温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用
温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中温度敏感型载体pBBRlMCS-2-Tsl及其应用。
【背景技术】
[0002] 把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表 达的工具叫载体（Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及 酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体 大致应有下列一些特性：（1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2)具有多种常用的限制性内 切酶的单切点；（3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；（5) 对宿主细胞无害。
[0003] 宽宿主质粒pBBRlMCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBRl质粒改造而来。 pBBRl 质粒来源于革兰氏阴性菌 Bordetella bronchiseptica S87 (Antoine R and Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms. Mol Microbiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 个卡那霉素（kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特性使得该质粒适用于DNA克 隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。
[0004] 温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质 粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建重组载体的方法。
[0007] 本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法1，是将SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBRlMCS-2-Tsl ;
[0008] 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行Al)的改 造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质，即所述目的基因表达盒编码 的蛋白质为SEQ ID No. 4所示的蛋白质：所述Al)为如下All)和/或A12)和/或A13):
[0009] All)将 SEQ ID No. 2 第 12 位的 Ala 突变为 Thr ;
[0010] A12)将 SEQ ID No. 2 第 81 位的 Asp 突变为 His ;
[0011] A13)将 SEQ ID No. 2 第 140 位的 His 突变为 Leu。
[0012] 上述方法1中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行BI)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位 核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子，即所述目的基因表达盒的 序列为SEQ ID No. 3 :所述BI)为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14):
[0013] BI 1)将 SEQ ID No. 1 第 1827 位的 G 突变为 A ;
[0014] B12)将 SEQ ID No. 1 第 2034 位的 G 突变为 C ;
[0015] B13)将 SEQ ID No. 1 第 2212 位的 A 突变为 T ;
[0016] B14)将 SEQ ID No. 1 第 2249 位的 C 突变为 A。
[0017] 其中，SEQ ID No. 1由5145个核苷酸组成，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸 为r印的编码基因，编码SEQ ID No. 2所示的r印蛋白。SEQ ID No. 3的第238-900位编码 SEQ ID No. 4所示的蛋白质。
[0018] 上述方法1中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的 终止子为SEQ ID No. 1的第2457-2526位所示的DNA分子。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了构建重组载体的方法。
[0020] 本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法2,是将SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；
[0021] 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No. 2所不的蛋白质进行所述Al) 及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸残基均 不变得到的蛋白质：
[0022] A2)将 SEQ ID No. 2 第 130 位的 His 突变为 Gln ;
[0023] A3)将 SEQ ID No. 2 第 86 位的 Arg 突变为 Cys ;
[0024] A4)如下 A41)和 / 或 A42):
[0025] A41)将 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突变为 Glu ;
[0026] A42)将 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突变为 Val。
[0027] 上述方法2中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行所述BI)及下述B2)、B3)和M)这三种中至少一 种的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均 不变得到的DNA分子：
[0028] B2)将 SEQ ID No. 1 第 2183 位的 C 突变为 G ;
[0029] B3)将 SEQ ID No. 1 第 2049 位的 C 突变为 T ;
[0030] B4)如下 B41)和 / 或 B42):
[0031] B41)将 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突变为 G ;
[0032] B42)将 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突变为 G。
[0033] 上述方法2中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的 改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变 得到的DNA分子：
[0034] C2)如下 C21)和 / 或 C22):
[0035] C21)将 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突变为 G ;
[0036] C22)将 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突变为 T ;
[0037] C3)如下 C31)和 / 或 C32):
[0038] C31)将 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突变为 T ;
[0039] C32)将 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突变为 A ;
[0040] C4)将 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突变为 A ;
[0041] 所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。
[0042] 为解决上述技术问题，本发明还提供了由所述方法1或所述方法2构建的重组载 体。
[0043] 为解决上述技术问题，本发明还提供了含有所述重组载体的重组微生物或重组细 胞系。
[0044] 所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌。其中，所述细菌可为大肠杆 菌或类球红细菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌 Escherichia coli DH5a、大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 或大肠杆菌 Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0045] 所述重组细胞系不包括繁殖材料。
[0046] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
[0047] Pl、所述蛋白质；
[0048] P2、所述目的基因。
[0049] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0050] L1、所述目的基因在制备温度敏感载体中的应用；
[0051] L2、所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。
[0052] 上述L2所述应用可为所述重组载体在大肠杆菌或类球红细菌中作为温度敏 感载体中的应用。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌 Escherichia coli DH5a、大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 或大肠杆菌 Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0053] 本申请中，所述温度敏感载体为所述载体在一定温度下可存在于宿主中，而改变 温度后，所述载体不能存在于所述宿主中。具体可为所述载体在30°C下可存在于宿主中，当 温度为37°C -42°C时，所述载体不能存在于所述宿主中。
[0054] 实验证明，本发明的重组载体pBBRlMCS-2-Tsl为温度敏感载体：在宿主菌 分别为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌Escherichia coli DH5a、大肠杆 菌 Escherichia coli BW25113 和大肠杆菌 Escherichia coli S17-1 时，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液体培养基和30°C LB+kan液体培养基中的丢失率以及 pBBRlMCS-2在42°C LB液体培养基中的丢失率均在10 %以下，而pBBRlMCS-2-Ts 1在42°C LB 液体培养基中的丢失率均达到99. 99%;在宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1 时，pBBRlMCS-2 和 pBBRlMCS-2-Tsl 在 30°C LB 液体培养基和 30°C LB+kan 液体培 养基中的丢失率以及PBBR1MCS-2在37°C LB液体培养基中的丢失率均在13 %以下，而 pBBRlMCS-2-Tsl在37°C LB液体培养基中的丢失率均达到78. 18%。
[0055] 实验证明，本发明的重组载体pBBRlMCS-2-Tsl为温度敏感载体可应用于：（1)载 体消除，即通过提高温度移去载体；（2)单交换同源重组，即通过提高温度，让载体DNA整合 到染色体的同源区域；（3)双交换同源重组，即通过提高温度，让载体DNA替换染色体上一 段 DNA。
【附图说明】
[0056] 图 1 为 pBBRlMCS-2 的图谱。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0058] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060] 下述实施例中的宽宿主载体pBBRlMCS-2为Biovector中国质粒载体菌株细胞株 基因保藏中心产品。 [0061] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli Tl为北京全式金生物技术有限公司 产品，目录号为CD501-01。
[0062] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli DH5 α为宝生物工程（大连）有限 公司，目录号为9057。
[0063] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli BW25113为Biovector中国质粒载 体菌株细胞株基因保藏中心产品。
[0064] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli S17-1为Biovector中国质粒载体 菌株细胞株基因保藏中心产品。
[0065] 下述实施例中的类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1为美国模式菌种收 集中心（ATCC)产品，菌株号为17023。
[0066] 下述实施例中的Sistrom培养基在文献（Sistrom WR. The kinetics of the synthesis of photopigments in Rhodopseudomonas sphaeroides. J.Gen. Microbiol. 1962.28:607-616)中报道过。
[0067] 下述实施例中的LB液体培养基为由溶质和溶剂组成无菌培养基，溶剂为水，溶质 及其浓度分别为胰蛋白胨lg/l〇〇mL，酵母浸粉0. 5g/100mL，NaCl 0. 5g/100mL ;
[0068] LB+kan液体培养基为向LB液体培养基中加入卡那霉素得到的无菌培养基， LB+kan液体培养基中卡那霉素的含量为50mg/L ;
[0069] LB平板为向LB液体培养基中加入琼脂得到的无菌固体培养基；
[0070] LB+kan平板为向LB液体培养基中加入琼脂和卡那霉素得到的无菌固体培养基， LB+kan平板中卡那霉素的含量为50mg/L。
[0071] 实施例1、温度敏感载体的制备
[0072] 1、温度敏感载体的筛选
[0073] 对宽宿主载体pBBRlMCS-2(图1)中SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA 片段进行随机突变，得到多条不同随机突变的突变后的DNA分子；将pBBRlMCS-2中SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段分别替换为上述各突变后的DNA分子，保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变，得到多个含有突变DNA片段的重组载体；将这些含有突变DNA 片段的重组载体分别导入大肠杆菌Escherichia coli Tl中，得到1068个含有突变DNA片 段的重组大肠杆菌。将pBBRlMCS-2导入大肠杆菌Escherichia coli Tl中，得到重组大肠 杆菌 Tl (pBBRlMCS-2)。
[0074] 其中，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸编码SEQ ID No. 2所示的r印蛋白。
[0075] 对上述含有突变DNA片段的重组大肠杆菌按照下述方法进行筛选，并将 Tl (pBBRlMCS-2)作为对照：将这1068个重组大肠杆菌中的每个重组大肠杆菌的同 一克隆分别进行①和②的处理：①将重组大肠杆菌接种至LB平板上，于42 °C下培养 18h，然后将LB平板上42°C下长出的重组大肠杆菌接种至LB+kan平板上，于42°C下 培养18h;②将重组大肠杆菌接种至LB+kan平板上，于30°C下培养18h。对比42°C 和30 °C下的LB+kan的平板，发现有4株重组大肠杆菌在30 °C下的LB+Kan平板上生 长正常，但在42°C下的LB+Kan平板上不能生长（表1)，而Tl(pBBRlMCS-2)在30°C下 的LB+Kan平板与42°C下的LB+Kan平板上均能正常生长，表明，这4株重组大肠杆菌对 温度敏感。将这4株重组大肠杆菌中从pBBRlMCS-2突变而来的重组载体分别命名为 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4,将对应的重组大 肠杆菌分别命名为 Tl (pBBRlMCS-2-Ts I)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)和 Tl (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0076] 表1、重组大肠杆菌的筛选
[0077]
[0078] 提取 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)和 Tl(pBBRlMCS-2-Ts4)中的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 质粒，分别对 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4对应于SEQ ID No. 1的第1557-2526位核苷酸所示的DNA片段进行测序， 发现：
[0079] pBBRlMCS-2-Tsl 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B11)、B12)、B13)和 B14)的改造并保 持pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Tsl的第1557-2526位核苷 酸序列为SEQ ID No. 3 :
[0080] BI 1)将 SEQ ID No. 1 第 1827 位的 G 突变为 A ;
[0081] B12)将 SEQ ID No. 1 第 2034 位的 G 突变为 C ;
[0082] B13)将 SEQ ID No. 1 第 2212 位的 A 突变为 T ;
[0083] B14)将 SEQ ID No. 1 第 2249 位的 C 突变为 A。
[0084] pBBRlMCS-2-Ts2 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B2)、C21)和 C22)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Ts2的第1557-2526位核苷酸序 列为 SEQ ID No. 5 :
[0085] B2)将 SEQ ID No. 1 第 2183 位的 C 突变为 G ;
[0086] C21)将 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突变为 G ;
[0087] C22)将 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突变为 T ;
[0088] pBBRlMCS-2-Ts3 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B3)、C31)和 C32)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Ts3的第1557-2526位核苷酸序 列为 SEQ ID No. 7 :
[0089] B3)为将 SEQ ID No. 1 第 2049 位的 C 突变为 T ;
[0090] C31)将 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突变为 T ;
[0091] C32)将 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突变为 A ;
[0092] pBBRlMCS-2-Ts4 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B41)、B42)和 C4)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Ts4的第1557-2526位核苷酸序 列为 SEQ ID No. 9 :
[0093] B41)将 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突变为 G ;
[0094] B42)将 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突变为 G ;
[0095] C4)将 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突变为 A。
[0096] 表明，与 pBBRlMCS-2 相比，pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4均发生了部分核苷酸的突变。
[0097] 在 1068 个重组大肠杆菌中除 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、 Tl (pBBR1MCS-2-Ts3)和 Tl (pBBR1MCS-2-Ts4)外的重组大肠杆菌（在 30°C 下的 LB+Kan 平 板与42°C下的LB+Kan平板上均能正常生长，即对温度不敏感的重组大肠杆菌）中随机选 取10株，对这10株中从pBBRlMCS-2突变而来的重组载体进行测序，结果发现，这10株对 温度不敏感的重组大肠杆菌中从PBBR1MCS-2突变而来的重组载体也均发生了部分核苷酸 的突变。
[0098] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Tsl的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 4)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下All)、A12)和A13)的 改造得到的蛋白质：
[0099] All)将 SEQ ID No. 2 第 12 位的 Ala 突变为 Thr ;
[0100] A12)将 SEQ ID No. 2 第 81 位的 Asp 突变为 His ;
[0101] A13)将 SEQ ID No. 2 第 140 位的 His 突变为 Leu。
[0102] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts2的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 6)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下A2)的改造得到的蛋 白质：A2)为将SEQ ID No. 2第130位的His突变为Gin。
[0103] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts3的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 8)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下A3)的改造得到的蛋 白质：A3)为将SEQ ID No. 2第86位的Arg突变为Cys。
[0104] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts4的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 10)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下A41)和A42)的改造 得到的蛋白质：
[0105] A41)将 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突变为 Glu ;
[0106] A42)将 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突变为 Val。
[0107] 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 温度敏 感性的验证
[0108] 将步骤1的Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)接种至LB+kan液体培养基中，于30°C培养18小 时，将得到的菌液进行以下处理：
[0109] ①将菌液按I :1000的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于30°C下培养18小 时，得到LB-30°C菌液；将LB-30°C菌液稀释后得到LB-30°C稀释菌液，将LB-30°C稀释菌液 分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-30°C稀释菌液，然后于30°C下 培养18小时，分别得到LB-LB-30°C平板和LB-LB+kan-30°C平板，统计LB-LB-30°C平板和 LB-LB+kan-30°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液体培养 基中的丢失率（表2)，载体的丢失率=(LB-LB-30°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-30°C平 板上的菌落数）+LB-LB-30°C平板上的菌落数；
[0110] ②将菌液按1 :1〇〇〇的比例接种至3mL LB+kan液体培养基中，然后于30°C下培 养18小时，得到LB+kan-30 °C菌液；将LB+kan-30 °C菌液稀释后得到LB+kan-30 °C稀释 菌液，将LB+kan-30°C稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB+kan-30 °C稀释菌液，然后于30 °C下培养18小时，分别得到LB+kan-LB-30 °C平板和 LB+kan_LB+kan_30°C 平板，统计 LB+kan_LB_30°C 平板 和 LB+kan_LB+kan_30°C 平板上的菌 落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB+kan液体培养基中的丢失率（表2)， 载体的丢失率=(LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数一 LB+kan-LB+kan-30°C平板上的菌落 数）+ LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数；
[0111] ③将菌液按I :1000的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于42°C下培养18小 时，得到LB-42°C菌液；将LB-42°C菌液稀释后得到LB-42°C稀释菌液，将LB-42°C稀释菌液 分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-42°C稀释菌液，然后于42°C下 培养18小时，分别得到LB-LB-42°C平板和LB-LB+kan-42°C平板，统计LB-LB-42°C平板和 LB-LB+kan-42°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在42°C LB液体培养 基中的丢失率（表2)，载体的丢失率=(LB-LB-42°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-42°C平 板上的菌落数）+LB-LB-42°C平板上的菌落数。
[0112] 按照上述方法，将 Tl(pBBRlMCS-2-Tsl)替换为 Tl(pBBRlMCS-2-Ts2)、 Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts4)和 Tl (pBBRlMCS-2)，其他步骤均不变，得到重 组载体 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3、pBBRlMCS-2-Ts4 和 pBBRlMCS-2 分别在 30°C LB 液体培养基、30 °C LB+kan液体培养基和42 °C LB液体培养基中的丢失率（表2)。
[0113] 表2、重组载体在不同温度下的丢失率
[0114]
[0115] 上述 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在30 °C LB液体培养基中的丢失率在8. 70% -9. 62%间，在30 °C LB+kan液体培养基中 的丢失率在4. 44% -7. 84%间，而在42°C LB液体培养基中的丢失率均达99. 99%，而 口881?1]\?^-2在这三种液体培养基中的丢失率在4.76%-9.80%间，说明？881?1]\?^-2-了81、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 均为温度敏感型载体。
[0116] 实施例 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中的温度敏感性
[0117] 分别将 pBBRlMCS-2 及实施例 1 步骤 1 的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、 pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别导入大肠杆菌 Escherichia coli DH5 a 中，分别得到重组大肠杆菌 DH5a (pBBRlMCS-2)、DH5a (pBBRlMCS-2-Tsl)、 DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts2)、DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts3)和 DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0118] 按照实施例1步骤2的方法，将Tl(pBBRlMCS-2-Tsl)分别替换为上 述 DH5a (pBBRlMCS-2)、DH5a (pBBRlMCS-2-Tsl)、DH5a (pBBRlMCS-2-Ts2)、 DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts3)和DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主 菌为大肠杆菌 Escherichia coli DH5a 时重组载体 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30 °C LB 液体培养基、 30°C LB+kan液体培养基和42°C LB液体培养基中的丢失率（表3)。
[0119] 表3、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中的丢失率
[0120]
[0121] 在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli DH5a 时，pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30°C LB 液体培养基和 30°C LB+kan 液体培养基中的丢失率以及口881?11?^-2在42°〇1^液体培养基中的丢失率均在10%以下， pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 42°C LB 液体培 养基中的丢失率均达到 99. 99%，说明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和pBBRlMCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中均可表现出其温度敏感性。
[0122] 实施例 3、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中的温度敏感性
[0123] 分别将 pBBRlMCS-2 及实施例 1 步骤 1 的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、 pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别导入大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 中，分别得到重组大肠杆菌 BW25113(pBBRlMCS-2)、BW25113(pBBRlMCS-2-Tsl)、 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts2)、BW25113(pBBRlMCS-2-Ts3)和 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0124] 按照实施例1步骤2的方法，将Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)分别替换为上述 BW25113(pBBRlMCS-2)、BW25113 (pBBRlMCS-2-Tsl)、BW25113 (pBBRlMCS-2-Ts2)、 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts3)和 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿 主菌为大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 时重组载体 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30 °C LB 液体培养基、 30°C LB+kan液体培养基和42°C LB液体培养基中的丢失率（表4)。
[0125] 表4、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中的丢失率
[0126]
[0128] 在宿主菌为大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 时，pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30 °C LB 液 体培养基和30°C LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBRlMCS-2在42°C LB液体培养 基中的丢失率均在10%以下，口831?1]\?^-2-了81、口881?1]\?^-2-了82、口881?1]\?^-2-了83和 pBBRlMCS-2-Ts4在42°C LB液体培养基中的丢失率均达到99. 99%，说明pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌 Escherichia coli BW25113中均可表现出其温度敏感性。
[0129] 实施例 4、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中的温度敏感性
[0130] 分别将 pBBRlMCS-2 及实施例 1 步骤 1 的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、 pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别导入大肠杆菌 Escherichia coli S17-1 中，分别得到重组大肠杆菌 S17-l(pBBRlMCS-2)、S17-l(pBBRlMCS-2-Tsl)、 S17-1(pBBRlMCS-2-Ts2)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3)和 S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0131] 按照实施例1步骤2的方法，将Tl(pBBRlMCS-2-Tsl)分别替换为上 述 S17-1 (pBBRlMCS-2)、S17-1(pBBRlMCS-2-Tsl)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts2)、 S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3)和 S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主 菌为大肠杆菌 Escherichia coli S17-1 时重组载体 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30 °C LB 液体培养基、 30°C LB+kan液体培养基和42°C LB液体培养基中的丢失率（表5)。
[0132] 表5、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中的丢失率
[0133]
[0135] 在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli S17-1 时，pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30°C LB 液体培养基和 30°C LB+kan 液体培养基中的丢失率以及口881?11?^-2在42°〇1^液体培养基中的丢失率均在10%以下， pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 42°C LB 液体培 养基中的丢失率均达到 99. 99%，说明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和pBBRlMCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中均可表现出其温度敏感性。
[0136] 实施例 5、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中的温度敏感性
[0137] 1、重组类球红细菌的制备
[0138] (1)将实施例4的重组大肠杆菌S17-l(pBBRlMCS-2)在LB+kan液体培养基中37°C 摇瓶过夜培养，次日以1/10的转接量转接至新鲜的LB液体培养基，继续培养约1-2小时至 0D600 为 I. 0 左右，得到 S17-1 (pBBRlMCS-2)培养液；取 I. 5mL S17-1 (pBBRlMCS-2)培养液 7000rpm下离心3-5分钟，弃上清液，得到菌体沉淀，用新鲜的LB培养基洗涤菌体沉淀2次， 用200 μ L LB液体培养基重悬菌体沉淀，得到供体菌悬浮液；
[0139] (2)将类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1在LB液体培养基中30°C下 培养24小时后转接至新鲜的LB培养基继续培养约24小时至0D600为1. 7-2. 5左右，得到 类球红细菌培养液；取I. 5mL类球红细菌培养液7000rpm下离心3-5分钟，弃上清液，得到 菌体沉淀，用新鲜的LB培养基洗涤菌体沉淀2次，用300 μ L LB液体培养基重悬菌体沉淀， 得到受体菌悬浮液；
[0140] (3)将30 μ L步骤（1)的供体菌悬浮液和300 μ L步骤（2)的受体菌悬浮液混匀后 涂布于LB平板上，30°C培养2 0-24小时；
[0141] (4)将步骤（3) LB平板上长出的菌用冰上预冷的ImL Sistrom培养基洗脱至EP管 中。4°C 5000rpm下离心2分钟，弃上清液，用500 μ 1冰上预冷的Sistrom培养基洗绦沉淀 两次，最后用100 μ L冰上预冷的Sistrom培养基重悬沉淀，得到菌体悬浮液；
[0142] (5)将步骤（4)的菌体悬浮液涂布在Sistrom平板（Sistrom平板为向Sistrom培 养基中加入K 2TeO3和卡那霉素得到的K2TeO3浓度为150mg/L、卡那霉素浓度为50mg/L的固 体培养基）上，30°C下培养3-5天长出接合子，即为含有pBBRlMCS-2-Tsl的重组类球红细 菌，将该重组菌命名为R. s (pBBRlMCS-2)。
[0143] 按照上述步骤（1) - (5)的方法，分别将重组大肠杆菌S17-1 (pBBRlMCS-2)替 换为 S17-1 (pBBRlMCS-2-Tsl)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts2)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3) 和S17-l(pBBRlMCS-2-Ts4)，替他步骤均不变，得到分别含有pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 的重组类球红细菌，将这些重组 菌分别命名为 R. s (pBBRlMCS-2-Tsl)、R. s (pBBRlMCS-2-Ts2)、R. s (pBBRlMCS-2-Ts3)和 R.s (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0144] 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在类球 红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1中的温度敏感性
[0145] 将步骤1的R. s (pBBRlMCS-2-Tsl)接种至LB+kan液体培养基中，于30°C培养20 小时，将得到的菌液进行以下处理：
[0146] ①将菌液按I :500的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于30°C下培养24小 时，得到LB-30°C菌液；将LB-30°C菌液稀释后得到LB-30°C稀释菌液，将LB-30°C稀释菌 液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-30°C稀释菌液，然后于30°C 下培养4天，分别得到LB-LB-30°C平板和LB-LB+kan-30°C平板，统计LB-LB-30°C平板和 LB-LB+kan-30°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液体培养 基中的丢失率，载体的丢失率=(LB-LB-30°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-30°C平板上的 菌落数）+LB-LB-30°C平板上的菌落数；
[0147] ②将菌液按I :500的比例接种至3mL LB+kan液体培养基中，然后于30°C下 培养24小时，得到LB+kan-30 °C菌液；将LB+kan-30 °C菌液稀释后得到LB+kan-30 °C 稀释菌液，将LB+kan-30 °C稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板 100 μ L LB+kan-30 °C稀释菌液，然后于30 °C下培养4天，分别得到LB+kan-LB-30 °C平板 和 LB+kan_LB+kan_30 °C 平板，统计 LB+kan_LB_30 °C 平板和 LB+kan_LB+kan_30 °C 平板上 的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB+kan液体培养基中的丢失率， 载体的丢失率=(LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数一 LB+kan-LB+kan-30°C平板上的菌落 数）+ LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数；
[0148] ③将菌液按I :500的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于37°C下培养24小 时，得到LB-37°C菌液；将LB-37°C菌液稀释后得到LB-37°C稀释菌液，将LB-37°C稀释菌 液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-37°C稀释菌液，然后于37°C 下培养4天，分别得到LB-LB-37°C平板和LB-LB+kan-37°C平板，统计LB-LB-37°C平板和 LB-LB+kan-37°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在37°C LB液体培养 基中的丢失率（表6)，载体的丢失率=(LB-LB-37°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-37°C平 板上的菌落数）+LB-LB-37°C平板上的菌落数。
[0149] 按照上述方法，将 R. s(pBBRlMCS-2-Tsl)替换为 R. s(pBBRlMCS-2-Ts2)、 R. s(pBBRlMCS-2-Ts3)、R. s(pBBRlMCS-2-Ts4)和 R. s(pBBRlMCS-2)，其他步骤均不变，分 别得到宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1时重组载体pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30°C LB 液 体培养基、30 °C LB+kan液体培养基和37 °C LB液体培养基中的丢失率（表6)。
[0150] 表6、温度敏感型载体在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中的丢失 率
[0151]
[0152]
[0153]在宿主菌为类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides 2· 4· 1 时，pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30 °C LB 液 体培养基和30 °C LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBRlMCS-2在37 °C LB液体培养 基中的丢失率均在 13% 以下，pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4在37°C LB液体培养基中的丢失率分别达到78. 18%、81. 36%、80. 53%和 78. 57%，说明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在类 球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中均可表现出其一定的温度敏感性。
【主权项】
1. 构建重组载体的方法，是将SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为 目的基因表达盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载 体； 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQIDNo. 2所示的蛋白质进行Al)的改造、 保持SEQIDNo. 2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述Al)为如下All)和/或 A12)和 / 或A13): All)将SEQIDNo. 2 第 12 位的Ala突变为Thr; A12)将SEQIDNo. 2 第 81 位的Asp突变为His; A13)将SEQIDNo. 2 第 140 位的His突变为Leu。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基因为将 SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行BI)的改造、保持SEQIDNo. 1 的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：所述BI) 为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14): BI1)将SEQIDNo. 1第1827位的G突变为A; B12)将SEQIDNo. 1第2034位的G突变为C; B13)将SEQIDNo. 1第2212位的A突变为T; B14)将SEQIDNo. 1第2249位的C突变为A。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所述目 的基因表达的启动子为SEQIDNo. 1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表 达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQIDNo. 1的第2457-2526位所示的DNA分子。4. 构建重组载体的方法，是将SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为 目的基因表达盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载 体； 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQIDNo. 2所示的蛋白质进行权利要求1所 述Al)及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQIDNo. 2的其它氨基酸 残基均不变得到的蛋白质： A2)将SEQIDNo. 2 第 130 位的His突变为Gln; A3)将SEQIDNo. 2第86位的Arg突变为Cys; A4)如下A41)和 / 或A42): A41)将SEQIDNo. 2 第 25 位的Lys突变为Glu; A42)将SEQIDNo. 2 第 146 位的Ile突变为Val。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基因为将 SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行权利要求2所述BI)及下述 B2)、B3)和B4)这三种中至少一种的改造、保持SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所 示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子： B2)将SEQIDNo. 1第2183位的C突变为G; B3)将SEQIDNo. 1第2049位的C突变为T; B4)如下B41)和/或M2): B41)将SEQIDNo. 1第1866位的A突变为G; B42)将SEQIDNo. 1第2229位的A突变为G。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所述目 的基因表达的启动子为将SEQIDNo. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、 C3)和C4)这三种中至少一种的改造、保持SEQIDNo. 1的第1557-1793位核苷酸所示的 DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子： C2)如下C21)和 / 或C22): C21)将SEQIDNo. 1第1732位的A突变为G; C22)将SEQIDNo. 1第1780位的G突变为T; C3)如下C31)和 / 或C32): C31)将SEQIDNo. 1第1747位的C突变为T; C32)将SEQIDNo. 1第1776位的T突变为A; C4)将SEQIDNo. 1第1751位的T突变为A; 所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQIDNo. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。7. 由权利要求1-6中任一所述方法构建的重组载体。8. 含有权利要求7所述重组载体的重组微生物或重组细胞系。9. 下述任一产品： Pl、权利要求1或4所述蛋白质； P2、权利要求2或5所述目的基因。10. 下述任一应用： Ll、权利要求2或5所述目的基因在制备温度敏感载体中的应用； L2、权利要求7所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。
【专利摘要】本发明公开了温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用。本发明所提供的温度敏感型载体，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组载体；目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造得到的蛋白质：A1)为如下A11)、A12)和A13)：A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
【IPC分类】C12N15/63, C12N1/15, C12N1/13, C12N1/19, C12N1/21
【公开号】CN104894153
【申请号】CN201510340926
【发明人】黄建忠, 江贤章, 周芬, 刘洪娇, 祁峰, 张明亮, 陶勇
【申请人】福建师范大学, 中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中温度敏感型载体pBBRlMCS-2-Tsl及其应用。
【背景技术】
[0002] 把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表 达的工具叫载体（Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及 酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体 大致应有下列一些特性：（1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2)具有多种常用的限制性内 切酶的单切点；（3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；（5) 对宿主细胞无害。
[0003] 宽宿主质粒pBBRlMCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBRl质粒改造而来。 pBBRl 质粒来源于革兰氏阴性菌 Bordetella bronchiseptica S87 (Antoine R and Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms. Mol Microbiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 个卡那霉素（kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特性使得该质粒适用于DNA克 隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。
[0004] 温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质 粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建重组载体的方法。
[0007] 本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法1，是将SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBRlMCS-2-Tsl ;
[0008] 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行Al)的改 造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质，即所述目的基因表达盒编码 的蛋白质为SEQ ID No. 4所示的蛋白质：所述Al)为如下All)和/或A12)和/或A13):
[0009] All)将 SEQ ID No. 2 第 12 位的 Ala 突变为 Thr ;
[0010] A12)将 SEQ ID No. 2 第 81 位的 Asp 突变为 His ;
[0011] A13)将 SEQ ID No. 2 第 140 位的 His 突变为 Leu。
[0012] 上述方法1中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行BI)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位 核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子，即所述目的基因表达盒的 序列为SEQ ID No. 3 :所述BI)为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14):
[0013] BI 1)将 SEQ ID No. 1 第 1827 位的 G 突变为 A ;
[0014] B12)将 SEQ ID No. 1 第 2034 位的 G 突变为 C ;
[0015] B13)将 SEQ ID No. 1 第 2212 位的 A 突变为 T ;
[0016] B14)将 SEQ ID No. 1 第 2249 位的 C 突变为 A。
[0017] 其中，SEQ ID No. 1由5145个核苷酸组成，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸 为r印的编码基因，编码SEQ ID No. 2所示的r印蛋白。SEQ ID No. 3的第238-900位编码 SEQ ID No. 4所示的蛋白质。
[0018] 上述方法1中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的 终止子为SEQ ID No. 1的第2457-2526位所示的DNA分子。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明还提供了构建重组载体的方法。
[0020] 本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法2,是将SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；
[0021] 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No. 2所不的蛋白质进行所述Al) 及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸残基均 不变得到的蛋白质：
[0022] A2)将 SEQ ID No. 2 第 130 位的 His 突变为 Gln ;
[0023] A3)将 SEQ ID No. 2 第 86 位的 Arg 突变为 Cys ;
[0024] A4)如下 A41)和 / 或 A42):
[0025] A41)将 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突变为 Glu ;
[0026] A42)将 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突变为 Val。
[0027] 上述方法2中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行所述BI)及下述B2)、B3)和M)这三种中至少一 种的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均 不变得到的DNA分子：
[0028] B2)将 SEQ ID No. 1 第 2183 位的 C 突变为 G ;
[0029] B3)将 SEQ ID No. 1 第 2049 位的 C 突变为 T ;
[0030] B4)如下 B41)和 / 或 B42):
[0031] B41)将 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突变为 G ;
[0032] B42)将 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突变为 G。
[0033] 上述方法2中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的 改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变 得到的DNA分子：
[0034] C2)如下 C21)和 / 或 C22):
[0035] C21)将 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突变为 G ;
[0036] C22)将 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突变为 T ;
[0037] C3)如下 C31)和 / 或 C32):
[0038] C31)将 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突变为 T ;
[0039] C32)将 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突变为 A ;
[0040] C4)将 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突变为 A ;
[0041] 所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。
[0042] 为解决上述技术问题，本发明还提供了由所述方法1或所述方法2构建的重组载 体。
[0043] 为解决上述技术问题，本发明还提供了含有所述重组载体的重组微生物或重组细 胞系。
[0044] 所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌。其中，所述细菌可为大肠杆 菌或类球红细菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌 Escherichia coli DH5a、大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 或大肠杆菌 Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0045] 所述重组细胞系不包括繁殖材料。
[0046] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一产品：
[0047] Pl、所述蛋白质；
[0048] P2、所述目的基因。
[0049] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0050] L1、所述目的基因在制备温度敏感载体中的应用；
[0051] L2、所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。
[0052] 上述L2所述应用可为所述重组载体在大肠杆菌或类球红细菌中作为温度敏 感载体中的应用。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌 Escherichia coli DH5a、大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 或大肠杆菌 Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0053] 本申请中，所述温度敏感载体为所述载体在一定温度下可存在于宿主中，而改变 温度后，所述载体不能存在于所述宿主中。具体可为所述载体在30°C下可存在于宿主中，当 温度为37°C -42°C时，所述载体不能存在于所述宿主中。
[0054] 实验证明，本发明的重组载体pBBRlMCS-2-Tsl为温度敏感载体：在宿主菌 分别为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌Escherichia coli DH5a、大肠杆 菌 Escherichia coli BW25113 和大肠杆菌 Escherichia coli S17-1 时，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液体培养基和30°C LB+kan液体培养基中的丢失率以及 pBBRlMCS-2在42°C LB液体培养基中的丢失率均在10 %以下，而pBBRlMCS-2-Ts 1在42°C LB 液体培养基中的丢失率均达到99. 99%;在宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1 时，pBBRlMCS-2 和 pBBRlMCS-2-Tsl 在 30°C LB 液体培养基和 30°C LB+kan 液体培 养基中的丢失率以及PBBR1MCS-2在37°C LB液体培养基中的丢失率均在13 %以下，而 pBBRlMCS-2-Tsl在37°C LB液体培养基中的丢失率均达到78. 18%。
[0055] 实验证明，本发明的重组载体pBBRlMCS-2-Tsl为温度敏感载体可应用于：（1)载 体消除，即通过提高温度移去载体；（2)单交换同源重组，即通过提高温度，让载体DNA整合 到染色体的同源区域；（3)双交换同源重组，即通过提高温度，让载体DNA替换染色体上一 段 DNA。
【附图说明】
[0056] 图 1 为 pBBRlMCS-2 的图谱。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0058] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060] 下述实施例中的宽宿主载体pBBRlMCS-2为Biovector中国质粒载体菌株细胞株 基因保藏中心产品。 [0061] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli Tl为北京全式金生物技术有限公司 产品，目录号为CD501-01。
[0062] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli DH5 α为宝生物工程（大连）有限 公司，目录号为9057。
[0063] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli BW25113为Biovector中国质粒载 体菌株细胞株基因保藏中心产品。
[0064] 下述实施例中的大肠杆菌Escherichia coli S17-1为Biovector中国质粒载体 菌株细胞株基因保藏中心产品。
[0065] 下述实施例中的类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1为美国模式菌种收 集中心（ATCC)产品，菌株号为17023。
[0066] 下述实施例中的Sistrom培养基在文献（Sistrom WR. The kinetics of the synthesis of photopigments in Rhodopseudomonas sphaeroides. J.Gen. Microbiol. 1962.28:607-616)中报道过。
[0067] 下述实施例中的LB液体培养基为由溶质和溶剂组成无菌培养基，溶剂为水，溶质 及其浓度分别为胰蛋白胨lg/l〇〇mL，酵母浸粉0. 5g/100mL，NaCl 0. 5g/100mL ;
[0068] LB+kan液体培养基为向LB液体培养基中加入卡那霉素得到的无菌培养基， LB+kan液体培养基中卡那霉素的含量为50mg/L ;
[0069] LB平板为向LB液体培养基中加入琼脂得到的无菌固体培养基；
[0070] LB+kan平板为向LB液体培养基中加入琼脂和卡那霉素得到的无菌固体培养基， LB+kan平板中卡那霉素的含量为50mg/L。
[0071] 实施例1、温度敏感载体的制备
[0072] 1、温度敏感载体的筛选
[0073] 对宽宿主载体pBBRlMCS-2(图1)中SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA 片段进行随机突变，得到多条不同随机突变的突变后的DNA分子；将pBBRlMCS-2中SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段分别替换为上述各突变后的DNA分子，保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变，得到多个含有突变DNA片段的重组载体；将这些含有突变DNA 片段的重组载体分别导入大肠杆菌Escherichia coli Tl中，得到1068个含有突变DNA片 段的重组大肠杆菌。将pBBRlMCS-2导入大肠杆菌Escherichia coli Tl中，得到重组大肠 杆菌 Tl (pBBRlMCS-2)。
[0074] 其中，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸编码SEQ ID No. 2所示的r印蛋白。
[0075] 对上述含有突变DNA片段的重组大肠杆菌按照下述方法进行筛选，并将 Tl (pBBRlMCS-2)作为对照：将这1068个重组大肠杆菌中的每个重组大肠杆菌的同 一克隆分别进行①和②的处理：①将重组大肠杆菌接种至LB平板上，于42 °C下培养 18h，然后将LB平板上42°C下长出的重组大肠杆菌接种至LB+kan平板上，于42°C下 培养18h;②将重组大肠杆菌接种至LB+kan平板上，于30°C下培养18h。对比42°C 和30 °C下的LB+kan的平板，发现有4株重组大肠杆菌在30 °C下的LB+Kan平板上生 长正常，但在42°C下的LB+Kan平板上不能生长（表1)，而Tl(pBBRlMCS-2)在30°C下 的LB+Kan平板与42°C下的LB+Kan平板上均能正常生长，表明，这4株重组大肠杆菌对 温度敏感。将这4株重组大肠杆菌中从pBBRlMCS-2突变而来的重组载体分别命名为 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4,将对应的重组大 肠杆菌分别命名为 Tl (pBBRlMCS-2-Ts I)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)和 Tl (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0076] 表1、重组大肠杆菌的筛选
[0077]
[0078] 提取 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)和 Tl(pBBRlMCS-2-Ts4)中的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 质粒，分别对 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4对应于SEQ ID No. 1的第1557-2526位核苷酸所示的DNA片段进行测序， 发现：
[0079] pBBRlMCS-2-Tsl 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B11)、B12)、B13)和 B14)的改造并保 持pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Tsl的第1557-2526位核苷 酸序列为SEQ ID No. 3 :
[0080] BI 1)将 SEQ ID No. 1 第 1827 位的 G 突变为 A ;
[0081] B12)将 SEQ ID No. 1 第 2034 位的 G 突变为 C ;
[0082] B13)将 SEQ ID No. 1 第 2212 位的 A 突变为 T ;
[0083] B14)将 SEQ ID No. 1 第 2249 位的 C 突变为 A。
[0084] pBBRlMCS-2-Ts2 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B2)、C21)和 C22)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Ts2的第1557-2526位核苷酸序 列为 SEQ ID No. 5 :
[0085] B2)将 SEQ ID No. 1 第 2183 位的 C 突变为 G ;
[0086] C21)将 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突变为 G ;
[0087] C22)将 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突变为 T ;
[0088] pBBRlMCS-2-Ts3 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B3)、C31)和 C32)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Ts3的第1557-2526位核苷酸序 列为 SEQ ID No. 7 :
[0089] B3)为将 SEQ ID No. 1 第 2049 位的 C 突变为 T ;
[0090] C31)将 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突变为 T ;
[0091] C32)将 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突变为 A ;
[0092] pBBRlMCS-2-Ts4 为将 pBBRlMCS-2 进行如下 B41)、B42)和 C4)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不变得到的重组载体，pBBRlMCS-2-Ts4的第1557-2526位核苷酸序 列为 SEQ ID No. 9 :
[0093] B41)将 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突变为 G ;
[0094] B42)将 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突变为 G ;
[0095] C4)将 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突变为 A。
[0096] 表明，与 pBBRlMCS-2 相比，pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4均发生了部分核苷酸的突变。
[0097] 在 1068 个重组大肠杆菌中除 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、 Tl (pBBR1MCS-2-Ts3)和 Tl (pBBR1MCS-2-Ts4)外的重组大肠杆菌（在 30°C 下的 LB+Kan 平 板与42°C下的LB+Kan平板上均能正常生长，即对温度不敏感的重组大肠杆菌）中随机选 取10株，对这10株中从pBBRlMCS-2突变而来的重组载体进行测序，结果发现，这10株对 温度不敏感的重组大肠杆菌中从PBBR1MCS-2突变而来的重组载体也均发生了部分核苷酸 的突变。
[0098] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Tsl的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 4)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下All)、A12)和A13)的 改造得到的蛋白质：
[0099] All)将 SEQ ID No. 2 第 12 位的 Ala 突变为 Thr ;
[0100] A12)将 SEQ ID No. 2 第 81 位的 Asp 突变为 His ;
[0101] A13)将 SEQ ID No. 2 第 140 位的 His 突变为 Leu。
[0102] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts2的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 6)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下A2)的改造得到的蛋 白质：A2)为将SEQ ID No. 2第130位的His突变为Gin。
[0103] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts3的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 8)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下A3)的改造得到的蛋 白质：A3)为将SEQ ID No. 2第86位的Arg突变为Cys。
[0104] 与pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts4的第1794-2456位核苷酸编码的蛋白质（氨 基酸序列为SEQ ID No. 10)为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行如下A41)和A42)的改造 得到的蛋白质：
[0105] A41)将 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突变为 Glu ;
[0106] A42)将 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突变为 Val。
[0107] 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 温度敏 感性的验证
[0108] 将步骤1的Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)接种至LB+kan液体培养基中，于30°C培养18小 时，将得到的菌液进行以下处理：
[0109] ①将菌液按I :1000的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于30°C下培养18小 时，得到LB-30°C菌液；将LB-30°C菌液稀释后得到LB-30°C稀释菌液，将LB-30°C稀释菌液 分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-30°C稀释菌液，然后于30°C下 培养18小时，分别得到LB-LB-30°C平板和LB-LB+kan-30°C平板，统计LB-LB-30°C平板和 LB-LB+kan-30°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液体培养 基中的丢失率（表2)，载体的丢失率=(LB-LB-30°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-30°C平 板上的菌落数）+LB-LB-30°C平板上的菌落数；
[0110] ②将菌液按1 :1〇〇〇的比例接种至3mL LB+kan液体培养基中，然后于30°C下培 养18小时，得到LB+kan-30 °C菌液；将LB+kan-30 °C菌液稀释后得到LB+kan-30 °C稀释 菌液，将LB+kan-30°C稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB+kan-30 °C稀释菌液，然后于30 °C下培养18小时，分别得到LB+kan-LB-30 °C平板和 LB+kan_LB+kan_30°C 平板，统计 LB+kan_LB_30°C 平板 和 LB+kan_LB+kan_30°C 平板上的菌 落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB+kan液体培养基中的丢失率（表2)， 载体的丢失率=(LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数一 LB+kan-LB+kan-30°C平板上的菌落 数）+ LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数；
[0111] ③将菌液按I :1000的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于42°C下培养18小 时，得到LB-42°C菌液；将LB-42°C菌液稀释后得到LB-42°C稀释菌液，将LB-42°C稀释菌液 分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-42°C稀释菌液，然后于42°C下 培养18小时，分别得到LB-LB-42°C平板和LB-LB+kan-42°C平板，统计LB-LB-42°C平板和 LB-LB+kan-42°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在42°C LB液体培养 基中的丢失率（表2)，载体的丢失率=(LB-LB-42°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-42°C平 板上的菌落数）+LB-LB-42°C平板上的菌落数。
[0112] 按照上述方法，将 Tl(pBBRlMCS-2-Tsl)替换为 Tl(pBBRlMCS-2-Ts2)、 Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts4)和 Tl (pBBRlMCS-2)，其他步骤均不变，得到重 组载体 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3、pBBRlMCS-2-Ts4 和 pBBRlMCS-2 分别在 30°C LB 液体培养基、30 °C LB+kan液体培养基和42 °C LB液体培养基中的丢失率（表2)。
[0113] 表2、重组载体在不同温度下的丢失率
[0114]
[0115] 上述 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在30 °C LB液体培养基中的丢失率在8. 70% -9. 62%间，在30 °C LB+kan液体培养基中 的丢失率在4. 44% -7. 84%间，而在42°C LB液体培养基中的丢失率均达99. 99%，而 口881?1]\?^-2在这三种液体培养基中的丢失率在4.76%-9.80%间，说明？881?1]\?^-2-了81、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 均为温度敏感型载体。
[0116] 实施例 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中的温度敏感性
[0117] 分别将 pBBRlMCS-2 及实施例 1 步骤 1 的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、 pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别导入大肠杆菌 Escherichia coli DH5 a 中，分别得到重组大肠杆菌 DH5a (pBBRlMCS-2)、DH5a (pBBRlMCS-2-Tsl)、 DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts2)、DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts3)和 DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0118] 按照实施例1步骤2的方法，将Tl(pBBRlMCS-2-Tsl)分别替换为上 述 DH5a (pBBRlMCS-2)、DH5a (pBBRlMCS-2-Tsl)、DH5a (pBBRlMCS-2-Ts2)、 DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts3)和DH5 a (pBBRlMCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主 菌为大肠杆菌 Escherichia coli DH5a 时重组载体 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30 °C LB 液体培养基、 30°C LB+kan液体培养基和42°C LB液体培养基中的丢失率（表3)。
[0119] 表3、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中的丢失率
[0120]
[0121] 在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli DH5a 时，pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30°C LB 液体培养基和 30°C LB+kan 液体培养基中的丢失率以及口881?11?^-2在42°〇1^液体培养基中的丢失率均在10%以下， pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 42°C LB 液体培 养基中的丢失率均达到 99. 99%，说明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和pBBRlMCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中均可表现出其温度敏感性。
[0122] 实施例 3、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中的温度敏感性
[0123] 分别将 pBBRlMCS-2 及实施例 1 步骤 1 的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、 pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别导入大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 中，分别得到重组大肠杆菌 BW25113(pBBRlMCS-2)、BW25113(pBBRlMCS-2-Tsl)、 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts2)、BW25113(pBBRlMCS-2-Ts3)和 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0124] 按照实施例1步骤2的方法，将Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)分别替换为上述 BW25113(pBBRlMCS-2)、BW25113 (pBBRlMCS-2-Tsl)、BW25113 (pBBRlMCS-2-Ts2)、 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts3)和 BW25113(pBBRlMCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿 主菌为大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 时重组载体 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30 °C LB 液体培养基、 30°C LB+kan液体培养基和42°C LB液体培养基中的丢失率（表4)。
[0125] 表4、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中的丢失率
[0126]
[0128] 在宿主菌为大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 时，pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30 °C LB 液 体培养基和30°C LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBRlMCS-2在42°C LB液体培养 基中的丢失率均在10%以下，口831?1]\?^-2-了81、口881?1]\?^-2-了82、口881?1]\?^-2-了83和 pBBRlMCS-2-Ts4在42°C LB液体培养基中的丢失率均达到99. 99%，说明pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌 Escherichia coli BW25113中均可表现出其温度敏感性。
[0129] 实施例 4、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中的温度敏感性
[0130] 分别将 pBBRlMCS-2 及实施例 1 步骤 1 的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、 pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别导入大肠杆菌 Escherichia coli S17-1 中，分别得到重组大肠杆菌 S17-l(pBBRlMCS-2)、S17-l(pBBRlMCS-2-Tsl)、 S17-1(pBBRlMCS-2-Ts2)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3)和 S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0131] 按照实施例1步骤2的方法，将Tl(pBBRlMCS-2-Tsl)分别替换为上 述 S17-1 (pBBRlMCS-2)、S17-1(pBBRlMCS-2-Tsl)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts2)、 S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3)和 S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts4)，其他步骤均不变，分别得到宿主 菌为大肠杆菌 Escherichia coli S17-1 时重组载体 pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30 °C LB 液体培养基、 30°C LB+kan液体培养基和42°C LB液体培养基中的丢失率（表5)。
[0132] 表5、温度敏感型载体在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中的丢失率
[0133]
[0135] 在宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli S17-1 时，pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30°C LB 液体培养基和 30°C LB+kan 液体培养基中的丢失率以及口881?11?^-2在42°〇1^液体培养基中的丢失率均在10%以下， pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 42°C LB 液体培 养基中的丢失率均达到 99. 99%，说明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和pBBRlMCS-2-Ts4在大肠杆菌Escherichia coli S17-1中均可表现出其温度敏感性。
[0136] 实施例 5、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中的温度敏感性
[0137] 1、重组类球红细菌的制备
[0138] (1)将实施例4的重组大肠杆菌S17-l(pBBRlMCS-2)在LB+kan液体培养基中37°C 摇瓶过夜培养，次日以1/10的转接量转接至新鲜的LB液体培养基，继续培养约1-2小时至 0D600 为 I. 0 左右，得到 S17-1 (pBBRlMCS-2)培养液；取 I. 5mL S17-1 (pBBRlMCS-2)培养液 7000rpm下离心3-5分钟，弃上清液，得到菌体沉淀，用新鲜的LB培养基洗涤菌体沉淀2次， 用200 μ L LB液体培养基重悬菌体沉淀，得到供体菌悬浮液；
[0139] (2)将类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1在LB液体培养基中30°C下 培养24小时后转接至新鲜的LB培养基继续培养约24小时至0D600为1. 7-2. 5左右，得到 类球红细菌培养液；取I. 5mL类球红细菌培养液7000rpm下离心3-5分钟，弃上清液，得到 菌体沉淀，用新鲜的LB培养基洗涤菌体沉淀2次，用300 μ L LB液体培养基重悬菌体沉淀， 得到受体菌悬浮液；
[0140] (3)将30 μ L步骤（1)的供体菌悬浮液和300 μ L步骤（2)的受体菌悬浮液混匀后 涂布于LB平板上，30°C培养2 0-24小时；
[0141] (4)将步骤（3) LB平板上长出的菌用冰上预冷的ImL Sistrom培养基洗脱至EP管 中。4°C 5000rpm下离心2分钟，弃上清液，用500 μ 1冰上预冷的Sistrom培养基洗绦沉淀 两次，最后用100 μ L冰上预冷的Sistrom培养基重悬沉淀，得到菌体悬浮液；
[0142] (5)将步骤（4)的菌体悬浮液涂布在Sistrom平板（Sistrom平板为向Sistrom培 养基中加入K 2TeO3和卡那霉素得到的K2TeO3浓度为150mg/L、卡那霉素浓度为50mg/L的固 体培养基）上，30°C下培养3-5天长出接合子，即为含有pBBRlMCS-2-Tsl的重组类球红细 菌，将该重组菌命名为R. s (pBBRlMCS-2)。
[0143] 按照上述步骤（1) - (5)的方法，分别将重组大肠杆菌S17-1 (pBBRlMCS-2)替 换为 S17-1 (pBBRlMCS-2-Tsl)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts2)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3) 和S17-l(pBBRlMCS-2-Ts4)，替他步骤均不变，得到分别含有pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 的重组类球红细菌，将这些重组 菌分别命名为 R. s (pBBRlMCS-2-Tsl)、R. s (pBBRlMCS-2-Ts2)、R. s (pBBRlMCS-2-Ts3)和 R.s (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0144] 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在类球 红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1中的温度敏感性
[0145] 将步骤1的R. s (pBBRlMCS-2-Tsl)接种至LB+kan液体培养基中，于30°C培养20 小时，将得到的菌液进行以下处理：
[0146] ①将菌液按I :500的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于30°C下培养24小 时，得到LB-30°C菌液；将LB-30°C菌液稀释后得到LB-30°C稀释菌液，将LB-30°C稀释菌 液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-30°C稀释菌液，然后于30°C 下培养4天，分别得到LB-LB-30°C平板和LB-LB+kan-30°C平板，统计LB-LB-30°C平板和 LB-LB+kan-30°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液体培养 基中的丢失率，载体的丢失率=(LB-LB-30°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-30°C平板上的 菌落数）+LB-LB-30°C平板上的菌落数；
[0147] ②将菌液按I :500的比例接种至3mL LB+kan液体培养基中，然后于30°C下 培养24小时，得到LB+kan-30 °C菌液；将LB+kan-30 °C菌液稀释后得到LB+kan-30 °C 稀释菌液，将LB+kan-30 °C稀释菌液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板 100 μ L LB+kan-30 °C稀释菌液，然后于30 °C下培养4天，分别得到LB+kan-LB-30 °C平板 和 LB+kan_LB+kan_30 °C 平板，统计 LB+kan_LB_30 °C 平板和 LB+kan_LB+kan_30 °C 平板上 的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB+kan液体培养基中的丢失率， 载体的丢失率=(LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数一 LB+kan-LB+kan-30°C平板上的菌落 数）+ LB+kan-LB-30°C平板上的菌落数；
[0148] ③将菌液按I :500的比例接种至3mL LB液体培养基中，然后于37°C下培养24小 时，得到LB-37°C菌液；将LB-37°C菌液稀释后得到LB-37°C稀释菌液，将LB-37°C稀释菌 液分别涂布至LB平板和LB+kan平板上，每个平板100 μ L LB-37°C稀释菌液，然后于37°C 下培养4天，分别得到LB-LB-37°C平板和LB-LB+kan-37°C平板，统计LB-LB-37°C平板和 LB-LB+kan-37°C平板上的菌落数，计算得到重组载体pBBRlMCS-2-Tsl在37°C LB液体培养 基中的丢失率（表6)，载体的丢失率=(LB-LB-37°C平板上的菌落数一 LB-LB+kan-37°C平 板上的菌落数）+LB-LB-37°C平板上的菌落数。
[0149] 按照上述方法，将 R. s(pBBRlMCS-2-Tsl)替换为 R. s(pBBRlMCS-2-Ts2)、 R. s(pBBRlMCS-2-Ts3)、R. s(pBBRlMCS-2-Ts4)和 R. s(pBBRlMCS-2)，其他步骤均不变，分 别得到宿主菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1时重组载体pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分别在 30°C LB 液 体培养基、30 °C LB+kan液体培养基和37 °C LB液体培养基中的丢失率（表6)。
[0150] 表6、温度敏感型载体在类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中的丢失 率
[0151]
[0152]
[0153]在宿主菌为类球红细菌 Rhodobacter sphaeroides 2· 4· 1 时，pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30 °C LB 液 体培养基和30 °C LB+kan液体培养基中的丢失率以及pBBRlMCS-2在37 °C LB液体培养 基中的丢失率均在 13% 以下，pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4在37°C LB液体培养基中的丢失率分别达到78. 18%、81. 36%、80. 53%和 78. 57%，说明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在类 球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中均可表现出其一定的温度敏感性。
【主权项】
1. 构建重组载体的方法，是将SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为 目的基因表达盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载 体； 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQIDNo. 2所示的蛋白质进行Al)的改造、 保持SEQIDNo. 2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述Al)为如下All)和/或 A12)和 / 或A13): All)将SEQIDNo. 2 第 12 位的Ala突变为Thr; A12)将SEQIDNo. 2 第 81 位的Asp突变为His; A13)将SEQIDNo. 2 第 140 位的His突变为Leu。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基因为将 SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行BI)的改造、保持SEQIDNo. 1 的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：所述BI) 为如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14): BI1)将SEQIDNo. 1第1827位的G突变为A; B12)将SEQIDNo. 1第2034位的G突变为C; B13)将SEQIDNo. 1第2212位的A突变为T; B14)将SEQIDNo. 1第2249位的C突变为A。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所述目 的基因表达的启动子为SEQIDNo. 1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表 达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQIDNo. 1的第2457-2526位所示的DNA分子。4. 构建重组载体的方法，是将SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为 目的基因表达盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载 体； 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQIDNo. 2所示的蛋白质进行权利要求1所 述Al)及下述A2)、A3)和A4)这三种中至少一种的改造、保持SEQIDNo. 2的其它氨基酸 残基均不变得到的蛋白质： A2)将SEQIDNo. 2 第 130 位的His突变为Gln; A3)将SEQIDNo. 2第86位的Arg突变为Cys; A4)如下A41)和 / 或A42): A41)将SEQIDNo. 2 第 25 位的Lys突变为Glu; A42)将SEQIDNo. 2 第 146 位的Ile突变为Val。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中的目的基因为将 SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行权利要求2所述BI)及下述 B2)、B3)和B4)这三种中至少一种的改造、保持SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所 示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子： B2)将SEQIDNo. 1第2183位的C突变为G; B3)将SEQIDNo. 1第2049位的C突变为T; B4)如下B41)和/或M2): B41)将SEQIDNo. 1第1866位的A突变为G; B42)将SEQIDNo. 1第2229位的A突变为G。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述目的基因表达盒中启动所述目 的基因表达的启动子为将SEQIDNo. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、 C3)和C4)这三种中至少一种的改造、保持SEQIDNo. 1的第1557-1793位核苷酸所示的 DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子： C2)如下C21)和 / 或C22): C21)将SEQIDNo. 1第1732位的A突变为G; C22)将SEQIDNo. 1第1780位的G突变为T; C3)如下C31)和 / 或C32): C31)将SEQIDNo. 1第1747位的C突变为T; C32)将SEQIDNo. 1第1776位的T突变为A; C4)将SEQIDNo. 1第1751位的T突变为A; 所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQIDNo. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。7. 由权利要求1-6中任一所述方法构建的重组载体。8. 含有权利要求7所述重组载体的重组微生物或重组细胞系。9. 下述任一产品： Pl、权利要求1或4所述蛋白质； P2、权利要求2或5所述目的基因。10. 下述任一应用： Ll、权利要求2或5所述目的基因在制备温度敏感载体中的应用； L2、权利要求7所述重组载体在作为温度敏感载体中的应用。
【专利摘要】本发明公开了温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts1及其应用。本发明所提供的温度敏感型载体，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组载体；目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A1)的改造得到的蛋白质：A1)为如下A11)、A12)和A13)：A11)将SEQ ID No.2第12位的Ala突变为Thr；A12)将SEQ ID No.2第81位的Asp突变为His；A13)将SEQ ID No.2第140位的His突变为Leu。
【IPC分类】C12N15/63, C12N1/15, C12N1/13, C12N1/19, C12N1/21
【公开号】CN104894153
【申请号】CN201510340926
【发明人】黄建忠, 江贤章, 周芬, 刘洪娇, 祁峰, 张明亮, 陶勇
【申请人】福建师范大学, 中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月18日
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