一种苹果酸酶基因及其重组表达载体的制作方法
一种苹果酸酶基因及其重组表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，具体涉及从深黄被孢霉(.Mortierella isabelIina)W)~22中克隆的苹果酸酶基因以及将该基因直接与不同载体连接，转入不同宿主细胞中，利用其编码苹果酸酶催化苹果酸脱羧，伴随着产生丙酮酸、0)2和NADPH，其产生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促进脂肪酸的合成等功能，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]苹果酸酶(malic enzyme，ME)是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸和CO2以及NAD(P) +的还原。苹果酸酶广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种:NAD-苹果酸酶(NAD-Malicenzyme, NAD-ME, EC 1.1.1.38 和 EC 1.1.1.39 )和 NADP-苹果酸酶(NADP-Malicenzyme，NADP-ME, EC 1.1.1.40)。本发明主要是针对NADP-苹果酸酶基因进行研宄。
[0003]通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH (SongY D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147 (6):1 507-1 515.)。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的PH和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F，Casati P, Andreo C S, FEBS Letters,2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D, Annual Review of Plant Phys1logy andPlantMolecular B1logy, 1994，45: 447- 467.)。此外，植物 NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。
[0004]NADP-ME也是景天酸代谢途径(CAM)植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明:NADP_ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17 (2): 200-204.)。
[0005]苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新苹果酸酶基因进一步将其插入pET-32a(+)构建重组表达质粒，并实现在万.co7i BL21中表达重组苹果酸酶，为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从深黄被孢霉(#oriieri?77a i sabel I ina)W)~22中分离的苹果酸酶基因#/量V及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID N0:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1821bp (碱基)，其中1-1821为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQID NO:2所示的多肽或其片段。
[0007]本发明另一目的是提供一种含有所分离的苹果酸酶基因iffMV的重组表达载体，是将SEQ ID NO:1所示基因直接与不同表达载体(质粒、病毒或运载体)连接所构建的重组载体。
[0008]本发明另一目的是提供一种含有该苹果酸酶基因量V或上述重组表达载体的宿主细胞大肠杆菌coif)菌株BL21。
[0009]本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。
【附图说明】
[0010]图1为利用本发明的深黄被孢霉M6-22苹果酸酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aMMEl质粒图谱；
图2为本发明所构建重组表达质粒pET32aMMEl的酶切分析图；其中:1为DNAMarker ；2为基因MIMEI饱PCR扩增产物；3为pET32aMMEl酶切后条带；4为pET32a(+)酶切后条带；
图3为本发明的苹果酸酶基因诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中:1为转化了 pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；2为转化了 pET32aMMEl并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为纯化的目的蛋白条带；4为蛋白电泳Marker。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0012]实施例1:深黄被孢霉苹果酸酶基因JffMY的克隆
米用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 从深黄被抱霉(iforii<9r<977a isabellina)中提取总 RNA，用反转录试剂盒 Thermo Scientific Maxima H Minus First Strand cDNASynthesis Kit合成cDNA，取I μ I为模板进行聚合酶链式反应。设计引物(引物I和引物
2)进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下:
引物 I:MIME1F1:5'- CGGGATCCATGTCACCTACCGTATCCGT -3' (SEQ ID NO:3)
引物 2:MIME1R1:5'- CCCTCGAGTTAGATCTTGCTGATAGACTTTTC-3' (SEQ ID N0:4)；
PCR扩增体系(50 μ L)组成如下:
5XFast Pfu Buffer1yL
dNTP (2.5 Mmol/L)5 yL
cDNAI μ L MIME1F2 (10 Mmol/L)IyL
MIME1R2 (10 Mmol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/M-L)IyL
无菌ddH20补足至50 μ L ；
扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 45s,57.5°C 45s,72°C 2mi n进行30个循环，最后72°C I Omin,反应完后取产物I μ L，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1821bp长的序列，命名为#/歷7，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0013]实施例2:重组表达质粒pET32aMMEl的构建
采用实施例1中测cDNA为模板进行PCR扩增，反应所用引物组合、反应组分和扩增条件如下:
引物 1:MME1F1:5'-CGGGATCCATGTCACCTACCGTATCCGT-3' (SEQ ID NO:3)
引物 2:MIME1R2:5'-CCCTCGAGGATCTTGCTGATAGACTTTTC-3' (SEQ ID NO:5)；
PCR扩增体系(50 PL)组成如下:
5XFast Pfu Buffer1yL
dNTP (2.5 Mmol/L)5 yL
cDNAI μ L
MIMEFl (10 Mmol/L)IyL
MIMERl (10 Mmol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/M-L)IyL
无菌ddH20补足至50 μ L ;
扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 45s,57.5°C 45s,72°C 2min进行30个循环，最后 72 °C 1min ；
将按照上述条件PCR获得基因片段#/歷7和表达载体pET-32a (+)用BaniA I和Xho I核酸内切酶进行双酶切，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pET32aMMEl，该质粒图谱如图1所示。进一步进行双酶切分析鉴定，如图2第3泳道所示，用BanR I和Xho I双酶切，重组质粒产生两条带，小分子条带与泳道2中该基因的PCR产物大小一致，大分子条带与泳道4中用相同两个内切酶酶切pET32a ( + )产生的条带大小一致，表明所构建的重组表达质粒正确，进一步测序分析也证明这一点。此外，通过核苷酸序列所编码的氨基酸相似性搜索表明，该基因编码的蛋白与真菌来源的苹果酸酶相似，但不完全相同。
[0014]实施例3:苹果酸酶基因JffMY在大肠杆菌BL21中的诱导表达 UMIMEl苹果酸酶蛋白的诱导表达
为了验证该基因编码蛋白的活性，将I μ g重组质粒pET32aMMEl加入50 μ I大肠杆菌BL21感受态细胞中，将整个体系冰浴30min之后于42°C热击90s，再次冰浴2min，然后将连接体系吸取并加入至950μ1 LB液体培养基中，37°C、10rpm振荡孵育lh。孵育结束后于2000 Xg离心3~5 min，留下约50 μ I上清液从新悬浮沉淀的菌体后涂布于含有氨节青霉素(Amp+)的LB固体平板，37°C倒置培养过夜。经菌落PCR筛选阳性克隆后，挑取阳性转化子于100 mL LB (含100 μ g/mL氨苄霉素)培养基中，37°C振荡培养至达到0.6左右，按1%比例接种到IL新鲜的LB液体培养基中，于37°C、160rpm培养至值约为0.8，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，于16°C恒温摇床80 rpm诱导培养12小时。12000 rpm离心1min收集菌体，SDS-PAGE分析显示，pET32aMMEl转化的大肠杆菌中表达出一条分子量约为70kD的蛋白(见图3泳道2)，但在空载体pET32a ( + )转化的大肠杆菌中没有(见图3泳道I)。进一步用该菌体悬浮于适量(使菌悬液的OD6cic1- 20) 30 mM的咪唑缓冲液中，冰上超声破碎细胞，4°C、14000 rpm离心15 min。将离心后的上清液用0.2 μ m的微型滤膜过滤，滤液上样于已用30mM咪挫缓冲液平衡好的His Trap HP柱(I ml, GE Healthcare)，用200mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一纯蛋白条带(见图3泳道3)。
[0015]2、MMEl苹果酸酶的酶活测定
苹果酸酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸、0)2和NADPH。由于苹果酸酶的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH的浓度变化呈线性关系，所以ME的活性可通过检测NADPH的浓度变化来测定，NADPH浓度升高越多则ME活力越大。以苹果酸和NAD+为底物加入苹果酸酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活。酶活单位定义:一个酶活力单位是指30°C时每分钟生成I nmol NADPH所需的酶量。
[0016]MIMEl苹果酸酶酶活按如下公式计算:
E=[V/( ε XDXPXV)] X [ Δ e/Δ t] Χ1000
= [2/(6.220X1X0.4625X0.4)] X [ (1.314-0.293)/1min] Χ1000=177.46 u/mg
V-----反应溶液最终体积(ml)
ε-----340nm处测定的NADPH的吸光度(6.220)
D-----光路长(Icm)(比色皿直径)
V-----酶液体积(ml)
P-----蛋白质浓度(mg/ml)
Δθ/Δ t——单位时间内吸光度的变化
结果显示，所纯化的MMEl苹果酸酶的酶活为292.84 u/mg，表明基因重组载体在大肠杆菌BL21中诱导表达出来的MMEl苹果酸酶具有苹果酸酶的活性。
【主权项】
1.一种苹果酸酶基因#/量7，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。2.一种含有权利要求1所述苹果酸酶基因iffMV的重组表达载体。3.—种宿主表达细胞，所述宿主细胞含有权利I所述的苹果酸酶基因#/量7或权利要求2所述的重组表达载体。
【专利摘要】一种苹果酸酶基因及其重组表达载体。本发明公开了一种从深黄被孢霉M6-22中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中表达，表达产物具有苹果酸酶功能。
【IPC分类】C12N15/53, C12N1/21, C12R1/19, C12N15/70
【公开号】CN104894147
【申请号】CN201510270913
【发明人】高春红, 张琦, 李凌彦, 魏云林, 林连兵, 季秀玲
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，具体涉及从深黄被孢霉(.Mortierella isabelIina)W)~22中克隆的苹果酸酶基因以及将该基因直接与不同载体连接，转入不同宿主细胞中，利用其编码苹果酸酶催化苹果酸脱羧，伴随着产生丙酮酸、0)2和NADPH，其产生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促进脂肪酸的合成等功能，属于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]苹果酸酶(malic enzyme，ME)是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸和CO2以及NAD(P) +的还原。苹果酸酶广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种:NAD-苹果酸酶(NAD-Malicenzyme, NAD-ME, EC 1.1.1.38 和 EC 1.1.1.39 )和 NADP-苹果酸酶(NADP-Malicenzyme，NADP-ME, EC 1.1.1.40)。本发明主要是针对NADP-苹果酸酶基因进行研宄。
[0003]通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH (SongY D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147 (6):1 507-1 515.)。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的PH和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F，Casati P, Andreo C S, FEBS Letters,2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D, Annual Review of Plant Phys1logy andPlantMolecular B1logy, 1994，45: 447- 467.)。此外，植物 NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。
[0004]NADP-ME也是景天酸代谢途径(CAM)植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明:NADP_ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17 (2): 200-204.)。
[0005]苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新苹果酸酶基因进一步将其插入pET-32a(+)构建重组表达质粒，并实现在万.co7i BL21中表达重组苹果酸酶，为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从深黄被孢霉(#oriieri?77a i sabel I ina)W)~22中分离的苹果酸酶基因#/量V及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQ ID N0:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1821bp (碱基)，其中1-1821为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQID NO:2所示的多肽或其片段。
[0007]本发明另一目的是提供一种含有所分离的苹果酸酶基因iffMV的重组表达载体，是将SEQ ID NO:1所示基因直接与不同表达载体(质粒、病毒或运载体)连接所构建的重组载体。
[0008]本发明另一目的是提供一种含有该苹果酸酶基因量V或上述重组表达载体的宿主细胞大肠杆菌coif)菌株BL21。
[0009]本发明提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。
【附图说明】
[0010]图1为利用本发明的深黄被孢霉M6-22苹果酸酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aMMEl质粒图谱；
图2为本发明所构建重组表达质粒pET32aMMEl的酶切分析图；其中:1为DNAMarker ；2为基因MIMEI饱PCR扩增产物；3为pET32aMMEl酶切后条带；4为pET32a(+)酶切后条带；
图3为本发明的苹果酸酶基因诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中:1为转化了 pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；2为转化了 pET32aMMEl并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为纯化的目的蛋白条带；4为蛋白电泳Marker。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0012]实施例1:深黄被孢霉苹果酸酶基因JffMY的克隆
米用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 从深黄被抱霉(iforii<9r<977a isabellina)中提取总 RNA，用反转录试剂盒 Thermo Scientific Maxima H Minus First Strand cDNASynthesis Kit合成cDNA，取I μ I为模板进行聚合酶链式反应。设计引物(引物I和引物
2)进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下:
引物 I:MIME1F1:5'- CGGGATCCATGTCACCTACCGTATCCGT -3' (SEQ ID NO:3)
引物 2:MIME1R1:5'- CCCTCGAGTTAGATCTTGCTGATAGACTTTTC-3' (SEQ ID N0:4)；
PCR扩增体系(50 μ L)组成如下:
5XFast Pfu Buffer1yL
dNTP (2.5 Mmol/L)5 yL
cDNAI μ L MIME1F2 (10 Mmol/L)IyL
MIME1R2 (10 Mmol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/M-L)IyL
无菌ddH20补足至50 μ L ；
扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 45s,57.5°C 45s,72°C 2mi n进行30个循环，最后72°C I Omin,反应完后取产物I μ L，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1821bp长的序列，命名为#/歷7，序列组成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0013]实施例2:重组表达质粒pET32aMMEl的构建
采用实施例1中测cDNA为模板进行PCR扩增，反应所用引物组合、反应组分和扩增条件如下:
引物 1:MME1F1:5'-CGGGATCCATGTCACCTACCGTATCCGT-3' (SEQ ID NO:3)
引物 2:MIME1R2:5'-CCCTCGAGGATCTTGCTGATAGACTTTTC-3' (SEQ ID NO:5)；
PCR扩增体系(50 PL)组成如下:
5XFast Pfu Buffer1yL
dNTP (2.5 Mmol/L)5 yL
cDNAI μ L
MIMEFl (10 Mmol/L)IyL
MIMERl (10 Mmol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/M-L)IyL
无菌ddH20补足至50 μ L ;
扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 45s,57.5°C 45s,72°C 2min进行30个循环，最后 72 °C 1min ；
将按照上述条件PCR获得基因片段#/歷7和表达载体pET-32a (+)用BaniA I和Xho I核酸内切酶进行双酶切，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR，筛选阳性克隆，构建获得重组表达质粒命名为pET32aMMEl，该质粒图谱如图1所示。进一步进行双酶切分析鉴定，如图2第3泳道所示，用BanR I和Xho I双酶切，重组质粒产生两条带，小分子条带与泳道2中该基因的PCR产物大小一致，大分子条带与泳道4中用相同两个内切酶酶切pET32a ( + )产生的条带大小一致，表明所构建的重组表达质粒正确，进一步测序分析也证明这一点。此外，通过核苷酸序列所编码的氨基酸相似性搜索表明，该基因编码的蛋白与真菌来源的苹果酸酶相似，但不完全相同。
[0014]实施例3:苹果酸酶基因JffMY在大肠杆菌BL21中的诱导表达 UMIMEl苹果酸酶蛋白的诱导表达
为了验证该基因编码蛋白的活性，将I μ g重组质粒pET32aMMEl加入50 μ I大肠杆菌BL21感受态细胞中，将整个体系冰浴30min之后于42°C热击90s，再次冰浴2min，然后将连接体系吸取并加入至950μ1 LB液体培养基中，37°C、10rpm振荡孵育lh。孵育结束后于2000 Xg离心3~5 min，留下约50 μ I上清液从新悬浮沉淀的菌体后涂布于含有氨节青霉素(Amp+)的LB固体平板，37°C倒置培养过夜。经菌落PCR筛选阳性克隆后，挑取阳性转化子于100 mL LB (含100 μ g/mL氨苄霉素)培养基中，37°C振荡培养至达到0.6左右，按1%比例接种到IL新鲜的LB液体培养基中，于37°C、160rpm培养至值约为0.8，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，于16°C恒温摇床80 rpm诱导培养12小时。12000 rpm离心1min收集菌体，SDS-PAGE分析显示，pET32aMMEl转化的大肠杆菌中表达出一条分子量约为70kD的蛋白(见图3泳道2)，但在空载体pET32a ( + )转化的大肠杆菌中没有(见图3泳道I)。进一步用该菌体悬浮于适量(使菌悬液的OD6cic1- 20) 30 mM的咪唑缓冲液中，冰上超声破碎细胞，4°C、14000 rpm离心15 min。将离心后的上清液用0.2 μ m的微型滤膜过滤，滤液上样于已用30mM咪挫缓冲液平衡好的His Trap HP柱(I ml, GE Healthcare)，用200mM咪唑缓冲液进行洗脱，洗脱液用离心管按顺序收集，洗脱样品用SDS-PAGE电泳检测，获得一纯蛋白条带(见图3泳道3)。
[0015]2、MMEl苹果酸酶的酶活测定
苹果酸酶是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸、0)2和NADPH。由于苹果酸酶的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH的浓度变化呈线性关系，所以ME的活性可通过检测NADPH的浓度变化来测定，NADPH浓度升高越多则ME活力越大。以苹果酸和NAD+为底物加入苹果酸酶进行反应，用紫外分光光度计在340nm处测定酶活。酶活单位定义:一个酶活力单位是指30°C时每分钟生成I nmol NADPH所需的酶量。
[0016]MIMEl苹果酸酶酶活按如下公式计算:
E=[V/( ε XDXPXV)] X [ Δ e/Δ t] Χ1000
= [2/(6.220X1X0.4625X0.4)] X [ (1.314-0.293)/1min] Χ1000=177.46 u/mg
V-----反应溶液最终体积(ml)
ε-----340nm处测定的NADPH的吸光度(6.220)
D-----光路长(Icm)(比色皿直径)
V-----酶液体积(ml)
P-----蛋白质浓度(mg/ml)
Δθ/Δ t——单位时间内吸光度的变化
结果显示，所纯化的MMEl苹果酸酶的酶活为292.84 u/mg，表明基因重组载体在大肠杆菌BL21中诱导表达出来的MMEl苹果酸酶具有苹果酸酶的活性。
【主权项】
1.一种苹果酸酶基因#/量7，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。2.一种含有权利要求1所述苹果酸酶基因iffMV的重组表达载体。3.—种宿主表达细胞，所述宿主细胞含有权利I所述的苹果酸酶基因#/量7或权利要求2所述的重组表达载体。
【专利摘要】一种苹果酸酶基因及其重组表达载体。本发明公开了一种从深黄被孢霉M6-22中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中表达，表达产物具有苹果酸酶功能。
【IPC分类】C12N15/53, C12N1/21, C12R1/19, C12N15/70
【公开号】CN104894147
【申请号】CN201510270913
【发明人】高春红, 张琦, 李凌彦, 魏云林, 林连兵, 季秀玲
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
最新回复(0)