天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用
天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶（SiPAL)基因 及其编码产物和应用。
【背景技术】
[0002] 天山雪莲（Saussurea involucrata)系菊科风毛菊属植物，主产于新疆天山、昆仑 山，生长在雪线以上，民间以全草入药，具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效，用于治 疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳瘘等疾患 [1]。由于天山雪莲生长环境特异、 人工栽培困难，雪莲细胞成为天山雪莲的替代品之一。雪莲细胞中主要含有紫丁香苷等木 质素类成分 [2_4]，其生物合成途径的第一个关键酶就是苯丙氨酸解氨酶。苯丙氨酸解氨酶 (Phenylalanin ammonia-lyase，PAL)为催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶，是这个途 径的关键酶和限速酶，它在木质素、香豆素、类黄酮、黄酮醇、异黄酮和花青素等次生代谢产 物合成中起重要作用。它的功能是催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进一步转化为香豆 素、绿原酸，也可以形成CoA酯，再进一步转化为紫丁香苷等木质素。天山雪莲细胞苯丙氨 酸解氨酶（SiPAL)基因的克隆，为利用基因工程提高雪莲细胞活性成分紫丁香苷含量提供 重要基础。
[0003] 在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明中所提及的天山雪莲苯丙 氨酸解氨酶基因及其氨基酸序列。
[0004] 参考文献：
[0005] [1]国家药典委员会.《中华人民共和国药典》2010年版（一部）·北京：化学工 业出版社，2010:50-51.
[0006] [2]李君山，蔡少青.雪莲花类药材的化学和药理研宄进展[J].中国药学杂 志，1998, 33(8) :449-452
[0007] [3]李燕，郭顺星，王春兰，等.天山雪莲细胞培养物化学成分研宄[J].中国药 学杂志，2008, 42 (23) : 1768-1769.
[0008] [4]陈日道.天山雪莲培养物的化学成分及紫丁香苷含量研宄[D].沈阳：沈阳药 科大学，2009.
【发明内容】
[0009] 本发明为解决现有技术中存在的上述问题，提供由天山雪莲（Saussurea involucrata)细胞中克隆的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶（SiPAL)基因，该基因 cDNA的长度为 2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。 [0010] 本发明的另一方面在于公开上文所述的SiPAL基因所编码的蛋白质，其氨基酸序 列如SEQ ID NO : 2所示。
[0011] 本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的扩增引物，其序列如SEQ ID NO : 3~4所示。
[0012] 本发明的另一方面在于公开含有上文所述SiPAL基因重组表达载体。本发明所 提供的SiPAL基因，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到SiPAL基 因重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒PET-31M+)。本发明的SiPAL基因 在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均 可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细 胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常 可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是⑶S、GFP等可以产生颜 色变化的酶或发光化合物的基因等。
[0013] 本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的宿主细胞。优选地，该宿主细 胞含有以上所述的含有SiPAL基因的重组表达载体。在本发明的技术方案中，所述的宿主 细胞优选采用E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21等细胞。
[0014] 本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因在雪莲细胞或组织培养中的应 用，具体可以应用于生物法合成木质素类成分的制备。进一步，所述木质素类成分为天山雪 莲的重要有效成分紫丁香苷。
[0015] 本发明所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902. 0的发明专利中记载 的方法获得，是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一定条件进 行大规模继代培养获得的紫红色团块。
[0016] 本发明的有益效果：本发明成功从雪莲细胞中克隆出了一种天山雪莲苯丙氨酸解 氨酶（SiPAL)基因，该酶可以应用于以L-苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本发明可以通 过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，还可以通过基因评价雪莲细胞药效成 分紫丁香苷的含量。
【附图说明】
[0017] 图1为紫丁香甙含量和苯丙氨酸解氨酶基因表达水平的相关性分析结果；
[0018] 图2为SiPAL结构功能域预测分析（来源于NCBI数据库）；
[0019] 图3为SiPAL系统进化树；
[0020] 图4为表达本发明SiPAL基因的重组表达载体pET-SiPAL的图谱；
[0021] 图5为本发明含SiPAL克隆的pET质粒经限制性内切酶酶切电泳鉴定结果，其中 泳道1为Ikb DNA ladder，泳道2为XhoI酶切pET-SiPAL产物，泳道3为NdeI和XhoI酶 切 pET-SiPAL 产物。
[0022] 图6为SiPAL蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。其中泳道ISProtein Ruler Marker 1，泳道2为含有pET-31b(+)空载体的E. coli BL21(DE3)培养物；泳道3为 含有 pET-SiPAL 的 E. coli BL21 (DE3)培养物。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。另外，下述实施例中， 本发明使用的试验方法中，如无特殊说明，均为本领域技术人员的公知常识，各种缓冲溶 液，检测试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得或者由常规实验方法制备获得。
[0024] 试验中使用试剂如T4-DNA连接酶、Marker、大肠杆菌感受态DH5a和E. coli BL21 (DE3)、pET-31b (+)载体以及DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司， ExTaq酶及RNA反转录试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司公司，NdeI、Xh〇I等限制 性内切酶购自纽英伦（NEB)生物技术北京有限公司，其他常用试剂购自宝生物（大连）工 程有限公司（TaKaRa)公司。引物合成和测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
[0025] 下面通过实例进一步详细描述本发明。
[0026] 实施例1雪莲细胞转录组测序
[0027] 利用Trizol分别提取天山雪莲细胞的总RNA，通过Illumina Hiseq2000平台测 序，总计产出14372403000nt数据。组装结果总Unigenel48718个，总长138529450nt，平均 长度 931nt，N50 达到 1515nt。Unigene 功能注释，注释到 NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，C0G， GO 库的 Unigene 分别是 77514 个，63458 个，49750 个，45573 个，28939 个，55950 个，所有注 释上的Unigene是83169个。预测编码蛋白框（⑶S)，比对到蛋白库的⑶S有75735个，预 测出的CDS有5305个，共81040个。通过GO注释，Blast对比分析以及MEGA6. 0构建系统 发育树等软件分析，从中获得天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因家族序列。
[0028] 所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902. 0的发明专利中记载的方法 获得，是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一定条件进行大规 模继代培养获得的紫红色团块。
[0029] 实施例2雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因筛选
[0030] 利用UPLC-qTOF-MS (超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱）对天山雪莲细胞中 酚酸类成分进行测定，并对上述天山雪莲细胞系不同细胞团中紫丁香苷含量和苯丙氨酸解 氨酶基因家族成员表达水平进行相关性分析，筛选与活性成分积累密切相关的天山雪莲细 胞苯丙氨酸解氨酶基因，命名为SiPAL (如图1所示），其核苷酸序列如SEQ ID No: 1，该基 因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0031] 实施例3雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因
[0032] SiPAL 的克隆利用正向引物 Pl: 5' ACCACAACTCTCAGCTACCCTCCTC 3'，反向引物 P2:5' TGGCAGGGGAGGGATAGA ATTC 3'，以天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶SiPAL全长序列为模 板进行 PCR 扩增。扩增体系如下：10 X Buffer 2.5 μ L，dNTP (2. 5mmol· L-l)l μ L，引物 Pl 和Ρ2各1 μ L，Taq DNA聚合酶（5U · L-l) 0. 2 μ L，模板1 μ L (约20ng)，其余用无菌双蒸水 补足。反应条件：94°C预变性5min，94°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸2min30s，35个循环 后72°C延伸10min，4°C保存。至此获得了天山雪莲苯丙氨酸解氨酶基因 SiPAL。
[0033] 实施例4 SiPAL基因的生物信息学分析
[0034] 本发明涉及的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶基因 SiPAL全长cDNA的长度为2405bp，详 细序列如序列表中的SEQ ID NO. 1，其中开放读码框位于120-2264bp。将SiPAL基因序列用 NCBI 数据库中的 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 数据库中进行核苷酸同源性检 索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的PAL有较高的同源性，同时具有典型的PAL-HAL 结构域。如图2和图3。其中图2为SiPAL结构功能域预测分析（来源于NCBI数据库）； 图3为SiPAL系统进化树（邻接法）。
[0035] 实施例5 SiPAL基因植物表达载体的构建
[0036] 以SiPAL cDNA为模板，设计特异性上游引物P3和下游引物P4,进行PCR扩增反 应，引物中划线部分为酶切位点。
[0037]
[0038] PCR反应体系（25 μ L)为：反应体系中含10XPCR缓冲液2. 5 μ L、 dNTP(2.5mmol.L-l)lyL、鉴另Ij 引 物（10ymol.L-l)各 0.2yL、Taq DNA 聚合酶 (5U · L-1) 0· 2 μ L和模板1 μ L (约20ng)，用无菌双蒸水补足反应体积。
[0039] PCR 反应条件：95°C预变性 5min，95°C 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，35 个 循环后72°C延伸10min，4°C保存。
[0040] 取5 μ 1扩增产物加入3 μ 1溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶 图，扩增片段为2144bp。用NdeI和XhoI在37°C下酶切扩增产物2小时，利用DNA凝胶 回收试剂盒（Takara公司，中国）纯化酶切产物。同时利用NdeI和XhoI在37°C下酶切 pET-31b (+)载体2小时，加入5 μ 1溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用DNA凝胶 回收试剂盒回收5300bp片段。
[0041] 二者经T4连接酶在8°C连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有 氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含SiPAL克隆的pET质粒经PCR和限制性内切酶酶 切电泳鉴定（如图5)和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pET-SiPAL用于 表达转化。图4中，泳道1为Ikb DNA ladder，泳道2为XhoI酶切pET-SiPAL产物，泳道3 为NdeI和XhoI酶切pET-SiPAL产物，该植物表达载体命名为pET-SiPAL(图4)。
[0042] 实施例6工程菌的诱导表达
[0043] 用目标质粒pET-SiPAL电转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，培养筛选含有 pET-SiPAL质粒的阳性菌株（E. coli BL21(DE3)-SiPAL)。该菌株含有可诱导表达的重组 T7RNA聚合酶基因，从而启动pET-SiPAL上T7启动子控制的SiPAL重组基因的高效表达。 将阳性克隆E. coliBL21(DE3)-SiPAL接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 振荡培养12_16h，0D600 = 0. 9-1. 0,以I : 100比例接种于新鲜的含抗生素氨苄青霉素的 培养基中，37°C振荡培养3~5h进行扩增，取Iml菌液作为诱导前对照，然后加入终浓度 为lmmol/L的异丙基硫代-β -D-半乳糖苷（IPTG)，在37°C振荡培养中诱导工程菌表达，于 诱导3h后取样lml，以含有pET-31b(+)空载体的E. coli BL21 (DE3)培养物为阴性对照。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为76. 3kD处，出现一条明显的特异蛋白质 表达条带，与理论值一致（如图6)。其中泳道1为Protein Ruler Marker 1，泳道2为含 有pET-31b (+)空载体的E. coli BL21 (DE3)培养物；泳道3为含有pET-SiPAL的培养物。
[0044] 实施例7粗酶液的制备
[0045] 1.粗酶提取液的制备：在实施例6得到含有pET-SiPAL质粒的阳性菌株（E. coli BL21 (DE3)-SiPAL)在含50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，当菌体密度 达到00600 = 1.8-2.0 后，120001'/11^11，4°〇，离心11^11。收集菌体沉淀，重悬于？83&!17.4) 缓冲液中，洗涤2次。加入lOmg/ml的溶菌酶，室温放置15min，再加入100 μ 1细胞裂解液 (含 lmmol/LDTT，0· lmmol/L EDTA，10%甘油的 PBS，ρΗ7·4)，剧烈振荡 lmin，冰浴 lmin，重 复6次。12000r/min，4°C，离心20min，吸取上清液作为粗酶提取液，置冰上备用。
[0046] 2. PAL活性测定：活性测定按以下条件进行：反应体系为0. lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 8)缓冲液 600 μ 1，0· 01mol/L L-Phe (L-苯丙氨酸）150 μ 1，粗酶提取液 30 μ 1 ;空白对照以30 μ I CldH2O替代粗酶液。37°C水浴保温反应lh。用紫外分光光度计测 定反应前后Oh和Ih时的OD 29tl，以二者差值计算细胞粗酶液PAL的实际活力。酶活力单位采 用国际酶单位（IU)，既以每分钟生成Ιμπιο?肉桂酸为1IU。利用公式酶比活力=酶的活力 单位/粗酶液蛋白质含量来计算重组PAL酶的比活力，发现SiPAL转基因工程菌株（E. coli 81^21(032)^?八1^)为 237.3 以111〇1/1^117口1'〇，即 237.3"8,51?八1^蛋白质（苯丙氨酸解氨 酶）表达量达到总蛋白质含量的9wt%左右。
【主权项】
1. 天山雪莲（Saussureainvolucrata)细胞的SiPAL基因，其特征在于，该基因cDNA 的长度为2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1 所示。2.权利要求1所述的SiPAL基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。3.扩增权利要求1所述的SiPAL基因的引物，其序列如SEQ ID NO :3~4所示。4. 含有权利要求1所述的基因的重组表达载体。5. 含有权利要求1所述的基因的宿主细胞。6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求4所述的重 组表达载体。7. 权利要求1所述的SiPAL基因在雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养中的应 用。8. 权利要求1所述的SiPAL基因在利用生物法制备木质素类成分中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的木质素类成分为紫丁香苷。
【专利摘要】本发明提供了一种天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用。通过对雪莲细胞的转录组测序，并对测序结果进行分析和筛选得到SiPAL基因。该基因的cDNA长度为2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用该基因与植物表达载体相连接得到的SiPAL重组表达载体，制备得到该酶，可以应用于以L-苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本发明可以通过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，尤其是在雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养领域。
【IPC分类】C12N15/11, C12N1/21, C12N9/88, C12N15/70, C12N15/60, C12P19/44
【公开号】CN104894150
【申请号】CN201510256188
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 陈晓霞, 杨健, 查良平, 刘汉石
【申请人】大连普瑞康生物技术有限公司(中国)
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶（SiPAL)基因 及其编码产物和应用。
【背景技术】
[0002] 天山雪莲（Saussurea involucrata)系菊科风毛菊属植物，主产于新疆天山、昆仑 山，生长在雪线以上，民间以全草入药，具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效，用于治 疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳瘘等疾患 [1]。由于天山雪莲生长环境特异、 人工栽培困难，雪莲细胞成为天山雪莲的替代品之一。雪莲细胞中主要含有紫丁香苷等木 质素类成分 [2_4]，其生物合成途径的第一个关键酶就是苯丙氨酸解氨酶。苯丙氨酸解氨酶 (Phenylalanin ammonia-lyase，PAL)为催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶，是这个途 径的关键酶和限速酶，它在木质素、香豆素、类黄酮、黄酮醇、异黄酮和花青素等次生代谢产 物合成中起重要作用。它的功能是催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进一步转化为香豆 素、绿原酸，也可以形成CoA酯，再进一步转化为紫丁香苷等木质素。天山雪莲细胞苯丙氨 酸解氨酶（SiPAL)基因的克隆，为利用基因工程提高雪莲细胞活性成分紫丁香苷含量提供 重要基础。
[0003] 在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明中所提及的天山雪莲苯丙 氨酸解氨酶基因及其氨基酸序列。
[0004] 参考文献：
[0005] [1]国家药典委员会.《中华人民共和国药典》2010年版（一部）·北京：化学工 业出版社，2010:50-51.
[0006] [2]李君山，蔡少青.雪莲花类药材的化学和药理研宄进展[J].中国药学杂 志，1998, 33(8) :449-452
[0007] [3]李燕，郭顺星，王春兰，等.天山雪莲细胞培养物化学成分研宄[J].中国药 学杂志，2008, 42 (23) : 1768-1769.
[0008] [4]陈日道.天山雪莲培养物的化学成分及紫丁香苷含量研宄[D].沈阳：沈阳药 科大学，2009.
【发明内容】
[0009] 本发明为解决现有技术中存在的上述问题，提供由天山雪莲（Saussurea involucrata)细胞中克隆的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶（SiPAL)基因，该基因 cDNA的长度为 2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。 [0010] 本发明的另一方面在于公开上文所述的SiPAL基因所编码的蛋白质，其氨基酸序 列如SEQ ID NO : 2所示。
[0011] 本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的扩增引物，其序列如SEQ ID NO : 3~4所示。
[0012] 本发明的另一方面在于公开含有上文所述SiPAL基因重组表达载体。本发明所 提供的SiPAL基因，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到SiPAL基 因重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒PET-31M+)。本发明的SiPAL基因 在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均 可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细 胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常 可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是⑶S、GFP等可以产生颜 色变化的酶或发光化合物的基因等。
[0013] 本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因的宿主细胞。优选地，该宿主细 胞含有以上所述的含有SiPAL基因的重组表达载体。在本发明的技术方案中，所述的宿主 细胞优选采用E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21等细胞。
[0014] 本发明的另一方面在于公开上文所述SiPAL基因在雪莲细胞或组织培养中的应 用，具体可以应用于生物法合成木质素类成分的制备。进一步，所述木质素类成分为天山雪 莲的重要有效成分紫丁香苷。
[0015] 本发明所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902. 0的发明专利中记载 的方法获得，是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一定条件进 行大规模继代培养获得的紫红色团块。
[0016] 本发明的有益效果：本发明成功从雪莲细胞中克隆出了一种天山雪莲苯丙氨酸解 氨酶（SiPAL)基因，该酶可以应用于以L-苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本发明可以通 过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，还可以通过基因评价雪莲细胞药效成 分紫丁香苷的含量。
【附图说明】
[0017] 图1为紫丁香甙含量和苯丙氨酸解氨酶基因表达水平的相关性分析结果；
[0018] 图2为SiPAL结构功能域预测分析（来源于NCBI数据库）；
[0019] 图3为SiPAL系统进化树；
[0020] 图4为表达本发明SiPAL基因的重组表达载体pET-SiPAL的图谱；
[0021] 图5为本发明含SiPAL克隆的pET质粒经限制性内切酶酶切电泳鉴定结果，其中 泳道1为Ikb DNA ladder，泳道2为XhoI酶切pET-SiPAL产物，泳道3为NdeI和XhoI酶 切 pET-SiPAL 产物。
[0022] 图6为SiPAL蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。其中泳道ISProtein Ruler Marker 1，泳道2为含有pET-31b(+)空载体的E. coli BL21(DE3)培养物；泳道3为 含有 pET-SiPAL 的 E. coli BL21 (DE3)培养物。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。另外，下述实施例中， 本发明使用的试验方法中，如无特殊说明，均为本领域技术人员的公知常识，各种缓冲溶 液，检测试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得或者由常规实验方法制备获得。
[0024] 试验中使用试剂如T4-DNA连接酶、Marker、大肠杆菌感受态DH5a和E. coli BL21 (DE3)、pET-31b (+)载体以及DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司， ExTaq酶及RNA反转录试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司公司，NdeI、Xh〇I等限制 性内切酶购自纽英伦（NEB)生物技术北京有限公司，其他常用试剂购自宝生物（大连）工 程有限公司（TaKaRa)公司。引物合成和测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
[0025] 下面通过实例进一步详细描述本发明。
[0026] 实施例1雪莲细胞转录组测序
[0027] 利用Trizol分别提取天山雪莲细胞的总RNA，通过Illumina Hiseq2000平台测 序，总计产出14372403000nt数据。组装结果总Unigenel48718个，总长138529450nt，平均 长度 931nt，N50 达到 1515nt。Unigene 功能注释，注释到 NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，C0G， GO 库的 Unigene 分别是 77514 个，63458 个，49750 个，45573 个，28939 个，55950 个，所有注 释上的Unigene是83169个。预测编码蛋白框（⑶S)，比对到蛋白库的⑶S有75735个，预 测出的CDS有5305个，共81040个。通过GO注释，Blast对比分析以及MEGA6. 0构建系统 发育树等软件分析，从中获得天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因家族序列。
[0028] 所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902. 0的发明专利中记载的方法 获得，是选取雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一定条件进行大规 模继代培养获得的紫红色团块。
[0029] 实施例2雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因筛选
[0030] 利用UPLC-qTOF-MS (超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱）对天山雪莲细胞中 酚酸类成分进行测定，并对上述天山雪莲细胞系不同细胞团中紫丁香苷含量和苯丙氨酸解 氨酶基因家族成员表达水平进行相关性分析，筛选与活性成分积累密切相关的天山雪莲细 胞苯丙氨酸解氨酶基因，命名为SiPAL (如图1所示），其核苷酸序列如SEQ ID No: 1，该基 因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0031] 实施例3雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因
[0032] SiPAL 的克隆利用正向引物 Pl: 5' ACCACAACTCTCAGCTACCCTCCTC 3'，反向引物 P2:5' TGGCAGGGGAGGGATAGA ATTC 3'，以天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶SiPAL全长序列为模 板进行 PCR 扩增。扩增体系如下：10 X Buffer 2.5 μ L，dNTP (2. 5mmol· L-l)l μ L，引物 Pl 和Ρ2各1 μ L，Taq DNA聚合酶（5U · L-l) 0. 2 μ L，模板1 μ L (约20ng)，其余用无菌双蒸水 补足。反应条件：94°C预变性5min，94°C 30s，56°C退火30s，72°C延伸2min30s，35个循环 后72°C延伸10min，4°C保存。至此获得了天山雪莲苯丙氨酸解氨酶基因 SiPAL。
[0033] 实施例4 SiPAL基因的生物信息学分析
[0034] 本发明涉及的天山雪莲苯丙氨酸解氨酶基因 SiPAL全长cDNA的长度为2405bp，详 细序列如序列表中的SEQ ID NO. 1，其中开放读码框位于120-2264bp。将SiPAL基因序列用 NCBI 数据库中的 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 数据库中进行核苷酸同源性检 索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的PAL有较高的同源性，同时具有典型的PAL-HAL 结构域。如图2和图3。其中图2为SiPAL结构功能域预测分析（来源于NCBI数据库）； 图3为SiPAL系统进化树（邻接法）。
[0035] 实施例5 SiPAL基因植物表达载体的构建
[0036] 以SiPAL cDNA为模板，设计特异性上游引物P3和下游引物P4,进行PCR扩增反 应，引物中划线部分为酶切位点。
[0037]
[0038] PCR反应体系（25 μ L)为：反应体系中含10XPCR缓冲液2. 5 μ L、 dNTP(2.5mmol.L-l)lyL、鉴另Ij 引 物（10ymol.L-l)各 0.2yL、Taq DNA 聚合酶 (5U · L-1) 0· 2 μ L和模板1 μ L (约20ng)，用无菌双蒸水补足反应体积。
[0039] PCR 反应条件：95°C预变性 5min，95°C 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 2min30s，35 个 循环后72°C延伸10min，4°C保存。
[0040] 取5 μ 1扩增产物加入3 μ 1溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶 图，扩增片段为2144bp。用NdeI和XhoI在37°C下酶切扩增产物2小时，利用DNA凝胶 回收试剂盒（Takara公司，中国）纯化酶切产物。同时利用NdeI和XhoI在37°C下酶切 pET-31b (+)载体2小时，加入5 μ 1溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用DNA凝胶 回收试剂盒回收5300bp片段。
[0041] 二者经T4连接酶在8°C连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有 氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含SiPAL克隆的pET质粒经PCR和限制性内切酶酶 切电泳鉴定（如图5)和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pET-SiPAL用于 表达转化。图4中，泳道1为Ikb DNA ladder，泳道2为XhoI酶切pET-SiPAL产物，泳道3 为NdeI和XhoI酶切pET-SiPAL产物，该植物表达载体命名为pET-SiPAL(图4)。
[0042] 实施例6工程菌的诱导表达
[0043] 用目标质粒pET-SiPAL电转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，培养筛选含有 pET-SiPAL质粒的阳性菌株（E. coli BL21(DE3)-SiPAL)。该菌株含有可诱导表达的重组 T7RNA聚合酶基因，从而启动pET-SiPAL上T7启动子控制的SiPAL重组基因的高效表达。 将阳性克隆E. coliBL21(DE3)-SiPAL接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 振荡培养12_16h，0D600 = 0. 9-1. 0,以I : 100比例接种于新鲜的含抗生素氨苄青霉素的 培养基中，37°C振荡培养3~5h进行扩增，取Iml菌液作为诱导前对照，然后加入终浓度 为lmmol/L的异丙基硫代-β -D-半乳糖苷（IPTG)，在37°C振荡培养中诱导工程菌表达，于 诱导3h后取样lml，以含有pET-31b(+)空载体的E. coli BL21 (DE3)培养物为阴性对照。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为76. 3kD处，出现一条明显的特异蛋白质 表达条带，与理论值一致（如图6)。其中泳道1为Protein Ruler Marker 1，泳道2为含 有pET-31b (+)空载体的E. coli BL21 (DE3)培养物；泳道3为含有pET-SiPAL的培养物。
[0044] 实施例7粗酶液的制备
[0045] 1.粗酶提取液的制备：在实施例6得到含有pET-SiPAL质粒的阳性菌株（E. coli BL21 (DE3)-SiPAL)在含50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养，当菌体密度 达到00600 = 1.8-2.0 后，120001'/11^11，4°〇，离心11^11。收集菌体沉淀，重悬于？83&!17.4) 缓冲液中，洗涤2次。加入lOmg/ml的溶菌酶，室温放置15min，再加入100 μ 1细胞裂解液 (含 lmmol/LDTT，0· lmmol/L EDTA，10%甘油的 PBS，ρΗ7·4)，剧烈振荡 lmin，冰浴 lmin，重 复6次。12000r/min，4°C，离心20min，吸取上清液作为粗酶提取液，置冰上备用。
[0046] 2. PAL活性测定：活性测定按以下条件进行：反应体系为0. lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 8)缓冲液 600 μ 1，0· 01mol/L L-Phe (L-苯丙氨酸）150 μ 1，粗酶提取液 30 μ 1 ;空白对照以30 μ I CldH2O替代粗酶液。37°C水浴保温反应lh。用紫外分光光度计测 定反应前后Oh和Ih时的OD 29tl，以二者差值计算细胞粗酶液PAL的实际活力。酶活力单位采 用国际酶单位（IU)，既以每分钟生成Ιμπιο?肉桂酸为1IU。利用公式酶比活力=酶的活力 单位/粗酶液蛋白质含量来计算重组PAL酶的比活力，发现SiPAL转基因工程菌株（E. coli 81^21(032)^?八1^)为 237.3 以111〇1/1^117口1'〇，即 237.3"8,51?八1^蛋白质（苯丙氨酸解氨 酶）表达量达到总蛋白质含量的9wt%左右。
【主权项】
1. 天山雪莲（Saussureainvolucrata)细胞的SiPAL基因，其特征在于，该基因cDNA 的长度为2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1 所示。2.权利要求1所述的SiPAL基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。3.扩增权利要求1所述的SiPAL基因的引物，其序列如SEQ ID NO :3~4所示。4. 含有权利要求1所述的基因的重组表达载体。5. 含有权利要求1所述的基因的宿主细胞。6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求4所述的重 组表达载体。7. 权利要求1所述的SiPAL基因在雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养中的应 用。8. 权利要求1所述的SiPAL基因在利用生物法制备木质素类成分中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的木质素类成分为紫丁香苷。
【专利摘要】本发明提供了一种天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用。通过对雪莲细胞的转录组测序，并对测序结果进行分析和筛选得到SiPAL基因。该基因的cDNA长度为2405bp，开放读码框位于120-2264bp之间，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用该基因与植物表达载体相连接得到的SiPAL重组表达载体，制备得到该酶，可以应用于以L-苯丙氨酸为底物制备肉桂酸。利用本发明可以通过基因工程技术提高天然药效成分紫丁香苷的含量，尤其是在雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养领域。
【IPC分类】C12N15/11, C12N1/21, C12N9/88, C12N15/70, C12N15/60, C12P19/44
【公开号】CN104894150
【申请号】CN201510256188
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 陈晓霞, 杨健, 查良平, 刘汉石
【申请人】大连普瑞康生物技术有限公司(中国)
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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