一种水稻cyp704b2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
一种水稻cyp704b2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻CYP704B2基因突变体 cyp704B2-2及其分子鉴定方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的 617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细 胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突 变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子 体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传， 而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2,玉米 的 ms45 和水稻的 mill 等（Aarts 等，1997，The Arabidopsis MALE STERILITY 2protein shares similarity with reductases in elongation/condensation complexes， Plant Journal，12:615-623 ;Albertsen，2006， Male tissue-preferred regulatory sequences of MS45 gene and method of using same，专利号：US7154024B2 ;Hong 等，2012，Somatic and reproductive cell development in rice anther is regulated by a putative glutaredoxin，Plant Cell，24:577-588); -些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南 芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecar pollen和gemini pollen (Oh等，2010， The SIDECAR POLLEN gene encodes a microspore-specific L0B/AS2 domain protein required for the correct timing and orientation of asymmetric cell division， Plant Journal，64:839_50 ;Park 等，1998， The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollenldisrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate，Development，125:3789_99);玉米上还克隆了一个抱子体显性核不 育基因 MS44 (Cigan and Albertsen，1998，Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants，US5750868) ;2)细胞质雄性不育则是由细胞 质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由 细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不 育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质 基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能（Chen and Liu， 2014， Male sterility and fertility restoration in crops， Annu Rev Plant Biol， 65:5. 1-5. 28)。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了 Rf-1，Rf-2, Rf-4, Rf-5等 基因 （Komori 等，2004，Map-based cloning of a fertility restorer gene, Rf-Ij in rice (Oryza sativa L )，Plant Journal，37:315-325 ;Itabashi 等，2011，The fertility restorer gene，Rf2,for Lead Rice-type cytoplasmic male sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein， Plant Journal，65:359-367 ;Tang 等，2014， The rice restorer Rf4for wild-abortive cytoplasmic male sterility encodes a PPR protein that functions in reduction of WA352 transcripts， Molecular Plant， 7:1497-500 ;Hu 等，2012, The rice pentatricopeptide repeat protein RF5restorers fertility in Hong-Lian Cytoplasmic male-sterile lines via a complex with the glycine-rich protein GRP162,Plant Cell，24:109-22) 〇
[0003] 水稻是我国的民族产业，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。目前，我 国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的 55%左右。杂种水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻品种，通过杂交产 生具有杂种优势的第一代杂交种用于生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，主要表现 在生长旺盛，根系发达，穗大粒多，抗逆性强等方面。杂交水稻比常规稻增产达30%。目前 我国种植的杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻（三系杂交稻） 就是生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄 性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系（简称不育系，代 号A)有野败型，红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系（简称保持系，代号 B)是用来繁殖不育系一种水稻。其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育细胞质基因，可 产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产 生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系（简称恢复系，代号R)携带恢复基因， 能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种（即杂交稻）正常可育。三系育种 法存在感病、品质差、育种效率低等问题。因受恢保关系的制约，95%的水稻资源不能用于 杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可 进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有 显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合几率大；不育系可一系两用。但是 两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大。比如在制种期间遇上低温，不育系将转为 可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率， 导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研宄课题。
[0004] 利用人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在水稻上获得了 多种新的不育突变体。cyp704B2突变体是其中之一。这种突变体的花药不产生成熟花 粉粒。这个不育基因已克隆，为CYP704B2基因，属于P450家族，编码区有4个外显子，编 码一个 544 个氨基酸的蛋白（Li 等，2010，Cytochrome P450 family member CYP704B2 catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cutin biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190)〇 CYP704B2基因在减数分裂形成小孢子前后，在绒粘层和小孢子特异性表达。CYP704B2蛋白 参与脂肪酸代谢，而脂肪酸代谢产物是角质和孢粉素前体。CYP704B2的缺失突变，使孢粉素 合成转运受阻，无法正常形成小孢子外壁，小孢子进一步发育受阻，导致完全雄性不育；此 外还造成突变体花药表面角质缺失。cyp704B2突变体来源于粳稻品种9522的钴60辐射诱 变突变体，是由一段3102bp片断缺失引起的突变。该缺失片段包括CYP704B2基因的前部 1732bp，1112bp编码区上游的基因间序列，以及上游基因编码区3' -端的258bp序列。由 于这一突变删除了上游基因的部分序列，因此该突变体可能存在潜在的非目标性状变异， 可能为其利用带来不利影响。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2及其分子鉴定方 法和应用。
[0006] 本发明首先对籼稻品种93-11种子（MtlR )进行钴60辐射诱变处理，种植处理的 种子获M1代植株W1代植株自交产生种子（为11 2代），种植M2代植株，对112代植株进行形态 学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析， 在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研宄。
[0007] 本发明提供的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其为水稻CYP704B2基因第 1267个碱基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于 第4个外显子。
[0008] 进一步地，水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0009] 本发明提供了含有本发明所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载 体。
[0010] 本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。
[0011] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中的应 用。
[0012] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不育的转 基因水稻中的应用。
[0013] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制种中的 应用。
[0014] 本发明还提供了检测水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，该分子 标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：
[0015] 上游引物 2245_F :AGCTTCGGGGACGACAAGA (如 SEQ ID NO. 2 所示）
[0016] 下游引物 2245_R :TGCGTCATCGCCATGTACGT (如 SEQ ID NO. 3 所示）。
[0017] 本发明提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。
[0018] 本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。
[0019] 一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法，通过下述引物对 扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：
[0020] 所述引物对的核苷酸序列为：
[0021] 上游引物 2245_F :AGCTTCGGGGACGACAAGA (如 SEQ ID NO. 2 所示）
[0022] 下游引物 2245_R :TGCGTCATCGCCATGTACGT (如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0023] 如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着 该待检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。
[0024] 本发明提供的突变体优点如下：
[0025] 1)该突变体来源于籼稻骨干亲本品种93-11。该品种已完成了全基因组测序，对 水稻分子育种十分有利。
[0026] 2)文献"Li 等，2010， Cytochrome P450 family member CYP704B2catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cut in biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190" 中 的突变体为大片段缺失，不仅CYP704B2基因缺失，而且上游基因3' -端的258个碱基对也 被删除，因此带有潜在的附加效应。而本发明的突变发生在一个CYP704B2基因的第4个外 显子中2个碱基的缺失，使这一基因发生移码突变，转录提前终止，导致CYP704B2蛋白的C 端220个氨基酸缺失，不存在这一潜在的附加效应问题。
[0027] 3)因辐射诱变造成突变位点比野生型少2个碱基对，采用实验室常用的聚丙烯酰 胺凝胶电泳就能开展分子检测，不需要特别的检测技术和方法。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例2中2245突变体和野生型的株型与穗型照片。
[0029] 图2是实施例3中2245突变体的显微镜照片。
[0030] 图3是实施例6中2245突变体CYP704B2基因的突变位点及蛋白质翻译终止位点 示意图。
[0031] 图4-a和图4-b组成实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因 DNA 序列的比对图。
[0032] 图5是实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因蛋白质序列的比对 图。
[0033] 图6是实施例7中野生型93-1U2245突变体CYP704B2基因扩增片段的电泳照片。
[0034] 图7是实施例8中2245X93-11组合匕群体中可育株和不育株CYP704B2基因突 变位点的PCR产物的电泳照片。
[0035] 图8是实施例9的杂交转育的技术路线图。
【具体实施方式】
[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0038] 实施例1 :钴60辐射诱变突变体库
[0039] 选用籼稻骨干亲本品种93-11作为辐射处理的材料，该品种已完成了全基因组测 序，对水稻分子育种十分有利。
[0040] 2013年夏，于长沙钴60 (6tlCo)辐射93-11种子（Mci代）10公斤，7月种植于海南临 高田间，分单株收获M 1代种子，共收获约6500份种子。
[0041] 选取M1代种子3200个株系，每个株系种植50棵单株。2014年春季，种植于海南临 高田间。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查 株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。 每个株系收6个单株，作为突变体库资源保存。
[0042] 实施例2 :M2代种植与性状观察
[0043] 在M2代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花 粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为2245的家系中发现1株 育性异常的植株，该突变体在营养生长、抽穗期、穗型均与野生型没有明显区别，图1为该 突变体植株与野生型植株的株型（图1左侧）和穗型（图1右侧）对比照片，但花药比野 生型小，颜色浅黄，结实率很低，被选作候选突变体材料进行下一步研宄。
[0044] 实施例3 :花粉镜检，自交，异交
[0045] 通过数碘染着色与不着色花粉比例，统计花粉育性。在体式显微镜下观察2245突 变体小花形态，发现雌蕊与野生型无明显区别，花药比野生型小，颜色较浅。田间采集开花 期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液（0.6 % KI，0.3 % I2，w/w)中轻轻挤压花药，滴 在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照（图2)。野生型花粉多而染 成蓝黑色，而突变体则看不到花粉粒。
[0046] 同一家系野生型植株套袋自交后正常结实，而2245突变体不结实。用93-11和中 花11为突变体授粉，均可正常结实，得到F 1代种子。表明该突变体为雄性不育突变体，雌 性不受影响。
[0047] 对匕代自交得到F2代种子，种植F2代植株144株，将花药碘染后在显微镜下观察， 其中110株花粉正常碘染，且正常自交结实，34株无花粉，且自然结实率低，符合3:1分离， 表明该不育性状由单个隐性基因控制。
[0048] 实施例4 :叶片采样与DNA提取
[0049] 本项研宄采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1 g叶片，放入 离心管，加入600 μ L CTAB提取缓冲液，5 μ L RNase A，震荡分散，65°C水浴0.5hr，其间轻 摇2-3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚（1: 1，v/v)，混勾，轻摇IOmin ;4°C 1000 Orpm离 心20min ;转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH值5. 2)、0. 6-1倍体积的冷异丙 醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4°C 1000 Orpm离心10min ;弃去上清，用体积百分含量70% 乙醇洗沉淀2次；风干，加入50 μ L I X TE溶解沉淀，-20°C保存。用Nanodrop2000检测DNA 浓度，稀释至l〇ng/L用作PCR模板。
[0050] 实施例5 :PCR反应与产物回收
[0051] 用候选基因0sCYP704B2基因的引物扩增93-11野生型和突变体DNA。
[0052] 用于扩增0sCYP704B2基因的引物对序列见下表1 :
[0053] 表1用于扩增0sCYP704B2的引物对序列
[0054]
[0055] PCR反应体系为：IyL IOX反应缓冲液，0.25yL dNTP，0.25yL正向引物和 0. 25yL反向引物，0. 5U Taq酶，I yL lOng/yL模板DNA，加超纯水将总体积补至10yL。 PCR反应程序为：94-98°C变性l_3min，然后执行以下循环：95°C变性20s，53-58°C复性 20s，72°C延伸30s，30-40个循环。循环结束后72°C补充延伸3-10min，结束反应。配置1. 5% 琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min ;采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
[0056] 实施例6 :DNA序列分析
[0057] 将回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序 引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6. O对双向测序结 果进行拼接；2245突变体CYP704B2基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由1928个 碱基组成，将水稻CYP704B2基因的该突变体基因命名为cyp704B2-2。对野生型和突变体 序 列进行比对发现，在CYP704B2基因的基因组序列第1267个碱基之后的2个G碱基缺失； 该突变位点位于第4个外显子，蛋白序列分析比对显示，该突变引起了移码突变，造成提前 终止（参见图4-a和图4-b这两张图共同组成野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因 DNA序列的比对图，反色显示位置为cyp704B2-2基因的突变位点），导致野生型中C端220 个氨基酸在2245突变体中替换为一个丙氨酸（参见图5,反色显示位置为cyp704B2-2翻译 的氨基酸序列中与野生型不同的氨基酸，短横线表示缺失的氨基酸）。
[0058] 实施例7 :突变位点分子标记设计与基因型鉴定
[0059] 根据实施例6中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物：正向引物2245_ F，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；反向引物2245_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 不O
[0060] 在实施例5中所述PCR反应条件下，用上述引物对对93-11和2245突变体进行扩 增。
[0061] 扩增产物在12 %聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如 下：（1)聚丙烯酰胺胶的配制：12% PA胶80mL，10%过硫酸胺250 μ L(冬天）/125 μ L(夏 天），四甲基乙二胺（TEMED)SOyL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒 精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2%的R印el Silane后，再用酒精擦净、干燥，将另 一块平板涂上 0· 5% 的 Bingding Silane I. 5mL(在 I. 5ml 离心管中加入 7. 5 μ L Binding Silane和7. 5 yL冰醋酸，补足95 %乙醇至I. 5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污 染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。（2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝 胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽（阴极）装入IXTBE的电极缓冲液，将聚合 的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入〇. 5XTBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电 泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。（3)电泳：扩增产物中加入 5 μ I 5 X Loading Buffer混合后95°C变性5分钟，立亥Ij转移到冰上冷却，吸取1. 5-3 μ 1加 入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。视SSR扩增产物 分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。（4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放 入10%的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2 次，每次5min ;将冲洗后的胶板放入新配制的染色液（2L水中加入2g硝酸银、3mL 37%甲 醛）中65r/min摇动30min ;将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶 板快速转移到4°C预冷的显影液（2L水中加入30g氢氧化钠 ，IOml 37%甲醛）轻轻摇动至 带纹出现；将胶板置于10%的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次 2min ;室温下自然干燥后，拍照保存图像。
[0062] 结果见图6, 2245突变体的扩增产物比野生型93-11略短，与测序结果一致。
[0063] 实施例8 :基因型-突变表型共分离验证
[0064] 在2245X93-11的F2群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株各18株提取 叶片DNA，方法同实施例4。用实施例7中所述引物2245_F和2245_R进行扩增这些DNA，并 如实施例7中所述方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0065] 电泳结果见图7,表型为野生型植株扩增产物的电泳带型全部为野生型93-11或 杂合型带型，突变体扩增产物的电泳带型全部与2245 (cyp704B2-2)的带型相同。这一结果 表明实施例6中所述突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。这一结果结合该突变体 的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断2245突变体的雄性不育表 型是由实施例6中所述的突变造成的。
[0066] 实施例9 :突变基因的杂交转育
[0067] 可按图8的步骤将2245的不育基因 cyp704B2-2通过杂交转育到其它水稻遗传背 景中：
[0068] ①杂交：
[0069] 以2245为母本，与受体水稻材料为父本杂交获得F1种子；
[0070] ②第一轮回交：
[0071] F1播种后获得F i植株，将F i植株与轮回亲本进行杂交，获得BC i种子；
[0072] ③BC1不育基因选择（前景选择）：
[0073] 播种BC1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例4中 所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对（2245_F* 2245_R)进行扩增和电泳，选取 基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；
[0074] ④队背景选择：
[0075] 采用一组（例如100个，或200个等）在2245和轮回亲本之间存在多态的，且在 基因组上均匀分布的分子标记（可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等 类型标记），对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高（例如大于88%相 似度，或2%中选率等）的材料；
[0076] ⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC2种子；
[0077] ⑥BC2的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回 亲本相似度高于选择标准（如相似度大于98%，或2%中选率等）的BC 2R植株；
[0078] ⑦自交获得BC2F2种子：对步骤⑥中选出的BC 2植株进行自交，获得BC 2F2种子；
[0079] ⑧BC2F2的前景选择：将步骤⑦中获得的BC 2F2种子播种，获得500株以上幼苗，在 幼苗期采集采集叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对（2245_ F和2245_R)进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合 野生型的单株；
[0080] ⑨BC2F2的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景 筛选，选出100%背景纯合的单株。如果中选单株的2245_?/2245_1?引物对扩增带型为纯合 突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它水 稻材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株 用于杂交育种或制种。
【主权项】
1. 一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其为水稻CYP704B2基因第1267个碱 基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于第4个外显子。2.如权利要求1所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。3.含有权利要求1或2所述CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载体。4. 含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中 的应用。6. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不 育的转基因水稻中的应用。7. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制 种中的应用。8. 检测权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，其 特征在于，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为： 上游引物2245_F:AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示） 下游引物2245_R:TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO. 3 所示）。9. 权利要求8所述的分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。10. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法， 其特征在于，通过下述引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物： 所述引物对的核苷酸序列为： 上游引物2245_F:AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示） 下游引物2245_R:TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO. 3 所示）； 如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着该待 检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。
【专利摘要】本发明提供一种水稻CYP704B2基因突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变引起水稻CYP704B2基因1267个碱基之后的2个G碱基缺失，将该CYP704B2基因突变体命名为cyp704B2-2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，进一步证实该突变体引起水稻隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/29, C12N15/63, A01H5/00, C12Q1/68
【公开号】CN104894144
【申请号】CN201510387564
【发明人】黄培劲, 李新鹏, 李京琳, 安保光, 张维, 龙湍
【申请人】海南波莲水稻基因科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月6日
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻CYP704B2基因突变体 cyp704B2-2及其分子鉴定方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的 617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细 胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突 变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子 体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传， 而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2,玉米 的 ms45 和水稻的 mill 等（Aarts 等，1997，The Arabidopsis MALE STERILITY 2protein shares similarity with reductases in elongation/condensation complexes， Plant Journal，12:615-623 ;Albertsen，2006， Male tissue-preferred regulatory sequences of MS45 gene and method of using same，专利号：US7154024B2 ;Hong 等，2012，Somatic and reproductive cell development in rice anther is regulated by a putative glutaredoxin，Plant Cell，24:577-588); -些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南 芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecar pollen和gemini pollen (Oh等，2010， The SIDECAR POLLEN gene encodes a microspore-specific L0B/AS2 domain protein required for the correct timing and orientation of asymmetric cell division， Plant Journal，64:839_50 ;Park 等，1998， The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollenldisrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate，Development，125:3789_99);玉米上还克隆了一个抱子体显性核不 育基因 MS44 (Cigan and Albertsen，1998，Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants，US5750868) ;2)细胞质雄性不育则是由细胞 质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由 细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不 育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质 基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能（Chen and Liu， 2014， Male sterility and fertility restoration in crops， Annu Rev Plant Biol， 65:5. 1-5. 28)。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了 Rf-1，Rf-2, Rf-4, Rf-5等 基因 （Komori 等，2004，Map-based cloning of a fertility restorer gene, Rf-Ij in rice (Oryza sativa L )，Plant Journal，37:315-325 ;Itabashi 等，2011，The fertility restorer gene，Rf2,for Lead Rice-type cytoplasmic male sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein， Plant Journal，65:359-367 ;Tang 等，2014， The rice restorer Rf4for wild-abortive cytoplasmic male sterility encodes a PPR protein that functions in reduction of WA352 transcripts， Molecular Plant， 7:1497-500 ;Hu 等，2012, The rice pentatricopeptide repeat protein RF5restorers fertility in Hong-Lian Cytoplasmic male-sterile lines via a complex with the glycine-rich protein GRP162,Plant Cell，24:109-22) 〇
[0003] 水稻是我国的民族产业，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。目前，我 国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的 55%左右。杂种水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻品种，通过杂交产 生具有杂种优势的第一代杂交种用于生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，主要表现 在生长旺盛，根系发达，穗大粒多，抗逆性强等方面。杂交水稻比常规稻增产达30%。目前 我国种植的杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻（三系杂交稻） 就是生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄 性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系（简称不育系，代 号A)有野败型，红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系（简称保持系，代号 B)是用来繁殖不育系一种水稻。其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育细胞质基因，可 产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产 生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系（简称恢复系，代号R)携带恢复基因， 能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种（即杂交稻）正常可育。三系育种 法存在感病、品质差、育种效率低等问题。因受恢保关系的制约，95%的水稻资源不能用于 杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可 进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有 显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合几率大；不育系可一系两用。但是 两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大。比如在制种期间遇上低温，不育系将转为 可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率， 导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研宄课题。
[0004] 利用人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在水稻上获得了 多种新的不育突变体。cyp704B2突变体是其中之一。这种突变体的花药不产生成熟花 粉粒。这个不育基因已克隆，为CYP704B2基因，属于P450家族，编码区有4个外显子，编 码一个 544 个氨基酸的蛋白（Li 等，2010，Cytochrome P450 family member CYP704B2 catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cutin biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190)〇 CYP704B2基因在减数分裂形成小孢子前后，在绒粘层和小孢子特异性表达。CYP704B2蛋白 参与脂肪酸代谢，而脂肪酸代谢产物是角质和孢粉素前体。CYP704B2的缺失突变，使孢粉素 合成转运受阻，无法正常形成小孢子外壁，小孢子进一步发育受阻，导致完全雄性不育；此 外还造成突变体花药表面角质缺失。cyp704B2突变体来源于粳稻品种9522的钴60辐射诱 变突变体，是由一段3102bp片断缺失引起的突变。该缺失片段包括CYP704B2基因的前部 1732bp，1112bp编码区上游的基因间序列，以及上游基因编码区3' -端的258bp序列。由 于这一突变删除了上游基因的部分序列，因此该突变体可能存在潜在的非目标性状变异， 可能为其利用带来不利影响。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2及其分子鉴定方 法和应用。
[0006] 本发明首先对籼稻品种93-11种子（MtlR )进行钴60辐射诱变处理，种植处理的 种子获M1代植株W1代植株自交产生种子（为11 2代），种植M2代植株，对112代植株进行形态 学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析， 在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研宄。
[0007] 本发明提供的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其为水稻CYP704B2基因第 1267个碱基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于 第4个外显子。
[0008] 进一步地，水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0009] 本发明提供了含有本发明所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载 体。
[0010] 本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。
[0011] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中的应 用。
[0012] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不育的转 基因水稻中的应用。
[0013] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制种中的 应用。
[0014] 本发明还提供了检测水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，该分子 标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：
[0015] 上游引物 2245_F :AGCTTCGGGGACGACAAGA (如 SEQ ID NO. 2 所示）
[0016] 下游引物 2245_R :TGCGTCATCGCCATGTACGT (如 SEQ ID NO. 3 所示）。
[0017] 本发明提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。
[0018] 本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。
[0019] 一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法，通过下述引物对 扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：
[0020] 所述引物对的核苷酸序列为：
[0021] 上游引物 2245_F :AGCTTCGGGGACGACAAGA (如 SEQ ID NO. 2 所示）
[0022] 下游引物 2245_R :TGCGTCATCGCCATGTACGT (如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0023] 如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着 该待检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。
[0024] 本发明提供的突变体优点如下：
[0025] 1)该突变体来源于籼稻骨干亲本品种93-11。该品种已完成了全基因组测序，对 水稻分子育种十分有利。
[0026] 2)文献"Li 等，2010， Cytochrome P450 family member CYP704B2catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cut in biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190" 中 的突变体为大片段缺失，不仅CYP704B2基因缺失，而且上游基因3' -端的258个碱基对也 被删除，因此带有潜在的附加效应。而本发明的突变发生在一个CYP704B2基因的第4个外 显子中2个碱基的缺失，使这一基因发生移码突变，转录提前终止，导致CYP704B2蛋白的C 端220个氨基酸缺失，不存在这一潜在的附加效应问题。
[0027] 3)因辐射诱变造成突变位点比野生型少2个碱基对，采用实验室常用的聚丙烯酰 胺凝胶电泳就能开展分子检测，不需要特别的检测技术和方法。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例2中2245突变体和野生型的株型与穗型照片。
[0029] 图2是实施例3中2245突变体的显微镜照片。
[0030] 图3是实施例6中2245突变体CYP704B2基因的突变位点及蛋白质翻译终止位点 示意图。
[0031] 图4-a和图4-b组成实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因 DNA 序列的比对图。
[0032] 图5是实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因蛋白质序列的比对 图。
[0033] 图6是实施例7中野生型93-1U2245突变体CYP704B2基因扩增片段的电泳照片。
[0034] 图7是实施例8中2245X93-11组合匕群体中可育株和不育株CYP704B2基因突 变位点的PCR产物的电泳照片。
[0035] 图8是实施例9的杂交转育的技术路线图。
【具体实施方式】
[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0038] 实施例1 :钴60辐射诱变突变体库
[0039] 选用籼稻骨干亲本品种93-11作为辐射处理的材料，该品种已完成了全基因组测 序，对水稻分子育种十分有利。
[0040] 2013年夏，于长沙钴60 (6tlCo)辐射93-11种子（Mci代）10公斤，7月种植于海南临 高田间，分单株收获M 1代种子，共收获约6500份种子。
[0041] 选取M1代种子3200个株系，每个株系种植50棵单株。2014年春季，种植于海南临 高田间。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查 株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。 每个株系收6个单株，作为突变体库资源保存。
[0042] 实施例2 :M2代种植与性状观察
[0043] 在M2代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花 粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为2245的家系中发现1株 育性异常的植株，该突变体在营养生长、抽穗期、穗型均与野生型没有明显区别，图1为该 突变体植株与野生型植株的株型（图1左侧）和穗型（图1右侧）对比照片，但花药比野 生型小，颜色浅黄，结实率很低，被选作候选突变体材料进行下一步研宄。
[0044] 实施例3 :花粉镜检，自交，异交
[0045] 通过数碘染着色与不着色花粉比例，统计花粉育性。在体式显微镜下观察2245突 变体小花形态，发现雌蕊与野生型无明显区别，花药比野生型小，颜色较浅。田间采集开花 期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液（0.6 % KI，0.3 % I2，w/w)中轻轻挤压花药，滴 在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照（图2)。野生型花粉多而染 成蓝黑色，而突变体则看不到花粉粒。
[0046] 同一家系野生型植株套袋自交后正常结实，而2245突变体不结实。用93-11和中 花11为突变体授粉，均可正常结实，得到F 1代种子。表明该突变体为雄性不育突变体，雌 性不受影响。
[0047] 对匕代自交得到F2代种子，种植F2代植株144株，将花药碘染后在显微镜下观察， 其中110株花粉正常碘染，且正常自交结实，34株无花粉，且自然结实率低，符合3:1分离， 表明该不育性状由单个隐性基因控制。
[0048] 实施例4 :叶片采样与DNA提取
[0049] 本项研宄采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1 g叶片，放入 离心管，加入600 μ L CTAB提取缓冲液，5 μ L RNase A，震荡分散，65°C水浴0.5hr，其间轻 摇2-3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚（1: 1，v/v)，混勾，轻摇IOmin ;4°C 1000 Orpm离 心20min ;转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH值5. 2)、0. 6-1倍体积的冷异丙 醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4°C 1000 Orpm离心10min ;弃去上清，用体积百分含量70% 乙醇洗沉淀2次；风干，加入50 μ L I X TE溶解沉淀，-20°C保存。用Nanodrop2000检测DNA 浓度，稀释至l〇ng/L用作PCR模板。
[0050] 实施例5 :PCR反应与产物回收
[0051] 用候选基因0sCYP704B2基因的引物扩增93-11野生型和突变体DNA。
[0052] 用于扩增0sCYP704B2基因的引物对序列见下表1 :
[0053] 表1用于扩增0sCYP704B2的引物对序列
[0054]
[0055] PCR反应体系为：IyL IOX反应缓冲液，0.25yL dNTP，0.25yL正向引物和 0. 25yL反向引物，0. 5U Taq酶，I yL lOng/yL模板DNA，加超纯水将总体积补至10yL。 PCR反应程序为：94-98°C变性l_3min，然后执行以下循环：95°C变性20s，53-58°C复性 20s，72°C延伸30s，30-40个循环。循环结束后72°C补充延伸3-10min，结束反应。配置1. 5% 琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min ;采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
[0056] 实施例6 :DNA序列分析
[0057] 将回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序 引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6. O对双向测序结 果进行拼接；2245突变体CYP704B2基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由1928个 碱基组成，将水稻CYP704B2基因的该突变体基因命名为cyp704B2-2。对野生型和突变体 序 列进行比对发现，在CYP704B2基因的基因组序列第1267个碱基之后的2个G碱基缺失； 该突变位点位于第4个外显子，蛋白序列分析比对显示，该突变引起了移码突变，造成提前 终止（参见图4-a和图4-b这两张图共同组成野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因 DNA序列的比对图，反色显示位置为cyp704B2-2基因的突变位点），导致野生型中C端220 个氨基酸在2245突变体中替换为一个丙氨酸（参见图5,反色显示位置为cyp704B2-2翻译 的氨基酸序列中与野生型不同的氨基酸，短横线表示缺失的氨基酸）。
[0058] 实施例7 :突变位点分子标记设计与基因型鉴定
[0059] 根据实施例6中得到的突变位点两侧的序列设计基因特异引物：正向引物2245_ F，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；反向引物2245_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 不O
[0060] 在实施例5中所述PCR反应条件下，用上述引物对对93-11和2245突变体进行扩 增。
[0061] 扩增产物在12 %聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法如 下：（1)聚丙烯酰胺胶的配制：12% PA胶80mL，10%过硫酸胺250 μ L(冬天）/125 μ L(夏 天），四甲基乙二胺（TEMED)SOyL。摇匀后灌胶。用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用酒 精擦净、晾干。在通风橱中将凹板涂上2%的R印el Silane后，再用酒精擦净、干燥，将另 一块平板涂上 0· 5% 的 Bingding Silane I. 5mL(在 I. 5ml 离心管中加入 7. 5 μ L Binding Silane和7. 5 yL冰醋酸，补足95 %乙醇至I. 5mL)。操作过程中，防止两块玻璃板相互污 染，彻底干燥后再进行玻璃板组装、灌胶。（2)预电泳：待胶凝固后，取出梳子，洗掉上边凝 胶尤其注意接缝处定要洗净。先在电泳槽下槽（阴极）装入IXTBE的电极缓冲液，将聚合 的凝胶板装在电泳槽内，在上槽中注入〇. 5XTBE的电极缓冲液。恒定功率40W-65W，预电 泳约30min。用吸管清除胶面上沉淀的尿素和气泡，插入梳子。（3)电泳：扩增产物中加入 5 μ I 5 X Loading Buffer混合后95°C变性5分钟，立亥Ij转移到冰上冷却，吸取1. 5-3 μ 1加 入上样孔；恒定功率40W-65W进行电泳，至溴酚蓝到达电泳槽底部结束。视SSR扩增产物 分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。（4)银染显色，将带胶的一块玻璃板放 入10%的冰乙酸固定液中，65r/min振荡约30min，直至二甲苯腈全部脱色；蒸馏水冲洗2 次，每次5min ;将冲洗后的胶板放入新配制的染色液（2L水中加入2g硝酸银、3mL 37%甲 醛）中65r/min摇动30min ;将染色后的胶板放入蒸馏水冲洗5s，立即拿出进行显影；将胶 板快速转移到4°C预冷的显影液（2L水中加入30g氢氧化钠 ，IOml 37%甲醛）轻轻摇动至 带纹出现；将胶板置于10%的冰乙酸固定液中至无气泡产生为止；用蒸馏水冲洗2次，每次 2min ;室温下自然干燥后，拍照保存图像。
[0062] 结果见图6, 2245突变体的扩增产物比野生型93-11略短，与测序结果一致。
[0063] 实施例8 :基因型-突变表型共分离验证
[0064] 在2245X93-11的F2群体中，随机选取野生型和突变体表型的植株各18株提取 叶片DNA，方法同实施例4。用实施例7中所述引物2245_F和2245_R进行扩增这些DNA，并 如实施例7中所述方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0065] 电泳结果见图7,表型为野生型植株扩增产物的电泳带型全部为野生型93-11或 杂合型带型，突变体扩增产物的电泳带型全部与2245 (cyp704B2-2)的带型相同。这一结果 表明实施例6中所述突变位点与隐性核雄性不育基因是共分离的。这一结果结合该突变体 的突变表型、突变位点，以及已发表文献中的表型描述，可推断2245突变体的雄性不育表 型是由实施例6中所述的突变造成的。
[0066] 实施例9 :突变基因的杂交转育
[0067] 可按图8的步骤将2245的不育基因 cyp704B2-2通过杂交转育到其它水稻遗传背 景中：
[0068] ①杂交：
[0069] 以2245为母本，与受体水稻材料为父本杂交获得F1种子；
[0070] ②第一轮回交：
[0071] F1播种后获得F i植株，将F i植株与轮回亲本进行杂交，获得BC i种子；
[0072] ③BC1不育基因选择（前景选择）：
[0073] 播种BC1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，以实施例4中 所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对（2245_F* 2245_R)进行扩增和电泳，选取 基因型为杂合的单株继续种植，弃去纯合野生型的单株；
[0074] ④队背景选择：
[0075] 采用一组（例如100个，或200个等）在2245和轮回亲本之间存在多态的，且在 基因组上均匀分布的分子标记（可以是但不限于SSR、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等 类型标记），对步骤③中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高（例如大于88%相 似度，或2%中选率等）的材料；
[0076] ⑤第二轮回交：用步骤④中选出的单株为父本，为轮回亲本授粉，获得BC2种子；
[0077] ⑥BC2的前景与背景选择：对选出的材料重复步骤③至步骤④的操作，选出与轮回 亲本相似度高于选择标准（如相似度大于98%，或2%中选率等）的BC 2R植株；
[0078] ⑦自交获得BC2F2种子：对步骤⑥中选出的BC 2植株进行自交，获得BC 2F2种子；
[0079] ⑧BC2F2的前景选择：将步骤⑦中获得的BC 2F2种子播种，获得500株以上幼苗，在 幼苗期采集采集叶片，以实施例4中所述方法提取DNA，以实施例7中所列的引物对（2245_ F和2245_R)进行扩增和电泳，选出带型为纯合突变体和杂合型的单株继续栽培，丢弃纯合 野生型的单株；
[0080] ⑨BC2F2的背景选择及应用：将步骤⑧中选出的单株按照步骤④的方法进行背景 筛选，选出100%背景纯合的单株。如果中选单株的2245_?/2245_1?引物对扩增带型为纯合 突变体，则该单株为我们的最终目标材料，可进一步与轮回亲本杂交保存材料，或与其它水 稻材料进行杂交。如果中选单株是杂合带型，可直接用于保存种质，或通过自交获得不育株 用于杂交育种或制种。
【主权项】
1. 一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其为水稻CYP704B2基因第1267个碱 基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于第4个外显子。2.如权利要求1所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。3.含有权利要求1或2所述CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载体。4. 含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中 的应用。6. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不 育的转基因水稻中的应用。7. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制 种中的应用。8. 检测权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，其 特征在于，该分子标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为： 上游引物2245_F:AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示） 下游引物2245_R:TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO. 3 所示）。9. 权利要求8所述的分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。10. 权利要求1或2所述的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法， 其特征在于，通过下述引物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物： 所述引物对的核苷酸序列为： 上游引物2245_F:AGCTTCGGGGACGACAAGA(如SEQIDNO.2所示） 下游引物2245_R:TGCGTCATCGCCATGTACGT(如SEQIDNO. 3 所示）； 如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着该待 检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。
【专利摘要】本发明提供一种水稻CYP704B2基因突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将籼稻品种93-11经钴60辐射诱变引起水稻CYP704B2基因1267个碱基之后的2个G碱基缺失，将该CYP704B2基因突变体命名为cyp704B2-2，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，进一步证实该突变体引起水稻隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/29, C12N15/63, A01H5/00, C12Q1/68
【公开号】CN104894144
【申请号】CN201510387564
【发明人】黄培劲, 李新鹏, 李京琳, 安保光, 张维, 龙湍
【申请人】海南波莲水稻基因科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月6日
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