一种乌克兰鳞鲤pepck基因及标定鲤科鱼类血糖的方法
一种乌克兰鳞鲤pepck基因及标定鲤科鱼类血糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生理检测技术领域，特别是一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定 鲤科鱼类血糖的方法。
【背景技术】
[0002] 目前对于鲤科鱼类血糖水平的方法普遍采用GB-T19634-2005自测用血糖监测系 统，或是采用市场上通用的葡萄糖氧化酶法，即测定血糖的试剂盒与试纸条，在鲤科鱼类养 殖过程中，使用现有国标方法鉴定的总糖含量相同的饲料喂养鲤科鱼类时，各种饲料对鱼 的血糖含量的影响是不同的。使用上述常规血糖测定法测定鲤科鱼类血糖含量，测量值灵 敏度不高，而且会出现假阳性的情况，并且现有测量技术成本偏高，单次成本在4元以上， 对于个体较小的鱼和观赏鱼等，血液组织采集困难，而对于大型鱼类、经济型鱼类的亲鱼， 采血容易感染并造成经济损失，并且现有常规血糖测定法前处理过程复杂，因此，需要一种 成本低，检测方便快捷的血糖水平测定方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标 定鲤科鱼类血糖的方法。
[0004] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
[0005] -种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因，该基因的全长cDNA序列为：SQ1。
[0006] 一种应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，步骤如下：
[0007] 第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，包括步骤如下：
[0008](一）制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA ;
[0009](二）合成第一链 cDNA ;
[0010] (三）PCR扩增PEPCK基因中间片段；
[0011] (四）3'RACE PCR 及 5' RACE PCR ;
[0012] (五）琼脂糖电泳检测中间片段；
[0013] (六）制备感受态细胞；
[0014] (七）T-A 克隆；
[0015] (八）转化感受态细胞；
[0016] (九）菌液PCR方法筛选阳性克隆；
[0017] (十）序列拼接，使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中 间序列的3'端序列和5'端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克 兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1 ;
[0018] 第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织 PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，具体步骤如下：
[0019](一）检测鱼类的饲养和取样
[0020] (1)饲养，取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞 鲤每箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在 15点更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱 中投喂低糖饲料、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖；
[0021] (2)取样，将解剖鱼体肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备 用，以进行后续试验；
[0022] (二）制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA ;
[0023] (三）合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA ;
[0024] (四）PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量，建立 各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，具体步骤为：
[0025] (I)PCR扩增内参基因，在冰上配制PCR反应体系，然后进行PCR反应程序；
[0026] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0027] (3)使用1%琼脂糖电泳检测内参基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结 果拍照；
[0028] (4)使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；
[0029] (5)按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为 引物进行半定量PCR ;
[0030] (6)使用1%琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统 对电泳结果拍照；
[0031] (7)使用Gel-Pr0软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比；
[0032] (8)建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；
[0033] 第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中 的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。
[0034] 而且，所述第二步的步骤（一）中低糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%、豆柏 15%、花生柏16%、棉柏8%、菜柏10%、DDGS3%、豆油4%、预混料1 %、微晶纤维素25%及 麸皮10% ;高糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜 柏10 %，DDGS3 %，豆油4 %，预混料1 %，麸皮10 %及糊精25 %。
[0035] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（1)步在冰上配制PCR反应体系的组份为：
[0036]
O
[0037] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（1)进行PCR反应程序的具体内容为：
[0038]
[0039] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（5)的PEP-F和PEP-R的引物序列为：
[0040] SQ2 ：CTCAGCAGTCTGATATGAGA
[0041] SQ3 ：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC〇
[0042] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（8)步建立各组织PEPCK基因的半定量PCR 扩增条带亮度与鱼血糖值的对应曲线的具体步骤为：
[0043] ①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组；
[0044] ②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测；
[0045] ③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA， 以cDNA为模板，SQ2与SQ3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂 糖凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值；
[0046] ④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描 点并连线建立二者的对应曲线模型，建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血 糖值，为了得到更精确的血糖值，对曲线的描点进行细化。
[0047] 而且，所述第三步的步骤（四）中第（9)步对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR 的血糖值确定的具体步骤为：
[0048] ①选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织为样品，按照权利要求2 中所述第二步的步骤（二）至步骤（四）的（7)步得出检测鱼各组织PEPCK基因的亮度 值；
[0049] ②利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，最终确定该被检测鱼的 血糖值。
[0050] 本发明的优点和积极效果是：
[0051] 1、本发明对鲤科鱼类血糖水平的测定，对于成百上千的大样本量统计学实验和检 测，能够节省大量的人力以及物料成本，测定成本低，单次测定成本在1元以下。
[0052] 2、本发明的测定方法操作简单，采用非血液组织中的鳞片根部肌肉组织的取样对 鱼体造成的创伤最小，不易感染，更不用处死样本，这种取样方法对珍惜样品，如大型观赏 鱼和经济鱼类的亲本身体指标的连续观察尤为重要，降低了取样的难度，减少了测定过程 中易于感染的风险
【附图说明】
[0053] 图1是不同喂食条件下乌克兰鳞鲤PEPCK各组织表达特征，其中，内参为β -actin 基因；
[0054] 图2是不同喂食条件PEPCK表达量所对应标定的鱼血糖值。
【具体实施方式】
[0055] 以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能 以此限定本发明的保护范围。
[0056] -种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法，该方法包括步骤如 下：
[0057] 第一步，制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA
[0058] (一）抽提乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA
[0059] (1)将禁食的健康乌克兰鳞鲤用解剖剪活体解剖，快速用镊子取出肝胰脏组织；
[0060] (2)取IOOmg组织置于5ml组织匀浆器中加入1ml裂解液RNAiso Plus，放置在冰 上匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；
[0061] (3)将匀浆液转移至已经用DEPC处理好的I. 5ml RNasefree离心管中，室温静置 5min ；
[0062] (4) 12000g，4°C离心 5min ;
[0063] (5)小心吸取上清液，移入新的RNasefree离心管中，切勿吸取沉淀；
[0064] (6)加入200μ 1氯仿，盖紧尚心管盖，用手剧烈震荡15s,待溶液充分乳化后，再室 温静置5min ;
[0065] (7) 12000g，4°C离心 15min
[0066] (8)从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为无色的上清液、中间的白色蛋白层及 带有颜色的下层有机相三层，吸取上清液转移至另一 DEPC处理过的离心管中，切忌吸出白 色中间层；
[0067] (9)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15~30°C 下静置IOmin ;
[0068] (10) 12000g，4°C离心10min，离心完成后，试管底部出现白色沉淀；
[0069] (11)小心地弃去 上清液,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml,切勿触及沉淀， 轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g，4°C离心5min后小心地弃去乙醇，尽量将其除净；
[0070] (12)室温干燥沉淀2~5min，加入20 μ IDEPC处理水充分溶解RNA，置于-20°C保 存用于后续试验；
[0071] (二）检测RNA质量
[0072] (1)将电泳槽等检测设备依次用浓度为3 %的H2O2和浓度为0. 1 %的DEPC水清洗 处理，晾干待用；
[0073] (2)配制1 %琼脂糖凝胶：称取0· 2g琼脂糖，加入20ml I X TAE缓冲液，摇匀使之 充分溶解，加热使混合液呈熔融状态，稍微冷却后加入2ulEB溶液，轻轻混匀，倒入到制胶 槽中使其凝固；
[0074] (3)取配好的1%琼脂糖凝胶，放入充满IXTAE缓冲液的电泳槽中；
[0075] (4)使用10μ 1单道可调量程移液器加样，取5μ 1所提取的RNA，另取1μ 16XDNA 电泳Loading Buffer与RNA混匀，加入凝胶加样孔中；
[0076] (5)在实验样品右边的剩余加样孔道中加入5μ I DL2000 DNA Marker ;
[0077] (6)打开电泳仪，电压调至130V，电泳时间15min ;
[0078] (7)使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照；
[0079] (8)使用微量分光光度计测定RNA的浓度；
[0080] 第二步，合成第一链cDNA
[0081] (1)在已用DEPC处理过的0. 2ml离心管中配制下列RNA和引物的混合液：
[0082]
[0083] (2) 65°C水浴5min后，迅速在冰上急冷；
[0084] (3)在上述离心管中继续配制以下反转录反应液：
[0085]
[0086] (4)在 PCR 仪上 42Γ 保温 60min ;
[0087] (5)在 PCR 仪上 95°C 保温 5min ;
[0088] (6)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于_20°C备用；
[0089] 第三步，PCR扩增PEPCK基因中间片段，
[0090] (1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0091]
[0092] PCR反应程序：
[0093]
[0094] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用
[0095] 第四步，3, RACE PCR
[0096] (一）RACE 反应，
[0097] (1)在已用DEPC处理过的0. 2ml离心管中配制下列反转录的反应液：
[0098]
[0100] (2)在 PCR 仪上 42 °C 保温 60min ;
[0101] (3)在 PCR 仪上 70°C保温 15min ;
[0102] (4)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于_20°C备用；
[0103] (二）PCR 反应
[0104] (1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0105]
[0106] PCR反应程序：
[0107]
[0108] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0109] 第五步，5, RACE PCR
[0110] (一）5, RACE 反应
[0111] (1)在已用DEPC处理过的0. 2ml离心管中配制下列RNA和引物的混合液：
[0112]
[0113] (2) 65°C水浴5min后，迅速在冰上急冷2min ;
[0114] (3)在上述离心管中继续配制以下反转录反应液：
[0115]
[0116] (4)在 PCR 仪上 37 °C 孵育 Ih ;
[0117] (5)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于-20°C备用；
[0118] (二）PCR 反应
[0119] (1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0120]
[0121] (2) PCR 反应程序：
[0122]
[0123] (3)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0124] 第六步，琼脂糖电泳检测中间片段，
[0125] (一）3' RACE 和 5' RACE PCR 扩增结果
[0126] (1)取配制好的1 %琼脂糖凝胶（在配制琼脂糖凝胶时加入2ulEB溶液），放入充 满I X TAE缓冲液的电泳槽中；
[0127] (2)使用10μ 1单道可调量程移液器，分别从以上三个PCR管中取5μ 1扩增产物， 另取1 μ 16 X DNA电泳Loading Buffer与PCR扩增产物DNA混匀，加入凝胶孔中；
[0128] (3)在与（2)所述凝胶孔右边相邻的两个凝胶孔中依次加入阴性对照扩增产物和 5 μ IDL 2000 DNA Marker ；
[0129] (4)打开电泳仪，电压调至120V，电泳时间20min ;
[0130] (5)使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照，中间片段条带长度约lOOObp， 3'端片段条带长度约1200bp，5'端片段条带长度约750bp ;
[0131] (二）回收纯化PCR产物
[0132] 按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作进行DNA回收和纯化，具体步骤为：
[0133] (1)在漂洗液PW中加入无水乙醇60ml，
[0134] (2)柱平衡步骤：将吸附柱CA2放入到一个收集管中，并在吸附柱中加入500 μ 1 平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0135] (3)在紫外灯下，用解剖刀小心将目的条带切下（尽量切除多余部分），将其盛入 I. 5ml无菌离心管中，称取重量，
[0136] (4)向胶块中加入等倍体积溶液PN，50°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转离 心管，以确保胶块充分溶解，可以再补加一些胶溶液，直至胶块完全溶解；
[0137] (5)将胶块完全溶解后的溶液温度降至室温，然后加入到一个吸附柱CA2中（吸 附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2放入收集管中；
[0138] (6)向吸附柱CA2中加入600μ 1漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
[0139] (7)重复操作步骤（6)
[0140] (8)将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸，附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
[0141] (9)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 50 μ IddH2O,室温放置 2min，12000rpm 离心 2min ;
[0142] (10)将离心得到的溶液重新加回吸附柱中，室温放置2min, 12000rpm离心2min， 将DNA溶液收集到离心管中；
[0143] 第七步，制备感受态细胞
[0144] (1)在LB固体培养基上将保藏于_20°C的大肠杆菌（E. coli)进行划线，并放入恒 温培养箱于37 °C培养过夜；
[0145] (2)在LB平板上挑取单菌落，加入4ml的LB液体培养基中，置于空气摇床中于 37 °C震荡培养过夜；
[0146] (3)将上一步培养好的菌液取出1ml，加入到100mLLB液体培养基中并置于空气摇 床中于37°C震荡培养数小时，直至用紫外分光光度计测定其OD 6Jt为0. 5
[0147] (4)将上一步培养好的菌液置于冰上5min ;
[0148] (5)将菌液倒入到两个50ml的塑料离心管中，4°C，5000rpm离心5min ;
[0149] (6)将上清液弃去，迅速将装有沉淀的离心管置于冰上待用；
[0150] (7)向每个离心管中加入预冷的0. lmol/L的0&(：12各10ml，轻轻用手在冰上摇动 30min以上，直至沉淀全部溶解；
[0151] (8)重复操作步骤（6)，弃上清，并向每个离心管加入2ml预冷的含15%甘油的 O-ImoVLCaCl2
[0152] (9)向每个I. 5ml的灭菌离心管中分装100 μ 1的感受态细胞，然后直接放入液氮 中，等到响声消失后放置_80°C冰箱储存；
[0153] 第八步，T-A克隆
[0154] 在0. 2ml的灭菌离心管中配制以下溶液：
[0155]
[0156] 室温孵育Ih,然后放入4°C冰箱过夜；
[0157] 第九步，转化感受态细胞
[0158] (1)取一管100 μ 1的感受态细胞置于冰浴中，然后将上述连接产物加入到感受态 细胞中，并用枪头轻轻搅拌混匀内容物，在冰浴中静置30min ;
[0159] (2)将离心管置于42°C水浴中放置60sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷 却3min，该过程不要摇动离心管；
[0160] (3)向离心管中加入900 μ 1无菌不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于空气 摇床中于37°C，170rpm/min震荡培养45min，为了使质粒上相关的抗性基因表达，使菌体复 苏；
[0161] (4)将离心管内容物混匀，吸取100 μ 1已转化的感受态 细胞加到含氨苄青霉素、 X-gal、IPTG的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻地将细胞均匀涂开，将平板 置于室温直至液体被吸收，倒置平板，放入恒温培养箱37°C避光培养16h ;
[0162] 第十步，菌液PCR方法筛选阳性克隆
[0163] 观察上述平板中菌落的颜色，蓝斑为阴性，白斑一般为阳性，为确定白斑的确为阳 性，一般将平板拿出后放置4°C冰箱中一段时间甚至过夜，再看菌落的颜色，挑选白色菌落 进行PCR检测；
[0164] 用已灭菌的牙签挑取10个白色菌落,对应接种至10个含氨苄青霉素（50 μ g/ml) 的ImlLB液体培养基的I. 5ml离心管中并将其标号，置于空气摇床中于37°C，170rpm/min 震荡培养6h左右，然后进行菌液PCR :
[0165] (1)按照下列组分在冰上配制PCR反应体系：
[0166]
[0168] PCR反应程序：
[0169] a.扩增PEPCK基因中间片段的PCR反应程序为：
[0170]
[0171] b.扩增PEPCK基因 3'端片段的PCR反应程序为：
[0172]
[0173] c.扩增PEPCK基因 5'端片段的PCR反应程序为：
[0174]
[0175] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用
[0176] (3)琼脂糖电泳检测菌液PCR扩增结果
[0177] ①取配制好的1 %琼脂糖凝胶（在配制琼脂糖凝胶时加入2ulEB溶液），放入充满 I X TAE缓冲液的电泳槽中；
[0178] ②使用10 μ 1单道可调量程移液器加样，按照标号顺序分别从每个PCR管中取 5 μ I PCR扩增产物DNA，另取1 μ I 6 X DNA电泳Loading Buffer与PCR扩增产物DNA混匀， 加入凝胶孔中；
[0179] ③在与⑵所述凝胶孔右边相邻的两个凝胶孔中依次加入阴性对照扩增产物和 5 μ IDL 2000 DNA Marker ；
[0180] ④打开电泳仪，电压调至120V，电泳时间20min ;
[0181] ⑤使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照，记下长度正确的条带所对应的 I. 5ml离心管号，这几管菌液即为阳性，选取一管菌液送去苏州金唯智生物科技（北京）有 限公司测序；
[0182] 第十一步，序列拼接
[0183] 使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序列、3'端序 列和5'端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞鲤PEPCK基因 全长cDNA序列为：SQ1,
[0184] ATCACACTCAGCAGTCTGATATGAGAGGTGCACAGGACTGAAGAGGAACAAGACACACCTCTCATATTG CTTTATTATATTTTTAGTCATAATTTCGGTTGTTTACTCACCACCTGCACTTGCACCAAAGATGTCCTGCCTGTTCC TCGGAGTACTAAGGTGGCGAAATGTCATCAGTACAGCTTCAGTGGGGGTGCGGTCACTCGCCTCCATCCCCTCTCTG CCACCGTCAGTGGCGGAGTTTGTGTCAGGTGCTGTGGCTGAATGTAAACCTGCTAAAGTGCACGTGGTCACAGGCAC TCCAGAGGAGACAGCAGACATCCTGGCCAACCTGGAGAAAGATGGCATGGTGAAGAAACTCGCCAAATATGAAAACT GCTGGCTGGCACGCACTGACCCCAAAGATGTGGCTCGTGTAGAGAGTAAAACTGTGATTGTCACTAAGGACCAAAGA GACACTATTCCCATTCCCACCGGAGGTGCCAAGTCCCAGCTGGGCAGCTGGATGAGTGAGGAAACCTTTCAGAAAGC CAGAGAGGACCGCTTTCCTGGCTGCATGGCGGGACGCACCATGTATGTGATCCCCTTCAGCATGGGCCCTGTGAACT CTTCTCTTGCTAAGTTTGGTGTTCAGGTGACAGATTCTCCATATGTGGTGGCTAGCATGGGCATCATGACACGCATG GGGACTCCTGTGCTGGAAAAACTAGCCGAGGGTGCGGAGTTTGTGCGCTGCCAGCACTCTTTGGGCAGACCTTTACC ACTCAAAGCTCCTTTAGTAAACAGCTGGCCTTGTAACCCGGACAAGGTGTTGATCTCACATCTTCCTGACACCAGAC AGATCCTGTCCTTCGGCAGCGGTTACGGTGGAAACTCGCTCCTTGGAAAGAAATGTTTTGCTCTTCGTATCGCCTCA CGCATTGCCAAAGACGAAGGCTGGTTGGCTGAACACATGCTGATTCTGGGAATCACAAATCCTCAGGGTGTAAAACG GTACATTGCAGCAGCGTTCCCGAGCGCTTGTGGGAAAACTAACCTGGCCATGATGAAACCATCACTGCCAGGCTGGA CGGTTGAGTGTGTGGGCGATGACATCGCCTGGATGAAATTTGACAGTCAGGGTAAACTCAGAGCCATTAATCCAGAG AATGGTTTTTTTGGAGTCGCCCCCGGGACATCCCTAAAGACAAACCCTCATGCCATGGCAACCATCTCCAGGAACAC AGTGTTCACTAACGTGGGAGAGACCAGCGATGGAGGAGTTTGGTGGGAGGGTCTGGAACCACCTGCACCTGGAATCA AACTCACAGACTGGCATGGAAAATCCTGGAAGTATGGTGATCCTACACTGTGTGCTCACCCGAACTCCAGGTTTTGT GCCCCAGCTGGCCAGTGCCCCATCATAGACCCACTCTGGGAAAGTGATGAGGGCGTCCCCATTGATGCCATTGTATT TGGTGGAAGAAGACCAGAAGGTGTGCCTTTGGTGTACGAGTCATTTAACTGGAAACATGGCGTGTTTGTAGGAGCAG CCATGAAATCTGAATCCACAGCTGCTGCTGAACATAAGGGTAAAGTAATCATGCATGACCCCTTCGCCATGCGTCCT TTCTTCGGTTACAACTTCGGTGACTACTTGGCCCACTGGTTGAGTATGGAGACGCACAAGGGCCAGACCCAACTCCC CAAGATCTTCCACGTCAACTGGTTCCGTAAAGATCAGAAGACCGGGTCTTTCTTGTGGCCAGGGTTTGGAGAGAACG CCCGCGTCCTCGAGTGGATCTTCAAACGATGCGGCCGTACCAGTGAAGACGAGGCTGCCACCAAAAGCATTGTGGGA TGGATTCCACAAAACGGTGCCATAAACACAGAAGGCCTGGGTGGAAATATCGATATGGGTGCCCTCTTTGACCTGCC CAAACCCTTCTGGCAGAAGGAAACACAAGAGCTTCGGACCTACTTCACCCAGCAGGTTGGAGCTGATCTGCCCGCAC AAGTGGAAGGAGAGCTGAGGGCGCTGGAGGAGAGAGTGAGGGATTGAACAGACGCTACATTACATTGATGTTGAGCA GATGTGAAGAATAGGATGGGTTGAGGTGGAGATAACTGTTTTAATCTGACTGTTGCACTGCAGTGGACACTGCACCT GAGAAAACACAAAACCAAAAAGTTCACAAGATGCCATCAGTGGTATCGATACCTAGGTGCCTTATTTGATCTTACAG TAGAAGCTAAAAaCTCTATTAAATGTTTACAAACTATGTCCCAAAATGCCTTTTAGATTATTACTATAGTTTCTTTA TTACTACAGTTTATTTTGAGCAAAGGTATTAGACATGTCTTTAAGGAGAGCACCAGTACCATCGTTTTTTACCTATC TAATGTAAGCTGAAGTTTTATTTCTAAAGATTTTGCCTTTTATCAGTGGAATTTGATTGACATGGATCAGGTTTAGC TAGGGTTGAAAGATCCAGACCAAAGAACACAGACAAGTCTCAGTCATTGAATGTGTGCATGTTTTTACATGAGCTGA CTGAATAAATACAACTCTAAACCAAAAAAAAAAA
[0185] 第十二步，半定量PCR
[0186] ( 一）饲养和取样
[0187] 取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每箱三 条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点更换 养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投喂低 糖、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖，将肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌 肉取出，记好标记存入液氮中备用，以进行后续试验；
[0188] 其中，低糖饲料各原料的质量分数
[0189] 鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜柏10%，DDGS3%，豆油4%，预混料 1 %，微晶纤维素 25%，麸皮10%，糊精0 ;
[0190] 其中，高糖饲料各原料的质量分数
[0191] 鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜柏10%，DDGS3%，豆油4%，预混料 1 %，微晶纤维素〇,麸皮10%，糊精25%
[0192] (二）制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA[0193] (三）合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA
[0194] (四）PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量
[0195] (I)PCR扩增内参基因
[0196] ①按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0197]
[0198] PCR反应程序：
[0199]
[0200] ②随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0201] ③使用1 %琼脂糖电泳检测内参基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结 果拍照；
[0202] ④使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；
[0203] ⑤按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引 物进行半定量PCR ;
[0204] ⑥使用1%琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对 电泳结果拍照
[0205] ⑦使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比， 对比结果如图1所示；
[0206] ⑧建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；
[0207] 如，对乌克兰鳞鲤肾脏组织建立PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲 线，如图2所示，具体如下：
[0208] ①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组。
[0209] ②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测。
[0210] ③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA， 以cDNA为模板，Q2与Q3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖 凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值。
[0211] ④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描 点并连线建立二者的对应曲线模型。建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血 糖值。为了得到更精确的血糖值，可对曲线的描点进行细化，建立曲线模型的点越多，对照 检测的值越准确。
[0212] ⑨利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克 兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定，
[0213] A，选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织的取样对鱼体造成的创 伤最小，不易感染，更不用处死样本，这种取样方法对珍惜样品，如大型观赏鱼和经济鱼类 的亲本身体指标的连续观察尤为重要；而对于成百上千的大样本量统计学实验和检测，也 能够节省大量的人力以及物料成本。，调整各组织cDNA后，以PEP-F，SQ2和PEP-R，SQ3
[0214] SQ2 ：CTCAGCAGTCTGATATGAGA
[0215] SQ3 ：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC
[0216] 作为引物进行半定量PCR，电泳检测各组织PEPCK基因，得出各组织PEPCK基因的 亮度值；
[0217] B，利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，最终确定该被检测鱼的 血糖值。
【主权项】
1. 一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因，其特征在于：该基因的全长cDNA序列为：SQ1。2. -种应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于步骤如 下： 第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，包括步骤如下： (一） 制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA ; (二） 合成第一链cDNA ; (三） PCR扩增PEPCK基因中间片段； (四） 3' RACE PCR 及 5' RACE PCR ; (五） 琼脂糖电泳检测中间片段； (六） 制备感受态细胞； (七） T-A克隆； (八） 转化感受态细胞； (九） 菌液PCR方法筛选阳性克隆； (十）序列拼接，使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序 列的3'端序列和5'端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞 鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1 ; 第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK 基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，具体步骤如下： (一） 检测鱼类的饲养和取样 (1) 饲养，取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每 箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点 更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投 喂低糖饲料、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖； (2) 取样，将解剖鱼体肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备用，以 进行后续试验； (二） 制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA ; (三） 合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA ; (四） PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量，建立各组 织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，具体步骤为： (1) PCR扩增内参基因，在冰上配制PCR反应体系，然后进行PCR反应程序； (2) 随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20°C备用； (3) 使用1%琼脂糖电泳检测内参基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍 昭. (4) 使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比； (5) 按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引物 进行半定量PCR ; (6) 使用1%琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电 泳结果拍照； (7) 使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比； (8)建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线； 第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌 克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。3. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（一）中低糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%、豆柏15%、 花生柏16%、棉柏8%、菜柏10%、DDGS3%、豆油4%、预混料1 %、微晶纤维素25%及麸 皮10 % ;高糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜柏 10 %，DDGS3 %，豆油4 %，预混料1 %，麸皮10 %及糊精25 %。4. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（1)步在冰上配制PCR反应体系的组份为：〇5. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（1)进行PCR反应程序的具体内容为：6. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（5)的PEP-F和PEP-R的引物序列为： SQ2 ：CTCAGCAGTCTGATATGAGA SQ3 ：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC〇7. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（8)步建立各组织PEPCK基因的半定量PCR扩增 条带亮度与鱼血糖值的对应曲线的具体步骤为： ① 将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组； ② 获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测； ③ 对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA，以 cDNA为模板，SQ2与SQ3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值； ④ 将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描点并 连线建立二者的对应曲线模型，建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血糖 值，为了得到更精确的血糖值，对曲线的描点进行细化。8. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第三步的步骤（四）中第（9)步对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的 血糖值确定的具体步骤为： ① 选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织为样品，按照权利要求2中 所述第二步的步骤（二）至步骤（四）的（7)步得出检测鱼各组织PEPCK基因的亮度值； ② 利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，最终确定该被检测鱼的血糖 值。
【专利摘要】本发明涉及一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法，该基因的全长cDNA序列为：SQ1，标定鲤科鱼类血糖的方法，包括步骤：第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线；第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。本发明提出了一种全新的鲤科鱼类血糖标定方法，标定成本低，标定方法操作简单，标定结果可靠，减少了测定过程中易于感染的风险。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/53
【公开号】CN104894145
【申请号】CN201510156059
【发明人】乔秀亭, 王墨染, 程镇燕, 段霁航, 方珍珍, 白东清, 孙金辉
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月3日
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生理检测技术领域，特别是一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定 鲤科鱼类血糖的方法。
【背景技术】
[0002] 目前对于鲤科鱼类血糖水平的方法普遍采用GB-T19634-2005自测用血糖监测系 统，或是采用市场上通用的葡萄糖氧化酶法，即测定血糖的试剂盒与试纸条，在鲤科鱼类养 殖过程中，使用现有国标方法鉴定的总糖含量相同的饲料喂养鲤科鱼类时，各种饲料对鱼 的血糖含量的影响是不同的。使用上述常规血糖测定法测定鲤科鱼类血糖含量，测量值灵 敏度不高，而且会出现假阳性的情况，并且现有测量技术成本偏高，单次成本在4元以上， 对于个体较小的鱼和观赏鱼等，血液组织采集困难，而对于大型鱼类、经济型鱼类的亲鱼， 采血容易感染并造成经济损失，并且现有常规血糖测定法前处理过程复杂，因此，需要一种 成本低，检测方便快捷的血糖水平测定方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标 定鲤科鱼类血糖的方法。
[0004] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
[0005] -种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因，该基因的全长cDNA序列为：SQ1。
[0006] 一种应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，步骤如下：
[0007] 第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，包括步骤如下：
[0008](一）制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA ;
[0009](二）合成第一链 cDNA ;
[0010] (三）PCR扩增PEPCK基因中间片段；
[0011] (四）3'RACE PCR 及 5' RACE PCR ;
[0012] (五）琼脂糖电泳检测中间片段；
[0013] (六）制备感受态细胞；
[0014] (七）T-A 克隆；
[0015] (八）转化感受态细胞；
[0016] (九）菌液PCR方法筛选阳性克隆；
[0017] (十）序列拼接，使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中 间序列的3'端序列和5'端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克 兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1 ;
[0018] 第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织 PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，具体步骤如下：
[0019](一）检测鱼类的饲养和取样
[0020] (1)饲养，取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞 鲤每箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在 15点更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱 中投喂低糖饲料、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖；
[0021] (2)取样，将解剖鱼体肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备 用，以进行后续试验；
[0022] (二）制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA ;
[0023] (三）合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA ;
[0024] (四）PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量，建立 各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，具体步骤为：
[0025] (I)PCR扩增内参基因，在冰上配制PCR反应体系，然后进行PCR反应程序；
[0026] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0027] (3)使用1%琼脂糖电泳检测内参基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结 果拍照；
[0028] (4)使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；
[0029] (5)按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为 引物进行半定量PCR ;
[0030] (6)使用1%琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统 对电泳结果拍照；
[0031] (7)使用Gel-Pr0软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比；
[0032] (8)建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；
[0033] 第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中 的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。
[0034] 而且，所述第二步的步骤（一）中低糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%、豆柏 15%、花生柏16%、棉柏8%、菜柏10%、DDGS3%、豆油4%、预混料1 %、微晶纤维素25%及 麸皮10% ;高糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜 柏10 %，DDGS3 %，豆油4 %，预混料1 %，麸皮10 %及糊精25 %。
[0035] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（1)步在冰上配制PCR反应体系的组份为：
[0036]
O
[0037] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（1)进行PCR反应程序的具体内容为：
[0038]
[0039] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（5)的PEP-F和PEP-R的引物序列为：
[0040] SQ2 ：CTCAGCAGTCTGATATGAGA
[0041] SQ3 ：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC〇
[0042] 而且，所述第二步的步骤（四）中第（8)步建立各组织PEPCK基因的半定量PCR 扩增条带亮度与鱼血糖值的对应曲线的具体步骤为：
[0043] ①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组；
[0044] ②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测；
[0045] ③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA， 以cDNA为模板，SQ2与SQ3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂 糖凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值；
[0046] ④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描 点并连线建立二者的对应曲线模型，建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血 糖值，为了得到更精确的血糖值，对曲线的描点进行细化。
[0047] 而且，所述第三步的步骤（四）中第（9)步对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR 的血糖值确定的具体步骤为：
[0048] ①选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织为样品，按照权利要求2 中所述第二步的步骤（二）至步骤（四）的（7)步得出检测鱼各组织PEPCK基因的亮度 值；
[0049] ②利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，最终确定该被检测鱼的 血糖值。
[0050] 本发明的优点和积极效果是：
[0051] 1、本发明对鲤科鱼类血糖水平的测定，对于成百上千的大样本量统计学实验和检 测，能够节省大量的人力以及物料成本，测定成本低，单次测定成本在1元以下。
[0052] 2、本发明的测定方法操作简单，采用非血液组织中的鳞片根部肌肉组织的取样对 鱼体造成的创伤最小，不易感染，更不用处死样本，这种取样方法对珍惜样品，如大型观赏 鱼和经济鱼类的亲本身体指标的连续观察尤为重要，降低了取样的难度，减少了测定过程 中易于感染的风险
【附图说明】
[0053] 图1是不同喂食条件下乌克兰鳞鲤PEPCK各组织表达特征，其中，内参为β -actin 基因；
[0054] 图2是不同喂食条件PEPCK表达量所对应标定的鱼血糖值。
【具体实施方式】
[0055] 以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能 以此限定本发明的保护范围。
[0056] -种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法，该方法包括步骤如 下：
[0057] 第一步，制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA
[0058] (一）抽提乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA
[0059] (1)将禁食的健康乌克兰鳞鲤用解剖剪活体解剖，快速用镊子取出肝胰脏组织；
[0060] (2)取IOOmg组织置于5ml组织匀浆器中加入1ml裂解液RNAiso Plus，放置在冰 上匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；
[0061] (3)将匀浆液转移至已经用DEPC处理好的I. 5ml RNasefree离心管中，室温静置 5min ；
[0062] (4) 12000g，4°C离心 5min ;
[0063] (5)小心吸取上清液，移入新的RNasefree离心管中，切勿吸取沉淀；
[0064] (6)加入200μ 1氯仿，盖紧尚心管盖，用手剧烈震荡15s,待溶液充分乳化后，再室 温静置5min ;
[0065] (7) 12000g，4°C离心 15min
[0066] (8)从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为无色的上清液、中间的白色蛋白层及 带有颜色的下层有机相三层，吸取上清液转移至另一 DEPC处理过的离心管中，切忌吸出白 色中间层；
[0067] (9)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15~30°C 下静置IOmin ;
[0068] (10) 12000g，4°C离心10min，离心完成后，试管底部出现白色沉淀；
[0069] (11)小心地弃去 上清液,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml,切勿触及沉淀， 轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g，4°C离心5min后小心地弃去乙醇，尽量将其除净；
[0070] (12)室温干燥沉淀2~5min，加入20 μ IDEPC处理水充分溶解RNA，置于-20°C保 存用于后续试验；
[0071] (二）检测RNA质量
[0072] (1)将电泳槽等检测设备依次用浓度为3 %的H2O2和浓度为0. 1 %的DEPC水清洗 处理，晾干待用；
[0073] (2)配制1 %琼脂糖凝胶：称取0· 2g琼脂糖，加入20ml I X TAE缓冲液，摇匀使之 充分溶解，加热使混合液呈熔融状态，稍微冷却后加入2ulEB溶液，轻轻混匀，倒入到制胶 槽中使其凝固；
[0074] (3)取配好的1%琼脂糖凝胶，放入充满IXTAE缓冲液的电泳槽中；
[0075] (4)使用10μ 1单道可调量程移液器加样，取5μ 1所提取的RNA，另取1μ 16XDNA 电泳Loading Buffer与RNA混匀，加入凝胶加样孔中；
[0076] (5)在实验样品右边的剩余加样孔道中加入5μ I DL2000 DNA Marker ;
[0077] (6)打开电泳仪，电压调至130V，电泳时间15min ;
[0078] (7)使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照；
[0079] (8)使用微量分光光度计测定RNA的浓度；
[0080] 第二步，合成第一链cDNA
[0081] (1)在已用DEPC处理过的0. 2ml离心管中配制下列RNA和引物的混合液：
[0082]
[0083] (2) 65°C水浴5min后，迅速在冰上急冷；
[0084] (3)在上述离心管中继续配制以下反转录反应液：
[0085]
[0086] (4)在 PCR 仪上 42Γ 保温 60min ;
[0087] (5)在 PCR 仪上 95°C 保温 5min ;
[0088] (6)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于_20°C备用；
[0089] 第三步，PCR扩增PEPCK基因中间片段，
[0090] (1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0091]
[0092] PCR反应程序：
[0093]
[0094] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用
[0095] 第四步，3, RACE PCR
[0096] (一）RACE 反应，
[0097] (1)在已用DEPC处理过的0. 2ml离心管中配制下列反转录的反应液：
[0098]
[0100] (2)在 PCR 仪上 42 °C 保温 60min ;
[0101] (3)在 PCR 仪上 70°C保温 15min ;
[0102] (4)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于_20°C备用；
[0103] (二）PCR 反应
[0104] (1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0105]
[0106] PCR反应程序：
[0107]
[0108] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0109] 第五步，5, RACE PCR
[0110] (一）5, RACE 反应
[0111] (1)在已用DEPC处理过的0. 2ml离心管中配制下列RNA和引物的混合液：
[0112]
[0113] (2) 65°C水浴5min后，迅速在冰上急冷2min ;
[0114] (3)在上述离心管中继续配制以下反转录反应液：
[0115]
[0116] (4)在 PCR 仪上 37 °C 孵育 Ih ;
[0117] (5)随即将反转录产物置于冰上冷却，然后进行下一步反应或存于-20°C备用；
[0118] (二）PCR 反应
[0119] (1)按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0120]
[0121] (2) PCR 反应程序：
[0122]
[0123] (3)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0124] 第六步，琼脂糖电泳检测中间片段，
[0125] (一）3' RACE 和 5' RACE PCR 扩增结果
[0126] (1)取配制好的1 %琼脂糖凝胶（在配制琼脂糖凝胶时加入2ulEB溶液），放入充 满I X TAE缓冲液的电泳槽中；
[0127] (2)使用10μ 1单道可调量程移液器，分别从以上三个PCR管中取5μ 1扩增产物， 另取1 μ 16 X DNA电泳Loading Buffer与PCR扩增产物DNA混匀，加入凝胶孔中；
[0128] (3)在与（2)所述凝胶孔右边相邻的两个凝胶孔中依次加入阴性对照扩增产物和 5 μ IDL 2000 DNA Marker ；
[0129] (4)打开电泳仪，电压调至120V，电泳时间20min ;
[0130] (5)使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照，中间片段条带长度约lOOObp， 3'端片段条带长度约1200bp，5'端片段条带长度约750bp ;
[0131] (二）回收纯化PCR产物
[0132] 按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作进行DNA回收和纯化，具体步骤为：
[0133] (1)在漂洗液PW中加入无水乙醇60ml，
[0134] (2)柱平衡步骤：将吸附柱CA2放入到一个收集管中，并在吸附柱中加入500 μ 1 平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0135] (3)在紫外灯下，用解剖刀小心将目的条带切下（尽量切除多余部分），将其盛入 I. 5ml无菌离心管中，称取重量，
[0136] (4)向胶块中加入等倍体积溶液PN，50°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转离 心管，以确保胶块充分溶解，可以再补加一些胶溶液，直至胶块完全溶解；
[0137] (5)将胶块完全溶解后的溶液温度降至室温，然后加入到一个吸附柱CA2中（吸 附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2放入收集管中；
[0138] (6)向吸附柱CA2中加入600μ 1漂洗液PW，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱CA2放入收集管中；
[0139] (7)重复操作步骤（6)
[0140] (8)将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸，附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
[0141] (9)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 50 μ IddH2O,室温放置 2min，12000rpm 离心 2min ;
[0142] (10)将离心得到的溶液重新加回吸附柱中，室温放置2min, 12000rpm离心2min， 将DNA溶液收集到离心管中；
[0143] 第七步，制备感受态细胞
[0144] (1)在LB固体培养基上将保藏于_20°C的大肠杆菌（E. coli)进行划线，并放入恒 温培养箱于37 °C培养过夜；
[0145] (2)在LB平板上挑取单菌落，加入4ml的LB液体培养基中，置于空气摇床中于 37 °C震荡培养过夜；
[0146] (3)将上一步培养好的菌液取出1ml，加入到100mLLB液体培养基中并置于空气摇 床中于37°C震荡培养数小时，直至用紫外分光光度计测定其OD 6Jt为0. 5
[0147] (4)将上一步培养好的菌液置于冰上5min ;
[0148] (5)将菌液倒入到两个50ml的塑料离心管中，4°C，5000rpm离心5min ;
[0149] (6)将上清液弃去，迅速将装有沉淀的离心管置于冰上待用；
[0150] (7)向每个离心管中加入预冷的0. lmol/L的0&(：12各10ml，轻轻用手在冰上摇动 30min以上，直至沉淀全部溶解；
[0151] (8)重复操作步骤（6)，弃上清，并向每个离心管加入2ml预冷的含15%甘油的 O-ImoVLCaCl2
[0152] (9)向每个I. 5ml的灭菌离心管中分装100 μ 1的感受态细胞，然后直接放入液氮 中，等到响声消失后放置_80°C冰箱储存；
[0153] 第八步，T-A克隆
[0154] 在0. 2ml的灭菌离心管中配制以下溶液：
[0155]
[0156] 室温孵育Ih,然后放入4°C冰箱过夜；
[0157] 第九步，转化感受态细胞
[0158] (1)取一管100 μ 1的感受态细胞置于冰浴中，然后将上述连接产物加入到感受态 细胞中，并用枪头轻轻搅拌混匀内容物，在冰浴中静置30min ;
[0159] (2)将离心管置于42°C水浴中放置60sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷 却3min，该过程不要摇动离心管；
[0160] (3)向离心管中加入900 μ 1无菌不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于空气 摇床中于37°C，170rpm/min震荡培养45min，为了使质粒上相关的抗性基因表达，使菌体复 苏；
[0161] (4)将离心管内容物混匀，吸取100 μ 1已转化的感受态 细胞加到含氨苄青霉素、 X-gal、IPTG的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻地将细胞均匀涂开，将平板 置于室温直至液体被吸收，倒置平板，放入恒温培养箱37°C避光培养16h ;
[0162] 第十步，菌液PCR方法筛选阳性克隆
[0163] 观察上述平板中菌落的颜色，蓝斑为阴性，白斑一般为阳性，为确定白斑的确为阳 性，一般将平板拿出后放置4°C冰箱中一段时间甚至过夜，再看菌落的颜色，挑选白色菌落 进行PCR检测；
[0164] 用已灭菌的牙签挑取10个白色菌落,对应接种至10个含氨苄青霉素（50 μ g/ml) 的ImlLB液体培养基的I. 5ml离心管中并将其标号，置于空气摇床中于37°C，170rpm/min 震荡培养6h左右，然后进行菌液PCR :
[0165] (1)按照下列组分在冰上配制PCR反应体系：
[0166]
[0168] PCR反应程序：
[0169] a.扩增PEPCK基因中间片段的PCR反应程序为：
[0170]
[0171] b.扩增PEPCK基因 3'端片段的PCR反应程序为：
[0172]
[0173] c.扩增PEPCK基因 5'端片段的PCR反应程序为：
[0174]
[0175] (2)随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用
[0176] (3)琼脂糖电泳检测菌液PCR扩增结果
[0177] ①取配制好的1 %琼脂糖凝胶（在配制琼脂糖凝胶时加入2ulEB溶液），放入充满 I X TAE缓冲液的电泳槽中；
[0178] ②使用10 μ 1单道可调量程移液器加样，按照标号顺序分别从每个PCR管中取 5 μ I PCR扩增产物DNA，另取1 μ I 6 X DNA电泳Loading Buffer与PCR扩增产物DNA混匀， 加入凝胶孔中；
[0179] ③在与⑵所述凝胶孔右边相邻的两个凝胶孔中依次加入阴性对照扩增产物和 5 μ IDL 2000 DNA Marker ；
[0180] ④打开电泳仪，电压调至120V，电泳时间20min ;
[0181] ⑤使用凝胶成像分析系统对电泳结果进行拍照，记下长度正确的条带所对应的 I. 5ml离心管号，这几管菌液即为阳性，选取一管菌液送去苏州金唯智生物科技（北京）有 限公司测序；
[0182] 第十一步，序列拼接
[0183] 使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序列、3'端序 列和5'端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞鲤PEPCK基因 全长cDNA序列为：SQ1,
[0184] ATCACACTCAGCAGTCTGATATGAGAGGTGCACAGGACTGAAGAGGAACAAGACACACCTCTCATATTG CTTTATTATATTTTTAGTCATAATTTCGGTTGTTTACTCACCACCTGCACTTGCACCAAAGATGTCCTGCCTGTTCC TCGGAGTACTAAGGTGGCGAAATGTCATCAGTACAGCTTCAGTGGGGGTGCGGTCACTCGCCTCCATCCCCTCTCTG CCACCGTCAGTGGCGGAGTTTGTGTCAGGTGCTGTGGCTGAATGTAAACCTGCTAAAGTGCACGTGGTCACAGGCAC TCCAGAGGAGACAGCAGACATCCTGGCCAACCTGGAGAAAGATGGCATGGTGAAGAAACTCGCCAAATATGAAAACT GCTGGCTGGCACGCACTGACCCCAAAGATGTGGCTCGTGTAGAGAGTAAAACTGTGATTGTCACTAAGGACCAAAGA GACACTATTCCCATTCCCACCGGAGGTGCCAAGTCCCAGCTGGGCAGCTGGATGAGTGAGGAAACCTTTCAGAAAGC CAGAGAGGACCGCTTTCCTGGCTGCATGGCGGGACGCACCATGTATGTGATCCCCTTCAGCATGGGCCCTGTGAACT CTTCTCTTGCTAAGTTTGGTGTTCAGGTGACAGATTCTCCATATGTGGTGGCTAGCATGGGCATCATGACACGCATG GGGACTCCTGTGCTGGAAAAACTAGCCGAGGGTGCGGAGTTTGTGCGCTGCCAGCACTCTTTGGGCAGACCTTTACC ACTCAAAGCTCCTTTAGTAAACAGCTGGCCTTGTAACCCGGACAAGGTGTTGATCTCACATCTTCCTGACACCAGAC AGATCCTGTCCTTCGGCAGCGGTTACGGTGGAAACTCGCTCCTTGGAAAGAAATGTTTTGCTCTTCGTATCGCCTCA CGCATTGCCAAAGACGAAGGCTGGTTGGCTGAACACATGCTGATTCTGGGAATCACAAATCCTCAGGGTGTAAAACG GTACATTGCAGCAGCGTTCCCGAGCGCTTGTGGGAAAACTAACCTGGCCATGATGAAACCATCACTGCCAGGCTGGA CGGTTGAGTGTGTGGGCGATGACATCGCCTGGATGAAATTTGACAGTCAGGGTAAACTCAGAGCCATTAATCCAGAG AATGGTTTTTTTGGAGTCGCCCCCGGGACATCCCTAAAGACAAACCCTCATGCCATGGCAACCATCTCCAGGAACAC AGTGTTCACTAACGTGGGAGAGACCAGCGATGGAGGAGTTTGGTGGGAGGGTCTGGAACCACCTGCACCTGGAATCA AACTCACAGACTGGCATGGAAAATCCTGGAAGTATGGTGATCCTACACTGTGTGCTCACCCGAACTCCAGGTTTTGT GCCCCAGCTGGCCAGTGCCCCATCATAGACCCACTCTGGGAAAGTGATGAGGGCGTCCCCATTGATGCCATTGTATT TGGTGGAAGAAGACCAGAAGGTGTGCCTTTGGTGTACGAGTCATTTAACTGGAAACATGGCGTGTTTGTAGGAGCAG CCATGAAATCTGAATCCACAGCTGCTGCTGAACATAAGGGTAAAGTAATCATGCATGACCCCTTCGCCATGCGTCCT TTCTTCGGTTACAACTTCGGTGACTACTTGGCCCACTGGTTGAGTATGGAGACGCACAAGGGCCAGACCCAACTCCC CAAGATCTTCCACGTCAACTGGTTCCGTAAAGATCAGAAGACCGGGTCTTTCTTGTGGCCAGGGTTTGGAGAGAACG CCCGCGTCCTCGAGTGGATCTTCAAACGATGCGGCCGTACCAGTGAAGACGAGGCTGCCACCAAAAGCATTGTGGGA TGGATTCCACAAAACGGTGCCATAAACACAGAAGGCCTGGGTGGAAATATCGATATGGGTGCCCTCTTTGACCTGCC CAAACCCTTCTGGCAGAAGGAAACACAAGAGCTTCGGACCTACTTCACCCAGCAGGTTGGAGCTGATCTGCCCGCAC AAGTGGAAGGAGAGCTGAGGGCGCTGGAGGAGAGAGTGAGGGATTGAACAGACGCTACATTACATTGATGTTGAGCA GATGTGAAGAATAGGATGGGTTGAGGTGGAGATAACTGTTTTAATCTGACTGTTGCACTGCAGTGGACACTGCACCT GAGAAAACACAAAACCAAAAAGTTCACAAGATGCCATCAGTGGTATCGATACCTAGGTGCCTTATTTGATCTTACAG TAGAAGCTAAAAaCTCTATTAAATGTTTACAAACTATGTCCCAAAATGCCTTTTAGATTATTACTATAGTTTCTTTA TTACTACAGTTTATTTTGAGCAAAGGTATTAGACATGTCTTTAAGGAGAGCACCAGTACCATCGTTTTTTACCTATC TAATGTAAGCTGAAGTTTTATTTCTAAAGATTTTGCCTTTTATCAGTGGAATTTGATTGACATGGATCAGGTTTAGC TAGGGTTGAAAGATCCAGACCAAAGAACACAGACAAGTCTCAGTCATTGAATGTGTGCATGTTTTTACATGAGCTGA CTGAATAAATACAACTCTAAACCAAAAAAAAAAA
[0185] 第十二步，半定量PCR
[0186] ( 一）饲养和取样
[0187] 取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每箱三 条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点更换 养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投喂低 糖、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖，将肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌 肉取出，记好标记存入液氮中备用，以进行后续试验；
[0188] 其中，低糖饲料各原料的质量分数
[0189] 鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜柏10%，DDGS3%，豆油4%，预混料 1 %，微晶纤维素 25%，麸皮10%，糊精0 ;
[0190] 其中，高糖饲料各原料的质量分数
[0191] 鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜柏10%，DDGS3%，豆油4%，预混料 1 %，微晶纤维素〇,麸皮10%，糊精25%
[0192] (二）制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA[0193] (三）合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA
[0194] (四）PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量
[0195] (I)PCR扩增内参基因
[0196] ①按照下列组份，在冰上配制PCR反应体系：
[0197]
[0198] PCR反应程序：
[0199]
[0200] ②随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于_20°C备用；
[0201] ③使用1 %琼脂糖电泳检测内参基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结 果拍照；
[0202] ④使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比；
[0203] ⑤按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引 物进行半定量PCR ;
[0204] ⑥使用1%琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对 电泳结果拍照
[0205] ⑦使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比， 对比结果如图1所示；
[0206] ⑧建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线；
[0207] 如，对乌克兰鳞鲤肾脏组织建立PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲 线，如图2所示，具体如下：
[0208] ①将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组。
[0209] ②获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测。
[0210] ③对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA， 以cDNA为模板，Q2与Q3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖 凝胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值。
[0211] ④将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描 点并连线建立二者的对应曲线模型。建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血 糖值。为了得到更精确的血糖值，可对曲线的描点进行细化，建立曲线模型的点越多，对照 检测的值越准确。
[0212] ⑨利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克 兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定，
[0213] A，选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织的取样对鱼体造成的创 伤最小，不易感染，更不用处死样本，这种取样方法对珍惜样品，如大型观赏鱼和经济鱼类 的亲本身体指标的连续观察尤为重要；而对于成百上千的大样本量统计学实验和检测，也 能够节省大量的人力以及物料成本。，调整各组织cDNA后，以PEP-F，SQ2和PEP-R，SQ3
[0214] SQ2 ：CTCAGCAGTCTGATATGAGA
[0215] SQ3 ：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC
[0216] 作为引物进行半定量PCR，电泳检测各组织PEPCK基因，得出各组织PEPCK基因的 亮度值；
[0217] B，利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，最终确定该被检测鱼的 血糖值。
【主权项】
1. 一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因，其特征在于：该基因的全长cDNA序列为：SQ1。2. -种应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其特征在于步骤如 下： 第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，包括步骤如下： (一） 制备乌克兰鳞鲤肝胰脏总RNA ; (二） 合成第一链cDNA ; (三） PCR扩增PEPCK基因中间片段； (四） 3' RACE PCR 及 5' RACE PCR ; (五） 琼脂糖电泳检测中间片段； (六） 制备感受态细胞； (七） T-A克隆； (八） 转化感受态细胞； (九） 菌液PCR方法筛选阳性克隆； (十）序列拼接，使用DNAStar软件中的EditSeq程序将乌克兰鳞鲤PEPCK基因中间序 列的3'端序列和5'端序列的核苷酸数据使用软件将它们按顺序拼接起来，得到乌克兰鳞 鲤PEPCK基因全长cDNA序列为：SQ1 ; 第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK 基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，具体步骤如下： (一） 检测鱼类的饲养和取样 (1) 饲养，取两个养殖箱冲洗干净后盛放好自来水，24小时连续曝气，将乌克兰鳞鲤每 箱三条分别放入两个养殖箱中暂养，先在每天9点分别向两箱鱼中投喂低糖饲料，在15点 更换养殖水体的三分之一，使其适应一周，然后禁食一天，再在第二天9点分别向两箱中投 喂低糖饲料、高糖饲料，15点分别将低糖组和高糖组各三条鱼活体解剖； (2) 取样，将解剖鱼体肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉取出，记好标记存入液氮中备用，以 进行后续试验； (二） 制备乌克兰鳞鲤各组织总RNA ; (三） 合成低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织第一链cDNA ; (四） PCR确定低糖组和高糖组乌克兰鳞鲤各组织PEPCK、对比基因的表达量，建立各组 织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，具体步骤为： (1) PCR扩增内参基因，在冰上配制PCR反应体系，然后进行PCR反应程序； (2) 随即将PCR产物置于冰上冷却，然后进行下一步实验或存于-20°C备用； (3) 使用1%琼脂糖电泳检测内参基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电泳结果拍 昭. (4) 使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织内参基因的亮度比； (5) 按照上一步得出的亮度比调整各组织cDNA的添加量，以PEP-F和PEP-R作为引物 进行半定量PCR ; (6) 使用1%琼脂糖电泳检测各组织PEPCK基因 PCR结果，并用凝胶成像分析系统对电 泳结果拍照； (7) 使用Gel-Pro软件分析各组织的条带亮度，得出各组织PEPCK基因的亮度比； (8)建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线； 第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌 克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。3. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（一）中低糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%、豆柏15%、 花生柏16%、棉柏8%、菜柏10%、DDGS3%、豆油4%、预混料1 %、微晶纤维素25%及麸 皮10 % ;高糖饲料各原料的质量分数为：鱼粉8%，豆柏15%，花生柏16%，棉柏8%，菜柏 10 %，DDGS3 %，豆油4 %，预混料1 %，麸皮10 %及糊精25 %。4. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（1)步在冰上配制PCR反应体系的组份为：〇5. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（1)进行PCR反应程序的具体内容为：6. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（5)的PEP-F和PEP-R的引物序列为： SQ2 ：CTCAGCAGTCTGATATGAGA SQ3 ：TTTGGGACATAGTTTGTAAAC〇7. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第二步的步骤（四）中第（8)步建立各组织PEPCK基因的半定量PCR扩增 条带亮度与鱼血糖值的对应曲线的具体步骤为： ① 将鲤鱼进行不同含糖量的饲料饲喂实验：高糖组，低糖组，禁食组； ② 获得三个组别鲤鱼的血样并进行常规血糖检测； ③ 对三个组别的鲤鱼进行非血组织取样，并分别进行RNA抽提并反转录为cDNA，以 cDNA为模板，SQ2与SQ3为引物进行PEPCK基因的半定量PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，并使用紫外摄像系统检测扩增目的条带亮度值； ④ 将三个组别的血糖值与相应的PEPCK基因目的条带亮度值在直方图上进行描点并 连线建立二者的对应曲线模型，建立曲线后根据相应的亮度值从曲线上查出相应的血糖 值，为了得到更精确的血糖值，对曲线的描点进行细化。8. 根据权利要求2所述的应用乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因标定鲤科鱼类血糖的方法，其 特征在于：所述第三步的步骤（四）中第（9)步对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的 血糖值确定的具体步骤为： ① 选取待检测鱼，获得非血液组织中的鳞片根部肌肉组织为样品，按照权利要求2中 所述第二步的步骤（二）至步骤（四）的（7)步得出检测鱼各组织PEPCK基因的亮度值； ② 利用PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线，最终确定该被检测鱼的血糖 值。
【专利摘要】本发明涉及一种乌克兰鳞鲤PEPCK酶基因及标定鲤科鱼类血糖的方法，该基因的全长cDNA序列为：SQ1，标定鲤科鱼类血糖的方法，包括步骤：第一步，乌克兰鳞鲤PEPCK基因全长cDNA序列的确定，第二步，得出不同饲养条件下乌克兰鳞鲤各组织PEPCK基因的亮度，建立各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的关系曲线；第三步，利用各组织PEPCK基因的亮度表达量与鱼血糖值的对应曲线，对生产中的乌克兰鳞鲤进行半定量PCR的血糖值确定。本发明提出了一种全新的鲤科鱼类血糖标定方法，标定成本低，标定方法操作简单，标定结果可靠，减少了测定过程中易于感染的风险。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/53
【公开号】CN104894145
【申请号】CN201510156059
【发明人】乔秀亭, 王墨染, 程镇燕, 段霁航, 方珍珍, 白东清, 孙金辉
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月3日
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