一种重组水貂α-干扰素的制备方法和应用
一种重组水貂α-干扰素的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及一种重组水貂α -干扰素的制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快的第一抵御病毒体系。已对人和鼠 的干扰素进行了深入研宄，但对于水貂的干扰素研宄相对较少。
[0003] 水貂α -干扰素是由13个相关功能基因编码的蛋白质家族，亚型基因间编码框大 小一致，氨基酸同源性88. 8-98.4%。成熟的水貂α-干扰素由167个氨基酸组成，诱导其 分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成。由于水貂的病毒性疾病种类多、危害大，因此发展 具广谱抗病毒效应的水貂干扰素具有重要意义。但干扰素的传统提取方法产量低、操作繁 琐，很难推广应用，因而寻找一种高效生产干扰素的方法成为亟待解决的问题。
[0004] 毕赤酵母表达系统是应用广泛的一种真核表达系统，可胞外表达外源蛋白。相比 于大肠杆菌等原核表达系统，它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能，而与杆状病毒、哺 乳动物细胞相比，它又具有培养成本低、产量高、便于产物的分离纯化等优点。近年来，酵母 表达系统的研宄得到迅速发展，此系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌毕赤 酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分离纯化操作，能大规模发 酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服传统获得干扰素方法的不足，提供一种重组水貂α -干扰素的制 备方法和应用，所述的制备方法通过高效外源表达重组水貂α-干扰素的真核表达系统实 现。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种重组水貂α -干扰素的制备方法，包 括：将水貂α 2-干扰素基因克隆至载体pGAPZa A中，实现毕赤酵母重组表达载体的构建及 筛选，并在毕赤酵母中进行诱导表达，获得重组水貂α -干扰素。
[0007] 所述的水貂α -干扰素基因序列如Seq ID NO :1所示。
[0008] 所述的水貂α -干扰素基因进行克隆时所用的引物为：
[0009] 扩增水貂α -干扰素基因特异性上游引物：
[0010] 5' -GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3' ；
[0011] 扩增水貂α -干扰素基因特异性下游引物：
[0012] 5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3 '。
[0013] 所述的诱导表达的具体方法为：用含Zeocin 100mg/L的YTO液体培养基进行菌体 的扩增培养，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 1. 5 ;按1:100比例转接到含Zeocin IOOmg/ L的YPD液体培养基中，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 6-8, 7000rpm，4°C，离心15min，获 得含有重组水貂α-干扰素的上清液。
[0014] 本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
[0015] 所述的毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选，包括以下步骤：
[0016] 首先将载体PGAPZa用Xh0 I和Xba I双酶切后检测回收，设计扩增水貂α-干 扰素基因特异性引物，引物上下游分别有15个碱基与上述酶切后线性载体的两端互补，回 收PCR基因片段，直接用In-Fusion HD Cloning Kit将片段和载体连接，转化DH5a感受态 细胞，经质粒PCR和双酶切鉴定阳性克隆，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体，即将 基因插入PGAP启动子和a -alpha信号肽下游的Xho I /Xba I位点，构建成分泌型酵母 表达重组质粒，以Bin I酶切载体呈线性化后电击转化酵母X-33,转化子经Zeocin IOOmg/ L抗性筛选，菌落PCR鉴定分析，确定阳性菌株后作进一步的摇瓶发酵。
[0017] 上述方法制备获得的重组水貂α -干扰素在制备治疗犬瘟热疾病的药物中应用。
[0018] 上述方法制备获得的重组水貂α -干扰素在制备治疗水貂细小病毒感染疾病的 药物中应用。
[0019] 上述应用的一种优选配方为50~100万IU重组水貂α -干扰素：1ml止血敏： 0. 8ml安乃近注射液。
[0020] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021] 本发明采用常规的PCR方法获得水貂α-干扰素基因编码区，克隆入毕赤酵母分 泌型表达载体中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分 泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白，蛋白浓度最高可达3. 593mg/mL。另外，本发明 通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组重组蛋白的抗病毒活性。
【附图说明】
[0022] 图1是毕赤酵母-X33培养上清多克隆抗体检测MiIFN-α蛋白表达结果图，其中 Α:克隆菌株1培养上清；Β:克隆菌株2培养上清；C:克隆菌株3培养上清；D:克隆菌株4 培养上清；Ε:克隆菌株5培养上清；F:克隆菌株6培养上清；G:克隆菌株7培养上清；Η: 阴性对照；MK:分子量标准。
[0023] 图2是表达产物纯化结果图，其中Α:诱导IFN-α蛋白表达产物（6 μ g) ;Β:未诱 导IFN- α蛋白表达产物（6 μ g)，MK:分子量标准。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0025] 实施例1毕赤酵母重组表达载体的构建
[0026] 1)水貂α -干扰素13个亚型基因序列扩增及多态性分析
[0027] 外周血淋巴细胞诱导及总RNA的提取：
[0028] 无菌采取健康水紹外周5mL，置于加有抗凝剂（38g/L梓檬酸钠）的灭菌容器中， 然后在无菌条件下加入RPMI1640培养液1 :1稀释。取5mL人用淋巴细胞分离液上，室温下 2000r/min水平转子离心40min。用折弯的灭菌长针头小心将白细胞层移于另一试管中（约 ImL)中，加2倍体积的RPMI1640培养液混匀后，2000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物再 加入等量RPMI1640,相同方法洗涤2次，弃去上清液，沉淀细胞用含lOOOOU/mL双抗、IOOmL/ L小牛血清的RPMI1640培养液悬浮。取10 μ L细胞悬液计数，按计数结果稀释至I X IO7/ mL，置于24孔细胞培养板中，37°C 50mL/LC02培养箱中静置培养2h后，加入TCID 5Q为10 _6 5 新城疫弱毒株Lasota 100 μ 1诱导物培养24h〇
[0029] 收集诱导24h后的淋巴细胞于15mL离心管中，2000r/min离心10min，弃上清液， 将沉淀用ImL TRIzol Reagent重悬，冻存于-70°C备用。
[0030] 取出装有淋巴细胞的冻存管，室温融化，加 l/5Trizol体积的氯仿，充分混匀后静 置3min，12000r/min离心15min，将沉淀用750mL/L的乙醇缓慢洗涤2遍，倒置控干后用 lmL/L DEPC处理的灭菌水9. 5 μ L溶解沉淀，即获得淋巴细胞总RNA。
[0031] 2) 13个亚型基因通用引物的设计与合成
[0032] 应用Primer 5. O基因分析软件，参照GenBank登陆的犬、狐、猫、猪、羊、牛、人及 禽类的α-干扰素基因序列，分析其核苷酸同源性，设计扩增水貂α-干扰素基因引物，弓丨 物序列如下：
[0033] 扩增水貂α -干扰素基因上游引物：5' -ATGGCCCTGCCCTGCTCCT-3' ；
[0034] 扩增水貂α -干扰素基因下游引物：5' -TCACTTCCTGCTCCGCAATCT-3'。
[0035] 采用RT-PCR方法扩增目的基因。操作步骤：在9. 5 μ L的RNA溶液中加入1 μ L 01igo(dT)15引物（50pmol/yL)，混匀后于70°C水浴作用5min，立即冷却，依次加入 lOmmol/L dNTP 5 μ L，AMV 缓冲液 4 μ L，RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L，AMV 1 μ L 充分混匀，42°C反 应lh，95°C 3min灭活反转录酶，冷却后直接用于PCR反应。PCR反应体系：10XEx Taq缓冲 液2.5 4 1^，2.5臟〇1/1/^1^(1阶132 4 1^，25口111〇1/^1^上、下游引物各14 1^，25口111〇1/1丁&9〇嫩 聚合酶0. 125 μ L，加入灭菌去离子水至25 μ L。将25 μ L反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为：95°C预变性 5min ;94°C 45s，52. 5°C lmin，72°C lmin，32 个循环后，72°C延 伸6 min。用15g/L琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，产物与PMD18-T载体连接，转化DH5a感 受态细胞，每批批挑取30个克隆，共计三批，PCR酶切鉴定正确后，测序。
[0036] 经过90个序列比对，将相同的基因序列分为一组，共计13组，90个克隆测序基因 序列大小均为564bp ;重复上述操作三次，结果均获得13组基因序列，即13个水貂IFN-a 基因亚型序列，核苷酸同源性93. 6-99. 3%。
[0037] 3)酵母表达载体构建
[0038] 在构建酵母表达载体之前，我们先将13个亚型基因构建到原核表达载体中，并分 别进行了表达，应用微量细胞病变抑制法检测抗病毒活性，其中IFN-a 2活性最高，我们选 择该亚型为酵母表达载体的基因模板。
[0039] ①引物设计
[0040] 参照本研宄团队已提交NCBI GenBank的水貂a 2-干扰素基因（EU863613)为 模板，设计扩增水貂α-干扰素成熟肽基因的特异性引物，引物首末为酵母表达载体 PGAPZaA连接位点（下划线部分），加重部分为载体序列。引物序列（5' -3'）如下，扩增 水貂a-干扰素基因特异性上游引物：
[0041] 5' -GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3'，扩增水貂 a -干扰素 基因特异性下游引物：5' -GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3' ；
[0042] ②PCR合成水貂a -干扰素成熟肽基因
[0043] PCR反应体系：10XE X Taq Buffer 2.5 μ 1，2. 5mmol/μ I dNTP 2 μ 1，上、下游引 物（25pmol/ μ 1)各 1 μ I，25pmol，Taq DNA 聚合酶（2U/ μ I) 0· 125 μ I，加入 17. 375 μ 1 灭菌 去离子水。将25 μ 1反应液混匀后，于PCR仪上进行扩增，循环参数为95°C预变性5min， 94°C 45s，52. 5°C lmin，72°C lmin，33 个循环后 72°C 延伸 lOmin，扩增完毕后，取 10μ 1 于 I. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收扩增产物进行测序，所得片段大小为500bp，其核苷酸 序列如下所示（Seq ID NO :1)。
[0044] 水貂α 2-干扰素基因序列，其中划线部分为信号序列：
[0045] ATGGCCCTGCCCTGCTCCTTCTTGGTAGCCCTGGTGGTGCTCAGCTGCCACTACCTCAGCTCTTTGGGA TGTGACCTGCCTCAGACCCCTGGCCTGCTGCACTGGAGGGCCCTGATGCTCCTGCGACAAATGAGGAGACTGTCTGC TAGCTCCTGTGACAACTACACAAACGACTTTGGCTTCCCCCAGGAGGCCTTCGACGGCAAGCCGCTGCAGAAGGCTC AAGCCCTCTCTGTCCTCCATGTGACGAACCGGAAGACCTTCCACCTCTTCTGCACAGAGGCCTCACCTGCTCCTTGG AACACGGCCCTCCTGGAGGAATTGTGCTCGGGACTTTCTGAGCAGCTGGGCCTCCTGGAAGCCTGTCCCCTGCAGGA GGCTGGGGTGGGAGAGCCGCCCCTGGTGAATGGGGACTCCATCCTGAGGAACTACTTCCAGAGAATCTCCCTCTATC TGCAAGAGAAGCAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGATGGTCCGAGCAGAGATCATGAAACCCTTGTATGCATCAACA GCCTTGCATAAGAGATTGCGGAGCAGGAAGTGA
[0046] ③表达重组质粒构建和酵母转化
[0047] 载体pGAPZ α用Xho I和Xba I进行双酶切为线性后检测回收，水貂α -干扰素 基因经PCR扩增，回收的目的片段用In-Fusion HD Cloning Kit将处理，连接原理是使目 的基因两端形成与酶切后载体两端15个碱基互补的粘性末端连接，融合连接反应体系为 10 μ 1，包括 5 X In-Fusion HD Enayme Premix 溶液 2 μ I，DNA 片段 2 μ 1，线性载体 1 μ 1，去 离子水μ 1 ;反应条件为50°C，15min，然后将连接产物冰预5min用于转化。将连接产物转 化至大肠杆菌工程菌DH5a，将重组子测序。经验证得到插入片段正确的重组子。摇菌，提 质粒，经Bin I酶切回收后即可进行毕赤酵母的转化，转化使用的是市售巴斯德毕赤酵母 (Pichia，Pastoris)X-33。酵母转化的具体步骤如下：
[0048] a)将10 μ 1经酶切线性化的质粒与100 μ 1的新鲜毕赤酵母感受态菌体混勾，转至 住0. 2cm预冷的电转化杯中；
[0049] b)将质粒与感受态混合物冰浴5min ;
[0050] c)所用电转化仪是美国的伯乐biorad电转化仪，电转化使用的电压为412V ;
[0051] d)点击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至一个新的I. 5ml的 离心管中；
[0052] e)将菌体悬液涂布于YPD (Zeocin 100mg/L)平板上，每200 μ 1涂布一块平板；
[0053] f)将平板置于30°C培养，转化2~3长出单菌落。
[0054] 4)重组毕氏酵母的筛选及鉴定
[0055] 挑取1个转化子单菌落到（Zeocin 100mg/L)平板上培养48小时，然后再点接到 (Zeocin 100mg/L)平板上，以酵母菌为模板，挑取6个菌落做PCR检测；30 μ 1反应体系，弓丨 物各 1 μ 1，Ex Taq Premix 15 μ 1，无菌水 13 μ 1。
[0056] 实施例2外源基因在毕赤酵母中的高密度分泌表达
[0057] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于YPD (Zeocin 100mg/L)液体培养基（按 < 10%装瓶），30°C，300rpm。摇床培养至对数期（0D600 = 1.5);
[0058] 2)转接Iml培养液至IOOmL YPD (Zeocin 100mg/L)液体培养基（按彡10装瓶）， 30°C，300rpm摇床培养至对数中期（0D600 = 6-8);
[0059] 3)室温7000rpm离心5min，收集上清，经硫酸按浓缩、透析，用5ml无菌水溶解后 作SDS-PAGE分析之样品；以12%的分离胶进行SDS-PAGE分析，His单克隆抗体检测表达正 确性；
[0060] 4)Western-blot进一步检测分析，结果见图1。
[0061] 基因工程α-干扰素表达产物氨基酸序列如下所示（Seq ID NO :2)，其中划线部 分为a -factor分泌信号肽，粗体部分为6 XHis标签，划线部分为肠激酶酶切位点。
[0062] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE⑶FDVAVLPFSNSTNNGLLFINTT IASIAAKEEGVSLEKREAEACDLPQTPGLLHWRALMLLRQMRRLSASSCDNYTNDFGFPQEAFDGKPLQKAQALSVL HVTNRKTFHLFCTEASPAPWNTALLEELCSGLSEQLGLLEACPLQEAGVGEPPLVNGDSILRNYFQRISLYLQEKQY SPCAffEMVRAEIMKPLYASTALHKRLRSRKFLEQKLISEEDLNSAVDDDDDKHHHHHHo
[0063] 实施例3外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
[0064] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于YPD (Zeocin 100mg/L)液体培养基（按 <10%装瓶），30°〇，300印111。摇床培养至对数期（00600 = 6);
[0065] 2)转接Iml培养液至IOOmL YPD(ZEOCIN 100MG/L)液体培养基（按彡10 %装 瓶）30°C，300rpm摇床培养至对数中期（0D600 = 30);
[0066] 3)室温4000rpm离心5min，收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至100ml BMMY 液体培养基中，28 °C，280rpm摇床培养；
[0067] 4)从细胞沉淀转至Yro液体培养基诱导开始，每隔24小时取样Iml分析表达水 平，确定最佳诱导时间为72h ;
[0068] 5)选择最佳的诱导时间收集样品，室温12000r/min离心15min，取上清液进行 SDS-PAGE 电泳及 Western-blot 分析。
[0069] 实施例4表达蛋白纯化及活 性检测 [0070] 1)表达产物的蛋白质含量测定
[0071] 对发酵诱导表达产物上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳后，进行R-250染色、脱色，置 于薄层扫描仪（UVP凝胶成像分析系统）进行灰度扫描，通过Labwork软件系统来分析，利 用牛血清蛋白做定量对照，计算样品总蛋白及总蛋白中MiIFN-α的有效含量。并用BCA蛋 白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。结果如表一所示，蛋白浓度最高可达4. 993mg/mL。
[0072] 2)抗病毒活性检测
[0073] ①人干扰素标准品（rhIFN-α )参考物质：购自中国食品药品鉴定研宄院，α -干 扰素国豕标准品，批号：（2008)国标生字0017,以下称干扰素标准品。
[0074] ②VSV的制备：用含10 %的优级胎牛血清的MEM营养液按照1:500稀释毒种，接种 于生长良好的单层MDCK细胞上（MDCK)进行增殖，孵育至细胞80%病变时，反复冻融3次， 10000 Xg离心10min，收集上清，分装与灭菌离心管中，冻存于一 80°C。
[0075] ③VSV的效价测定：在96孔板中培养MDCK细胞至单层，弃去营养液，用无血清的 MEM营养液按照10倍倍比连续稀释VSV，每一个稀释度做8个重复孔，每孔加入稀释后的病 毒液100 μ 1，细胞阴性对照孔加入100 μ 1无血清的MEM营养液，37°C CO2恒温培养箱内孵育 lh，弃去上清液，没孔加入含3%胎牛血清的MEM营养液100 μ 1。当出现病变时，观察记录 结果，用Karber法计算出VSV的效价（TCID5tl)，将测定完效价的病毒标记并保存于一 80°C 备用。
[0076] ④抗病毒活性的测定：
[0077] 生物学活性定参照2002年中华人民共和国药典三部，用CPE(细胞致病变效应） 抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检验品的最高稀释度仍能保护半数细胞 (50% )免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。具体方法为：
[0078] a、细胞培养：取MDCK细胞在96孔板中培养之全部贴壁生长到60%。
[0079] b、干扰素加样：将96孔板细胞培养物去除培养液，分两组，一组将水貂α -干扰素 标准品稀释成l〇〇〇U/ml，每孔加入100 μ 1 4倍倍比稀释，一组每孔加入100 μ 1 4倍倍比稀 释的试验干扰素溶液，每列是一个稀释度，同时设置无干扰素和无病毒的细胞对照孔，然后 放入37 °C CO2恒温培养箱内培养24h。
[0080] C、攻毒：用IOOTCID5ci剂量的水泡性口炎病毒进行攻毒，对照孔加无病毒的培养 液，同时设立阴性对照（只加经倍比稀释的重组干扰素，不加病毒），阴性对照（不加干扰 素，只加病毒），空白对照（不加干扰素，不加病毒），在倒置显微镜下观察标准品lU/ml的 孔出现50 %病变的时候判断结果。
[0081] d、染色：弃去上述步骤中96孔细胞培养板中的上清，用PBS洗3次，控干水分，每 孔加入0. 5 %的结晶紫染色液50 μ 1，室温放置20min，然后用PBS洗涤三次后，加入终止液， 在波长570mm处测定吸光度。
[0082] e、引进病毒滴度测定的Reed-Muench法计算干扰素效价（U/ml)，国际上最，常采 用的判定干扰素活性的方法是在标本的梯次稀释度中，仍能保护半数细胞免受攻击病毒损 害的最高稀释度的倒数即为干扰素的效价。
[0083] f、应用MDCK/VSV病毒检测系统，将酵母分泌表达MilFN-a 4倍倍比稀释后检测抗 病毒活性，攻毒后观察细胞病变，在接种24h后，部分孔出现了细胞病变，见表1。距离比= (高于50%病变率的百分数-50% V (高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分 数）。参照"IFN-α国际单位（IU/ml)=(样品CPEI5tl稀释度/标准品CPEI 5tl)/标准品的 单位"公式计算重组干扰素的比活性。多次重复试验测得MiIFN-α重组干扰素抗病毒活性 分别为 1.92X 106U/mg。
[0084] 表1.水貂IFN- α在MDCK/VSV上细胞病变抑制观察记录表
[0085]
[0086]
[0087] 实施例5重组毕赤酵母的发酵
[0088] 1)种子液制备
[0089] 将酵母克隆划线接种到YPDs-zeocin平板上30°C培养72小时后，挑取菌落接种到 Yro液体培养基中培养，在无菌条件下取样检测，镜检无杂菌即可作为菌种。发酵使用的种 子液保存在4°C，应在48h内使用。
[0090] 2)发酵条件
[0091] 发酵培养基为YPD (Zeocin 100mg/L)，培养温度为30°C培养OD6qq= 6-8,接种量占 培养基总体积的15%，300rpm培养后，检测其生物活性。
[0092] 3)提取工艺
[0093] 将工程菌株接种于含100mg/L Zeocin的YH)培养基发酵72h，离心收集发酵上 清液，以醋酸调节pH4. 0-5. 0,过CM Sepharose柱层析，收集0. 4mol/L NaCl洗脱峰，加硫 酸按至30 %，离心取上清液，过PhenylSepharose层析，收集10 %硫酸按洗脱峰，过EAE epharose柱层析，收集0. mol/NaCl洗脱峰，过Sephacryl S-200柱层析，获得纯度大于99 % 的MiIFN-α原液，见图2。
[0094] 实施例6水貂α -干扰素对人工复制水貂细小病毒感染的防治试验 [0095] 本试验依据农业部兽药审评中心《兽用生物制品实验室效力试验技术指导原则》 (VB/Gu007/Ver01)要求，采用吉林特研生物技术有限责任公司代号为SPMV-Il水貂细小病 毒种毒，进行水貂细小病毒疾病模型复制，并使用不同剂量重组水貂α -干扰素并配合辅 助治疗，通过对人工发病水貂在使用药物后各项指标分析，验证重组水貂α -干扰素对人 工复制水貂细小病毒病治疗效果。
[0096] 1)实验药物及毒株的制备
[0097] 应用酵母表达系统制备重组水貂α -干扰素，4°C保存备用。临用前以灭菌的生理 盐水稀释后应用，现配现用。毒株代号为SPMV-Il分离株按照常规方法用猫肾细胞（MDCK) 细胞测得其组织细胞半数感染剂量（TCID5tl)为10-6_ 5/100 μ 1，以常规方法用3月龄水貂（雌 雄兼有）测定水貂细小病毒半数感染量ID5tl为l(T4_°/2ml。以猪红细胞测定水貂细小病毒 株血凝价2 8。
[0098] 2)实验动物分组及治疗
[0099] (1)3月龄未接种过水貂细小病毒疫苗的水貂共40只，雌雄兼有。接种病毒前观察 7日。为避免肠道寄生虫对实验结果影响，观察期间应用阿苯达唑进行驱虫（25mg/kg体重 内服，一日一次，连续三次）。引进动物前对饲养房间、用具全部以甲醛熏蒸消毒。每日饲喂 2次，饲料为商品化毛皮动物饲料，自由饮水。符合试验条件水貂应临床表现健康，体温、白 细胞总数等检查结果均正常。粪便以犬细小病毒快速诊断试纸（上海快灵）进行检查，结 果均为阴性。
[0100] 3)实验方法
[0101] (1)疾病模型复制发病判断标准
[0102] ①临床症状观察及剖检：接种后，每日两次观察临床症状（如精神状态、呕吐、腹 泻、便血等），对表现异常水貂测肛温。对发病死亡水貂进行剖检，重点观察小肠及肠系膜淋 巴结组织变化。
[0103] ②水貂细小病毒快速诊断：根据发病情况和典型临床症状初步诊断为水貂细小病 毒感染水貂，再用犬细小病毒快速诊断试剂盒进行确诊。以无菌棉拭子取病水貂直肠粪便， 加生理盐水约2ml，充分振动后静置3分钟，吸取上清液加入试剂盒中，约5分钟后观察结 果，呈现一条红线为阴性，两条红线为阳性。
[0104] ③水貂细小病毒分离培养：取病死水貂十二指肠或空肠内容物，加生理盐水及双 抗，混匀静置后，上清液用除菌滤器过滤（滤膜孔径为〇. 22微米）。待犬肾细胞（MDCK株）长 成单层并用胰酶消化后按1 : 2分瓶，取过滤好的上清按照约细胞培养上清量的1/3接种 犬肾细胞（MDCK株），同时设立阴性对照，37°C静置培养，24小时后将细胞生长液（含10% 小牛血清、30微克/毫升L-谷氨酰胺DMEM)换成维持液（不含小牛血清、补加90微克/毫 升L-谷氨酰胺DMEM)，逐日观察细胞病变，若经盲传3代后，产生细胞病变，则继续传代。
[0105] ④PCR检测：提取分离病毒基因组DNA，并以此DNA为模板，参照水貂细小病毒相 关文献及GenBank数据库中的已有的VP2蛋白相应基因序列合成，扩增的目的基因为水貂 细小病毒VP2蛋白相应基因，扩增目的片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定是否获得了预计长度 DNA片段大小（573bp)。
[0106] 发病判断标准：按每只水貂灌服100个TCID50SPMV-11，多数水貂在接种后第 6~ 8日开始出现临床症状。表现为精神萎靡，活动明显减少，喜卧，排奠次数增多，粪便显灰黄 色或黄色，稀如粥状，散发特殊腥臭味；约1日后呈喷射状排出番茄汁样粪便，混有伪膜或 黏液，白细胞下降，体温升高；同时用犬细小病毒快速诊断试纸进行实验室诊断为阳性，判 定人工感染成功。
[0107] (2)联合治疗实验
[0108] 在开展联合治疗之前，我们采用单独使用干扰素治疗水貂细小病毒感染只有20% 治愈率，达不到理想的效果（80%以上）。分析原因可能是由于重组水貂α-干扰素应用后 虽然能针对病毒发挥作用，但在改善由病毒感染导致的一系列症状，如呕吐、腹泻、脱水、电 解质紊乱、酸中毒、高热、出血等严重临床症状方面，仍需配合对症治疗措施，方能进一步改 善疗效。该情况与临床应用干扰素治疗犬细小病毒病结果一致。所以本次实验以干扰素治 疗和辅助治疗同时进行。
[0109] 试验方法：所有实验水貂随机分为4组，每组10只，试验分组及处理见表2:
[0110] 表2实验动物分组及给药
[0111]
[0112] 按每只水貂灌服100个tcid5(ispmv-ii，各组水貂均于出现呕吐、精神沉郁或腹泻 症状时开始按表2给药治疗，给药疗程水貂α -干扰素治疗，g卩：低剂量干扰素（20万IU/ kg) +辅助治疗组、中剂量干扰素（推荐剂量，50万IU/kg) +辅助治疗组、高剂量干扰素（100 万IU/kg) +辅助治疗组，分别给予相应剂量射用重组水貂α -干扰素。
[0113] 辅助治疗：肌肉注射止血敏（0.7ml)，安乃近注射液（0.5ml)。分别于臀部肌肉丰 满处注射。口服补液盐（8. 95g)、安贝消食片（1片）、土霉素片（SOmg)。其中口服补液盐以 温水冲服，安贝消食片与土霉素直接投服于口中。
[0114] 试验结果：按每只水貂灌服100个Tcid5qSPMV-II后6~8日，各组水貂均出现 呕吐、精神沉郁或腹泻症状，经犬细小病毒快速诊断试剂盒进行确诊后，按表2方案进行治 疗，对各组犬进行仔细观察，对死亡水貂进行剖检，用PCR病毒扩增后进行病毒鉴定，并按 临床观察及疗效判定标准进行效果判定。试验动物疾病模型复制情况见表3。
[0115] 表3联合治疗效果试验研宄中实验动物疾病模型复制情况
[0116]
[0117]
[0118] 辅助治疗组各水貂每日1次给予对症治疗，5只水貂中，有1只水貂于给药治疗后 第3日死亡，其余4只均连续给药7日，至给药结束后第7日仍有2只水貂未完全康复，表现 为精神沉郁、食欲减退、体重下降。有效率40%，死亡率20%。干扰素低剂量组5只水貂除 每日一次皮下注射给予20万IU/kg体重重组水貂α -干扰素外，同时结合辅助治疗措施。 5只水貂中仅有1只水貂于给药后第2日死亡。其他4只水貂均于连续给药3日后出现明 显好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5~7日后均基本痊愈，至给药结束后第7日，精神、 食欲恢复正常。有效率80%，死亡率20%。
[0119] 干扰素中剂量与高剂量组5只水貂除每日一次皮下注射给予40或80万IU/kg体 重重组水貂α -干扰素外，同时结合辅助治疗措施。10只水貂均于连续给药3~4日后出 现明显好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5~7日后均基本痊愈，至给药结束后第7日， 精神、食欲恢复正常。有效率1〇〇%，死亡率〇%。治疗情况见表4。
[0120] 表4联合治疗效果试验各组水貂发病及治疗情况
[0121]
[0123] (3)分析与讨论：重组水貂α -干扰素治疗结果与使用剂量呈正相关性，即随着重 组水貂α-干扰素剂量（以细胞效价表示）增加，对水貂治愈率增加，死亡率降低。根据 "有效率高于80%，死亡率低于20%，判定为有效"判断标准，所以40万IU/kg体重为重组 水貂α -干扰素有效剂量。
[0124] 总结分析：
[0125] 通过治疗方案研宄试验可以看出，按50万IU/kg体重单独应用重组水貂α -干扰 素组其综合平均分、治愈率、有效率与感染对照组相比均差异显著，说明重组水貂α -干扰 素对水貂细小病毒病感染具有一定效果。但水貂在具有呕吐、腹泻、脱水、电解质紊乱、酸中 毒、高热、出血等严重临床症状时如果不配合对症辅助治疗，发病水貂上述症状不能得到有 效快速缓解，全身多个器官处于病理状态，机体抵抗力低下，不利于疾病快速恢复，甚至个 别水貂会因为多器官和组织衰竭引起急性死亡。
[0126] 通过联合治疗效果试验研宄结果可以看出，重组水貂α-干扰素配合辅助方案 治疗水貂细小病毒病感染各剂量组从综合平均分、治愈率、有效率各项指标均优于单独辅 助治疗组，且差异均极显著，其治疗结果与治疗试验方案研宄项下单独应用干扰素组相比， 各方面指标都有明显提高，中剂量组和高剂量组有效率达到100%，说明重组水貂α-干 扰素在治疗水貂细小病毒病上效果显著；从各剂量组水貂各指标综合结果来看，重组水貂 α -干扰素治疗效果在一定剂量范围内呈正相关，当剂量达到50万IU/kg体重以上时，即能 有效治疗水貂细小病毒病引起感染。通过验证试验研宄结果表明，两批重组水貂α-干扰 素对水貂细小病毒病治疗效果从综合平均分、治愈率、有效率各项指标来看差异不显著，且 与联合治疗效果试验研宄项下高中剂量组相比差异不显著，说明重组水貂α -干扰素对水 貂细小病毒病治疗效果稳定。
[0127] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重组水貂a-干扰素的制备方法，其特征在于：包括：将水貂a-干扰素基因克 隆至载体pGAPZaA中，实现毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选，并在毕赤酵母中进行诱 导表达，获得重组水貂a-干扰素。2. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的水貂a_干扰素基因序列如SeqIDNO:1所示。3. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的水貂 干扰素基因进行克隆时所用的引物为： 扩增水貂a_干扰素基因特异性上游引物如SeqIDNO:3所示； 扩增水貂干扰素基因特异性下游引物如SeqIDNO:4所示。4. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的诱导 表达的具体方法为：用含Zeocin100mg/L的YH)液体培养基进行菌体的扩增培养，30°C， 300rpm摇床培养至OD6qq= 1. 5 ;按1:100比例转接到含ZeocinlOOmg/L的YH)液体培养 基中，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 6-8, 7000rpm，4°C，离心15min，获得含有重组水貂 a_干扰素的上清液。5. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的毕赤 酵母重组表达载体的构建及筛选，包括以下步骤： 首先将载体pGAPZa用XhoI和XbaI双酶切后检测回收，设计扩增水貂a-干扰素 基因特异性引物，回收PCR基因片段用In-FusionHDCloningKit将处理后的片段和载体 连接，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体，即将基因插入PGAP启动子和a-alpha信 号肽下游的XhoI/XbaI位点，构建成分泌型酵母表达重组质粒，以BinI酶切载体呈 线性化转化酵母X-33,经含Zeocin100mg/L的YH)培养基平板筛选和PCR鉴定分析，确定 阳性菌株后作进一步的摇瓶发酵。6. 权利要求1~5任一项所述的方法制备获得的重组水貂a-干扰素在制备治疗犬瘟 热疾病的药物中应用。7. 权利要求1~5任一项所述的方法制备获得的重组水貂a-干扰素在制备治疗水貂 细小病毒感染疾病的药物中应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的一种配方为50~100万IU重 组水貂a-干扰素：1ml止血敏：0. 8ml安乃近注射液。
【专利摘要】本发明提供了一种重组水貂α-干扰素的制备方法和应用，属于基因工程领域。所述的制备方法采用常规的PCR方法获得α-干扰素基因编码区，将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pGAPZα中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白。本发明通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组蛋白的抗病毒活性。
【IPC分类】C12R1/84, A61P31/14, C12N15/81, C12N15/21, A61P31/20, A61K38/21
【公开号】CN104894157
【申请号】CN201510095208
【发明人】张海玲, 闫喜军, 赵建军, 张蕾, 白雪, 胡博, 刘昊
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月3日
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及一种重组水貂α -干扰素的制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快的第一抵御病毒体系。已对人和鼠 的干扰素进行了深入研宄，但对于水貂的干扰素研宄相对较少。
[0003] 水貂α -干扰素是由13个相关功能基因编码的蛋白质家族，亚型基因间编码框大 小一致，氨基酸同源性88. 8-98.4%。成熟的水貂α-干扰素由167个氨基酸组成，诱导其 分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成。由于水貂的病毒性疾病种类多、危害大，因此发展 具广谱抗病毒效应的水貂干扰素具有重要意义。但干扰素的传统提取方法产量低、操作繁 琐，很难推广应用，因而寻找一种高效生产干扰素的方法成为亟待解决的问题。
[0004] 毕赤酵母表达系统是应用广泛的一种真核表达系统，可胞外表达外源蛋白。相比 于大肠杆菌等原核表达系统，它具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能，而与杆状病毒、哺 乳动物细胞相比，它又具有培养成本低、产量高、便于产物的分离纯化等优点。近年来，酵母 表达系统的研宄得到迅速发展，此系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌毕赤 酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，利于下游分离纯化操作，能大规模发 酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服传统获得干扰素方法的不足，提供一种重组水貂α -干扰素的制 备方法和应用，所述的制备方法通过高效外源表达重组水貂α-干扰素的真核表达系统实 现。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种重组水貂α -干扰素的制备方法，包 括：将水貂α 2-干扰素基因克隆至载体pGAPZa A中，实现毕赤酵母重组表达载体的构建及 筛选，并在毕赤酵母中进行诱导表达，获得重组水貂α -干扰素。
[0007] 所述的水貂α -干扰素基因序列如Seq ID NO :1所示。
[0008] 所述的水貂α -干扰素基因进行克隆时所用的引物为：
[0009] 扩增水貂α -干扰素基因特异性上游引物：
[0010] 5' -GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3' ；
[0011] 扩增水貂α -干扰素基因特异性下游引物：
[0012] 5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3 '。
[0013] 所述的诱导表达的具体方法为：用含Zeocin 100mg/L的YTO液体培养基进行菌体 的扩增培养，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 1. 5 ;按1:100比例转接到含Zeocin IOOmg/ L的YPD液体培养基中，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 6-8, 7000rpm，4°C，离心15min，获 得含有重组水貂α-干扰素的上清液。
[0014] 本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
[0015] 所述的毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选，包括以下步骤：
[0016] 首先将载体PGAPZa用Xh0 I和Xba I双酶切后检测回收，设计扩增水貂α-干 扰素基因特异性引物，引物上下游分别有15个碱基与上述酶切后线性载体的两端互补，回 收PCR基因片段，直接用In-Fusion HD Cloning Kit将片段和载体连接，转化DH5a感受态 细胞，经质粒PCR和双酶切鉴定阳性克隆，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体，即将 基因插入PGAP启动子和a -alpha信号肽下游的Xho I /Xba I位点，构建成分泌型酵母 表达重组质粒，以Bin I酶切载体呈线性化后电击转化酵母X-33,转化子经Zeocin IOOmg/ L抗性筛选，菌落PCR鉴定分析，确定阳性菌株后作进一步的摇瓶发酵。
[0017] 上述方法制备获得的重组水貂α -干扰素在制备治疗犬瘟热疾病的药物中应用。
[0018] 上述方法制备获得的重组水貂α -干扰素在制备治疗水貂细小病毒感染疾病的 药物中应用。
[0019] 上述应用的一种优选配方为50~100万IU重组水貂α -干扰素：1ml止血敏： 0. 8ml安乃近注射液。
[0020] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0021] 本发明采用常规的PCR方法获得水貂α-干扰素基因编码区，克隆入毕赤酵母分 泌型表达载体中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分 泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白，蛋白浓度最高可达3. 593mg/mL。另外，本发明 通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组重组蛋白的抗病毒活性。
【附图说明】
[0022] 图1是毕赤酵母-X33培养上清多克隆抗体检测MiIFN-α蛋白表达结果图，其中 Α:克隆菌株1培养上清；Β:克隆菌株2培养上清；C:克隆菌株3培养上清；D:克隆菌株4 培养上清；Ε:克隆菌株5培养上清；F:克隆菌株6培养上清；G:克隆菌株7培养上清；Η: 阴性对照；MK:分子量标准。
[0023] 图2是表达产物纯化结果图，其中Α:诱导IFN-α蛋白表达产物（6 μ g) ;Β:未诱 导IFN- α蛋白表达产物（6 μ g)，MK:分子量标准。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0025] 实施例1毕赤酵母重组表达载体的构建
[0026] 1)水貂α -干扰素13个亚型基因序列扩增及多态性分析
[0027] 外周血淋巴细胞诱导及总RNA的提取：
[0028] 无菌采取健康水紹外周5mL，置于加有抗凝剂（38g/L梓檬酸钠）的灭菌容器中， 然后在无菌条件下加入RPMI1640培养液1 :1稀释。取5mL人用淋巴细胞分离液上，室温下 2000r/min水平转子离心40min。用折弯的灭菌长针头小心将白细胞层移于另一试管中（约 ImL)中，加2倍体积的RPMI1640培养液混匀后，2000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物再 加入等量RPMI1640,相同方法洗涤2次，弃去上清液，沉淀细胞用含lOOOOU/mL双抗、IOOmL/ L小牛血清的RPMI1640培养液悬浮。取10 μ L细胞悬液计数，按计数结果稀释至I X IO7/ mL，置于24孔细胞培养板中，37°C 50mL/LC02培养箱中静置培养2h后，加入TCID 5Q为10 _6 5 新城疫弱毒株Lasota 100 μ 1诱导物培养24h〇
[0029] 收集诱导24h后的淋巴细胞于15mL离心管中，2000r/min离心10min，弃上清液， 将沉淀用ImL TRIzol Reagent重悬，冻存于-70°C备用。
[0030] 取出装有淋巴细胞的冻存管，室温融化，加 l/5Trizol体积的氯仿，充分混匀后静 置3min，12000r/min离心15min，将沉淀用750mL/L的乙醇缓慢洗涤2遍，倒置控干后用 lmL/L DEPC处理的灭菌水9. 5 μ L溶解沉淀，即获得淋巴细胞总RNA。
[0031] 2) 13个亚型基因通用引物的设计与合成
[0032] 应用Primer 5. O基因分析软件，参照GenBank登陆的犬、狐、猫、猪、羊、牛、人及 禽类的α-干扰素基因序列，分析其核苷酸同源性，设计扩增水貂α-干扰素基因引物，弓丨 物序列如下：
[0033] 扩增水貂α -干扰素基因上游引物：5' -ATGGCCCTGCCCTGCTCCT-3' ；
[0034] 扩增水貂α -干扰素基因下游引物：5' -TCACTTCCTGCTCCGCAATCT-3'。
[0035] 采用RT-PCR方法扩增目的基因。操作步骤：在9. 5 μ L的RNA溶液中加入1 μ L 01igo(dT)15引物（50pmol/yL)，混匀后于70°C水浴作用5min，立即冷却，依次加入 lOmmol/L dNTP 5 μ L，AMV 缓冲液 4 μ L，RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L，AMV 1 μ L 充分混匀，42°C反 应lh，95°C 3min灭活反转录酶，冷却后直接用于PCR反应。PCR反应体系：10XEx Taq缓冲 液2.5 4 1^，2.5臟〇1/1/^1^(1阶132 4 1^，25口111〇1/^1^上、下游引物各14 1^，25口111〇1/1丁&9〇嫩 聚合酶0. 125 μ L，加入灭菌去离子水至25 μ L。将25 μ L反应液混匀后，于PCR仪上进行扩 增，循环参数为：95°C预变性 5min ;94°C 45s，52. 5°C lmin，72°C lmin，32 个循环后，72°C延 伸6 min。用15g/L琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，产物与PMD18-T载体连接，转化DH5a感 受态细胞，每批批挑取30个克隆，共计三批，PCR酶切鉴定正确后，测序。
[0036] 经过90个序列比对，将相同的基因序列分为一组，共计13组，90个克隆测序基因 序列大小均为564bp ;重复上述操作三次，结果均获得13组基因序列，即13个水貂IFN-a 基因亚型序列，核苷酸同源性93. 6-99. 3%。
[0037] 3)酵母表达载体构建
[0038] 在构建酵母表达载体之前，我们先将13个亚型基因构建到原核表达载体中，并分 别进行了表达，应用微量细胞病变抑制法检测抗病毒活性，其中IFN-a 2活性最高，我们选 择该亚型为酵母表达载体的基因模板。
[0039] ①引物设计
[0040] 参照本研宄团队已提交NCBI GenBank的水貂a 2-干扰素基因（EU863613)为 模板，设计扩增水貂α-干扰素成熟肽基因的特异性引物，引物首末为酵母表达载体 PGAPZaA连接位点（下划线部分），加重部分为载体序列。引物序列（5' -3'）如下，扩增 水貂a-干扰素基因特异性上游引物：
[0041] 5' -GAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATGTGACCTGCCTCAGA-3'，扩增水貂 a -干扰素 基因特异性下游引物：5' -GAGTTTTTGTTCTAGATTACTTCCTGCTCCGCA-3' ；
[0042] ②PCR合成水貂a -干扰素成熟肽基因
[0043] PCR反应体系：10XE X Taq Buffer 2.5 μ 1，2. 5mmol/μ I dNTP 2 μ 1，上、下游引 物（25pmol/ μ 1)各 1 μ I，25pmol，Taq DNA 聚合酶（2U/ μ I) 0· 125 μ I，加入 17. 375 μ 1 灭菌 去离子水。将25 μ 1反应液混匀后，于PCR仪上进行扩增，循环参数为95°C预变性5min， 94°C 45s，52. 5°C lmin，72°C lmin，33 个循环后 72°C 延伸 lOmin，扩增完毕后，取 10μ 1 于 I. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收扩增产物进行测序，所得片段大小为500bp，其核苷酸 序列如下所示（Seq ID NO :1)。
[0044] 水貂α 2-干扰素基因序列，其中划线部分为信号序列：
[0045] ATGGCCCTGCCCTGCTCCTTCTTGGTAGCCCTGGTGGTGCTCAGCTGCCACTACCTCAGCTCTTTGGGA TGTGACCTGCCTCAGACCCCTGGCCTGCTGCACTGGAGGGCCCTGATGCTCCTGCGACAAATGAGGAGACTGTCTGC TAGCTCCTGTGACAACTACACAAACGACTTTGGCTTCCCCCAGGAGGCCTTCGACGGCAAGCCGCTGCAGAAGGCTC AAGCCCTCTCTGTCCTCCATGTGACGAACCGGAAGACCTTCCACCTCTTCTGCACAGAGGCCTCACCTGCTCCTTGG AACACGGCCCTCCTGGAGGAATTGTGCTCGGGACTTTCTGAGCAGCTGGGCCTCCTGGAAGCCTGTCCCCTGCAGGA GGCTGGGGTGGGAGAGCCGCCCCTGGTGAATGGGGACTCCATCCTGAGGAACTACTTCCAGAGAATCTCCCTCTATC TGCAAGAGAAGCAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGATGGTCCGAGCAGAGATCATGAAACCCTTGTATGCATCAACA GCCTTGCATAAGAGATTGCGGAGCAGGAAGTGA
[0046] ③表达重组质粒构建和酵母转化
[0047] 载体pGAPZ α用Xho I和Xba I进行双酶切为线性后检测回收，水貂α -干扰素 基因经PCR扩增，回收的目的片段用In-Fusion HD Cloning Kit将处理，连接原理是使目 的基因两端形成与酶切后载体两端15个碱基互补的粘性末端连接，融合连接反应体系为 10 μ 1，包括 5 X In-Fusion HD Enayme Premix 溶液 2 μ I，DNA 片段 2 μ 1，线性载体 1 μ 1，去 离子水μ 1 ;反应条件为50°C，15min，然后将连接产物冰预5min用于转化。将连接产物转 化至大肠杆菌工程菌DH5a，将重组子测序。经验证得到插入片段正确的重组子。摇菌，提 质粒，经Bin I酶切回收后即可进行毕赤酵母的转化，转化使用的是市售巴斯德毕赤酵母 (Pichia，Pastoris)X-33。酵母转化的具体步骤如下：
[0048] a)将10 μ 1经酶切线性化的质粒与100 μ 1的新鲜毕赤酵母感受态菌体混勾，转至 住0. 2cm预冷的电转化杯中；
[0049] b)将质粒与感受态混合物冰浴5min ;
[0050] c)所用电转化仪是美国的伯乐biorad电转化仪，电转化使用的电压为412V ;
[0051] d)点击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至一个新的I. 5ml的 离心管中；
[0052] e)将菌体悬液涂布于YPD (Zeocin 100mg/L)平板上，每200 μ 1涂布一块平板；
[0053] f)将平板置于30°C培养，转化2~3长出单菌落。
[0054] 4)重组毕氏酵母的筛选及鉴定
[0055] 挑取1个转化子单菌落到（Zeocin 100mg/L)平板上培养48小时，然后再点接到 (Zeocin 100mg/L)平板上，以酵母菌为模板，挑取6个菌落做PCR检测；30 μ 1反应体系，弓丨 物各 1 μ 1，Ex Taq Premix 15 μ 1，无菌水 13 μ 1。
[0056] 实施例2外源基因在毕赤酵母中的高密度分泌表达
[0057] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于YPD (Zeocin 100mg/L)液体培养基（按 < 10%装瓶），30°C，300rpm。摇床培养至对数期（0D600 = 1.5);
[0058] 2)转接Iml培养液至IOOmL YPD (Zeocin 100mg/L)液体培养基（按彡10装瓶）， 30°C，300rpm摇床培养至对数中期（0D600 = 6-8);
[0059] 3)室温7000rpm离心5min，收集上清，经硫酸按浓缩、透析，用5ml无菌水溶解后 作SDS-PAGE分析之样品；以12%的分离胶进行SDS-PAGE分析，His单克隆抗体检测表达正 确性；
[0060] 4)Western-blot进一步检测分析，结果见图1。
[0061] 基因工程α-干扰素表达产物氨基酸序列如下所示（Seq ID NO :2)，其中划线部 分为a -factor分泌信号肽，粗体部分为6 XHis标签，划线部分为肠激酶酶切位点。
[0062] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE⑶FDVAVLPFSNSTNNGLLFINTT IASIAAKEEGVSLEKREAEACDLPQTPGLLHWRALMLLRQMRRLSASSCDNYTNDFGFPQEAFDGKPLQKAQALSVL HVTNRKTFHLFCTEASPAPWNTALLEELCSGLSEQLGLLEACPLQEAGVGEPPLVNGDSILRNYFQRISLYLQEKQY SPCAffEMVRAEIMKPLYASTALHKRLRSRKFLEQKLISEEDLNSAVDDDDDKHHHHHHo
[0063] 实施例3外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
[0064] 1)挑取待表达的重组毕赤酵母单菌落于YPD (Zeocin 100mg/L)液体培养基（按 <10%装瓶），30°〇，300印111。摇床培养至对数期（00600 = 6);
[0065] 2)转接Iml培养液至IOOmL YPD(ZEOCIN 100MG/L)液体培养基（按彡10 %装 瓶）30°C，300rpm摇床培养至对数中期（0D600 = 30);
[0066] 3)室温4000rpm离心5min，收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至100ml BMMY 液体培养基中，28 °C，280rpm摇床培养；
[0067] 4)从细胞沉淀转至Yro液体培养基诱导开始，每隔24小时取样Iml分析表达水 平，确定最佳诱导时间为72h ;
[0068] 5)选择最佳的诱导时间收集样品，室温12000r/min离心15min，取上清液进行 SDS-PAGE 电泳及 Western-blot 分析。
[0069] 实施例4表达蛋白纯化及活 性检测 [0070] 1)表达产物的蛋白质含量测定
[0071] 对发酵诱导表达产物上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳后，进行R-250染色、脱色，置 于薄层扫描仪（UVP凝胶成像分析系统）进行灰度扫描，通过Labwork软件系统来分析，利 用牛血清蛋白做定量对照，计算样品总蛋白及总蛋白中MiIFN-α的有效含量。并用BCA蛋 白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。结果如表一所示，蛋白浓度最高可达4. 993mg/mL。
[0072] 2)抗病毒活性检测
[0073] ①人干扰素标准品（rhIFN-α )参考物质：购自中国食品药品鉴定研宄院，α -干 扰素国豕标准品，批号：（2008)国标生字0017,以下称干扰素标准品。
[0074] ②VSV的制备：用含10 %的优级胎牛血清的MEM营养液按照1:500稀释毒种，接种 于生长良好的单层MDCK细胞上（MDCK)进行增殖，孵育至细胞80%病变时，反复冻融3次， 10000 Xg离心10min，收集上清，分装与灭菌离心管中，冻存于一 80°C。
[0075] ③VSV的效价测定：在96孔板中培养MDCK细胞至单层，弃去营养液，用无血清的 MEM营养液按照10倍倍比连续稀释VSV，每一个稀释度做8个重复孔，每孔加入稀释后的病 毒液100 μ 1，细胞阴性对照孔加入100 μ 1无血清的MEM营养液，37°C CO2恒温培养箱内孵育 lh，弃去上清液，没孔加入含3%胎牛血清的MEM营养液100 μ 1。当出现病变时，观察记录 结果，用Karber法计算出VSV的效价（TCID5tl)，将测定完效价的病毒标记并保存于一 80°C 备用。
[0076] ④抗病毒活性的测定：
[0077] 生物学活性定参照2002年中华人民共和国药典三部，用CPE(细胞致病变效应） 抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检验品的最高稀释度仍能保护半数细胞 (50% )免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。具体方法为：
[0078] a、细胞培养：取MDCK细胞在96孔板中培养之全部贴壁生长到60%。
[0079] b、干扰素加样：将96孔板细胞培养物去除培养液，分两组，一组将水貂α -干扰素 标准品稀释成l〇〇〇U/ml，每孔加入100 μ 1 4倍倍比稀释，一组每孔加入100 μ 1 4倍倍比稀 释的试验干扰素溶液，每列是一个稀释度，同时设置无干扰素和无病毒的细胞对照孔，然后 放入37 °C CO2恒温培养箱内培养24h。
[0080] C、攻毒：用IOOTCID5ci剂量的水泡性口炎病毒进行攻毒，对照孔加无病毒的培养 液，同时设立阴性对照（只加经倍比稀释的重组干扰素，不加病毒），阴性对照（不加干扰 素，只加病毒），空白对照（不加干扰素，不加病毒），在倒置显微镜下观察标准品lU/ml的 孔出现50 %病变的时候判断结果。
[0081] d、染色：弃去上述步骤中96孔细胞培养板中的上清，用PBS洗3次，控干水分，每 孔加入0. 5 %的结晶紫染色液50 μ 1，室温放置20min，然后用PBS洗涤三次后，加入终止液， 在波长570mm处测定吸光度。
[0082] e、引进病毒滴度测定的Reed-Muench法计算干扰素效价（U/ml)，国际上最，常采 用的判定干扰素活性的方法是在标本的梯次稀释度中，仍能保护半数细胞免受攻击病毒损 害的最高稀释度的倒数即为干扰素的效价。
[0083] f、应用MDCK/VSV病毒检测系统，将酵母分泌表达MilFN-a 4倍倍比稀释后检测抗 病毒活性，攻毒后观察细胞病变，在接种24h后，部分孔出现了细胞病变，见表1。距离比= (高于50%病变率的百分数-50% V (高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分 数）。参照"IFN-α国际单位（IU/ml)=(样品CPEI5tl稀释度/标准品CPEI 5tl)/标准品的 单位"公式计算重组干扰素的比活性。多次重复试验测得MiIFN-α重组干扰素抗病毒活性 分别为 1.92X 106U/mg。
[0084] 表1.水貂IFN- α在MDCK/VSV上细胞病变抑制观察记录表
[0085]
[0086]
[0087] 实施例5重组毕赤酵母的发酵
[0088] 1)种子液制备
[0089] 将酵母克隆划线接种到YPDs-zeocin平板上30°C培养72小时后，挑取菌落接种到 Yro液体培养基中培养，在无菌条件下取样检测，镜检无杂菌即可作为菌种。发酵使用的种 子液保存在4°C，应在48h内使用。
[0090] 2)发酵条件
[0091] 发酵培养基为YPD (Zeocin 100mg/L)，培养温度为30°C培养OD6qq= 6-8,接种量占 培养基总体积的15%，300rpm培养后，检测其生物活性。
[0092] 3)提取工艺
[0093] 将工程菌株接种于含100mg/L Zeocin的YH)培养基发酵72h，离心收集发酵上 清液，以醋酸调节pH4. 0-5. 0,过CM Sepharose柱层析，收集0. 4mol/L NaCl洗脱峰，加硫 酸按至30 %，离心取上清液，过PhenylSepharose层析，收集10 %硫酸按洗脱峰，过EAE epharose柱层析，收集0. mol/NaCl洗脱峰，过Sephacryl S-200柱层析，获得纯度大于99 % 的MiIFN-α原液，见图2。
[0094] 实施例6水貂α -干扰素对人工复制水貂细小病毒感染的防治试验 [0095] 本试验依据农业部兽药审评中心《兽用生物制品实验室效力试验技术指导原则》 (VB/Gu007/Ver01)要求，采用吉林特研生物技术有限责任公司代号为SPMV-Il水貂细小病 毒种毒，进行水貂细小病毒疾病模型复制，并使用不同剂量重组水貂α -干扰素并配合辅 助治疗，通过对人工发病水貂在使用药物后各项指标分析，验证重组水貂α -干扰素对人 工复制水貂细小病毒病治疗效果。
[0096] 1)实验药物及毒株的制备
[0097] 应用酵母表达系统制备重组水貂α -干扰素，4°C保存备用。临用前以灭菌的生理 盐水稀释后应用，现配现用。毒株代号为SPMV-Il分离株按照常规方法用猫肾细胞（MDCK) 细胞测得其组织细胞半数感染剂量（TCID5tl)为10-6_ 5/100 μ 1，以常规方法用3月龄水貂（雌 雄兼有）测定水貂细小病毒半数感染量ID5tl为l(T4_°/2ml。以猪红细胞测定水貂细小病毒 株血凝价2 8。
[0098] 2)实验动物分组及治疗
[0099] (1)3月龄未接种过水貂细小病毒疫苗的水貂共40只，雌雄兼有。接种病毒前观察 7日。为避免肠道寄生虫对实验结果影响，观察期间应用阿苯达唑进行驱虫（25mg/kg体重 内服，一日一次，连续三次）。引进动物前对饲养房间、用具全部以甲醛熏蒸消毒。每日饲喂 2次，饲料为商品化毛皮动物饲料，自由饮水。符合试验条件水貂应临床表现健康，体温、白 细胞总数等检查结果均正常。粪便以犬细小病毒快速诊断试纸（上海快灵）进行检查，结 果均为阴性。
[0100] 3)实验方法
[0101] (1)疾病模型复制发病判断标准
[0102] ①临床症状观察及剖检：接种后，每日两次观察临床症状（如精神状态、呕吐、腹 泻、便血等），对表现异常水貂测肛温。对发病死亡水貂进行剖检，重点观察小肠及肠系膜淋 巴结组织变化。
[0103] ②水貂细小病毒快速诊断：根据发病情况和典型临床症状初步诊断为水貂细小病 毒感染水貂，再用犬细小病毒快速诊断试剂盒进行确诊。以无菌棉拭子取病水貂直肠粪便， 加生理盐水约2ml，充分振动后静置3分钟，吸取上清液加入试剂盒中，约5分钟后观察结 果，呈现一条红线为阴性，两条红线为阳性。
[0104] ③水貂细小病毒分离培养：取病死水貂十二指肠或空肠内容物，加生理盐水及双 抗，混匀静置后，上清液用除菌滤器过滤（滤膜孔径为〇. 22微米）。待犬肾细胞（MDCK株）长 成单层并用胰酶消化后按1 : 2分瓶，取过滤好的上清按照约细胞培养上清量的1/3接种 犬肾细胞（MDCK株），同时设立阴性对照，37°C静置培养，24小时后将细胞生长液（含10% 小牛血清、30微克/毫升L-谷氨酰胺DMEM)换成维持液（不含小牛血清、补加90微克/毫 升L-谷氨酰胺DMEM)，逐日观察细胞病变，若经盲传3代后，产生细胞病变，则继续传代。
[0105] ④PCR检测：提取分离病毒基因组DNA，并以此DNA为模板，参照水貂细小病毒相 关文献及GenBank数据库中的已有的VP2蛋白相应基因序列合成，扩增的目的基因为水貂 细小病毒VP2蛋白相应基因，扩增目的片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定是否获得了预计长度 DNA片段大小（573bp)。
[0106] 发病判断标准：按每只水貂灌服100个TCID50SPMV-11，多数水貂在接种后第 6~ 8日开始出现临床症状。表现为精神萎靡，活动明显减少，喜卧，排奠次数增多，粪便显灰黄 色或黄色，稀如粥状，散发特殊腥臭味；约1日后呈喷射状排出番茄汁样粪便，混有伪膜或 黏液，白细胞下降，体温升高；同时用犬细小病毒快速诊断试纸进行实验室诊断为阳性，判 定人工感染成功。
[0107] (2)联合治疗实验
[0108] 在开展联合治疗之前，我们采用单独使用干扰素治疗水貂细小病毒感染只有20% 治愈率，达不到理想的效果（80%以上）。分析原因可能是由于重组水貂α-干扰素应用后 虽然能针对病毒发挥作用，但在改善由病毒感染导致的一系列症状，如呕吐、腹泻、脱水、电 解质紊乱、酸中毒、高热、出血等严重临床症状方面，仍需配合对症治疗措施，方能进一步改 善疗效。该情况与临床应用干扰素治疗犬细小病毒病结果一致。所以本次实验以干扰素治 疗和辅助治疗同时进行。
[0109] 试验方法：所有实验水貂随机分为4组，每组10只，试验分组及处理见表2:
[0110] 表2实验动物分组及给药
[0111]
[0112] 按每只水貂灌服100个tcid5(ispmv-ii，各组水貂均于出现呕吐、精神沉郁或腹泻 症状时开始按表2给药治疗，给药疗程水貂α -干扰素治疗，g卩：低剂量干扰素（20万IU/ kg) +辅助治疗组、中剂量干扰素（推荐剂量，50万IU/kg) +辅助治疗组、高剂量干扰素（100 万IU/kg) +辅助治疗组，分别给予相应剂量射用重组水貂α -干扰素。
[0113] 辅助治疗：肌肉注射止血敏（0.7ml)，安乃近注射液（0.5ml)。分别于臀部肌肉丰 满处注射。口服补液盐（8. 95g)、安贝消食片（1片）、土霉素片（SOmg)。其中口服补液盐以 温水冲服，安贝消食片与土霉素直接投服于口中。
[0114] 试验结果：按每只水貂灌服100个Tcid5qSPMV-II后6~8日，各组水貂均出现 呕吐、精神沉郁或腹泻症状，经犬细小病毒快速诊断试剂盒进行确诊后，按表2方案进行治 疗，对各组犬进行仔细观察，对死亡水貂进行剖检，用PCR病毒扩增后进行病毒鉴定，并按 临床观察及疗效判定标准进行效果判定。试验动物疾病模型复制情况见表3。
[0115] 表3联合治疗效果试验研宄中实验动物疾病模型复制情况
[0116]
[0117]
[0118] 辅助治疗组各水貂每日1次给予对症治疗，5只水貂中，有1只水貂于给药治疗后 第3日死亡，其余4只均连续给药7日，至给药结束后第7日仍有2只水貂未完全康复，表现 为精神沉郁、食欲减退、体重下降。有效率40%，死亡率20%。干扰素低剂量组5只水貂除 每日一次皮下注射给予20万IU/kg体重重组水貂α -干扰素外，同时结合辅助治疗措施。 5只水貂中仅有1只水貂于给药后第2日死亡。其他4只水貂均于连续给药3日后出现明 显好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5~7日后均基本痊愈，至给药结束后第7日，精神、 食欲恢复正常。有效率80%，死亡率20%。
[0119] 干扰素中剂量与高剂量组5只水貂除每日一次皮下注射给予40或80万IU/kg体 重重组水貂α -干扰素外，同时结合辅助治疗措施。10只水貂均于连续给药3~4日后出 现明显好转，呕吐、腹泻症状得到缓解，给药5~7日后均基本痊愈，至给药结束后第7日， 精神、食欲恢复正常。有效率1〇〇%，死亡率〇%。治疗情况见表4。
[0120] 表4联合治疗效果试验各组水貂发病及治疗情况
[0121]
[0123] (3)分析与讨论：重组水貂α -干扰素治疗结果与使用剂量呈正相关性，即随着重 组水貂α-干扰素剂量（以细胞效价表示）增加，对水貂治愈率增加，死亡率降低。根据 "有效率高于80%，死亡率低于20%，判定为有效"判断标准，所以40万IU/kg体重为重组 水貂α -干扰素有效剂量。
[0124] 总结分析：
[0125] 通过治疗方案研宄试验可以看出，按50万IU/kg体重单独应用重组水貂α -干扰 素组其综合平均分、治愈率、有效率与感染对照组相比均差异显著，说明重组水貂α -干扰 素对水貂细小病毒病感染具有一定效果。但水貂在具有呕吐、腹泻、脱水、电解质紊乱、酸中 毒、高热、出血等严重临床症状时如果不配合对症辅助治疗，发病水貂上述症状不能得到有 效快速缓解，全身多个器官处于病理状态，机体抵抗力低下，不利于疾病快速恢复，甚至个 别水貂会因为多器官和组织衰竭引起急性死亡。
[0126] 通过联合治疗效果试验研宄结果可以看出，重组水貂α-干扰素配合辅助方案 治疗水貂细小病毒病感染各剂量组从综合平均分、治愈率、有效率各项指标均优于单独辅 助治疗组，且差异均极显著，其治疗结果与治疗试验方案研宄项下单独应用干扰素组相比， 各方面指标都有明显提高，中剂量组和高剂量组有效率达到100%，说明重组水貂α-干 扰素在治疗水貂细小病毒病上效果显著；从各剂量组水貂各指标综合结果来看，重组水貂 α -干扰素治疗效果在一定剂量范围内呈正相关，当剂量达到50万IU/kg体重以上时，即能 有效治疗水貂细小病毒病引起感染。通过验证试验研宄结果表明，两批重组水貂α-干扰 素对水貂细小病毒病治疗效果从综合平均分、治愈率、有效率各项指标来看差异不显著，且 与联合治疗效果试验研宄项下高中剂量组相比差异不显著，说明重组水貂α -干扰素对水 貂细小病毒病治疗效果稳定。
[0127] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重组水貂a-干扰素的制备方法，其特征在于：包括：将水貂a-干扰素基因克 隆至载体pGAPZaA中，实现毕赤酵母重组表达载体的构建及筛选，并在毕赤酵母中进行诱 导表达，获得重组水貂a-干扰素。2. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的水貂a_干扰素基因序列如SeqIDNO:1所示。3. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的水貂 干扰素基因进行克隆时所用的引物为： 扩增水貂a_干扰素基因特异性上游引物如SeqIDNO:3所示； 扩增水貂干扰素基因特异性下游引物如SeqIDNO:4所示。4. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的诱导 表达的具体方法为：用含Zeocin100mg/L的YH)液体培养基进行菌体的扩增培养，30°C， 300rpm摇床培养至OD6qq= 1. 5 ;按1:100比例转接到含ZeocinlOOmg/L的YH)液体培养 基中，30°C，300rpm摇床培养至OD6qq= 6-8, 7000rpm，4°C，离心15min，获得含有重组水貂 a_干扰素的上清液。5. 根据权利要求1所述的重组水貂a_干扰素的制备方法，其特征在于：所述的毕赤 酵母重组表达载体的构建及筛选，包括以下步骤： 首先将载体pGAPZa用XhoI和XbaI双酶切后检测回收，设计扩增水貂a-干扰素 基因特异性引物，回收PCR基因片段用In-FusionHDCloningKit将处理后的片段和载体 连接，经验证得到插入正确的重组毕赤酵母载体，即将基因插入PGAP启动子和a-alpha信 号肽下游的XhoI/XbaI位点，构建成分泌型酵母表达重组质粒，以BinI酶切载体呈 线性化转化酵母X-33,经含Zeocin100mg/L的YH)培养基平板筛选和PCR鉴定分析，确定 阳性菌株后作进一步的摇瓶发酵。6. 权利要求1~5任一项所述的方法制备获得的重组水貂a-干扰素在制备治疗犬瘟 热疾病的药物中应用。7. 权利要求1~5任一项所述的方法制备获得的重组水貂a-干扰素在制备治疗水貂 细小病毒感染疾病的药物中应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的一种配方为50~100万IU重 组水貂a-干扰素：1ml止血敏：0. 8ml安乃近注射液。
【专利摘要】本发明提供了一种重组水貂α-干扰素的制备方法和应用，属于基因工程领域。所述的制备方法采用常规的PCR方法获得α-干扰素基因编码区，将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pGAPZα中，电转化毕赤酵母菌，筛选高抗性转化子，实现重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并得到具有抗病毒活性的重组蛋白。本发明通过优化毕赤酵母表达系统，提高了重组蛋白的抗病毒活性。
【IPC分类】C12R1/84, A61P31/14, C12N15/81, C12N15/21, A61P31/20, A61K38/21
【公开号】CN104894157
【申请号】CN201510095208
【发明人】张海玲, 闫喜军, 赵建军, 张蕾, 白雪, 胡博, 刘昊
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月3日
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