报道。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具 有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供一种提高丹参毛状根中丹参酮含 量的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明从丹参中分离克隆出789bp的 SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了 918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列； 构建了 SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，激光共聚焦显微镜观察显示 SmWRKY70转录因子在细胞核中表达；构建了 SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶 片获得SmWRKY70基因的过表达的转基因丹参毛状根，QRT-PCR分析转基因丹参毛状根中 SmWRKY70以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达，高效液相色谱法（HPLC)测定转 基因丹参毛状根中丹参酮的含量。
[0006] 本发明包括如下具体步骤：
[0007] (1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将 丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所 述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO. 1所示；植物表达载体为经过改造获得 的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素 抗性位点。
[0008] (2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参 SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] (3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参SmWRKY70 转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析。
[0010] (4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草， 对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析。
[0011] (5)将步骤（1)所获得的SmWRKY70转录因子的植物过表达载体转化发根农杆菌， 获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1。
[0012] (6)将步骤（5)所获得的含SmWRKY70转录因子的植物过表达载体的发根农杆菌菌 株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；所述的经PCR检测的阳 性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因（SmWRKY70)表达的组成型启动子CaMV35S的内 部及插入基因 SmWRKY70的内部，分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下 观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系。
[0013] (7) QRT-PCR分析步骤（6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中 SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的 株系；QRT-PCT分析转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关 基因的表达，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的转基因丹参毛状根克隆进行总RNA的提 取，并反转录成cDNA，分别设计检测基因及看家基因 Actin的引物，进行QRT-PCR扩增，分析 SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达情况。
[0014] (8)用高效液相色谱法（HPLC)测定步骤（7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中 丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系；对SmWRKY70基因的表达量 显著提高的转基因丹参毛状根中丹参酮的含量进行高效液相色谱法测定的具体测定方法 如下：将丹参酮粗提物各取20 μ L，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为C-18反相 硅胶柱，流动相为乙腈：水（65 :35,柱温为30°C，流速为lmL/min，检测波长为220nm。
[0015] 本发明应用常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、定量QRT-PCR 分析、丹参酮提取及含量测定等，建立了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。采用遗 传转化丹参SmWRKY70转录因子基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状 根株系，所获得的转基因丹参毛状根中总丹参酮含量显著提高，其中总丹参酮含量最高的 一个克隆为W70-03 (13. 731mg/g)，是对照组（2. 175mg/g)的6. 31倍。本发明提供了一种提 高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质 药源，为商业化大量生产丹参酮和降低药品价格提供了可能，对缓解丹参酮药源的紧缺性 起到积极的促进作用，也为规模化生产丹参酮临床药物的大量需求提供了重要来源。
【附图说明】
[0016] 图 1 为 pCAMBIA2300+: :SmWRKY70 载体构建图。
[0017] 图2为SmWRKY70启动子序列。
[0018] 图3为SmWRKY70在不同组织中的表达情况。
[0019] 图4为SmWRKY70在MJ、SA、YE处理下的表达模式。
[0020] 图5为SmWRKY70的亚细胞定位。
[0021] 图6为丹参的相关基因在SmWRKY70毛状根株系中的表达。
[0022] 图7为HPLC分析SmWRKY70转基因毛状根株系中的丹参酮含量。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请权利要求书所限定的 范围。
[0024] 下列实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建 议的条件。
[0025] 实施例1 :丹参SmWRKY70基因的克隆
[0026] I. 1.丹参总RNA的提取
[0027] 取少量丹参（采用产于山东平邑丹参酮含量较高的丹参品种）幼嫩叶片，用液氮 速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RMpr印Pure Plant Kit使用说明 书提取总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1. 2% ;0. 5 X TBE电泳缓冲液； 150v，15min)检测RNA的完整性。用Nano Drop 2000c超微量分光光度计检测其纯度和浓 度。
[0028] L 2.丹参SmWRKY70基因的克隆
[0029] 以所获的0.5 yg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL (AMV)进行第一链cDNA 的合成（操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书）。根据本实验室所得到的丹参 SmWRKY70基因的转录组序列，分别设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游 引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载体。以所述 的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服 务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果得到了完整的SmWRKY70转录因子基因的 编码框序列（如SEQ ID NO. 1所示）。
[0030] 实施例2 :丹参SmWRKY70启动子的克隆
[0031] 2. 1.丹参基因组DNA的提取
[0032] 采用CTAB法提取丹参嫩叶的基因组DNA，将提取的DNA进行凝胶电泳，初步确定所 提取的DNA完整性，用Nano Drop 2000c超微量分光光度计上检测DNA样品的纯度和浓度。
[0033] 2. 2.丹参SmWRKY70启动子的克隆
[0034] 采用 TaKaRa 公司的 LA PCRTM in vitro Cloning Kit(Code :DRR015)试剂盒 进行SmWRKY70启动子克隆（操作步骤参照TaKaRa公司提供的相关说明书）。将提取的 DNA用限制性内切酶EcoR I、Pst I、Bgl II酶切6个小时，然后用乙醇沉淀回收，连接 试剂盒中对应的接头，4小时后用乙醇沉淀回收。根据SmWRKY70的已知序列，设计引物 SmWRKY70-SPl (SmWRKY70-SPl :5' -GCGGAAGGAGCCTGAGAAGCCTCATCCGAC-3'），以加有接头 的回收产物为模板，用SmWRKY70-SPl+Primer Cl为引物，进行第一轮PCR扩增。然后根据 S mWRKY70的已知序列，设计引物SmWRKY70-SPl的上游设计引物51^服￥70-5?2(51111服￥70-SP2:5' -AGCATGGCGAGAGAGTGAGTGAAGGTGTCC-3'），以第一轮 PCR 产物原液、稀释 10 倍、稀释 100倍为模板，用SmWRKY70-SP2+Primer C2为引物，进行第二轮PCR扩增后测序，最终获得 一条长度分别为918bp的启动子序列（如SEQ ID NO. 2所示）。
[0035] 2. 3.丹参SmWRKY70启动子分析
[0036] 根据 PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)网 站对SmWRKY70已克隆的启动子分析结果显示：SmWRKY70的启动子区包含4个W-box，表 明SmWRKY70可以自我调节或被其它WRKY基因交叉调控；SmWRKY70的启动子区还包含2个 MYB-识别域和1个E-box，表明SmWRKY70可能被R2R3MYB转录因子和bHLH转录因子结合； SmWRKY70的启动子区还包含1个参与到MJ响应的顺式作用元件，CGTCA结构域；包含2个 参与到SA响应的顺式作用元件，AGAAAA结构域，因此SmWRKY70均能响应MJ和SA的诱导 (见图2)。
[0037] 实施例3 :丹参SmWRKY70的组织表达谱分析
[0038] 为了研宄SmWRKY70的组织表达模式，分别提取丹参两年生的根、茎、叶、花、种子 五个组织的总RNA，并分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cDNA，用于QRT-PCR分 析SmWRKY70的组织表达谱，反应体系用TIANGEN公司提供的SuperReal PreMix (SYBR Green)试剂盒，用Actin作为内参基因，采用比较CT法计算基因的相对表达量。结果显示， SmWRKY70在所检测的所有组织中，在叶和叶柄中表达较强，其次在茎中表达较高，在主根、 须根、花、花丝、花萼中表达较弱（见图3)。
[0039] 实施例4 :丹参SmWRKY70对激素处理的响应分析
[0040] 为了验证SmWRKY70是否响应MJ、SA、YE激素的诱导，对在摇瓶中培养了 60左右 大小的丹参毛状根进行了 MJ、SA、YE处理，提取经MJ、SA、YE处理不同时间后的丹参毛状根 的总RNA，QRT-PCR结果显示：SmWRKY70在MJ诱导0. 5小时后表达量达到最高，然后开始下 降；SmWRKY70在SA诱导3小时后表达量达到最高，然后开始下降，到9小时基本回复到诱 导前表达水平。SmWRKY70在YE诱导1小时后表达量达到最高，然后开始下降，到4小时基 本回复到诱导前表达水平（见图4)。
[0041] 实施例5 :丹参SmWRKY70的亚细胞定位分析
[0042] 5. I. pM0N530: : SmWRKY70 的构建
[0043] 根据已经克隆获得的丹参SmWRKY70的ORF序列，设计亚细胞定位载体构建的引 物，构建PM0N530: : SmWRKY70,并将pM0N530: : SmWRKY70质粒转化农杆菌Ase，用于后续的烟 草中的瞬时表达实验。
[0044] 5. 2.在烟草中的瞬时表达
[0045] 将构建好的工程菌 pM0N530::SmWRKY70 in Ase、pM0N530 in Ase 瞬时转化 60 天 的烟草。25°C培养2天后利用激光共聚焦显微镜观察SmWRKY70: :GFP蛋白、35S: :GFP蛋白 在烟草中的表达。结果显示空载体在整个细胞中表达，pM0N530::SmWRKY70在细胞核中表 达，与它们作为转录因子的功能是一致的（见图5)。
[0046] 实施例6 :含丹参SmWRKY70基因的过表达载体的构建
[0047] 以pCAMBIA2300+为中间表达载体，用从丹参汇总克隆的SmWRKY70基因替换 PCAMBIA2300+上的 gus 基因。具体地，Spe I/BstE II 双酶切 pMD18-T: : SmWRKY70 和 PCAMBIA2300+;回收SmWRKY70基因和pCAMBIA2300 +大片段；连接转化，挑取单克隆菌 落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmWRKY70基因已被成功 构建到植物表达载体pCAMBIA2300+中，从而获得含SmWRKY70基因的植物过表达载体 pCAMBIA2300+: :SmWRKY70(见图 1)。
[0048] 本实施实例将调控丹参酮生物合成的转录因子SmWRKY70可操作性地连接于表达 调控序列，形成含SmWRKY70基因的植物过表达载体pCAMBIA2300 +: : SmWRKY70,该表达载体 可用于通过代谢工程策略来提高丹参中丹参酮含量。
[0049] 实施例7 :发根农杆菌介导的丹参SmWRKY70基因遗传转化丹参获得转基因丹参毛 状根
[0050] 7. 1.含植物表达载体的发根农杆菌工程菌的获得
[0051] 将实施例6中含SmWRKY70基因的植物过表达载体pCAMBIA2300+: : SmWRKY70转入 发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmWRKY70基因的植物 过表达载体pCAMBIA2300+::SmWRKY70已经成功构建到发根农杆菌C58C1中。
[0052] 7. 2.发根农杆菌介导SmWRKY70基因遗传转化丹参
[0053] 7. 2. 1外植体的预培养
[0054] 剪取丹参健壮无菌苗叶片（0. 5cm2)，接种到预培养培养基（MS)上，25°C暗培养2 天。
[0055] 7. 2. 2农杆菌与外植体的共培养
[0056] 将上述预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的 1/2MS悬液中浸泡10分钟（轻轻摇晃是外植体与菌液充分接触）后，取出浸染后的丹参叶 片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养3-4天。
[0057] 7. 2. 3毛状根的诱导和继代培养
[0058] 将上述的共培养3-4天的丹参外植体转接到除菌固体培养基（1/2MS+Cef500mg/ L)中，25°C暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已经发根的丹参外植体转 接到除菌固体培养基（1/2MS+Cef300mg/L)上，25°C暗培养2周待毛状根长至3cm以上时剪 取单一毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基（l/2MS+Cen〇Omg/L)中暗培养两 周，直至无农杆菌溢出。
[0059] 7. 3.转基因丹参毛状根的PCR检测
[0060] 7. 3. 1转基因毛状根基因组DNA的提取
[0061] 本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取7. 2. 3中除菌完毕的转基 因毛状根5cm左右放入I. 5mL离心管中，加入适量的石英砂及600 μ L CTAB裂解液（65°C 预热，含1 % β -巯基乙醇），用研磨棒将材料充分研磨。置于65°C水浴锅中40-50分钟， 其间多次混匀样品（次/min)，冷却至室温后加入等体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化lOmin， 1200rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿（I: 1)，轻轻混匀， 12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加入等体积的氯仿混勾，12000rpm离心 20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀 挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温 晾干，加入30-50 μ L水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80°c超低温冰箱冻存，备用。
[0062] 7. 3. 2引物设计及PCR检测
[0063] 在pCAMBIA2300+: : SmWRKY70上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子 CaMV35S及插入基因（SmWRKY70)上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述 毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中 能检测到和阳性对照大小相当的PCR产物。而以pCAMBIA2300 +空载体遗传转化丹参所获 得的毛状根及野生型丹参植株根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。结果说明 SmWRKY70基因已经整合到丹参基因组中。
[0064] 本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含 SmWRKY70基因的植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗 传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得 为筛选高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。
[0065] 实施例8 :QRT_PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达
[0066] 8. 1.毛状根液体培养
[0067] 选择实施例3中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌蒸 馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有200mL的1/2MS液体培养基继代一次，60天后收 获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包装好进入液氮中冷冻后保存 于-80°C用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮含量提取。
[0068] 8. 2.转基因丹参毛状根的QRT-PCR检测
[0069] 根据SmWRKY70基因的编码序列设计QRT-PCR引物用于检测丹参毛状根中总的 SmWRKY70基因的表达情况，同时检测丹参酮生物合成途径中的相关基因（SmDXS、SmDXR、 SmIPPI、SmGGPPS、SmCPS、SmKSL、SmCYP76AHl)，看家基因 Actin 用来作为内参（见图 6)。
[0070] QRT-PCR结果显示：SmWRKY70基因在过表达株系中的表达量明显提高，最高株系 是对照的47. 06倍；丹参酮生物合成途径中的相关基因中的SmDXS基因和SmDXR基因与 SmWRKY70基因的表达成正相关性，所以预测SmDXS基因和SmDXR基因可能是SmWRKY70基因 的调控靶点。
[0071] 实施例9 :利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量
[0072] 9. 1.毛状根中丹参酮含量的提取
[0073] 将上述提RNA时收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取0. 2g毛状根粉 末于50mL离心管中，加入16mL 甲醇：二氯甲烧（3 :l，v/v)，超声60min，室温，避光，过夜静 置，12000rpm，离心10min，吸取上清萃取液于旋转蒸发仪中60°C真空干燥，残余物重新用 2mL的甲醇（分析纯）溶解，将样品用0. 22 μπι的滤膜过滤后待测。
[0074] 9.2.毛状根中丹参酮含量的HPLC测定
[0075] 将二氢丹参酮（DH-TI)、隐丹参酮（CT)、丹参酮I (T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)标准 品分别用分析纯甲醇配置成280 μ g/mL，300 μ g/mL，28 μ g/mL，290 μ g/mL的浓度。
[0076] 上述0. 22 μπι滤膜过滤后的丹参酮粗提物各取20 μ L，注入高效液相色谱仪。色 谱条件为：C-18 反相硅胶柱（Symmetry Shield TM C18, 5 μ m，250 X 4. 6mm，Waters);乙腈： 水（65 :35)为流动相；柱温为30°C ;流速为lmL/min ;波长为220nm。记录各丹参酮组分的 峰面积，代入线性回归方程后，计算即得样品丹参酮含量。
[0077] 在本发明中，过表达SmWRKY70丹参毛状根株系中所检测的4种丹参酮（二氢丹参 酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA)含量比对照组含量明显提高，其中总丹参酮含量最高 的一个克隆为W70-03(13. 731mg/g)，是对照组（2. 175mg/g)的6. 31倍。其中二氢丹参酮、 隐丹参酮、丹参酮I含量的提高较为显著，丹参酮IIA则没有太大变化（见图7)。
[0078] 序列表 <110>上海师范大学 <120>-种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法 <160>4 <210> 1 <211〉789 <212> DNA <213>丹参转录因子基因序列 <400> I I ATGGCATCTT CCTCCTGCGT TCACAGAAAC GCCGTGCCGG AGCGAGTGAT GACCGA GTTG 61 ACTCGCGGCC GGGAGATAGC CGACCGGATC CGGCTCMGT TGCGCGAGAC C GGATTCGAT I2I GGCTCGGCCG GTTCAGTTTT TCCGGTTCAG AGCCTTGTGA GCCAGCTCCT GG ACACCTTC 181 ACTCACTCTC TCGCCATGCT TCGCGACGGC GGCGAGTCGG ATGAGGCTTC TC AGGCTCCT 241 TCCGCCGCCA AATTGGAGGA CTCCGGCGAC AGTTGCAAGA CGCCGGCGGC CA AGGATCGC 301 CGGGGATGCT ACAAGCGAM GAGAAGTTCG GAGACAAGGA TCAAAGAGAG CT CGGATTTA 361 TTTGMGATG GGCATGCATG GAGGAAATAT GGACAAAAAT CCATCCTTAA CG CCAAACAT 421 CCTAGGAACT ACTATAGGTG CGCTCATAAA Tl'CGACCAAA AATGCCl'AGC CA CAAAACAA 481 GTCCAAAAAA TCCAAGACGA GCCCCCTCTA TATAGGACAA CCTACAACGG CC AACACACT 54I TGCAACAAGT CAGCCCTCCA CCACCACGTC GTCCCCGCCT CGCCGGATTC CT CCTCCGTC 601 ATGTGGAGCT TCAATTCGAT CAAACAGGAG GAGGAGATTC AAATGAAAAC AC CGGACGAG 66I TACTACATAT CGCCCCACCA CTTTTCGCCC ATGTCTTCGG ATGTGTACTC TT GCTCTCAT
[0079] 721 AGTATTGAGG ATGTGGATGA CATTGTGGGC TCCTTCGAAG ATTATTTCGA AT TTGAAACC 781 TTAAGTTGA <210>2 <211>918 <212> DNA <213>丹参转录因子基因的启动子序列 <400> 2 I TCTCTGGGTT CTCTCTTCAA AGTTTGTGAG ATTGTTTGAG TGTTGATTGC TGCTGT GTTT 61 GTACTTTCTC AGTTTGTGAT TTGTGAATAA AACGAACTCT TGTTCATGGC C CGTGGACGT 121 AGGGATCTTT TCCGAACCAC GTAAATTC1G AGITGCGTTT ATl'TGl'TTGG ?'?' TAMTATT 181 CAAAAGAATC ATTGCTTGTT CAACAAACTA CAATCTCTAA AGCTCGAGGG AT GAAACTAA 241 ATTCTTTCAT GATTTTAATC CAATCAAACC CTTTAATTAT CCTCTAACCA AC CTCTMTT 301 CTCCCTCCGT CCCATAAGTT TAGGCTTGTT TTTCTTTTTT GAATGTCTCA TT TATATAGG 361 CTTGTTTCCA TAAAAAGTAA TGTTTTTTTA CTCATTTACT ATTATATCCT TA TTTAATTC 421 TTTAATTTAC TCACACTTTA ATACATCATT ΛΛΛΤΛΛΤΛΛΛ TATGGGCATA CT AGGGAA1T 481 TACTTGTATA TTTTTATTTC TAATTATTTT CTTAATCTTT GTGAAMTCC CA CTCAGCCT 541 AAACTTATGG GACGAAGGGA GTAATAATTA ATATACTAAG CAGGACAAAA AA GTGTAGCC 601 GAAGGAGCCA GCGGTAATTG CACATGGTCA TGACATACCC TATGACAAAG CA GCTTACGT 661 CACCTAGAAT GCGCAATAGA AAAAACCCAC GCGCCCAACA ACCCGTACCC GA CACGCCTC 721 CATCCAATCA AGCGAAGTGA CTTCACGAAC CCATACAGCG CGTGACTGCG AG AGCCTCTC
[0080] 781 AAATCTCCCA TGAATTTCCC ACAAATTTCC TAGAGCAACT CTCTAATATT AA AATAATTA 841 AACTATTCAT CACTATATAA TAAGGAGTTT CGAAGATGAG AAAGTAGGGT AA CCAAACTA 901 CTCAGAAAAA AATTGAGC <210>3 <211〉30 <212> DNA <2〗3> 兄O70-SPI引物序列 <400> 3 I GCGGAAGGAG CCTGAGAAGC CTCATCCGAC <210>4 <211>30 <212> DNA <213>細if見O70-SP2引物序列 <400> 4 I AGCATGGCGA GAGAGTGAGT GAAGGTGTCC 〇
【主权项】
1. 一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将丹参 SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所述的 丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQIDNO. 1所示； (2) 采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参 SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQIDNO. 2所示； (3) 根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参SmWRKY70转录 因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析； ⑷根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，对丹 参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析； (5) 将步骤（1)所获得的SmWRKY70基因的过表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化 丹参的发根农杆菌菌株； (6) 将步骤（5)所获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的 转基因丹参毛状根； (7) QRT-PCR分析步骤（6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中SmWRKY70 基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的株系； (8) 用高效液相色谱法测定步骤（7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中丹参酮的含 量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系。2. 根据权利要求1所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤（1) 所述的植物表达载体为经过改造获得的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止 子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。3. 根据权利要求1所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤（5) 中所述的发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1。
【专利摘要】本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，该方法用丹参SmWRKY70转录因子构建重组的植物表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmWRKY70基因的丹参毛状根。本发明从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达丹参毛状根。采用本发明的方法获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
【IPC分类】C12N15/84, C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN104894143
【申请号】CN201510334881
【发明人】开国银, 李磊磊, 郝小龙
【申请人】上海师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术，特别涉及一种利用代谢工程策略，转化丹参SmWRKY70转录 因子提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。
【背景技术】
[0002] 丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge)，是一种多年生的双子叶草本植物，作为一种 传统中药，丹参在临床上主要用于对心脑血管疾病的治疗。丹参中的有效成分主要包括两 大类，一类是脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮 IIA等等；还有一类是水溶性的丹酚酸类化合物。大量研宄已经证明，丹参酮具有多种药理 活性，分别是心脑血管保护、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，因此具有巨大的市场 需求。但是，在传统的栽培模式下，丹参生长周期较长、品质严重退化的弊端；而在化学合成 过程中，由于丹参酮的结构复杂导致其化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污 染；在离体条件下的细胞培养方法获得的细胞，其药用活性成分积累量很低而且稳定性很 差，远达不到商业化开发利用的要求。代谢工程的迅速发展与毛状根培养技术的日益成熟 为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量，解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条新思路。
[0003] 据文献检索分析，WRKY转录因子是植物界中最大的一类转录因子之一，是调控许 多植物过程信号网络必不可少的部分。WRKY转录因子最显著的特征是其DNA结合域中都 至少含有1个WRKY结构域。WRKY蛋白参与植物的许多生理过程，主要包括：生物胁迫、非 生物胁迫、种子的形成、种子的休眠与萌发、植物的衰老和发育。利用代谢工程手段，将丹参 SmWRKY70转录因子转化丹参，获得高产丹参酮的丹参毛状根，为商业化生产丹参酮提供新 型优质药源，目前尚未发现与本发明主题所提及的利用丹参SmWRKY70转录因子提高丹参 毛状根中丹参酮含量的相关报道。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具 有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供一种提高丹参毛状根中丹参酮含 量的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明从丹参中分离克隆出789bp的 SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了 918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列； 构建了 SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，激光共聚焦显微镜观察显示 SmWRKY70转录因子在细胞核中表达；构建了 SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶 片获得SmWRKY70基因的过表达的转基因丹参毛状根，QRT-PCR分析转基因丹参毛状根中 SmWRKY70以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达，高效液相色谱法（HPLC)测定转 基因丹参毛状根中丹参酮的含量。
[0006] 本发明包括如下具体步骤：
[0007] (1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将 丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所 述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO. 1所示；植物表达载体为经过改造获得 的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素 抗性位点。
[0008] (2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参 SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] (3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参SmWRKY70 转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析。
[0010] (4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草， 对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析。
[0011] (5)将步骤（1)所获得的SmWRKY70转录因子的植物过表达载体转化发根农杆菌， 获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1。
[0012] (6)将步骤（5)所获得的含SmWRKY70转录因子的植物过表达载体的发根农杆菌菌 株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；所述的经PCR检测的阳 性转基因丹参毛状根是指：在驱动插入基因（SmWRKY70)表达的组成型启动子CaMV35S的内 部及插入基因 SmWRKY70的内部，分别设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩增，紫外线下 观察到目的条带的株系即为阳性转基因丹参毛状根株系。
[0013] (7) QRT-PCR分析步骤（6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中 SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的 株系；QRT-PCT分析转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关 基因的表达，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的转基因丹参毛状根克隆进行总RNA的提 取，并反转录成cDNA，分别设计检测基因及看家基因 Actin的引物，进行QRT-PCR扩增，分析 SmWRKY70基因以及丹参酮生物合成途径中的相关基因的表达情况。
[0014] (8)用高效液相色谱法（HPLC)测定步骤（7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中 丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系；对SmWRKY70基因的表达量 显著提高的转基因丹参毛状根中丹参酮的含量进行高效液相色谱法测定的具体测定方法 如下：将丹参酮粗提物各取20 μ L，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为C-18反相 硅胶柱，流动相为乙腈：水（65 :35,柱温为30°C，流速为lmL/min，检测波长为220nm。
[0015] 本发明应用常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、定量QRT-PCR 分析、丹参酮提取及含量测定等，建立了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法。采用遗 传转化丹参SmWRKY70转录因子基因的代谢工程策略获得了高产丹参酮的丹参转基因毛状 根株系，所获得的转基因丹参毛状根中总丹参酮含量显著提高，其中总丹参酮含量最高的 一个克隆为W70-03 (13. 731mg/g)，是对照组（2. 175mg/g)的6. 31倍。本发明提供了一种提 高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质 药源，为商业化大量生产丹参酮和降低药品价格提供了可能，对缓解丹参酮药源的紧缺性 起到积极的促进作用，也为规模化生产丹参酮临床药物的大量需求提供了重要来源。
【附图说明】
[0016] 图 1 为 pCAMBIA2300+: :SmWRKY70 载体构建图。
[0017] 图2为SmWRKY70启动子序列。
[0018] 图3为SmWRKY70在不同组织中的表达情况。
[0019] 图4为SmWRKY70在MJ、SA、YE处理下的表达模式。
[0020] 图5为SmWRKY70的亚细胞定位。
[0021] 图6为丹参的相关基因在SmWRKY70毛状根株系中的表达。
[0022] 图7为HPLC分析SmWRKY70转基因毛状根株系中的丹参酮含量。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请权利要求书所限定的 范围。
[0024] 下列实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆 (Sambrook等）中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建 议的条件。
[0025] 实施例1 :丹参SmWRKY70基因的克隆
[0026] I. 1.丹参总RNA的提取
[0027] 取少量丹参（采用产于山东平邑丹参酮含量较高的丹参品种）幼嫩叶片，用液氮 速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RMpr印Pure Plant Kit使用说明 书提取总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1. 2% ;0. 5 X TBE电泳缓冲液； 150v，15min)检测RNA的完整性。用Nano Drop 2000c超微量分光光度计检测其纯度和浓 度。
[0028] L 2.丹参SmWRKY70基因的克隆
[0029] 以所获的0.5 yg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL (AMV)进行第一链cDNA 的合成（操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书）。根据本实验室所得到的丹参 SmWRKY70基因的转录组序列，分别设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游 引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建表达载体。以所述 的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服 务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果得到了完整的SmWRKY70转录因子基因的 编码框序列（如SEQ ID NO. 1所示）。
[0030] 实施例2 :丹参SmWRKY70启动子的克隆
[0031] 2. 1.丹参基因组DNA的提取
[0032] 采用CTAB法提取丹参嫩叶的基因组DNA，将提取的DNA进行凝胶电泳，初步确定所 提取的DNA完整性，用Nano Drop 2000c超微量分光光度计上检测DNA样品的纯度和浓度。
[0033] 2. 2.丹参SmWRKY70启动子的克隆
[0034] 采用 TaKaRa 公司的 LA PCRTM in vitro Cloning Kit(Code :DRR015)试剂盒 进行SmWRKY70启动子克隆（操作步骤参照TaKaRa公司提供的相关说明书）。将提取的 DNA用限制性内切酶EcoR I、Pst I、Bgl II酶切6个小时，然后用乙醇沉淀回收，连接 试剂盒中对应的接头，4小时后用乙醇沉淀回收。根据SmWRKY70的已知序列，设计引物 SmWRKY70-SPl (SmWRKY70-SPl :5' -GCGGAAGGAGCCTGAGAAGCCTCATCCGAC-3'），以加有接头 的回收产物为模板，用SmWRKY70-SPl+Primer Cl为引物，进行第一轮PCR扩增。然后根据 S mWRKY70的已知序列，设计引物SmWRKY70-SPl的上游设计引物51^服￥70-5?2(51111服￥70-SP2:5' -AGCATGGCGAGAGAGTGAGTGAAGGTGTCC-3'），以第一轮 PCR 产物原液、稀释 10 倍、稀释 100倍为模板，用SmWRKY70-SP2+Primer C2为引物，进行第二轮PCR扩增后测序，最终获得 一条长度分别为918bp的启动子序列（如SEQ ID NO. 2所示）。
[0035] 2. 3.丹参SmWRKY70启动子分析
[0036] 根据 PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)网 站对SmWRKY70已克隆的启动子分析结果显示：SmWRKY70的启动子区包含4个W-box，表 明SmWRKY70可以自我调节或被其它WRKY基因交叉调控；SmWRKY70的启动子区还包含2个 MYB-识别域和1个E-box，表明SmWRKY70可能被R2R3MYB转录因子和bHLH转录因子结合； SmWRKY70的启动子区还包含1个参与到MJ响应的顺式作用元件，CGTCA结构域；包含2个 参与到SA响应的顺式作用元件，AGAAAA结构域，因此SmWRKY70均能响应MJ和SA的诱导 (见图2)。
[0037] 实施例3 :丹参SmWRKY70的组织表达谱分析
[0038] 为了研宄SmWRKY70的组织表达模式，分别提取丹参两年生的根、茎、叶、花、种子 五个组织的总RNA，并分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cDNA，用于QRT-PCR分 析SmWRKY70的组织表达谱，反应体系用TIANGEN公司提供的SuperReal PreMix (SYBR Green)试剂盒，用Actin作为内参基因，采用比较CT法计算基因的相对表达量。结果显示， SmWRKY70在所检测的所有组织中，在叶和叶柄中表达较强，其次在茎中表达较高，在主根、 须根、花、花丝、花萼中表达较弱（见图3)。
[0039] 实施例4 :丹参SmWRKY70对激素处理的响应分析
[0040] 为了验证SmWRKY70是否响应MJ、SA、YE激素的诱导，对在摇瓶中培养了 60左右 大小的丹参毛状根进行了 MJ、SA、YE处理，提取经MJ、SA、YE处理不同时间后的丹参毛状根 的总RNA，QRT-PCR结果显示：SmWRKY70在MJ诱导0. 5小时后表达量达到最高，然后开始下 降；SmWRKY70在SA诱导3小时后表达量达到最高，然后开始下降，到9小时基本回复到诱 导前表达水平。SmWRKY70在YE诱导1小时后表达量达到最高，然后开始下降，到4小时基 本回复到诱导前表达水平（见图4)。
[0041] 实施例5 :丹参SmWRKY70的亚细胞定位分析
[0042] 5. I. pM0N530: : SmWRKY70 的构建
[0043] 根据已经克隆获得的丹参SmWRKY70的ORF序列，设计亚细胞定位载体构建的引 物，构建PM0N530: : SmWRKY70,并将pM0N530: : SmWRKY70质粒转化农杆菌Ase，用于后续的烟 草中的瞬时表达实验。
[0044] 5. 2.在烟草中的瞬时表达
[0045] 将构建好的工程菌 pM0N530::SmWRKY70 in Ase、pM0N530 in Ase 瞬时转化 60 天 的烟草。25°C培养2天后利用激光共聚焦显微镜观察SmWRKY70: :GFP蛋白、35S: :GFP蛋白 在烟草中的表达。结果显示空载体在整个细胞中表达，pM0N530::SmWRKY70在细胞核中表 达，与它们作为转录因子的功能是一致的（见图5)。
[0046] 实施例6 :含丹参SmWRKY70基因的过表达载体的构建
[0047] 以pCAMBIA2300+为中间表达载体，用从丹参汇总克隆的SmWRKY70基因替换 PCAMBIA2300+上的 gus 基因。具体地，Spe I/BstE II 双酶切 pMD18-T: : SmWRKY70 和 PCAMBIA2300+;回收SmWRKY70基因和pCAMBIA2300 +大片段；连接转化，挑取单克隆菌 落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmWRKY70基因已被成功 构建到植物表达载体pCAMBIA2300+中，从而获得含SmWRKY70基因的植物过表达载体 pCAMBIA2300+: :SmWRKY70(见图 1)。
[0048] 本实施实例将调控丹参酮生物合成的转录因子SmWRKY70可操作性地连接于表达 调控序列，形成含SmWRKY70基因的植物过表达载体pCAMBIA2300 +: : SmWRKY70,该表达载体 可用于通过代谢工程策略来提高丹参中丹参酮含量。
[0049] 实施例7 :发根农杆菌介导的丹参SmWRKY70基因遗传转化丹参获得转基因丹参毛 状根
[0050] 7. 1.含植物表达载体的发根农杆菌工程菌的获得
[0051] 将实施例6中含SmWRKY70基因的植物过表达载体pCAMBIA2300+: : SmWRKY70转入 发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmWRKY70基因的植物 过表达载体pCAMBIA2300+::SmWRKY70已经成功构建到发根农杆菌C58C1中。
[0052] 7. 2.发根农杆菌介导SmWRKY70基因遗传转化丹参
[0053] 7. 2. 1外植体的预培养
[0054] 剪取丹参健壮无菌苗叶片（0. 5cm2)，接种到预培养培养基（MS)上，25°C暗培养2 天。
[0055] 7. 2. 2农杆菌与外植体的共培养
[0056] 将上述预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的 1/2MS悬液中浸泡10分钟（轻轻摇晃是外植体与菌液充分接触）后，取出浸染后的丹参叶 片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养3-4天。
[0057] 7. 2. 3毛状根的诱导和继代培养
[0058] 将上述的共培养3-4天的丹参外植体转接到除菌固体培养基（1/2MS+Cef500mg/ L)中，25°C暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已经发根的丹参外植体转 接到除菌固体培养基（1/2MS+Cef300mg/L)上，25°C暗培养2周待毛状根长至3cm以上时剪 取单一毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基（l/2MS+Cen〇Omg/L)中暗培养两 周，直至无农杆菌溢出。
[0059] 7. 3.转基因丹参毛状根的PCR检测
[0060] 7. 3. 1转基因毛状根基因组DNA的提取
[0061] 本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取7. 2. 3中除菌完毕的转基 因毛状根5cm左右放入I. 5mL离心管中，加入适量的石英砂及600 μ L CTAB裂解液（65°C 预热，含1 % β -巯基乙醇），用研磨棒将材料充分研磨。置于65°C水浴锅中40-50分钟， 其间多次混匀样品（次/min)，冷却至室温后加入等体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化lOmin， 1200rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿（I: 1)，轻轻混匀， 12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加入等体积的氯仿混勾，12000rpm离心 20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀 挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温 晾干，加入30-50 μ L水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80°c超低温冰箱冻存，备用。
[0062] 7. 3. 2引物设计及PCR检测
[0063] 在pCAMBIA2300+: : SmWRKY70上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子 CaMV35S及插入基因（SmWRKY70)上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述 毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中 能检测到和阳性对照大小相当的PCR产物。而以pCAMBIA2300 +空载体遗传转化丹参所获 得的毛状根及野生型丹参植株根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。结果说明 SmWRKY70基因已经整合到丹参基因组中。
[0064] 本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含 SmWRKY70基因的植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗 传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得 为筛选高产丹参酮的毛状根提供了直接素材。
[0065] 实施例8 :QRT_PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达
[0066] 8. 1.毛状根液体培养
[0067] 选择实施例3中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌蒸 馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有200mL的1/2MS液体培养基继代一次，60天后收 获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包装好进入液氮中冷冻后保存 于-80°C用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮含量提取。
[0068] 8. 2.转基因丹参毛状根的QRT-PCR检测
[0069] 根据SmWRKY70基因的编码序列设计QRT-PCR引物用于检测丹参毛状根中总的 SmWRKY70基因的表达情况，同时检测丹参酮生物合成途径中的相关基因（SmDXS、SmDXR、 SmIPPI、SmGGPPS、SmCPS、SmKSL、SmCYP76AHl)，看家基因 Actin 用来作为内参（见图 6)。
[0070] QRT-PCR结果显示：SmWRKY70基因在过表达株系中的表达量明显提高，最高株系 是对照的47. 06倍；丹参酮生物合成途径中的相关基因中的SmDXS基因和SmDXR基因与 SmWRKY70基因的表达成正相关性，所以预测SmDXS基因和SmDXR基因可能是SmWRKY70基因 的调控靶点。
[0071] 实施例9 :利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量
[0072] 9. 1.毛状根中丹参酮含量的提取
[0073] 将上述提RNA时收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取0. 2g毛状根粉 末于50mL离心管中，加入16mL 甲醇：二氯甲烧（3 :l，v/v)，超声60min，室温，避光，过夜静 置，12000rpm，离心10min，吸取上清萃取液于旋转蒸发仪中60°C真空干燥，残余物重新用 2mL的甲醇（分析纯）溶解，将样品用0. 22 μπι的滤膜过滤后待测。
[0074] 9.2.毛状根中丹参酮含量的HPLC测定
[0075] 将二氢丹参酮（DH-TI)、隐丹参酮（CT)、丹参酮I (T-I)和丹参酮IIA(T-IIA)标准 品分别用分析纯甲醇配置成280 μ g/mL，300 μ g/mL，28 μ g/mL，290 μ g/mL的浓度。
[0076] 上述0. 22 μπι滤膜过滤后的丹参酮粗提物各取20 μ L，注入高效液相色谱仪。色 谱条件为：C-18 反相硅胶柱（Symmetry Shield TM C18, 5 μ m，250 X 4. 6mm，Waters);乙腈： 水（65 :35)为流动相；柱温为30°C ;流速为lmL/min ;波长为220nm。记录各丹参酮组分的 峰面积，代入线性回归方程后，计算即得样品丹参酮含量。
[0077] 在本发明中，过表达SmWRKY70丹参毛状根株系中所检测的4种丹参酮（二氢丹参 酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA)含量比对照组含量明显提高，其中总丹参酮含量最高 的一个克隆为W70-03(13. 731mg/g)，是对照组（2. 175mg/g)的6. 31倍。其中二氢丹参酮、 隐丹参酮、丹参酮I含量的提高较为显著，丹参酮IIA则没有太大变化（见图7)。
[0078] 序列表 <110>上海师范大学 <120>-种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法 <160>4 <210> 1 <211〉789 <212> DNA <213>丹参转录因子基因序列 <400> I I ATGGCATCTT CCTCCTGCGT TCACAGAAAC GCCGTGCCGG AGCGAGTGAT GACCGA GTTG 61 ACTCGCGGCC GGGAGATAGC CGACCGGATC CGGCTCMGT TGCGCGAGAC C GGATTCGAT I2I GGCTCGGCCG GTTCAGTTTT TCCGGTTCAG AGCCTTGTGA GCCAGCTCCT GG ACACCTTC 181 ACTCACTCTC TCGCCATGCT TCGCGACGGC GGCGAGTCGG ATGAGGCTTC TC AGGCTCCT 241 TCCGCCGCCA AATTGGAGGA CTCCGGCGAC AGTTGCAAGA CGCCGGCGGC CA AGGATCGC 301 CGGGGATGCT ACAAGCGAM GAGAAGTTCG GAGACAAGGA TCAAAGAGAG CT CGGATTTA 361 TTTGMGATG GGCATGCATG GAGGAAATAT GGACAAAAAT CCATCCTTAA CG CCAAACAT 421 CCTAGGAACT ACTATAGGTG CGCTCATAAA Tl'CGACCAAA AATGCCl'AGC CA CAAAACAA 481 GTCCAAAAAA TCCAAGACGA GCCCCCTCTA TATAGGACAA CCTACAACGG CC AACACACT 54I TGCAACAAGT CAGCCCTCCA CCACCACGTC GTCCCCGCCT CGCCGGATTC CT CCTCCGTC 601 ATGTGGAGCT TCAATTCGAT CAAACAGGAG GAGGAGATTC AAATGAAAAC AC CGGACGAG 66I TACTACATAT CGCCCCACCA CTTTTCGCCC ATGTCTTCGG ATGTGTACTC TT GCTCTCAT
[0079] 721 AGTATTGAGG ATGTGGATGA CATTGTGGGC TCCTTCGAAG ATTATTTCGA AT TTGAAACC 781 TTAAGTTGA <210>2 <211>918 <212> DNA <213>丹参转录因子基因的启动子序列 <400> 2 I TCTCTGGGTT CTCTCTTCAA AGTTTGTGAG ATTGTTTGAG TGTTGATTGC TGCTGT GTTT 61 GTACTTTCTC AGTTTGTGAT TTGTGAATAA AACGAACTCT TGTTCATGGC C CGTGGACGT 121 AGGGATCTTT TCCGAACCAC GTAAATTC1G AGITGCGTTT ATl'TGl'TTGG ?'?' TAMTATT 181 CAAAAGAATC ATTGCTTGTT CAACAAACTA CAATCTCTAA AGCTCGAGGG AT GAAACTAA 241 ATTCTTTCAT GATTTTAATC CAATCAAACC CTTTAATTAT CCTCTAACCA AC CTCTMTT 301 CTCCCTCCGT CCCATAAGTT TAGGCTTGTT TTTCTTTTTT GAATGTCTCA TT TATATAGG 361 CTTGTTTCCA TAAAAAGTAA TGTTTTTTTA CTCATTTACT ATTATATCCT TA TTTAATTC 421 TTTAATTTAC TCACACTTTA ATACATCATT ΛΛΛΤΛΛΤΛΛΛ TATGGGCATA CT AGGGAA1T 481 TACTTGTATA TTTTTATTTC TAATTATTTT CTTAATCTTT GTGAAMTCC CA CTCAGCCT 541 AAACTTATGG GACGAAGGGA GTAATAATTA ATATACTAAG CAGGACAAAA AA GTGTAGCC 601 GAAGGAGCCA GCGGTAATTG CACATGGTCA TGACATACCC TATGACAAAG CA GCTTACGT 661 CACCTAGAAT GCGCAATAGA AAAAACCCAC GCGCCCAACA ACCCGTACCC GA CACGCCTC 721 CATCCAATCA AGCGAAGTGA CTTCACGAAC CCATACAGCG CGTGACTGCG AG AGCCTCTC
[0080] 781 AAATCTCCCA TGAATTTCCC ACAAATTTCC TAGAGCAACT CTCTAATATT AA AATAATTA 841 AACTATTCAT CACTATATAA TAAGGAGTTT CGAAGATGAG AAAGTAGGGT AA CCAAACTA 901 CTCAGAAAAA AATTGAGC <210>3 <211〉30 <212> DNA <2〗3> 兄O70-SPI引物序列 <400> 3 I GCGGAAGGAG CCTGAGAAGC CTCATCCGAC <210>4 <211>30 <212> DNA <213>細if見O70-SP2引物序列 <400> 4 I AGCATGGCGA GAGAGTGAGT GAAGGTGTCC 〇
【主权项】
1. 一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将丹参 SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所述的 丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQIDNO. 1所示； (2) 采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参 SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQIDNO. 2所示； (3) 根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT-PCR引物，对丹参SmWRKY70转录 因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析； ⑷根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，对丹 参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析； (5) 将步骤（1)所获得的SmWRKY70基因的过表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化 丹参的发根农杆菌菌株； (6) 将步骤（5)所获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的 转基因丹参毛状根； (7) QRT-PCR分析步骤（6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中SmWRKY70 基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的株系； (8) 用高效液相色谱法测定步骤（7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中丹参酮的含 量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系。2. 根据权利要求1所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤（1) 所述的植物表达载体为经过改造获得的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和终止 子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。3. 根据权利要求1所述的提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤（5) 中所述的发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1。
【专利摘要】本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，该方法用丹参SmWRKY70转录因子构建重组的植物表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmWRKY70基因的丹参毛状根。本发明从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达丹参毛状根。采用本发明的方法获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
【IPC分类】C12N15/84, C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN104894143
【申请号】CN201510334881
【发明人】开国银, 李磊磊, 郝小龙
【申请人】上海师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日
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