一种刺激淋巴细胞活化的纳米基因药物及其制备方法
一种刺激淋巴细胞活化的纳米基因药物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种刺激淋巴细胞活化的新型纳米基因药物及其制备方法，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 淋巴细胞的活化对机体发挥抗感染和抗肿瘤的功能具有重要作用。然而在持续慢 性感染、或肿瘤发生过程中，机体的免疫功能受到抑制，处于低活性状态。制备有效的刺激 淋巴细胞活化的药物，对有效治疗慢性感染性疾病和肿瘤具有非常重要的意义。淋巴细胞 的生长和活化主要依赖细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等，因此基于细胞因子的基 因和蛋白质序列，体外制备相应基因和蛋白类物，理论上具有很好的促进淋巴细胞增殖和 刺激淋巴细胞活化的功能。
[0003] IL-21主要由活化的T细胞分泌，其受体主要表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、 γ δ T细胞、B细胞，亦可表达于巨噬细胞、树突状细胞、以及部分上皮细胞表面。IL-21与其 受体结合后，主要激活受体偶联的JAK1、JAK3激酶磷酸化，继而活化STAT3,从而启动IL-21 调控的靶基因颗粒酶Α、颗粒酶BUFN-γ、抗凋亡基因 bcl-3、以及IL-21和IL-21受体的表 达，高效刺激T和NK淋巴细胞的活化。另外，近几年来，IL-21被认为对促进B细胞自IgM 向IgG类抗体的类别转换中发挥关键作用。
[0004] MHC I 类相关抗原 A (MHC class I chain-related antigen A, MICA)是机体受到 应激反应后表达在细胞表面的一种糖蛋白，在大多数上皮性肿瘤细胞和病毒感染的细胞表 面广泛表达，而仅于正常肠道上皮组织中微量表达，成为肿瘤治疗很好的候选靶点。NKg2D 为MICA分子的受体，属于C-型凝集素家族成员，1个MICA分子可与两个同源性的NKg2D分 子结合，二者之间的亲和力较高（K d为8 X KT7~4X 10 -9M)。因此体外制备的NKG2D分子 在理论上具备体内靶向识别肿瘤细胞和病毒感染细胞的活性。
[0005] 单纯DNA基因药物体内应用时，细胞主动摄取效率低下、转染细胞的效率不高，体 内表达相关基因产物的情况受注射途径、免疫剂量的影响。另外，DNA基因药物的表达产物 在体内一般无法聚集于肿瘤或局部感染部位，从而导致对肿瘤或感染性疾病的治疗效应往 往达不到理想的效果。
[0006] 纳米药物因具有良好稳定性、对胃肠刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、良好 靶向性和缓释功能等特点，成为现代药物研宄发展的一个重要方向。"纳米凝胶"(Nanogel) 是能够在水溶液中分散并具有纳米尺寸的水凝胶颗粒，可通过离子键、氢键及疏水相互作 用等将生物活性分子嵌合到交联的网络结构中。聚电解质纳米凝胶还可结合带有相反电荷 的小分子药物、核酸类药物及蛋白质，用来运送相应药物用于疾病的治疗。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种具有识别异常细胞和免疫活化效应 的纳米基因药物，即纳米基因疫苗，及其制备方法，该纳米基因药物很强的淋巴细胞刺激活 性。
[0008] 本发明的方法能在体外大量制备负载pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-21融合蛋白表 达载体的纳米基因药物，且该纳米基因药物可被真核细胞摄取而表达dsNKg2D-IL-21蛋 白，并激活NK和CD8+T细胞的功能。体内应用时，该纳米基因药物可聚集中肿瘤组织所在 部位。
[0009] 本发明的方案是首先在pcDNA3. 1 (_)载体中插入融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-21，其序列如SEQ ID No:l所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0010] 本发明所说融合基因 dsNKG2D-IL-IL-21，可在真核细胞表达。是指2个NKG2D受 体胞外区基因序列与细胞因子IL-21基因序列连接后形成的dsNKG2D-IL-21，该融合基因 的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-21 插入 pcDNA3. 1 (-)载体内多克隆位点 BamH I 和 Hind III 之间，命名为 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21。
[0012] 得到的pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表达载体经测序，其基因序列如 SEQ ID N0:3所示；其中核苷酸残基位置10-69为鼠 β 2-微球蛋白前导肽基因的序列，核 苷酸残基位置70-486为第一个NKG2D胞外区的基因序列；553-969为第二个NKG2D胞外区 的基因序列；核苷酸残基1036-1380为IL-21的基因序列；核苷酸残基487-552、970-1035 为柔性片段的基因序列。
[0013] 一种纳米基因疫苗，由壳聚糖包封融合基因表达载体 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21 构成。
[0014] 上述纳米基因疫苗，所述壳聚糖为羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
[0015] 该纳米基因药物由壳聚糖运送表达生物活性因子dsNKG2D-IL-21。利用壳聚糖自 身带有大量正电荷的特点，制备成纳米基因药物，负载大量带负电荷的融合蛋白表达载体， 该纳米基因药物经真核细胞吞噬、融合基因表达后，可分泌出可溶性dsNKG2D-IL-21蛋白。 达到既识别肿瘤细胞或病毒感染的细胞，又显著刺激体内淋巴细胞，使淋巴细胞明显增强 抗肿瘤或感染的功能。
[0016] 本发明还提供纳米基因疫苗的制备方法，其步骤如下：
[0017] l)pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的构建：利用PCR分别扩增含 鼠 β2-微球蛋白的信号肽及NKG2D受体的第一个胞外区的融合片段SEQ ID N0:4、和NKG2D 的第2个胞外区片段SEQ ID NO: 5、及IL-21的基因片段SEQ ID NO: 6,先后将这3个片段 先后插入PCDNA3. 1(_)载体，得到融合蛋白表达载体。
[0018] 2)纳米基因疫苗的制备：利用大提质粒试剂盒，大量提取无内毒素 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体。利用壳聚糖体外溶胀法制备成纳 米基因疫苗，确定其包封率、粒径大小及Zeta电位后，直接用于转染细胞，可分泌出 dsNKG2D-IL-21 蛋白。
[0019] 上述纳米基因疫苗的制备方法，壳聚糖：融合蛋白表达载体质量比1 :2~2:1。
[0020] 上述纳米基因疫苗的制备方法，使用的大提质粒试剂盒为Qiagen公司大提质粒 试剂盒（No. 12362)。
[0021] 上述纳米基因疫苗的制备方法，所述壳聚糖为羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
[0022] 上述纳米基因疫苗的制备方法，壳聚糖体外溶胀法制备纳米基因疫苗，还包括如 下步骤：
[0023] 1)将融合蛋白表达载体溶液滴加入壳聚糖中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均 匀；
[0024] 2) 4°C离心机离心20-25分钟，彻底分离游离DNA和纳米基因疫苗。
[0025] 本发明还公开了纳米基因疫苗在制备增强免疫或抑制肿瘤的药物中的应用。
[0026] 上述pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体，经脂质体介导转染结肠 癌细胞CT-26后，流式细胞仪证实其表达NKG2D。ELISA法证实细胞培养上清含有IL-21。 壳聚糖材料对pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体的包封率可超过90%，其 粒径分布于200~400nm之间，且大小均一，Zeta电位范围在53. 8±6. 56之间。
[0027] 负载融合蛋白表达载体的纳米基因药物体外与肿瘤细胞共孵育后，细胞培养上清 具有激活NK和CD8+T细胞活化的能力。荷瘤小鼠体内实验证实，纳米基因药物呈明显聚集 于肿瘤组织分布。
[0028] 因此，本发明主要首先利用DNA重组技术，将2个NKG2D基因的胞外区序列和 IL-21基因序列插入pcDNA3. 1表达载体，然后使用壳聚糖修饰为水溶性羟丙基三甲基氯化 铵壳聚糖，在PH7.0条件下可携带正电荷的特点，从而吸附带负电荷的重组质粒DNA。该纳 米药物用来运送具有刺激淋巴活化和体内靶向性分布的重组dsNKG2D-IL-21基因载体的 纳米凝胶，国内外均未见报道，有望成为抗肿瘤和感染性疾病的药物之一。
[0029] 本发明的纳米药物将具有下列优势：
[0030] 1)外源性补充IL-21蛋白药物已被证实具有很好的抗肿瘤活性，然而该药物在体 内的半衰期很短，4小时以内基本代谢完成。因此我们制备的dsNKG2D-IL-21基因在体内表 达的蛋白质分子，首先可克服半衰期短的缺点。
[0031] 2)重组dsNKG2D-IL-21基因载体在体内预期表达的dsNKG2D-IL-21蛋白，可识别 NKG2D配体阳性表达的细胞（主要是肿瘤细胞和病毒感染的细胞），理论上具有较好的局部 优势分布效应。
[0032] 3)利用壳聚糖纳米颗粒来运送重组基因，不仅可利用壳聚糖纳米颗粒易于分布肿 瘤组织的特点，进一步增殖肿瘤靶向性，还可达到局部缓慢释放基因的目的，尽可能延长药 物在体内的半衰期，从而增强药物疗效。
【附图说明】
[0033] 图1.纳米基因药物颗粒示意图（1.质粒DNA ;2.壳聚糖纳米颗粒）。
[0034] 图2. ATG-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因片段的构建策略图。
[0035] 图3. pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因表达载体经双酶切鉴定，产物电泳 图（I. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 用 Xba I/Kpn I 酶切；2. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 用 Xho I/Kpn I 酶切；3. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 用 Xba I/Xho I 酶切；4. DNA ladder)。
[0036] 图4. pcDNA 3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体经脂质体包裹，转染结肠 癌细胞株CT-26后，标记NKG2D抗体后的流式细胞术检测图（A.流式检测结果；B.统计学 结果）。
[0037] 图5. CT-26细胞经脂质体包裹的表达载体转染后，ELISA法检测细胞培养上清 IL-21的分泌。
[0038] 图6.壳聚糖对融合基因表达载体包封率的检测，经壳聚糖包封融合基因 表达载体后取上清的电泳结果图（A.M.DNA ladder，1.壳聚糖：融合基因表达载体 为2:1，2.壳聚糖：融合基因表达载体为1:1，3.壳聚糖：融合基因表达载体为2:1， 4. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 ;B.包封率的计算结果）。
[0039] 图7.检测纳米基因颗粒的大小（A.电镜检测；B.动态光闪射仪检测）。
[0040] 图8.纳米基因颗粒的Zeta电位检测。
[0041] 图9.用负载pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的纳米基因颗粒和 肿瘤细胞孵育后，与小鼠脾脏单细胞悬液共培养过夜，NK和CD8+T细胞活化的检测（A. NK细 胞表达活化性受体⑶69的检测；B.⑶8+T细胞表达活化性受体⑶44的检测）。
[0042] 图10.纳米基因药物经尾静脉注射后荷瘤小鼠后，体内动态观察药物在小鼠体内 的分布。
【具体实施方式】
[0043] I. pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因真核表达载体的构建：
[0044] I. IPCR扩增的引物序列：利用生物信息学的手段，分别设计相应的引物（见表1)， 从小鼠脾脏单细胞悬液扩增出信号肽-sNKG2D(l)、sNKG2D(2)、IL-21的基因片段。在信号 肽-sNKG2D(l)的下游引物、sNKG2D(2)的下游引物均加上（Gly4Ser)4的反向互补序列（表 中方框内显示）。图2显示ATG-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因片段的构建策略。
[0045] 表1.信号肽、NKG2D、IL-21基因片段扩增的引物序列
[0046]
[0047] 信号肽-sNKG2D (1)的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO :4所示，第1-6位碱基为 Xba I 酶切位点的序列；第7位为避免NKG2D发生移码突变而随机加入的核苷酸；第8-68 为鼠 β 2-微球蛋白信号肽的基因序列；第69-485为NKG2D胞外区的基因序列；486-544为 柔性片段的基因序列；545-551为Xho I酶切位点序列。
[0048] SNKG2D (2)的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO :5所示，其中碱基第1-6为Xho I酶 切位点序列；7-424为NKG2D胞外区的基因序列；425-484为柔性片段的基因序列；485-490 为Pst I酶切位点序列。
[0049] IL-21的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO :6所示，其中碱基第1-6为Pst I酶切 位点序列；7-376为IL-21基因序列；376-381为Kpn I酶切位点序列；373-375为终止密码 子。
[0050] 2. 2pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的酶切鉴定：上述2段PCR 产物各自分别经Xba I/Xho I、Xho I/Pst I、Pst I/Kpn I双酶切后，通过T4连接酶连接，先 后插入 pcDNA3. 1(_)载体（来源于 Clontech 公司）得到 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL_21。图 3 显示 pcDNA3.1-sig-dsNKg2D-IL-15 融合蛋白表达载体经 Xba I/Xho I、Xho I/Kpn I、Xba I/Kpn I双酶切后的电泳结果，结果显示重组基因片段已被稳定插入pcDNA3. 1(-)载体。对 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体进行插入片段的全部测序，经DNAstar软 件与预期序列比对，同源性为99%。
[0051] 2. pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的大量制备与表达鉴定：
[0052] 2. lpcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的大量制备：在正确获得融 合蛋白表达载体的基础上，利用Qiagen公司提供的大提质粒试剂盒（Cat. No. 12362)，提取 无内毒素的融合蛋白表达载体。
[0053] 实验流程如下：
[0054] a)挑单克隆，于含有Amp+抗性的LB (2-5mL)培养8h，37°C，300rmp
[0055] b)转接取100 μ L或50 μ L转接
[0056] i.高拷贝融合基因表达载体于与25mL或100mL，低拷贝融合基因表达载体于 IOOmL，转接（100-200 μ L)
[0057] ii. 500mL LB，转接（250-500 yL)，37°C，240rpm，12-16h(摇床）
[0058] c)离心，6500rpm 20min/7300rpm 15min，4°C，弃上清
[0059] d)用IOmL Buffer Pl重悬（用枪头吹打充分）
[0060] e)加 IOmL Buffer P2,迅速完全地颠倒4-6次，（变蓝），15-25°C室温静置5min
[0061] f)在静置过程中，将 QIA filter Cartridge cap 抒到 QIA filter Cartridge，放 入到合适的管中
[0062] g)加入IOmL提前预冷的Buffer P3,迅速颠倒4-6次
[0063] h)将溶解产物加入至QIA filter Maxi Cartridge中，室温静置10min，不要插入 QIA filter Plungers，移动 QIA filter Cartridge Cap，轻轻插入 Plunger 在 QIA filter Cartridge中，并且过滤溶解产物至一只50mL试管（新试管）
[0064] i)加 2. 5mL Buffer ER至滤液，颠倒试管10次，至于冰上，30min
[0065] j)用 IOmL Buffer QBT 平衡 QIAGEN-tip，重力流流空
[0066] k)将第i步的滤液至QIAGEN-tip，流下
[0067] 1)用 Buffer QC 洗 QIAGEN-tip 两次，每次 30mL
[0068] m)用15mL Buffer QN洗脱DNA至一只30mL去内毒素的试管
[0069] η)加10. 5mL室温放置的异丙醇至洗提的DNA，混匀，析出沉淀
[0070] 〇) 15000g，30min，4°C [7000rmp，130min]，弃上清
[0071] p)用 5mL 70% 乙醇轻吹，离心 15000g，10min[7000rpm，lh]，弃上清
[0072] q)室温静置5-10min，用适量（200 μ DBuffer TE再溶解DNA，重悬得到后置于超 净台
[0073] 2. 2pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21 融合基因载体在 CT-26 细胞（来自 ATCC)内的 表达鉴定：为明确融合基因表达载体转染真核细胞细胞后，是否表达出相应蛋白，将融合基 因表达载体用脂质体包裹，转染结肠癌细胞CT-26。转染后的细胞分别用流式细胞仪检测 NKG2D的表达（图4)，ELISA法检测细胞培养上IL-21的表达（图5)。结果表明该融合基 因表达载体可表达出NKG2D和IL-21的融合蛋白。
[0074] 3.负载pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因载体的纳米基因疫苗的制备与鉴 定
[0075] 3. 1羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的制备
[0076] 壳聚糖（脱乙酰度85%，Mv = 200000)来自浙江玉环海洋生物有限公司。称取2 克壳聚糖溶于2 %的乙酸溶液中，搅拌溶解后逐滴加入NaOH溶液调价pH值为9. 0,此时有 大量白色絮状沉淀析出，继续侵泡12h后，抽滤并洗涤沉淀至滤液为中性。将所得白色沉淀 物与50ml异丙醇加入至三口烧瓶中，磁力搅拌并升温至 8(TC，逐滴加入2, 3-环氧丙基三甲 基氯化氨。反应结束后，反应液在乙醇中沉淀，分离沉淀后，洗涤干燥，即可得2-羟丙基三 甲基氯化铵壳聚糖。
[0077] 3. 2图1所示纳米基因药物颗粒的制备：
[0078] 按下列实验流程将融合基因表达载体1用水溶性壳聚糖溶胀为纳米溶胶2,其 中壳聚糖：融合基因表达载体1质量比在1:2时，包封率平均值为72. 5±4. 65,1:1时为 95. 3±0.65,2:1时为91.6±1.96。包封后上清的电泳结果见图6。激光动态光闪射仪和 电镜测定纳米基因疫苗大小在200~400nm之间，且粒径大小均一（图7)。Zeta电位为 41. 0±0· 56(图 8)。
[0079] 实验流程：
[0080] 1.利用Qiagen公司的大量质粒提取试剂盒，测定融合基因表达载体的浓度和总 量，调整浓度为lmg/ml。
[0081] 2.称量壳聚糖的重量在超净工作台中，用超纯水稀释为lmg/ml。其中壳聚糖（脱 乙酰度85%，Mv = 200000)来自浙江玉环海洋生物有限公司，修饰为羟丙基三甲基氯化铵 壳聚糖，N-[ (2-hydroxy-3_trimethyIammonium) ] 〇
[0082] 3.按1:0. 5,1:1，1:2质量比，总体积预期共设为lml。将融合蛋白表达载体1溶 液滴加入壳聚糖中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均匀。
[0083] 4. 4°C离心机最大速度离心20-25分钟，彻底分离游离DNA和纳米基因疫苗。
[0084] 5.紫外分光光度计检测上清中DNA浓度和总量，计算包封率。并用1 %琼脂糖凝 胶电泳观察上清中DNA的残留。
[0085] 6.激光动态光闪射仪和透射电镜检测纳米基因疫苗大小，Zeta电位仪检测电位 大小。
[0086] 4体外分析肿瘤细胞摄取纳米药物后，刺激淋巴细胞活化的情况纳米基因疫苗的 活性鉴定
[0087] 将纳米基因疫苗分别用细胞培养基稀释成10%，20%浓度，与小鼠结肠癌细胞 CT-26 (来自ATCC)共孵育6小时，洗涤细胞，加入小鼠脾脏单细胞悬液共培养过夜。次日收 集细胞，进行DX5/CD69、CD8/CD44抗体标记，流式细胞术检测阳性细胞的频率。结果证实负 载dsNKG2D-IL-21的纳米基因药物被肿瘤细胞摄取后，可明显刺激NK细胞表达⑶69,⑶8+T 细胞表达⑶44 (图9)。
[0088] 5.纳米基因药物在荷瘤小鼠体内的分布特性
[0089] 为明确该壳聚糖纳米药物在体内的分布，进一步对壳聚糖纳米材料进行Cy5. 5焚 光染料修饰（上海凯靖生物公司完成）。C57BL6小鼠皮下背部注射5X 106B16-RAE黑色素 瘤细胞，7天后尾静脉注射荧光标记的纳米药物，小动物活体成像系统观察纳米药物在体内 的动态分布。结果显示（图10)，注射药物4~8小时，壳聚糖药物可明显聚集于肿瘤组织 所在部位，且在体内可维持20~24小时的时间。纳米药物既达到趋向性分布于肿瘤组织， 又延长体内代谢时间的目的。
【主权项】
1. 一种融合基因，其特征在于，由融合基因dsNKG2D-IL-21基因的上游引入鼠0 -2微 球蛋白的信号肽序列，得到的融合基因ATG-sig-dsNKG2D-IL-21，其序列如SEQIDN〇:l所 不O2. -种融合基因表达载体pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21，其特征在于，其基因序列如 SEQIDNO:2 所示。3. -种纳米基因疫苗，其特征在于，由壳聚糖包封pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21融合 蛋白表达载体构成。4. 如权利要求3所述纳米基因疫苗，其特征在于，所述壳聚糖为羟丙基三甲基氯化铵 壳聚糖。5. -种制备权利要求3所述的纳米基因疫苗的方法，其特征在于，步骤如下： 1)pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的构建：以利用PCR分别扩增 鼠0 2-微球蛋白的信号肽、及鼠NKG2D受体的第一个胞外区的融合片段SEQIDN0:4,和 NKG2D的第2个胞外区SEQIDNO: 5,及IL-21的融合片段SEQIDNO: 6,将这三个片段先后 插入pcDNA3. 1(_)载体，得到融合蛋白表达载体； 2) 纳米基因疫苗的制备：利用大提质粒试剂盒，大量提取无内毒素 pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体，利用壳聚糖体外溶胀法制备成纳米基因 疫苗。6. 如权利要求5所述的纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，壳聚糖：融合蛋白表达 载体质量比为1 :2~2:1。7. 如权利要求5所述纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为羟丙基三 甲基氯化铵壳聚糖。8. 如权利要求5所述的纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，使用的大提质粒试剂 盒为Qiagen公司大提质粒试剂盒。9. 如权利要求5所述的纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，壳聚糖体外溶胀法制 备纳米基因疫苗，包括如下步骤： 1) 将融合蛋白表达载体溶液滴加入壳聚糖中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均匀； 2) 4°C离心机离心20-25分钟，彻底分离游离DNA和纳米基因药物。10. 权利要求3所述的纳米基因疫苗在制备增强免疫或抑制肿瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种刺激淋巴细胞活化的新型纳米基因药物及其制备方法，公开了一种融合基因，由融合基因dsNKG2D-IL-21基因的上游引入鼠β-2微球蛋白的信号肽序列，得到融合基因ATG-sig-dsNKG2D-IL-21；一种融合基因表达载体pcDNA3.1-sig-dsNKg2D-IL-21；一种纳米基因疫苗药物，由壳聚糖包封pcDNA3.1-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体构成。本发明还提供纳米基因疫苗的制备方法。该纳米药物用来运送具有刺激淋巴活化和体内靶向性分布的重组dsNKG2D-IL-21基因载体的纳米凝胶，有望成为抗肿瘤和感染性疾病的药物。
【IPC分类】C12N15/62, A61K39/00, A61K48/00, A61P35/00, A61P37/02, C12N15/63
【公开号】CN104894151
【申请号】CN201510289975
【发明人】赵培蕾, 龚卫娟, 肖炜明
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种刺激淋巴细胞活化的新型纳米基因药物及其制备方法，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 淋巴细胞的活化对机体发挥抗感染和抗肿瘤的功能具有重要作用。然而在持续慢 性感染、或肿瘤发生过程中，机体的免疫功能受到抑制，处于低活性状态。制备有效的刺激 淋巴细胞活化的药物，对有效治疗慢性感染性疾病和肿瘤具有非常重要的意义。淋巴细胞 的生长和活化主要依赖细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等，因此基于细胞因子的基 因和蛋白质序列，体外制备相应基因和蛋白类物，理论上具有很好的促进淋巴细胞增殖和 刺激淋巴细胞活化的功能。
[0003] IL-21主要由活化的T细胞分泌，其受体主要表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、 γ δ T细胞、B细胞，亦可表达于巨噬细胞、树突状细胞、以及部分上皮细胞表面。IL-21与其 受体结合后，主要激活受体偶联的JAK1、JAK3激酶磷酸化，继而活化STAT3,从而启动IL-21 调控的靶基因颗粒酶Α、颗粒酶BUFN-γ、抗凋亡基因 bcl-3、以及IL-21和IL-21受体的表 达，高效刺激T和NK淋巴细胞的活化。另外，近几年来，IL-21被认为对促进B细胞自IgM 向IgG类抗体的类别转换中发挥关键作用。
[0004] MHC I 类相关抗原 A (MHC class I chain-related antigen A, MICA)是机体受到 应激反应后表达在细胞表面的一种糖蛋白，在大多数上皮性肿瘤细胞和病毒感染的细胞表 面广泛表达，而仅于正常肠道上皮组织中微量表达，成为肿瘤治疗很好的候选靶点。NKg2D 为MICA分子的受体，属于C-型凝集素家族成员，1个MICA分子可与两个同源性的NKg2D分 子结合，二者之间的亲和力较高（K d为8 X KT7~4X 10 -9M)。因此体外制备的NKG2D分子 在理论上具备体内靶向识别肿瘤细胞和病毒感染细胞的活性。
[0005] 单纯DNA基因药物体内应用时，细胞主动摄取效率低下、转染细胞的效率不高，体 内表达相关基因产物的情况受注射途径、免疫剂量的影响。另外，DNA基因药物的表达产物 在体内一般无法聚集于肿瘤或局部感染部位，从而导致对肿瘤或感染性疾病的治疗效应往 往达不到理想的效果。
[0006] 纳米药物因具有良好稳定性、对胃肠刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、良好 靶向性和缓释功能等特点，成为现代药物研宄发展的一个重要方向。"纳米凝胶"(Nanogel) 是能够在水溶液中分散并具有纳米尺寸的水凝胶颗粒，可通过离子键、氢键及疏水相互作 用等将生物活性分子嵌合到交联的网络结构中。聚电解质纳米凝胶还可结合带有相反电荷 的小分子药物、核酸类药物及蛋白质，用来运送相应药物用于疾病的治疗。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种具有识别异常细胞和免疫活化效应 的纳米基因药物，即纳米基因疫苗，及其制备方法，该纳米基因药物很强的淋巴细胞刺激活 性。
[0008] 本发明的方法能在体外大量制备负载pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-21融合蛋白表 达载体的纳米基因药物，且该纳米基因药物可被真核细胞摄取而表达dsNKg2D-IL-21蛋 白，并激活NK和CD8+T细胞的功能。体内应用时，该纳米基因药物可聚集中肿瘤组织所在 部位。
[0009] 本发明的方案是首先在pcDNA3. 1 (_)载体中插入融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-21，其序列如SEQ ID No:l所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0010] 本发明所说融合基因 dsNKG2D-IL-IL-21，可在真核细胞表达。是指2个NKG2D受 体胞外区基因序列与细胞因子IL-21基因序列连接后形成的dsNKG2D-IL-21，该融合基因 的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-21 插入 pcDNA3. 1 (-)载体内多克隆位点 BamH I 和 Hind III 之间，命名为 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21。
[0012] 得到的pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表达载体经测序，其基因序列如 SEQ ID N0:3所示；其中核苷酸残基位置10-69为鼠 β 2-微球蛋白前导肽基因的序列，核 苷酸残基位置70-486为第一个NKG2D胞外区的基因序列；553-969为第二个NKG2D胞外区 的基因序列；核苷酸残基1036-1380为IL-21的基因序列；核苷酸残基487-552、970-1035 为柔性片段的基因序列。
[0013] 一种纳米基因疫苗，由壳聚糖包封融合基因表达载体 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21 构成。
[0014] 上述纳米基因疫苗，所述壳聚糖为羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
[0015] 该纳米基因药物由壳聚糖运送表达生物活性因子dsNKG2D-IL-21。利用壳聚糖自 身带有大量正电荷的特点，制备成纳米基因药物，负载大量带负电荷的融合蛋白表达载体， 该纳米基因药物经真核细胞吞噬、融合基因表达后，可分泌出可溶性dsNKG2D-IL-21蛋白。 达到既识别肿瘤细胞或病毒感染的细胞，又显著刺激体内淋巴细胞，使淋巴细胞明显增强 抗肿瘤或感染的功能。
[0016] 本发明还提供纳米基因疫苗的制备方法，其步骤如下：
[0017] l)pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的构建：利用PCR分别扩增含 鼠 β2-微球蛋白的信号肽及NKG2D受体的第一个胞外区的融合片段SEQ ID N0:4、和NKG2D 的第2个胞外区片段SEQ ID NO: 5、及IL-21的基因片段SEQ ID NO: 6,先后将这3个片段 先后插入PCDNA3. 1(_)载体，得到融合蛋白表达载体。
[0018] 2)纳米基因疫苗的制备：利用大提质粒试剂盒，大量提取无内毒素 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体。利用壳聚糖体外溶胀法制备成纳 米基因疫苗，确定其包封率、粒径大小及Zeta电位后，直接用于转染细胞，可分泌出 dsNKG2D-IL-21 蛋白。
[0019] 上述纳米基因疫苗的制备方法，壳聚糖：融合蛋白表达载体质量比1 :2~2:1。
[0020] 上述纳米基因疫苗的制备方法，使用的大提质粒试剂盒为Qiagen公司大提质粒 试剂盒（No. 12362)。
[0021] 上述纳米基因疫苗的制备方法，所述壳聚糖为羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
[0022] 上述纳米基因疫苗的制备方法，壳聚糖体外溶胀法制备纳米基因疫苗，还包括如 下步骤：
[0023] 1)将融合蛋白表达载体溶液滴加入壳聚糖中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均 匀；
[0024] 2) 4°C离心机离心20-25分钟，彻底分离游离DNA和纳米基因疫苗。
[0025] 本发明还公开了纳米基因疫苗在制备增强免疫或抑制肿瘤的药物中的应用。
[0026] 上述pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体，经脂质体介导转染结肠 癌细胞CT-26后，流式细胞仪证实其表达NKG2D。ELISA法证实细胞培养上清含有IL-21。 壳聚糖材料对pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体的包封率可超过90%，其 粒径分布于200~400nm之间，且大小均一，Zeta电位范围在53. 8±6. 56之间。
[0027] 负载融合蛋白表达载体的纳米基因药物体外与肿瘤细胞共孵育后，细胞培养上清 具有激活NK和CD8+T细胞活化的能力。荷瘤小鼠体内实验证实，纳米基因药物呈明显聚集 于肿瘤组织分布。
[0028] 因此，本发明主要首先利用DNA重组技术，将2个NKG2D基因的胞外区序列和 IL-21基因序列插入pcDNA3. 1表达载体，然后使用壳聚糖修饰为水溶性羟丙基三甲基氯化 铵壳聚糖，在PH7.0条件下可携带正电荷的特点，从而吸附带负电荷的重组质粒DNA。该纳 米药物用来运送具有刺激淋巴活化和体内靶向性分布的重组dsNKG2D-IL-21基因载体的 纳米凝胶，国内外均未见报道，有望成为抗肿瘤和感染性疾病的药物之一。
[0029] 本发明的纳米药物将具有下列优势：
[0030] 1)外源性补充IL-21蛋白药物已被证实具有很好的抗肿瘤活性，然而该药物在体 内的半衰期很短，4小时以内基本代谢完成。因此我们制备的dsNKG2D-IL-21基因在体内表 达的蛋白质分子，首先可克服半衰期短的缺点。
[0031] 2)重组dsNKG2D-IL-21基因载体在体内预期表达的dsNKG2D-IL-21蛋白，可识别 NKG2D配体阳性表达的细胞（主要是肿瘤细胞和病毒感染的细胞），理论上具有较好的局部 优势分布效应。
[0032] 3)利用壳聚糖纳米颗粒来运送重组基因，不仅可利用壳聚糖纳米颗粒易于分布肿 瘤组织的特点，进一步增殖肿瘤靶向性，还可达到局部缓慢释放基因的目的，尽可能延长药 物在体内的半衰期，从而增强药物疗效。
【附图说明】
[0033] 图1.纳米基因药物颗粒示意图（1.质粒DNA ;2.壳聚糖纳米颗粒）。
[0034] 图2. ATG-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因片段的构建策略图。
[0035] 图3. pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因表达载体经双酶切鉴定，产物电泳 图（I. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 用 Xba I/Kpn I 酶切；2. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 用 Xho I/Kpn I 酶切；3. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 用 Xba I/Xho I 酶切；4. DNA ladder)。
[0036] 图4. pcDNA 3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体经脂质体包裹，转染结肠 癌细胞株CT-26后，标记NKG2D抗体后的流式细胞术检测图（A.流式检测结果；B.统计学 结果）。
[0037] 图5. CT-26细胞经脂质体包裹的表达载体转染后，ELISA法检测细胞培养上清 IL-21的分泌。
[0038] 图6.壳聚糖对融合基因表达载体包封率的检测，经壳聚糖包封融合基因 表达载体后取上清的电泳结果图（A.M.DNA ladder，1.壳聚糖：融合基因表达载体 为2:1，2.壳聚糖：融合基因表达载体为1:1，3.壳聚糖：融合基因表达载体为2:1， 4. pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-21 ;B.包封率的计算结果）。
[0039] 图7.检测纳米基因颗粒的大小（A.电镜检测；B.动态光闪射仪检测）。
[0040] 图8.纳米基因颗粒的Zeta电位检测。
[0041] 图9.用负载pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的纳米基因颗粒和 肿瘤细胞孵育后，与小鼠脾脏单细胞悬液共培养过夜，NK和CD8+T细胞活化的检测（A. NK细 胞表达活化性受体⑶69的检测；B.⑶8+T细胞表达活化性受体⑶44的检测）。
[0042] 图10.纳米基因药物经尾静脉注射后荷瘤小鼠后，体内动态观察药物在小鼠体内 的分布。
【具体实施方式】
[0043] I. pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因真核表达载体的构建：
[0044] I. IPCR扩增的引物序列：利用生物信息学的手段，分别设计相应的引物（见表1)， 从小鼠脾脏单细胞悬液扩增出信号肽-sNKG2D(l)、sNKG2D(2)、IL-21的基因片段。在信号 肽-sNKG2D(l)的下游引物、sNKG2D(2)的下游引物均加上（Gly4Ser)4的反向互补序列（表 中方框内显示）。图2显示ATG-sig-dsNKG2D-IL-21融合基因片段的构建策略。
[0045] 表1.信号肽、NKG2D、IL-21基因片段扩增的引物序列
[0046]
[0047] 信号肽-sNKG2D (1)的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO :4所示，第1-6位碱基为 Xba I 酶切位点的序列；第7位为避免NKG2D发生移码突变而随机加入的核苷酸；第8-68 为鼠 β 2-微球蛋白信号肽的基因序列；第69-485为NKG2D胞外区的基因序列；486-544为 柔性片段的基因序列；545-551为Xho I酶切位点序列。
[0048] SNKG2D (2)的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO :5所示，其中碱基第1-6为Xho I酶 切位点序列；7-424为NKG2D胞外区的基因序列；425-484为柔性片段的基因序列；485-490 为Pst I酶切位点序列。
[0049] IL-21的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO :6所示，其中碱基第1-6为Pst I酶切 位点序列；7-376为IL-21基因序列；376-381为Kpn I酶切位点序列；373-375为终止密码 子。
[0050] 2. 2pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的酶切鉴定：上述2段PCR 产物各自分别经Xba I/Xho I、Xho I/Pst I、Pst I/Kpn I双酶切后，通过T4连接酶连接，先 后插入 pcDNA3. 1(_)载体（来源于 Clontech 公司）得到 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL_21。图 3 显示 pcDNA3.1-sig-dsNKg2D-IL-15 融合蛋白表达载体经 Xba I/Xho I、Xho I/Kpn I、Xba I/Kpn I双酶切后的电泳结果，结果显示重组基因片段已被稳定插入pcDNA3. 1(-)载体。对 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体进行插入片段的全部测序，经DNAstar软 件与预期序列比对，同源性为99%。
[0051] 2. pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的大量制备与表达鉴定：
[0052] 2. lpcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的大量制备：在正确获得融 合蛋白表达载体的基础上，利用Qiagen公司提供的大提质粒试剂盒（Cat. No. 12362)，提取 无内毒素的融合蛋白表达载体。
[0053] 实验流程如下：
[0054] a)挑单克隆，于含有Amp+抗性的LB (2-5mL)培养8h，37°C，300rmp
[0055] b)转接取100 μ L或50 μ L转接
[0056] i.高拷贝融合基因表达载体于与25mL或100mL，低拷贝融合基因表达载体于 IOOmL，转接（100-200 μ L)
[0057] ii. 500mL LB，转接（250-500 yL)，37°C，240rpm，12-16h(摇床）
[0058] c)离心，6500rpm 20min/7300rpm 15min，4°C，弃上清
[0059] d)用IOmL Buffer Pl重悬（用枪头吹打充分）
[0060] e)加 IOmL Buffer P2,迅速完全地颠倒4-6次，（变蓝），15-25°C室温静置5min
[0061] f)在静置过程中，将 QIA filter Cartridge cap 抒到 QIA filter Cartridge，放 入到合适的管中
[0062] g)加入IOmL提前预冷的Buffer P3,迅速颠倒4-6次
[0063] h)将溶解产物加入至QIA filter Maxi Cartridge中，室温静置10min，不要插入 QIA filter Plungers，移动 QIA filter Cartridge Cap，轻轻插入 Plunger 在 QIA filter Cartridge中，并且过滤溶解产物至一只50mL试管（新试管）
[0064] i)加 2. 5mL Buffer ER至滤液，颠倒试管10次，至于冰上，30min
[0065] j)用 IOmL Buffer QBT 平衡 QIAGEN-tip，重力流流空
[0066] k)将第i步的滤液至QIAGEN-tip，流下
[0067] 1)用 Buffer QC 洗 QIAGEN-tip 两次，每次 30mL
[0068] m)用15mL Buffer QN洗脱DNA至一只30mL去内毒素的试管
[0069] η)加10. 5mL室温放置的异丙醇至洗提的DNA，混匀，析出沉淀
[0070] 〇) 15000g，30min，4°C [7000rmp，130min]，弃上清
[0071] p)用 5mL 70% 乙醇轻吹，离心 15000g，10min[7000rpm，lh]，弃上清
[0072] q)室温静置5-10min，用适量（200 μ DBuffer TE再溶解DNA，重悬得到后置于超 净台
[0073] 2. 2pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21 融合基因载体在 CT-26 细胞（来自 ATCC)内的 表达鉴定：为明确融合基因表达载体转染真核细胞细胞后，是否表达出相应蛋白，将融合基 因表达载体用脂质体包裹，转染结肠癌细胞CT-26。转染后的细胞分别用流式细胞仪检测 NKG2D的表达（图4)，ELISA法检测细胞培养上IL-21的表达（图5)。结果表明该融合基 因表达载体可表达出NKG2D和IL-21的融合蛋白。
[0074] 3.负载pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因载体的纳米基因疫苗的制备与鉴 定
[0075] 3. 1羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的制备
[0076] 壳聚糖（脱乙酰度85%，Mv = 200000)来自浙江玉环海洋生物有限公司。称取2 克壳聚糖溶于2 %的乙酸溶液中，搅拌溶解后逐滴加入NaOH溶液调价pH值为9. 0,此时有 大量白色絮状沉淀析出，继续侵泡12h后，抽滤并洗涤沉淀至滤液为中性。将所得白色沉淀 物与50ml异丙醇加入至三口烧瓶中，磁力搅拌并升温至 8(TC，逐滴加入2, 3-环氧丙基三甲 基氯化氨。反应结束后，反应液在乙醇中沉淀，分离沉淀后，洗涤干燥，即可得2-羟丙基三 甲基氯化铵壳聚糖。
[0077] 3. 2图1所示纳米基因药物颗粒的制备：
[0078] 按下列实验流程将融合基因表达载体1用水溶性壳聚糖溶胀为纳米溶胶2,其 中壳聚糖：融合基因表达载体1质量比在1:2时，包封率平均值为72. 5±4. 65,1:1时为 95. 3±0.65,2:1时为91.6±1.96。包封后上清的电泳结果见图6。激光动态光闪射仪和 电镜测定纳米基因疫苗大小在200~400nm之间，且粒径大小均一（图7)。Zeta电位为 41. 0±0· 56(图 8)。
[0079] 实验流程：
[0080] 1.利用Qiagen公司的大量质粒提取试剂盒，测定融合基因表达载体的浓度和总 量，调整浓度为lmg/ml。
[0081] 2.称量壳聚糖的重量在超净工作台中，用超纯水稀释为lmg/ml。其中壳聚糖（脱 乙酰度85%，Mv = 200000)来自浙江玉环海洋生物有限公司，修饰为羟丙基三甲基氯化铵 壳聚糖，N-[ (2-hydroxy-3_trimethyIammonium) ] 〇
[0082] 3.按1:0. 5,1:1，1:2质量比，总体积预期共设为lml。将融合蛋白表达载体1溶 液滴加入壳聚糖中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均匀。
[0083] 4. 4°C离心机最大速度离心20-25分钟，彻底分离游离DNA和纳米基因疫苗。
[0084] 5.紫外分光光度计检测上清中DNA浓度和总量，计算包封率。并用1 %琼脂糖凝 胶电泳观察上清中DNA的残留。
[0085] 6.激光动态光闪射仪和透射电镜检测纳米基因疫苗大小，Zeta电位仪检测电位 大小。
[0086] 4体外分析肿瘤细胞摄取纳米药物后，刺激淋巴细胞活化的情况纳米基因疫苗的 活性鉴定
[0087] 将纳米基因疫苗分别用细胞培养基稀释成10%，20%浓度，与小鼠结肠癌细胞 CT-26 (来自ATCC)共孵育6小时，洗涤细胞，加入小鼠脾脏单细胞悬液共培养过夜。次日收 集细胞，进行DX5/CD69、CD8/CD44抗体标记，流式细胞术检测阳性细胞的频率。结果证实负 载dsNKG2D-IL-21的纳米基因药物被肿瘤细胞摄取后，可明显刺激NK细胞表达⑶69,⑶8+T 细胞表达⑶44 (图9)。
[0088] 5.纳米基因药物在荷瘤小鼠体内的分布特性
[0089] 为明确该壳聚糖纳米药物在体内的分布，进一步对壳聚糖纳米材料进行Cy5. 5焚 光染料修饰（上海凯靖生物公司完成）。C57BL6小鼠皮下背部注射5X 106B16-RAE黑色素 瘤细胞，7天后尾静脉注射荧光标记的纳米药物，小动物活体成像系统观察纳米药物在体内 的动态分布。结果显示（图10)，注射药物4~8小时，壳聚糖药物可明显聚集于肿瘤组织 所在部位，且在体内可维持20~24小时的时间。纳米药物既达到趋向性分布于肿瘤组织， 又延长体内代谢时间的目的。
【主权项】
1. 一种融合基因，其特征在于，由融合基因dsNKG2D-IL-21基因的上游引入鼠0 -2微 球蛋白的信号肽序列，得到的融合基因ATG-sig-dsNKG2D-IL-21，其序列如SEQIDN〇:l所 不O2. -种融合基因表达载体pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21，其特征在于，其基因序列如 SEQIDNO:2 所示。3. -种纳米基因疫苗，其特征在于，由壳聚糖包封pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21融合 蛋白表达载体构成。4. 如权利要求3所述纳米基因疫苗，其特征在于，所述壳聚糖为羟丙基三甲基氯化铵 壳聚糖。5. -种制备权利要求3所述的纳米基因疫苗的方法，其特征在于，步骤如下： 1)pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体的构建：以利用PCR分别扩增 鼠0 2-微球蛋白的信号肽、及鼠NKG2D受体的第一个胞外区的融合片段SEQIDN0:4,和 NKG2D的第2个胞外区SEQIDNO: 5,及IL-21的融合片段SEQIDNO: 6,将这三个片段先后 插入pcDNA3. 1(_)载体，得到融合蛋白表达载体； 2) 纳米基因疫苗的制备：利用大提质粒试剂盒，大量提取无内毒素 pcDNA3.l-sig-dsNKg2D-IL-21融合基因表达载体，利用壳聚糖体外溶胀法制备成纳米基因 疫苗。6. 如权利要求5所述的纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，壳聚糖：融合蛋白表达 载体质量比为1 :2~2:1。7. 如权利要求5所述纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为羟丙基三 甲基氯化铵壳聚糖。8. 如权利要求5所述的纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，使用的大提质粒试剂 盒为Qiagen公司大提质粒试剂盒。9. 如权利要求5所述的纳米基因疫苗的制备方法，其特征在于，壳聚糖体外溶胀法制 备纳米基因疫苗，包括如下步骤： 1) 将融合蛋白表达载体溶液滴加入壳聚糖中，300rpm，室温振荡30分钟，混合均匀； 2) 4°C离心机离心20-25分钟，彻底分离游离DNA和纳米基因药物。10. 权利要求3所述的纳米基因疫苗在制备增强免疫或抑制肿瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种刺激淋巴细胞活化的新型纳米基因药物及其制备方法，公开了一种融合基因，由融合基因dsNKG2D-IL-21基因的上游引入鼠β-2微球蛋白的信号肽序列，得到融合基因ATG-sig-dsNKG2D-IL-21；一种融合基因表达载体pcDNA3.1-sig-dsNKg2D-IL-21；一种纳米基因疫苗药物，由壳聚糖包封pcDNA3.1-sig-dsNKg2D-IL-21融合蛋白表达载体构成。本发明还提供纳米基因疫苗的制备方法。该纳米药物用来运送具有刺激淋巴活化和体内靶向性分布的重组dsNKG2D-IL-21基因载体的纳米凝胶，有望成为抗肿瘤和感染性疾病的药物。
【IPC分类】C12N15/62, A61K39/00, A61K48/00, A61P35/00, A61P37/02, C12N15/63
【公开号】CN104894151
【申请号】CN201510289975
【发明人】赵培蕾, 龚卫娟, 肖炜明
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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