一种对秀丽隐杆线虫高毒力的几丁质酶及其编码基因的制作方法
一种对秀丽隐杆线虫高毒力的几丁质酶及其编码基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种对秀丽隐杆线虫高毒力 的几丁质酶及其编码基因。
【背景技术】
[0002] 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)因其遗传背景清楚、个体结构简单、生 活史短、基因组已测序完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类 遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信 号传导等领域得到广泛应用（Kaletta等，2006)。
[0003] 假单胞菌，在其生物代谢过程中能够产生丰富的几丁质酶，能够将生物体内的几 丁质成份水解为寡糖或者单糖，从而为其生长提供所需的能源物质（王治伟等，2006)。 另外，作为根际微生物的的主要群体，假单胞菌被广泛的应用于生物防治中（杨海君等， 2004)。其产生的小分子化合物（如氰化物）以及水解酶类（如丝氨酸蛋白酶）对线虫具 有很强的毒性（Singh等，2010)。
[0004] 几丁质酶，主要有18家族以及19家族两类，其中多数19家族来自于植物，而18 家族广泛的存在于各类生物中（Henrissat等，1993)。几丁质酶主要由典型的催化区以及 结合区两部分组成，也有少数来自真菌的几丁质酶仅由催化区构成。几丁质酶可以水解几 丁质产生几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖，且广泛存在于自然界的生物中，在生物防治中发 挥着重要的作用。
[0005] 几丁质，是由N-乙酰-β-D氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接起来的直链多聚 物，是最丰富的天然高分子化合物之一，广泛分布于动物、植物及微生物体内。有研宄表明 几丁质是线虫虫卵以及角质层的重要组成成份，在线虫的生长和繁殖中扮演着至关重要的 角色。将一定量的几丁质或者壳聚糖施入土壤中，能够诱发大量可利用该物质的菌体繁殖 生长，从而有效的控制植物病虫害的传播（Radwan等，2011)。
[0006] 目前，关于几丁质酶的作用部位及作用机理报道的不多。有研宄表明，几丁质酶能 够溶解真菌的细胞壁，参与孢子的萌发、细胞自溶以及孢子的形成，并且可以协助某些真菌 寄生侵染宿主。另外，几丁质酶可以水解昆虫中肠围食膜上的几丁质，形成穿孔从而导致 围食膜成型延迟，为其他肠道内毒素如晶体蛋白提供通道，协同提高杀虫活性（Smirnoff， 1974)。对于线虫的影响，本发明表明，几丁质酶可以水解线虫的卵壳和角质层，从而破坏线 虫的组织结构，导致内溶物外渗。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一种对秀丽隐杆线虫（野生型N2,下同）具有高毒力 的几丁质酶及其编码基因，该基因是通过设计引物从铜绿假单胞菌基因组中直接克隆得到 的。基因全长1452bp (如序列表SEQ ID N0:1中l-1452b碱基对应的序列所示），编码483 个氨基酸（其编码的蛋白质如序列表SEQ ID NO: 2所示）。该基因测序结果经Genbank数 据库中的BLASTN进行比对，发现其与铜绿假单胞菌的几丁质酶基因亲缘关系最近，表明该 基因最有可能是一个几丁质酶基因。收集已报道的杀线虫几丁质酶构建进化树分析，与该 基因编码的氨基酸序列相似性最高也只有40%，证明该基因是一个新的杀线虫基因。
[0008] 将该杀秀丽隐杆线虫基因克隆到pGEX-6p_l表达载体（购自美国GE Healthcare 公司）上，作为重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(购自Invitrogen 公司），经诱导表达得到大小为79. OkDa的融合蛋白，纯化除去GST标签后得到大小为 53. OkDa的纯蛋白。并将该蛋白用于生测秀丽隐杆线虫，结果表明：其半致死浓度LC5tl为 387. 3±3L 7μg/ml。
[0009] 为了实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：
[0010] 本发明从华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏的菌株（分离时间： 2012年9月；分离地点：湖北省武汉市华中农业大学狮子山）中筛选得到一株对秀丽隐杆 线虫具有高毒力的候选菌株（实验室保藏编号为0364)。
[0011] 抽提该候选菌株的基因组DNA，并以之作为模板，用16S通用引物 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和 27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)进行 PCR 扩增，经 鉴定该菌株最有可能为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。
[0012] 将该菌株的活性成份分别进行酸碱以及热处理，初步推断该活性成份最有可能是 蛋白类物质。
[0013] 将该原始菌株分别接种到LMZ培养基（成份：0.2% (质量体积比）明胶，0.8%蛋 白胨，0. 1 %酵母提取物，0. 05%硫酸铵，0. 001 %硫酸亚铁，0. 05%硫酸镁，pH7. 0)、几丁质 培养基（成份：〇. 5%蛋白胨，0. 25%酵母提取物，0. 5%氯化钠，0. 2%胶体几丁质，pH7. 0)、 牛奶培养基（成份：〇. 5%蛋白胨，0. 25%酵母提取物，0. 5%氯化钠，1 %脱脂奶粉，pH7. 0)， 培养2d后发酵液用于生测秀丽隐杆线虫，推测该菌株产生的几丁质酶与杀线虫具有一定 的关系。
[0014] 在NCBI的基因组数据库中找到铜绿假单胞菌中的几丁质酶基因，设计引物从该 菌株的基因组DNA中克隆得到了全长1452bp的目的基因（核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示），并且将该基因装载到表达载体pGEX-6p-l上，得到重组载体pGEX-6p-pachi转化大肠 杆菌BL21 (DE3)，经诱导表达，纯化，得到了目的蛋白。我们将该蛋白命名为pachi，其蛋白 质的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0015] 将重组载体pGEX_6p_pachi转化大肠杆菌（Escherichia coli)DH5 α，我们将得 到重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌DH5 a /6p_pachi，Escherichia coli DH5 a /6p_pachi， 于2015年03月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏 号为 CCTCC NO :M2015139。
[0016] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》的内容。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQ ID N0:1是本发明克隆得到的对秀丽隐杆线虫具有高毒力的几丁 质酶基因的核苷酸序列（l_1452bp的碱基对应的序列所示）及其对应的氨基酸序列 (l-1452bp)，其中第l-1452bp为编码区即CDS)。
[0018] 序列表SEQ ID NO: 2是本发明的高毒力几丁质酶基因编码的蛋白质序列，分子量 为 53. OkDa。
[0019] 图1:本发明技术流程图。
[0020] 图2 :线虫生命周期示意图。
[0021] 图3 :线虫死亡鉴定图。其中图3中A图为活线虫显微图片；图3中B图为死亡线 虫显微图片。
[0022] 图4 :原始质粒pGEX-6p_l图谱。
[0023] 图5 :本发明构建的重组质粒pGEX-6p_pachi图谱。
[0024] 图6 :几丁质酶pachi表达及纯化的SDS-PAGE分析图。对图6中各泳道的说明： 泳道M是蛋白标样（购于Fermentas公司，大小范围为14. 4-116kDa);泳道1是大肠杆菌 DE3/pGEX-6p-l未诱导破细胞上清液；泳道2是大肠杆菌DE3/pGEX-6p-l诱导破细胞上清 液；泳道3是大肠杆菌DE3/pGEX-6p-pachi未诱导破细胞上清液；泳道4是大肠杆菌DE3/ pGEX-6p-pachi诱导破细胞上清液；泳道5是纯化并切除GST标签后的pachi蛋白液。
[0025] 图7 :标准蛋白浓度曲线。
[0026] 图8 :N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。
[0027] 图9 :几丁质酶pachi对秀丽隐杆线虫致死率。
[0028] 图10 :几丁质酶pachi抑制秀丽隐杆线虫繁殖示意图。
[0029] 图11 :几丁质酶pachi对秀丽隐杆线虫生长影响、虫卵和角质层降解示意图。其中 图11中A图是几丁质酶pachi对秀丽隐杆线虫生长影响；图11中B图是几丁质酶pachi 降解秀丽隐杆线虫虫卵的示意图；图11中C图是几丁质酶pachi降解秀丽隐杆线虫角质层 的示意图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1 :高毒力菌株筛选
[0031] 将本实验室保藏的菌株（分离时间：2012年9月；分离地点：湖北省武汉市华中 农业大学狮子山）分别划线接种得到LB(培养基成份：1% (质量体积比，下同）蛋白胨， 0. 5%酵母提取物，1 %氯化钠，1. 5%琼脂粉）平板上，于37°C恒温培养箱培养12-14小时 后，平板长出单菌落，挑取单菌落接种到液体LB培养基（成份：1% (质量体积比，下同） 蛋白胨，0. 5 %酵母提取物，1 %氯化钠），37°C培养两天后，按不同稀释倍数（I X，3 X，5 X， IOX，20 X)稀释。
[0032] 将培养好的秀丽隐杆线虫（培养方法见实施例6步骤2)用无菌水冲洗，静置，除 去上清液，加入无菌水清洗至虫体干净，然后用M9缓冲液（1L溶液：氯化钠5. Og，磷酸二氢 钾3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0.25g)重悬，得到线虫液。取一干净无菌的96孔 板，每孔加入上述不同稀释倍数的培养液100 μ 1，同时加入5 μ 1的秀丽隐杆线虫液（约40 条），设三个平行实验。并且以大肠杆菌Ε. coli 0Ρ50 (Brenner，1974)作为阴性对照（生测 方法同上），用封口膜将96孔板密封，于20°C培养两天后，在倒置显微镜（型号XSD-1B，购 自Olympus公司）下观察，线虫僵直的为死亡的线虫（如图3所示）。
[0033] 从本实验室（分离时间：2012年9月 ；分离地点：湖北省武汉市华中农业大学狮子 山）保藏的300株菌株中筛选得到6株对秀丽隐杆线虫具有高毒力（结果见下表1)的菌 株（编号分别为 0364, 2258, CL4, F39-2, J3-4, J3-15)。
[0034] 表1 6株候选菌株对秀丽隐杆线虫毒杀效果
[0035]
[0036] 实施例2 :活性物质的分类判定
[0037] 将上述实施例1中筛选得到的6株菌株分别接种到液体LB培养基（成份见实施 例ILB液体培养基），37°C培养两天后，制备细胞破碎液：在I. 5ml的离心管中加入1ml的培 养液（〇D6(KI~1. 2)，12000rpm离心lmin，将上清液转移至另外一个干净的I. 5ml离心管作 为发酵上清液，菌体用400 μ I PBS缓冲液（pH7. 4, HOmM氯化钠，2. 7mM氯化钾，10.0 mM磷 酸氢二钠，I. 8mM磷酸氢二钾）重悬，于超声波破碎仪（JY92- II DN，购自宁波东芝生物科技 股份有限公司）中破碎细胞，得到细胞破碎液。按实施例1生测方法，分别用发酵上清液和 细胞破碎液生测线虫。结果如下表2。
[0038] 表2候选菌株发酵液上清和细胞破碎液对秀丽隐杆线虫毒杀效果
[0039]
[0041] 依据上述表2,分别收集各菌株中对秀丽隐杆线虫具有较高的活性的成份（如 0364菌株的细胞破碎液，2258菌株的发酵液上清，其他菌株相同）。
[0042] 将上述收集的各活性成份分别进行热处理：各活性成份分别于恒温水浴锅（型号 SHHW，购自上海东星建材试验设备有限公司）中60°C和100°C处理lOmin，然后取出在冰上 冷却，生测线虫（生测方法同实施例1)，结果如下表3,因此选择活性成份对秀丽隐杆线虫 致死率高且对温度敏感的菌株（编号为0364)进行酸碱处理，并将该菌株作为候选菌株。
[0043] 表3温度处理对各活性成份活性的影响
[0044]
[0045] 酸碱处理：候选菌株的细胞破碎液分别用lmol/L盐酸和lmol/L氢氧化钠调整pH 为（3,4,5,6,7,8,9，10，11)，然后放到4°〇冰箱（购自青岛海尔公司）处理1211后分别用 lmol/L盐酸和lmol/L氢氧化钠调pH至中性，生测线虫（生测方法同实施例1)。结果如下 表4。
[0046] 表4酸碱处理对候选菌株细胞破碎液活性影响
[0047]
[0048] 候选菌株（编号0364)其活性成份（细胞破碎液）经过热处理和酸碱处理，发现 该活性成份对温度及酸碱都比较敏感，初步推测该活性物质极有可能是蛋白类物质。
[0049] 另外，将候选菌株（编号0364)分别接种到LMZ培养基（成份：0· 2% (质量体积 比）明胶，0. 8 %蛋白胨，0. 1 %酵母提取物，0. 05 %硫酸铵，0. 001 %硫酸亚铁，0. 05 %硫酸 镁，pH 7.0)、几丁质培养基（成份：0.5%蛋白胨，0.25%酵母提取物，0.5%氯化钠，0.2% 胶体几丁质，pH 7.0)和牛奶培养基（成份：0.5%蛋白胨，0.25%酵母提取物，0.5%氯化 钠，1 %脱脂奶粉，PH 7.0)，37°C培养两天后，依据上述细胞破碎液制备方法，得到各培养基 培养的细菌的细胞破碎液，并且稀释不同倍数（1X，2X)，生测线虫（生测方法同实施例 1)。结果见表5。该候选菌株（编号0364)生长在几丁质培养基中，对秀丽隐杆线虫具有更 高的致死率。因此，推断该菌株产生的几丁质酶可能参与了菌株对线虫的侵染过程。
[0050] 表5不同培养基培养对候选菌株活性的影响
[0051]
[0052] 实施例3 :候选菌株的鉴定及目的基因的克隆
[0053] (1)候选菌株总DNA的提取：
[0054] 将该候选菌株（编号0364)，接种到液体LB培养基（成份见实施例1LB液体培养 基），37°C培养2d后，取2ml的菌液于离心管中，收集菌体；
[0055] 用 200 μ I TE buffer (配方：50mmol/Tris-HCl ρΗ8· 0,10mmol/L EDTA，调 pH 至 8. 0)重悬菌体，并且加入50 μ I 100 μ g/ml溶菌酶（该溶菌酶购自Sigma公司），37°C水浴 Ih ；
[0056] 加入500 μ 1细菌裂解液（裂解液成份：20% (质量体积比，下同）十二烷基磺酸 钠（SDS) ,5%乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na), 5%醋酸钠（NaAc)，3%柠檬酸钠，5% (体积：体 积，下同）1'1^〇1^-100,5%了￥661120,50%1'1^8-(：1(501111))，70°〇水浴1011^11后，取出于4°〇 冷却，加入150 μ I 5mol/L氯化钠溶液；
[0057] 加入等体积的酷：氯仿：异戊醇（体积比为25 :24 :1)，混勾，12000rpm离心10min， 取上清，重复这一步骤2次；
[0058] 取上清液，加入2/3体积的异丙醇轻轻混匀，于-20°C静置30min，12000rpm离心 IOmin ；
[0059] 弃上清，保留沉淀，加入70%的乙醇洗涤2次，于室温干燥后，溶于50 μ I CldH2O 中，保存于-40 °C备用。
[0060] (2)候选菌株的16S基因扩增：
[0061] 以步骤1提取的细菌总DNA为模板，采用16S通用引物 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和 27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)进行扩增，
[0062] PCR体系如下：
[0063] I () X PCR biiiVcr (购厂 ΤΛΚΛΤΛ 公 I I'J) 5μ1 dN 丁Ps ( IOniM 购 Γ. ΤΛΚΛΤΛ 公 m'J ) ΙμL Taq DNA聚合酶（购于TAKATA公司） ΙμL 模板（上述步骤1提取的候选菌株的总DNA ) 1 μL 1492R 引物 ΙμL 27F 引物 ΙμL 加 CldH2O 个 5()μ[。
[0064] PCR 条件：94°C预变性 4min ;94°C，30s ;52°C，30s ;72°C，90s，30 个循环；72°C延伸 lOmin，15°C，5min〇
[0065] 将PCR产物用胶回收试剂盒（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司）纯化 后，于博洪生物科技有限公司测序，结果经Blast比对得知，该候选菌株与Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌）亲缘关系最近。
[0066] (3)目的基因扩增：
[0067] 根据NCBI Genebank数据库公布的铜绿假单胞菌chitinase基因的核苷酸序列 (Accession Number ：CP006831)设计引物，ιΗ向引物 F(5-CCGGAATTCATGATCAGGATCGACTTTT CCCAGTTGCA-3)，包含EcoR I酶切位点（见正向引物F的下划线部分）；反向引物R(5-CC GCTCGAGTCAGCGCAGCGGCCGCC-3)，包含Xho I酶切位点（见反向引物R的下划线部分）。引 物由博洪生物科技有限公司合成。
[0068] PCR 扩增
[0069] PCR 体系：
[0070] I (i X PCR bull'cr (购 Γ· ΤΛΚΛΤΛ 公 i I'J ) 5μ1 dNTPs UOmM 购于 TAKATA 公司） ΙμL Taq DNA聚合酶（购于TAKATA公司） 1 μL 模板（上述提取的总DNA) ΙμL 正向引物F(IOpM) ΙμL 反向引物ΙΙ(1〇μΜ) ΙμL 加 ddH2〇 至 50μ1。
[0071] PCR 条件：94°C预变性 4min ;94°C，30s ;60°C，30s ;72°C，90s，30 个循环；72°C延伸 lOmin，15 °C，5min〇
[0072] 将PCR产物用胶回收试剂盒（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司）纯化 后，于博洪生物科技有限公司测序，结果经Blast比对得知，该基因与来自Pseudomonas aeruginosa的几丁质酶基因亲缘关系最近，该基因的DNA序列全长为1452bp，以AUG为起 始密码子，终止密码子为UGA，编码483个氨基酸，并且将该几丁质酶命名为pachi。该几丁 质酶属于糖基水解酶18家族，含有典型的催化区CHA，连接区FN3,结合区CBD。与其它已报 道的杀线虫几丁质酶的氨基酸序列相比，最高只有40%的相似性（见表6)，表明该基因是 一个新的杀线虫几丁质酶。
[0073] 表6 pachi与已报道杀线虫几丁质酶同源性
[0074]
[0075] (4) PCR 产物及质粒 pGEX-6p-l 酶切：
[0076] 酶切选用EcoR I -Xho I (均购于TAKARA)双酶切体系，酶切体系如下：酶切缓 冲液10 μ I ;EcoR I，3 μ I ;Xho I，3 μ I ;PCR纯化产物（约3 μ g);加水至100 μ 1。混匀于 37°C水浴12h后，用胶回收试剂盒纯化。质粒pGEX-6p-l酶切体系和条件同上。
[0077] (5)酶切片段与载体连接：
[0078] 连接体系：5X连接酶缓冲液（购于TAKARA公司），2 μ 1 ;双酶切PCR产物， 3 μ 1 (约200ng);双酶切载体，1 μ 1 (约40ng) ;Τ4连接酶，0· 5 μ 1 ;加水至10 μ 1。混勾后， 16 °C保温过夜。
[0079] (6)重组质粒转化大肠杆菌E. coli DH5 α :
[0080] 取酶连产物ΙμL与50μ1大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5a混匀，吸入预 冷的Imm电转杯（购自BIO-RAD公司）中，电击转化（电压12. 5kv/cm)(电转仪型号 MicroPulser，购自BIO-RAD公司）， 加入500 μ I LB液体培养基（成份见实施例1LB液体 培养基），37°C复苏lh，涂布于含lOOμg/ml氨苄青霉素 LB平板，37°C保温14h后，挑取长 出的单菌落，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB液体培养基（成份见实施例1LB液体培养 基）中，37°C培养12h。
[0081] (7)质粒抽提：
[0082] 取一 2ml的离心管，收集2ml菌液，离心取菌体；
[0083] 用 250 μ 1 溶液 I (25mM Tris-Cl (ρΗ8· 0)，IOmM 乙二胺四乙酸，50mM葡萄糖）重悬 菌体，加入250 μ 1溶液II (200mM氢氧化钠，1% (质量体积比）十二烷基磺酸钠（SDS))，上 下颠倒2~3次，加入350 μ 1溶液III (3M醋酸钾，5M醋酸），混勾，12000rpm离心10min，取 上清液，加入2/3体积的异丙醇轻轻混勾，于-20°C静置30min，12000rpm离心10min ;弃上 清，保留沉淀，加入70%的乙醇洗涤2次，于室温干燥后，溶于50 μ I CldH2O中，保存于-20°C 备用。
[0084] (8)重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3):
[0085] 取抽提好的质粒1 μ 1与30 μ 1大肠杆菌感受态细胞E. coli BL21 (DE3)混匀，吸 入预冷的Imm电转杯（购自BIO-RAD公司）中，电击转化（电压12. 5kv/cm)(电转仪型号 MicroPulser，购自BIO-RAD公司），加入500 μ I LB液体培养基（成份见实施例1LB液体 培养基），涂布于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB平板（成份见实施例1LB平板），37°C保温 14h后，挑取长出的单菌落，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB液体培养基中（成份见实 施例ILB液体培养基），37°C培养ia后，取800 μ 1菌液与灭菌的甘油200 μ 1混勾，保存 于-80。。。
[0086] (9)菌株的微生物学特征：
[0087] 上述步骤6得到的大肠杆菌，为两段钝圆的短小杆菌，大小0. 5Χ 1~3微米，周身 长有鞭毛，能够运动，不能够产生芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。菌落 表面光滑，凸出，不透明，为圆形菌落。将该大肠杆菌DH5α/6p-pachi，Escherichiacoli DH5a/6p-pachi于2015年03月20日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO :M2015139。
[0088] 实施例4 :蛋白的诱导、表达、纯化及分析
[0089] (1)重组蛋白的表达：
[0090] 挑取上述实施例3步骤8转化长出的单菌落，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB 液体培养基（成份见实施例1LB液体培养基）中，37°C培养12h后，以1% (体积：体积） 的接种量至IL含100 y g/ml氨苄青霉素 LB液体培养基（成份见实施例1LB液体培养基） 中，37°C培养2~3h，待0D_达到0. 6,加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)至终浓度 为0.1 mM，18°C诱导12h后。离心收集菌体，用PBS缓冲液（成份见实施例2 PBS缓冲液） 洗涤2~3次，再用50ml PBS重悬，然后用高压细胞破碎仪（购自美国THERMO公司）破碎 细胞。破碎液于4°C、12000rpm/min离心10min (离心机型号Avanti J-E，购自BACKMAN公 司），取上清液，重复上述离心2~3次。收集上清液，用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
[0091] (2)蛋白的纯化：
[0092] 利用GST亲和纯化系统纯化目的蛋白，具体操作步骤如下（所有操作均在4°C进 行）：
[0093] 装柱：取 Iml 柱材料 GSH Sepharose 4B (购于 Amersham-Pharmacia 公司）于层析 柱中，用5个柱体积的PBS缓冲液洗脱，至酒精清洗干净，活化柱材料；
[0094] 结合：将细胞破碎液上清缓缓加入柱子中，柱子流速控制在0. 5ml/min ;
[0095] 洗脱：用预冷（4°C )的PBS缓冲液（成份见实施例2 PBS缓冲液）洗脱杂蛋白， 柱子流速控制在lml/min。用Bradford试剂（购于上海生物工程技术有限公司）检测杂蛋 白洗脱情况；
[0096] 酶解：取10 μ 1浓度为IOunit/ μ 1的3C蛋白酶（购于Pharmacia公司）与Iml 的PBS缓冲液混勾，加入层析柱，于4°C酶解16h ;
[0097] 收集蛋白：收集酶解后的蛋白于I. 5ml的离心管中。
[0098] (3)纯化蛋白的检测：
[0099] 使用12%的SDS-PAGE检测蛋白。配方如下：
[0100] 5 %的浓缩胶：
[0101] H2O 1.4ml 30%Acr-Bis (29： I) ().33ml IMTris-IIC!, pi 16.8 0.25m! 10% SDS 0.02m! 10%过硫酸铵 0.02ml TI;.M1-；D ().0002ml
[0102] 12%的分离胶：
[0103] H2O 1.6ml 30% Acr-Bis (29: I ) 2ml I.5M I'ris-MCI, pMS.S 1.3ml 10% SDS 0.05ml 10%过硫酸铵 0 05ml TliMliD ().0()02ml
[0104] 检测方法：取40μ1纯化的蛋白样品，加入10μ1蛋白上样缓冲液（5X，购于 TAKARA公司），沸水浴lOmin，上样10 μ 1。结果见图4。
[0105] (4)蛋白浓度测定：
[0106] 使用Bradford蛋白定量检测试剂盒（购于上海生物工程技术有限公司）进行蛋 白质的定量。具体操作如下：
[0107] 取蛋白标样（购于上海生物工程技术有限公司）用PBS稀释成0μg/ml，0.01yg/ ml,0. 02 μ g/ml,0. 04 μ g/ml,0. 06 μ g/ml,0. 08 μ g/ml,0. 10 μ g/ml,0. 15 μ g/ml,0. 20 μ g/ ml等9个梯度；
[0108] 在96孔酶标板中，每孔加入上述稀释后的蛋白标样20 μ 1，每个浓度重复4次， 各孔再加入200 μ I Bradford Reagent，混勾，室温放置IOmin后，用酶标仪（购自Thermo Scientific公司）测定A595读数。
[0109] 绘制标曲（见图7)，计算出样品的蛋白浓度为3mg/ml。
[0110] 实施例5 :几丁质酶活性测定
[0111] (1)胶体几丁质配制：
[0112] 称取5g固体几丁质（通常为类白色粉末或片状，购自Aladdin公司），加入到 250ml三角瓶中，加入100mL的浓盐酸，在磁力搅拌器（78-1型，购自江苏金坛市大中仪器 厂）上搅拌12小时至几丁质完全溶解，将该溶解液加入到预冷的IL无菌水中，于4°C恒温 冰箱（购自青岛海尔公司）中静置12小时，离心收集沉淀，并且用无菌水重悬，再离心，如 此重复7-10次，至重悬液的pH为7. 0,即得到胶体几丁质。
[0113] (2)几丁质酶活性测定：
[0114] 取I. 5ml离心管，加入3 μ 1上述实施例4纯化得到的几丁质酶和150 μ 1上述实施 例5步骤1得到的胶体几丁质，混勾，于40°C恒温水浴锅（型号为SHHW，购自上海东星建材 试验设备有限公司）保温1小时，取出12000rpm离心（离心机型号为Centrifuge 5415D， 购自eppendorf公司）lmin，吸取上清液120 μ 1，加入等体积（120 μ 1)的DNS显色液（1L 溶液：酒石酸钾钠182. 0g，3, 5-二硝基水杨酸6. 3g，氢氧化钠21. 0g，苯酷5. 0g，无水亚硫 酸钠5. Og)，并于100°C反应5min，冷却后，吸取200 μ 1该反应液至干净的96孔酶标板中， 用酶标仪（购自Thermo Scientific公司）测定A54c!读数。上述每组实验设3个平行。
[0115] (3)N_乙酰氨基葡萄糖标准曲线绘制：
[0116] 称取0.05g的N-乙酰氨基葡萄糖固体，加入5ml无菌水，玻璃棒搅拌至固体溶 解，即得浓度为l〇mg/ml的N-乙酰氨基葡萄糖母液，按不同比例稀释（浓度为0. 2mg/ml， 0· 4mg/ml，0. 6mg/ml，0. 8mg/ml，I. 0mg/ml，I. 2mg/ml)，显色反应同上述步骤 2 DNS 显色反 应。绘制标准曲线如图8。
[0117] 酶活力定义：在温度40°C，pH7. 0反应条件下，且底物饱和的情况下，1分钟内该几 丁质酶催化胶体几丁质降解产生Img N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单 位（IU)。
[0118] 经计算得该几丁质酶活力为0.023U。
[0119] 实施例6 :几丁质酶对秀丽隐杆线虫半致死率LC5tl和抑制繁育的测定
[0120] (1)秀丽隐杆线虫的裂解与同步化：
[0121] 用2ml无菌水冲洗有大量受孕的秀丽隐杆线虫成虫的平板，于2ml离心管里静置， 待秀丽隐杆线虫沉入管底，吸去上清，加入2ml无菌水重悬，静置。重复2~3次待秀丽隐 杆线虫清洗干净。加入1ml裂解液（成份：3. 5ml ddH20,0.5ml 5M氢氧化钠 ，Iml 4-6%次 氯酸钠）。待线虫完全溶解，虫卵全部释放后（一般5-10min)，800rpm离心收集虫卵，并用 M9缓冲液（成份：0· 5% (质量体积比，下同）氯化钠，0· 3%磷酸二氢钾，0· 6%磷酸氢二钠， 0. 025%硫酸镁）清洗3~5次，至清洗干净。加入1ml M9重悬，放入20°C孵化。
[0122] (2)秀丽隐杆线虫的培养：
[01 23] 挑取大肠杆菌E. coli 0P50 (Brenner，1974)单菌落，接种于含100 μ g/ml氨节青 霉素 LB液体培养基中，37°C培养12h后，取200 μ 1菌液涂布于NGM固体培养基（成份： (0. 3%氯化钠，0. 25%蛋白胨，1. 5%琼脂粉）灭菌后加入lmg/ml胆固醇（溶解在100%酒 精中）lml，lmol/1 氯化 1? 21ml，lmol/1 硫酸镁 41ml，lmol/1 磷酸钾缓冲液（pH6. 5) 25ml) 平板，将孵化的秀丽隐杆线虫接种于平板上，20°C培养2~3天即可得到L4幼虫。
[0124] (3)半致死率LC50测定：
[0125] 用无菌水冲洗秀丽隐杆线虫L4(见图2秀丽隐杆线虫的生活史中L4 larva)期 的幼虫，静置，除去上清液，加入无菌水清洗至虫体干净，然后用M9缓冲液（1L溶液：氯化 钠5. 0g，磷酸二氢钾3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0. 25g)重悬。取一干净无菌的 96孔板，每孔加入稀释后的不同浓度（浓度为980 μ g/ml，730 μ g/ml，640 μ g/ml，520 μ g/ ml，250 μ g/ml，150 μ g/ml，75 μ g/ml，0 μ g/ml)的几丁质酶 100 μ 1，5 μ I 的 L4 幼虫（约 40 头），每个样品设4个平行。将96孔板用封口膜密封后于20°C放置2d。于倒置光学显微镜 (型号型号XSD-1B，购自Olympus公司）下观察，不能活动的线虫记为死亡。选择合适的浓 度梯度绘制出完整的致死率曲线（图9)，并通过图表计算出LC 5tl为387. 3±31. 7 μ g/ml。
[0126] (4)抑制繁育测定：
[0127] 取一干净无菌的96孔板，每孔加入稀释后的不同浓度（浓度为150 μ g/ml， 100 μ g/ml，75 μ g/ml，50 μ g/ml，30 μ g/ml，0 μ g/ml)的几丁质酶 100 μ 1，5 μ 1 的 L4 幼虫 (3~5头），5 μ 1的大肠杆菌E. coli 0P50 (于PBS中重悬，至终OD6tltl~0. 6)，每个样品设 4个平行。将96孔板用封口膜密封后于20°C放置2d。于倒置显微镜（型号XSD-1B，购自 Olympus公司）下观察，计数幼虫的孵化数。选择合适的浓度梯度绘制出完整的繁育抑制曲 线（图10)。并通过计算得出半抑制浓度IC 5tl为106. 1 ±4. 3 μ g/ml。
[0128] 实施例7 :几丁质酶对秀丽隐杆线虫的幼虫生长抑制的测定以及对虫卵和角质层 的降解测定
[0129] (1)对秀丽隐杆线虫幼虫生长抑制的测定：
[0130] 如上所述（实施例6步骤1)收集的秀丽隐杆线虫虫卵，重悬于Iml M9缓冲液 (1L溶液：氯化钠5. Og，磷酸二氢钾3. Og，磷酸氢二钠6. Og，七水合硫酸镁0. 25g)中，置于 20°C恒温培养箱（购自天津市泰斯特仪器有限公司）保温ld，待虫卵孵化得到Ll幼虫。 取一干净无菌的96孔板，每孔加入稀释后的不同浓度（300 μ g/ml，250 μ g/ml，200 μ g/ml， 150 μ g/ml，100 μ g/ml，50 μ g/ml，0 μ g/ml)的几 丁质酶 100 μ 1，5 μ I 的 LI 幼虫（约 40 头），5μ1的大肠杆菌E. coli 0P50(于PBS中重悬，至终0D6QQ~0. 6)，每个样品设4个平 行。将96孔板用封口膜密封后于20°C放置2d。于扫描显微镜（型号为1X73,购自Olympus 公司）40X下拍摄线虫图片（见图11中的A图）。
[0131] (2)对虫卵的降解测定：
[0132] 如上所述（实施例6步骤1)收集的秀丽隐杆线虫虫卵，重悬于M9缓冲液（1L溶 液：氯化钠5. 0g，磷酸二氢钾3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0. 25g)中，取一干净无 菌的96孔板，每孔加入100 μ 1 200 μ g/ml的几丁质酶，5 μ 1虫卵（约40粒），置于20°C 保温，分别在4小时和8小时取样观察，并且用扫描显微镜（型号为1X73,购自Olympus公 司）40X下拍摄虫卵图片（见图11中的B图）
[0133] (3)对角质层的降解测定：
[0134] 如上所述（实例6步骤2)收集的秀丽隐杆线虫L4期（见图2秀丽隐杆线虫的 生活史中L4 larva)幼虫，重悬于200 μ I M9缓冲液（1L溶液：氯化钠5. 0g，磷酸二氢钾 3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0. 25g)中，取一干净无菌的96孔板，每孔加入100 μ 1 1000 μ g/ml的几丁质酶，5 μ 1秀丽隐杆线虫虫皮（约40张），置于20°C保温，12小时后取 样观察，并且用扫描显微镜（型号为1X73,购自Olympus公司）40X下拍摄虫卵图片（见图 11中的C图）。
[0135] 主要参考文献
[0136] 1.王治伟等，微生物几丁质酶研宄进展生物技术通讯，2006,17:439-442 ;
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【主权项】
1. 一种分离的对秀丽隐杆线虫具有毒杀作用的编码基因，其特征在于该基因编码的蛋 白质序列如SEQIDNO:2所示。2. -种表达对秀丽隐杆线虫具有毒杀作用的几丁质酶质粒的大肠杆菌（Escherichia coli)DH5a/6p-pachi，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCM2015139,该 菌株的基因组包含SEQIDNO:1所述的编码基因。3. 如权利要求2所述的大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5a/6p_pachi，其特征在于， 该菌株的基因组包含SEQIDNO:1中第l-1452bp所述的编码基因。4. 权利要求1所述的编码基因在制备杀秀丽隐杆线虫制剂中的应用。5. 权利要求2或3所述的大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5a/6p_pachi在制备杀秀 丽隐杆线虫制剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种对秀丽隐杆线虫高毒力的几丁质酶及其编码基因。本发明克隆的基因来源于假单胞菌。本发明包含几丁质酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/6p-pachi保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015139。经过生物学功能验证，证明该杀虫几丁质酶对秀丽隐杆线虫具有毒性，可以通过降解秀丽隐杆线虫的虫卵和角质层来达到毒杀效果。本发明公开了所述几丁质酶在生防线虫方面的应用。CCTCC NO：M201513920150320
【IPC分类】C12R1/19, C12N15/56, A01N63/02, A01P5/00, C12N9/42, C12N1/21
【公开号】CN104894149
【申请号】CN201510124341
【发明人】刘子铎, 陈林, 吴高兵
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月20日
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种对秀丽隐杆线虫高毒力 的几丁质酶及其编码基因。
【背景技术】
[0002] 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)因其遗传背景清楚、个体结构简单、生 活史短、基因组已测序完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类 遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信 号传导等领域得到广泛应用（Kaletta等，2006)。
[0003] 假单胞菌，在其生物代谢过程中能够产生丰富的几丁质酶，能够将生物体内的几 丁质成份水解为寡糖或者单糖，从而为其生长提供所需的能源物质（王治伟等，2006)。 另外，作为根际微生物的的主要群体，假单胞菌被广泛的应用于生物防治中（杨海君等， 2004)。其产生的小分子化合物（如氰化物）以及水解酶类（如丝氨酸蛋白酶）对线虫具 有很强的毒性（Singh等，2010)。
[0004] 几丁质酶，主要有18家族以及19家族两类，其中多数19家族来自于植物，而18 家族广泛的存在于各类生物中（Henrissat等，1993)。几丁质酶主要由典型的催化区以及 结合区两部分组成，也有少数来自真菌的几丁质酶仅由催化区构成。几丁质酶可以水解几 丁质产生几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖，且广泛存在于自然界的生物中，在生物防治中发 挥着重要的作用。
[0005] 几丁质，是由N-乙酰-β-D氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接起来的直链多聚 物，是最丰富的天然高分子化合物之一，广泛分布于动物、植物及微生物体内。有研宄表明 几丁质是线虫虫卵以及角质层的重要组成成份，在线虫的生长和繁殖中扮演着至关重要的 角色。将一定量的几丁质或者壳聚糖施入土壤中，能够诱发大量可利用该物质的菌体繁殖 生长，从而有效的控制植物病虫害的传播（Radwan等，2011)。
[0006] 目前，关于几丁质酶的作用部位及作用机理报道的不多。有研宄表明，几丁质酶能 够溶解真菌的细胞壁，参与孢子的萌发、细胞自溶以及孢子的形成，并且可以协助某些真菌 寄生侵染宿主。另外，几丁质酶可以水解昆虫中肠围食膜上的几丁质，形成穿孔从而导致 围食膜成型延迟，为其他肠道内毒素如晶体蛋白提供通道，协同提高杀虫活性（Smirnoff， 1974)。对于线虫的影响，本发明表明，几丁质酶可以水解线虫的卵壳和角质层，从而破坏线 虫的组织结构，导致内溶物外渗。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了一种对秀丽隐杆线虫（野生型N2,下同）具有高毒力 的几丁质酶及其编码基因，该基因是通过设计引物从铜绿假单胞菌基因组中直接克隆得到 的。基因全长1452bp (如序列表SEQ ID N0:1中l-1452b碱基对应的序列所示），编码483 个氨基酸（其编码的蛋白质如序列表SEQ ID NO: 2所示）。该基因测序结果经Genbank数 据库中的BLASTN进行比对，发现其与铜绿假单胞菌的几丁质酶基因亲缘关系最近，表明该 基因最有可能是一个几丁质酶基因。收集已报道的杀线虫几丁质酶构建进化树分析，与该 基因编码的氨基酸序列相似性最高也只有40%，证明该基因是一个新的杀线虫基因。
[0008] 将该杀秀丽隐杆线虫基因克隆到pGEX-6p_l表达载体（购自美国GE Healthcare 公司）上，作为重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(购自Invitrogen 公司），经诱导表达得到大小为79. OkDa的融合蛋白，纯化除去GST标签后得到大小为 53. OkDa的纯蛋白。并将该蛋白用于生测秀丽隐杆线虫，结果表明：其半致死浓度LC5tl为 387. 3±3L 7μg/ml。
[0009] 为了实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：
[0010] 本发明从华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏的菌株（分离时间： 2012年9月；分离地点：湖北省武汉市华中农业大学狮子山）中筛选得到一株对秀丽隐杆 线虫具有高毒力的候选菌株（实验室保藏编号为0364)。
[0011] 抽提该候选菌株的基因组DNA，并以之作为模板，用16S通用引物 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和 27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)进行 PCR 扩增，经 鉴定该菌株最有可能为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。
[0012] 将该菌株的活性成份分别进行酸碱以及热处理，初步推断该活性成份最有可能是 蛋白类物质。
[0013] 将该原始菌株分别接种到LMZ培养基（成份：0.2% (质量体积比）明胶，0.8%蛋 白胨，0. 1 %酵母提取物，0. 05%硫酸铵，0. 001 %硫酸亚铁，0. 05%硫酸镁，pH7. 0)、几丁质 培养基（成份：〇. 5%蛋白胨，0. 25%酵母提取物，0. 5%氯化钠，0. 2%胶体几丁质，pH7. 0)、 牛奶培养基（成份：〇. 5%蛋白胨，0. 25%酵母提取物，0. 5%氯化钠，1 %脱脂奶粉，pH7. 0)， 培养2d后发酵液用于生测秀丽隐杆线虫，推测该菌株产生的几丁质酶与杀线虫具有一定 的关系。
[0014] 在NCBI的基因组数据库中找到铜绿假单胞菌中的几丁质酶基因，设计引物从该 菌株的基因组DNA中克隆得到了全长1452bp的目的基因（核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示），并且将该基因装载到表达载体pGEX-6p-l上，得到重组载体pGEX-6p-pachi转化大肠 杆菌BL21 (DE3)，经诱导表达，纯化，得到了目的蛋白。我们将该蛋白命名为pachi，其蛋白 质的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0015] 将重组载体pGEX_6p_pachi转化大肠杆菌（Escherichia coli)DH5 α，我们将得 到重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌DH5 a /6p_pachi，Escherichia coli DH5 a /6p_pachi， 于2015年03月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏 号为 CCTCC NO :M2015139。
[0016] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》的内容。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQ ID N0:1是本发明克隆得到的对秀丽隐杆线虫具有高毒力的几丁 质酶基因的核苷酸序列（l_1452bp的碱基对应的序列所示）及其对应的氨基酸序列 (l-1452bp)，其中第l-1452bp为编码区即CDS)。
[0018] 序列表SEQ ID NO: 2是本发明的高毒力几丁质酶基因编码的蛋白质序列，分子量 为 53. OkDa。
[0019] 图1:本发明技术流程图。
[0020] 图2 :线虫生命周期示意图。
[0021] 图3 :线虫死亡鉴定图。其中图3中A图为活线虫显微图片；图3中B图为死亡线 虫显微图片。
[0022] 图4 :原始质粒pGEX-6p_l图谱。
[0023] 图5 :本发明构建的重组质粒pGEX-6p_pachi图谱。
[0024] 图6 :几丁质酶pachi表达及纯化的SDS-PAGE分析图。对图6中各泳道的说明： 泳道M是蛋白标样（购于Fermentas公司，大小范围为14. 4-116kDa);泳道1是大肠杆菌 DE3/pGEX-6p-l未诱导破细胞上清液；泳道2是大肠杆菌DE3/pGEX-6p-l诱导破细胞上清 液；泳道3是大肠杆菌DE3/pGEX-6p-pachi未诱导破细胞上清液；泳道4是大肠杆菌DE3/ pGEX-6p-pachi诱导破细胞上清液；泳道5是纯化并切除GST标签后的pachi蛋白液。
[0025] 图7 :标准蛋白浓度曲线。
[0026] 图8 :N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。
[0027] 图9 :几丁质酶pachi对秀丽隐杆线虫致死率。
[0028] 图10 :几丁质酶pachi抑制秀丽隐杆线虫繁殖示意图。
[0029] 图11 :几丁质酶pachi对秀丽隐杆线虫生长影响、虫卵和角质层降解示意图。其中 图11中A图是几丁质酶pachi对秀丽隐杆线虫生长影响；图11中B图是几丁质酶pachi 降解秀丽隐杆线虫虫卵的示意图；图11中C图是几丁质酶pachi降解秀丽隐杆线虫角质层 的示意图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1 :高毒力菌株筛选
[0031] 将本实验室保藏的菌株（分离时间：2012年9月；分离地点：湖北省武汉市华中 农业大学狮子山）分别划线接种得到LB(培养基成份：1% (质量体积比，下同）蛋白胨， 0. 5%酵母提取物，1 %氯化钠，1. 5%琼脂粉）平板上，于37°C恒温培养箱培养12-14小时 后，平板长出单菌落，挑取单菌落接种到液体LB培养基（成份：1% (质量体积比，下同） 蛋白胨，0. 5 %酵母提取物，1 %氯化钠），37°C培养两天后，按不同稀释倍数（I X，3 X，5 X， IOX，20 X)稀释。
[0032] 将培养好的秀丽隐杆线虫（培养方法见实施例6步骤2)用无菌水冲洗，静置，除 去上清液，加入无菌水清洗至虫体干净，然后用M9缓冲液（1L溶液：氯化钠5. Og，磷酸二氢 钾3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0.25g)重悬，得到线虫液。取一干净无菌的96孔 板，每孔加入上述不同稀释倍数的培养液100 μ 1，同时加入5 μ 1的秀丽隐杆线虫液（约40 条），设三个平行实验。并且以大肠杆菌Ε. coli 0Ρ50 (Brenner，1974)作为阴性对照（生测 方法同上），用封口膜将96孔板密封，于20°C培养两天后，在倒置显微镜（型号XSD-1B，购 自Olympus公司）下观察，线虫僵直的为死亡的线虫（如图3所示）。
[0033] 从本实验室（分离时间：2012年9月 ；分离地点：湖北省武汉市华中农业大学狮子 山）保藏的300株菌株中筛选得到6株对秀丽隐杆线虫具有高毒力（结果见下表1)的菌 株（编号分别为 0364, 2258, CL4, F39-2, J3-4, J3-15)。
[0034] 表1 6株候选菌株对秀丽隐杆线虫毒杀效果
[0035]
[0036] 实施例2 :活性物质的分类判定
[0037] 将上述实施例1中筛选得到的6株菌株分别接种到液体LB培养基（成份见实施 例ILB液体培养基），37°C培养两天后，制备细胞破碎液：在I. 5ml的离心管中加入1ml的培 养液（〇D6(KI~1. 2)，12000rpm离心lmin，将上清液转移至另外一个干净的I. 5ml离心管作 为发酵上清液，菌体用400 μ I PBS缓冲液（pH7. 4, HOmM氯化钠，2. 7mM氯化钾，10.0 mM磷 酸氢二钠，I. 8mM磷酸氢二钾）重悬，于超声波破碎仪（JY92- II DN，购自宁波东芝生物科技 股份有限公司）中破碎细胞，得到细胞破碎液。按实施例1生测方法，分别用发酵上清液和 细胞破碎液生测线虫。结果如下表2。
[0038] 表2候选菌株发酵液上清和细胞破碎液对秀丽隐杆线虫毒杀效果
[0039]
[0041] 依据上述表2,分别收集各菌株中对秀丽隐杆线虫具有较高的活性的成份（如 0364菌株的细胞破碎液，2258菌株的发酵液上清，其他菌株相同）。
[0042] 将上述收集的各活性成份分别进行热处理：各活性成份分别于恒温水浴锅（型号 SHHW，购自上海东星建材试验设备有限公司）中60°C和100°C处理lOmin，然后取出在冰上 冷却，生测线虫（生测方法同实施例1)，结果如下表3,因此选择活性成份对秀丽隐杆线虫 致死率高且对温度敏感的菌株（编号为0364)进行酸碱处理，并将该菌株作为候选菌株。
[0043] 表3温度处理对各活性成份活性的影响
[0044]
[0045] 酸碱处理：候选菌株的细胞破碎液分别用lmol/L盐酸和lmol/L氢氧化钠调整pH 为（3,4,5,6,7,8,9，10，11)，然后放到4°〇冰箱（购自青岛海尔公司）处理1211后分别用 lmol/L盐酸和lmol/L氢氧化钠调pH至中性，生测线虫（生测方法同实施例1)。结果如下 表4。
[0046] 表4酸碱处理对候选菌株细胞破碎液活性影响
[0047]
[0048] 候选菌株（编号0364)其活性成份（细胞破碎液）经过热处理和酸碱处理，发现 该活性成份对温度及酸碱都比较敏感，初步推测该活性物质极有可能是蛋白类物质。
[0049] 另外，将候选菌株（编号0364)分别接种到LMZ培养基（成份：0· 2% (质量体积 比）明胶，0. 8 %蛋白胨，0. 1 %酵母提取物，0. 05 %硫酸铵，0. 001 %硫酸亚铁，0. 05 %硫酸 镁，pH 7.0)、几丁质培养基（成份：0.5%蛋白胨，0.25%酵母提取物，0.5%氯化钠，0.2% 胶体几丁质，pH 7.0)和牛奶培养基（成份：0.5%蛋白胨，0.25%酵母提取物，0.5%氯化 钠，1 %脱脂奶粉，PH 7.0)，37°C培养两天后，依据上述细胞破碎液制备方法，得到各培养基 培养的细菌的细胞破碎液，并且稀释不同倍数（1X，2X)，生测线虫（生测方法同实施例 1)。结果见表5。该候选菌株（编号0364)生长在几丁质培养基中，对秀丽隐杆线虫具有更 高的致死率。因此，推断该菌株产生的几丁质酶可能参与了菌株对线虫的侵染过程。
[0050] 表5不同培养基培养对候选菌株活性的影响
[0051]
[0052] 实施例3 :候选菌株的鉴定及目的基因的克隆
[0053] (1)候选菌株总DNA的提取：
[0054] 将该候选菌株（编号0364)，接种到液体LB培养基（成份见实施例1LB液体培养 基），37°C培养2d后，取2ml的菌液于离心管中，收集菌体；
[0055] 用 200 μ I TE buffer (配方：50mmol/Tris-HCl ρΗ8· 0,10mmol/L EDTA，调 pH 至 8. 0)重悬菌体，并且加入50 μ I 100 μ g/ml溶菌酶（该溶菌酶购自Sigma公司），37°C水浴 Ih ；
[0056] 加入500 μ 1细菌裂解液（裂解液成份：20% (质量体积比，下同）十二烷基磺酸 钠（SDS) ,5%乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na), 5%醋酸钠（NaAc)，3%柠檬酸钠，5% (体积：体 积，下同）1'1^〇1^-100,5%了￥661120,50%1'1^8-(：1(501111))，70°〇水浴1011^11后，取出于4°〇 冷却，加入150 μ I 5mol/L氯化钠溶液；
[0057] 加入等体积的酷：氯仿：异戊醇（体积比为25 :24 :1)，混勾，12000rpm离心10min， 取上清，重复这一步骤2次；
[0058] 取上清液，加入2/3体积的异丙醇轻轻混匀，于-20°C静置30min，12000rpm离心 IOmin ；
[0059] 弃上清，保留沉淀，加入70%的乙醇洗涤2次，于室温干燥后，溶于50 μ I CldH2O 中，保存于-40 °C备用。
[0060] (2)候选菌株的16S基因扩增：
[0061] 以步骤1提取的细菌总DNA为模板，采用16S通用引物 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和 27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)进行扩增，
[0062] PCR体系如下：
[0063] I () X PCR biiiVcr (购厂 ΤΛΚΛΤΛ 公 I I'J) 5μ1 dN 丁Ps ( IOniM 购 Γ. ΤΛΚΛΤΛ 公 m'J ) ΙμL Taq DNA聚合酶（购于TAKATA公司） ΙμL 模板（上述步骤1提取的候选菌株的总DNA ) 1 μL 1492R 引物 ΙμL 27F 引物 ΙμL 加 CldH2O 个 5()μ[。
[0064] PCR 条件：94°C预变性 4min ;94°C，30s ;52°C，30s ;72°C，90s，30 个循环；72°C延伸 lOmin，15°C，5min〇
[0065] 将PCR产物用胶回收试剂盒（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司）纯化 后，于博洪生物科技有限公司测序，结果经Blast比对得知，该候选菌株与Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌）亲缘关系最近。
[0066] (3)目的基因扩增：
[0067] 根据NCBI Genebank数据库公布的铜绿假单胞菌chitinase基因的核苷酸序列 (Accession Number ：CP006831)设计引物，ιΗ向引物 F(5-CCGGAATTCATGATCAGGATCGACTTTT CCCAGTTGCA-3)，包含EcoR I酶切位点（见正向引物F的下划线部分）；反向引物R(5-CC GCTCGAGTCAGCGCAGCGGCCGCC-3)，包含Xho I酶切位点（见反向引物R的下划线部分）。引 物由博洪生物科技有限公司合成。
[0068] PCR 扩增
[0069] PCR 体系：
[0070] I (i X PCR bull'cr (购 Γ· ΤΛΚΛΤΛ 公 i I'J ) 5μ1 dNTPs UOmM 购于 TAKATA 公司） ΙμL Taq DNA聚合酶（购于TAKATA公司） 1 μL 模板（上述提取的总DNA) ΙμL 正向引物F(IOpM) ΙμL 反向引物ΙΙ(1〇μΜ) ΙμL 加 ddH2〇 至 50μ1。
[0071] PCR 条件：94°C预变性 4min ;94°C，30s ;60°C，30s ;72°C，90s，30 个循环；72°C延伸 lOmin，15 °C，5min〇
[0072] 将PCR产物用胶回收试剂盒（购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司）纯化 后，于博洪生物科技有限公司测序，结果经Blast比对得知，该基因与来自Pseudomonas aeruginosa的几丁质酶基因亲缘关系最近，该基因的DNA序列全长为1452bp，以AUG为起 始密码子，终止密码子为UGA，编码483个氨基酸，并且将该几丁质酶命名为pachi。该几丁 质酶属于糖基水解酶18家族，含有典型的催化区CHA，连接区FN3,结合区CBD。与其它已报 道的杀线虫几丁质酶的氨基酸序列相比，最高只有40%的相似性（见表6)，表明该基因是 一个新的杀线虫几丁质酶。
[0073] 表6 pachi与已报道杀线虫几丁质酶同源性
[0074]
[0075] (4) PCR 产物及质粒 pGEX-6p-l 酶切：
[0076] 酶切选用EcoR I -Xho I (均购于TAKARA)双酶切体系，酶切体系如下：酶切缓 冲液10 μ I ;EcoR I，3 μ I ;Xho I，3 μ I ;PCR纯化产物（约3 μ g);加水至100 μ 1。混匀于 37°C水浴12h后，用胶回收试剂盒纯化。质粒pGEX-6p-l酶切体系和条件同上。
[0077] (5)酶切片段与载体连接：
[0078] 连接体系：5X连接酶缓冲液（购于TAKARA公司），2 μ 1 ;双酶切PCR产物， 3 μ 1 (约200ng);双酶切载体，1 μ 1 (约40ng) ;Τ4连接酶，0· 5 μ 1 ;加水至10 μ 1。混勾后， 16 °C保温过夜。
[0079] (6)重组质粒转化大肠杆菌E. coli DH5 α :
[0080] 取酶连产物ΙμL与50μ1大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5a混匀，吸入预 冷的Imm电转杯（购自BIO-RAD公司）中，电击转化（电压12. 5kv/cm)(电转仪型号 MicroPulser，购自BIO-RAD公司）， 加入500 μ I LB液体培养基（成份见实施例1LB液体 培养基），37°C复苏lh，涂布于含lOOμg/ml氨苄青霉素 LB平板，37°C保温14h后，挑取长 出的单菌落，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB液体培养基（成份见实施例1LB液体培养 基）中，37°C培养12h。
[0081] (7)质粒抽提：
[0082] 取一 2ml的离心管，收集2ml菌液，离心取菌体；
[0083] 用 250 μ 1 溶液 I (25mM Tris-Cl (ρΗ8· 0)，IOmM 乙二胺四乙酸，50mM葡萄糖）重悬 菌体，加入250 μ 1溶液II (200mM氢氧化钠，1% (质量体积比）十二烷基磺酸钠（SDS))，上 下颠倒2~3次，加入350 μ 1溶液III (3M醋酸钾，5M醋酸），混勾，12000rpm离心10min，取 上清液，加入2/3体积的异丙醇轻轻混勾，于-20°C静置30min，12000rpm离心10min ;弃上 清，保留沉淀，加入70%的乙醇洗涤2次，于室温干燥后，溶于50 μ I CldH2O中，保存于-20°C 备用。
[0084] (8)重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3):
[0085] 取抽提好的质粒1 μ 1与30 μ 1大肠杆菌感受态细胞E. coli BL21 (DE3)混匀，吸 入预冷的Imm电转杯（购自BIO-RAD公司）中，电击转化（电压12. 5kv/cm)(电转仪型号 MicroPulser，购自BIO-RAD公司），加入500 μ I LB液体培养基（成份见实施例1LB液体 培养基），涂布于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB平板（成份见实施例1LB平板），37°C保温 14h后，挑取长出的单菌落，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB液体培养基中（成份见实 施例ILB液体培养基），37°C培养ia后，取800 μ 1菌液与灭菌的甘油200 μ 1混勾，保存 于-80。。。
[0086] (9)菌株的微生物学特征：
[0087] 上述步骤6得到的大肠杆菌，为两段钝圆的短小杆菌，大小0. 5Χ 1~3微米，周身 长有鞭毛，能够运动，不能够产生芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。菌落 表面光滑，凸出，不透明，为圆形菌落。将该大肠杆菌DH5α/6p-pachi，Escherichiacoli DH5a/6p-pachi于2015年03月20日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO :M2015139。
[0088] 实施例4 :蛋白的诱导、表达、纯化及分析
[0089] (1)重组蛋白的表达：
[0090] 挑取上述实施例3步骤8转化长出的单菌落，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素 LB 液体培养基（成份见实施例1LB液体培养基）中，37°C培养12h后，以1% (体积：体积） 的接种量至IL含100 y g/ml氨苄青霉素 LB液体培养基（成份见实施例1LB液体培养基） 中，37°C培养2~3h，待0D_达到0. 6,加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)至终浓度 为0.1 mM，18°C诱导12h后。离心收集菌体，用PBS缓冲液（成份见实施例2 PBS缓冲液） 洗涤2~3次，再用50ml PBS重悬，然后用高压细胞破碎仪（购自美国THERMO公司）破碎 细胞。破碎液于4°C、12000rpm/min离心10min (离心机型号Avanti J-E，购自BACKMAN公 司），取上清液，重复上述离心2~3次。收集上清液，用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
[0091] (2)蛋白的纯化：
[0092] 利用GST亲和纯化系统纯化目的蛋白，具体操作步骤如下（所有操作均在4°C进 行）：
[0093] 装柱：取 Iml 柱材料 GSH Sepharose 4B (购于 Amersham-Pharmacia 公司）于层析 柱中，用5个柱体积的PBS缓冲液洗脱，至酒精清洗干净，活化柱材料；
[0094] 结合：将细胞破碎液上清缓缓加入柱子中，柱子流速控制在0. 5ml/min ;
[0095] 洗脱：用预冷（4°C )的PBS缓冲液（成份见实施例2 PBS缓冲液）洗脱杂蛋白， 柱子流速控制在lml/min。用Bradford试剂（购于上海生物工程技术有限公司）检测杂蛋 白洗脱情况；
[0096] 酶解：取10 μ 1浓度为IOunit/ μ 1的3C蛋白酶（购于Pharmacia公司）与Iml 的PBS缓冲液混勾，加入层析柱，于4°C酶解16h ;
[0097] 收集蛋白：收集酶解后的蛋白于I. 5ml的离心管中。
[0098] (3)纯化蛋白的检测：
[0099] 使用12%的SDS-PAGE检测蛋白。配方如下：
[0100] 5 %的浓缩胶：
[0101] H2O 1.4ml 30%Acr-Bis (29： I) ().33ml IMTris-IIC!, pi 16.8 0.25m! 10% SDS 0.02m! 10%过硫酸铵 0.02ml TI;.M1-；D ().0002ml
[0102] 12%的分离胶：
[0103] H2O 1.6ml 30% Acr-Bis (29: I ) 2ml I.5M I'ris-MCI, pMS.S 1.3ml 10% SDS 0.05ml 10%过硫酸铵 0 05ml TliMliD ().0()02ml
[0104] 检测方法：取40μ1纯化的蛋白样品，加入10μ1蛋白上样缓冲液（5X，购于 TAKARA公司），沸水浴lOmin，上样10 μ 1。结果见图4。
[0105] (4)蛋白浓度测定：
[0106] 使用Bradford蛋白定量检测试剂盒（购于上海生物工程技术有限公司）进行蛋 白质的定量。具体操作如下：
[0107] 取蛋白标样（购于上海生物工程技术有限公司）用PBS稀释成0μg/ml，0.01yg/ ml,0. 02 μ g/ml,0. 04 μ g/ml,0. 06 μ g/ml,0. 08 μ g/ml,0. 10 μ g/ml,0. 15 μ g/ml,0. 20 μ g/ ml等9个梯度；
[0108] 在96孔酶标板中，每孔加入上述稀释后的蛋白标样20 μ 1，每个浓度重复4次， 各孔再加入200 μ I Bradford Reagent，混勾，室温放置IOmin后，用酶标仪（购自Thermo Scientific公司）测定A595读数。
[0109] 绘制标曲（见图7)，计算出样品的蛋白浓度为3mg/ml。
[0110] 实施例5 :几丁质酶活性测定
[0111] (1)胶体几丁质配制：
[0112] 称取5g固体几丁质（通常为类白色粉末或片状，购自Aladdin公司），加入到 250ml三角瓶中，加入100mL的浓盐酸，在磁力搅拌器（78-1型，购自江苏金坛市大中仪器 厂）上搅拌12小时至几丁质完全溶解，将该溶解液加入到预冷的IL无菌水中，于4°C恒温 冰箱（购自青岛海尔公司）中静置12小时，离心收集沉淀，并且用无菌水重悬，再离心，如 此重复7-10次，至重悬液的pH为7. 0,即得到胶体几丁质。
[0113] (2)几丁质酶活性测定：
[0114] 取I. 5ml离心管，加入3 μ 1上述实施例4纯化得到的几丁质酶和150 μ 1上述实施 例5步骤1得到的胶体几丁质，混勾，于40°C恒温水浴锅（型号为SHHW，购自上海东星建材 试验设备有限公司）保温1小时，取出12000rpm离心（离心机型号为Centrifuge 5415D， 购自eppendorf公司）lmin，吸取上清液120 μ 1，加入等体积（120 μ 1)的DNS显色液（1L 溶液：酒石酸钾钠182. 0g，3, 5-二硝基水杨酸6. 3g，氢氧化钠21. 0g，苯酷5. 0g，无水亚硫 酸钠5. Og)，并于100°C反应5min，冷却后，吸取200 μ 1该反应液至干净的96孔酶标板中， 用酶标仪（购自Thermo Scientific公司）测定A54c!读数。上述每组实验设3个平行。
[0115] (3)N_乙酰氨基葡萄糖标准曲线绘制：
[0116] 称取0.05g的N-乙酰氨基葡萄糖固体，加入5ml无菌水，玻璃棒搅拌至固体溶 解，即得浓度为l〇mg/ml的N-乙酰氨基葡萄糖母液，按不同比例稀释（浓度为0. 2mg/ml， 0· 4mg/ml，0. 6mg/ml，0. 8mg/ml，I. 0mg/ml，I. 2mg/ml)，显色反应同上述步骤 2 DNS 显色反 应。绘制标准曲线如图8。
[0117] 酶活力定义：在温度40°C，pH7. 0反应条件下，且底物饱和的情况下，1分钟内该几 丁质酶催化胶体几丁质降解产生Img N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单 位（IU)。
[0118] 经计算得该几丁质酶活力为0.023U。
[0119] 实施例6 :几丁质酶对秀丽隐杆线虫半致死率LC5tl和抑制繁育的测定
[0120] (1)秀丽隐杆线虫的裂解与同步化：
[0121] 用2ml无菌水冲洗有大量受孕的秀丽隐杆线虫成虫的平板，于2ml离心管里静置， 待秀丽隐杆线虫沉入管底，吸去上清，加入2ml无菌水重悬，静置。重复2~3次待秀丽隐 杆线虫清洗干净。加入1ml裂解液（成份：3. 5ml ddH20,0.5ml 5M氢氧化钠 ，Iml 4-6%次 氯酸钠）。待线虫完全溶解，虫卵全部释放后（一般5-10min)，800rpm离心收集虫卵，并用 M9缓冲液（成份：0· 5% (质量体积比，下同）氯化钠，0· 3%磷酸二氢钾，0· 6%磷酸氢二钠， 0. 025%硫酸镁）清洗3~5次，至清洗干净。加入1ml M9重悬，放入20°C孵化。
[0122] (2)秀丽隐杆线虫的培养：
[01 23] 挑取大肠杆菌E. coli 0P50 (Brenner，1974)单菌落，接种于含100 μ g/ml氨节青 霉素 LB液体培养基中，37°C培养12h后，取200 μ 1菌液涂布于NGM固体培养基（成份： (0. 3%氯化钠，0. 25%蛋白胨，1. 5%琼脂粉）灭菌后加入lmg/ml胆固醇（溶解在100%酒 精中）lml，lmol/1 氯化 1? 21ml，lmol/1 硫酸镁 41ml，lmol/1 磷酸钾缓冲液（pH6. 5) 25ml) 平板，将孵化的秀丽隐杆线虫接种于平板上，20°C培养2~3天即可得到L4幼虫。
[0124] (3)半致死率LC50测定：
[0125] 用无菌水冲洗秀丽隐杆线虫L4(见图2秀丽隐杆线虫的生活史中L4 larva)期 的幼虫，静置，除去上清液，加入无菌水清洗至虫体干净，然后用M9缓冲液（1L溶液：氯化 钠5. 0g，磷酸二氢钾3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0. 25g)重悬。取一干净无菌的 96孔板，每孔加入稀释后的不同浓度（浓度为980 μ g/ml，730 μ g/ml，640 μ g/ml，520 μ g/ ml，250 μ g/ml，150 μ g/ml，75 μ g/ml，0 μ g/ml)的几丁质酶 100 μ 1，5 μ I 的 L4 幼虫（约 40 头），每个样品设4个平行。将96孔板用封口膜密封后于20°C放置2d。于倒置光学显微镜 (型号型号XSD-1B，购自Olympus公司）下观察，不能活动的线虫记为死亡。选择合适的浓 度梯度绘制出完整的致死率曲线（图9)，并通过图表计算出LC 5tl为387. 3±31. 7 μ g/ml。
[0126] (4)抑制繁育测定：
[0127] 取一干净无菌的96孔板，每孔加入稀释后的不同浓度（浓度为150 μ g/ml， 100 μ g/ml，75 μ g/ml，50 μ g/ml，30 μ g/ml，0 μ g/ml)的几丁质酶 100 μ 1，5 μ 1 的 L4 幼虫 (3~5头），5 μ 1的大肠杆菌E. coli 0P50 (于PBS中重悬，至终OD6tltl~0. 6)，每个样品设 4个平行。将96孔板用封口膜密封后于20°C放置2d。于倒置显微镜（型号XSD-1B，购自 Olympus公司）下观察，计数幼虫的孵化数。选择合适的浓度梯度绘制出完整的繁育抑制曲 线（图10)。并通过计算得出半抑制浓度IC 5tl为106. 1 ±4. 3 μ g/ml。
[0128] 实施例7 :几丁质酶对秀丽隐杆线虫的幼虫生长抑制的测定以及对虫卵和角质层 的降解测定
[0129] (1)对秀丽隐杆线虫幼虫生长抑制的测定：
[0130] 如上所述（实施例6步骤1)收集的秀丽隐杆线虫虫卵，重悬于Iml M9缓冲液 (1L溶液：氯化钠5. Og，磷酸二氢钾3. Og，磷酸氢二钠6. Og，七水合硫酸镁0. 25g)中，置于 20°C恒温培养箱（购自天津市泰斯特仪器有限公司）保温ld，待虫卵孵化得到Ll幼虫。 取一干净无菌的96孔板，每孔加入稀释后的不同浓度（300 μ g/ml，250 μ g/ml，200 μ g/ml， 150 μ g/ml，100 μ g/ml，50 μ g/ml，0 μ g/ml)的几 丁质酶 100 μ 1，5 μ I 的 LI 幼虫（约 40 头），5μ1的大肠杆菌E. coli 0P50(于PBS中重悬，至终0D6QQ~0. 6)，每个样品设4个平 行。将96孔板用封口膜密封后于20°C放置2d。于扫描显微镜（型号为1X73,购自Olympus 公司）40X下拍摄线虫图片（见图11中的A图）。
[0131] (2)对虫卵的降解测定：
[0132] 如上所述（实施例6步骤1)收集的秀丽隐杆线虫虫卵，重悬于M9缓冲液（1L溶 液：氯化钠5. 0g，磷酸二氢钾3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0. 25g)中，取一干净无 菌的96孔板，每孔加入100 μ 1 200 μ g/ml的几丁质酶，5 μ 1虫卵（约40粒），置于20°C 保温，分别在4小时和8小时取样观察，并且用扫描显微镜（型号为1X73,购自Olympus公 司）40X下拍摄虫卵图片（见图11中的B图）
[0133] (3)对角质层的降解测定：
[0134] 如上所述（实例6步骤2)收集的秀丽隐杆线虫L4期（见图2秀丽隐杆线虫的 生活史中L4 larva)幼虫，重悬于200 μ I M9缓冲液（1L溶液：氯化钠5. 0g，磷酸二氢钾 3. 0g，磷酸氢二钠6g，七水合硫酸镁0. 25g)中，取一干净无菌的96孔板，每孔加入100 μ 1 1000 μ g/ml的几丁质酶，5 μ 1秀丽隐杆线虫虫皮（约40张），置于20°C保温，12小时后取 样观察，并且用扫描显微镜（型号为1X73,购自Olympus公司）40X下拍摄虫卵图片（见图 11中的C图）。
[0135] 主要参考文献
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【主权项】
1. 一种分离的对秀丽隐杆线虫具有毒杀作用的编码基因，其特征在于该基因编码的蛋 白质序列如SEQIDNO:2所示。2. -种表达对秀丽隐杆线虫具有毒杀作用的几丁质酶质粒的大肠杆菌（Escherichia coli)DH5a/6p-pachi，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCM2015139,该 菌株的基因组包含SEQIDNO:1所述的编码基因。3. 如权利要求2所述的大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5a/6p_pachi，其特征在于， 该菌株的基因组包含SEQIDNO:1中第l-1452bp所述的编码基因。4. 权利要求1所述的编码基因在制备杀秀丽隐杆线虫制剂中的应用。5. 权利要求2或3所述的大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5a/6p_pachi在制备杀秀 丽隐杆线虫制剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于农业微生物基因工程技术领域，具体涉及一种对秀丽隐杆线虫高毒力的几丁质酶及其编码基因。本发明克隆的基因来源于假单胞菌。本发明包含几丁质酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/6p-pachi保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015139。经过生物学功能验证，证明该杀虫几丁质酶对秀丽隐杆线虫具有毒性，可以通过降解秀丽隐杆线虫的虫卵和角质层来达到毒杀效果。本发明公开了所述几丁质酶在生防线虫方面的应用。CCTCC NO：M201513920150320
【IPC分类】C12R1/19, C12N15/56, A01N63/02, A01P5/00, C12N9/42, C12N1/21
【公开号】CN104894149
【申请号】CN201510124341
【发明人】刘子铎, 陈林, 吴高兵
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月20日
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