低丙烯酰胺食品的制作方法
低丙烯酰胺食品的制作方法
【专利说明】低丙烯酰胺食品
[0001] 本申请为申请号为200680043287. X的分案申请，要求2005年9月20日的优先权。
[0002] 优先权申请的交叉参考
[0003] 本非临时美国专利申请要求享有2005年9月20日提交的美国临时申请系列号 60/718, 335和2006年7月28日提交的美国临时申请系列号60/833, 788的优先权，二者的 内容在这里引作参考。 发明领域
[0004] 本发明涉及在植物中，例如在这些植物的富含淀粉的贮藏器官中下调和上调基因 的遗传方法，以降低在这些器官的加工相关的加热后积累的丙烯酰胺的水平。
[0005] 发明背景
[0006] 加热含有游离天冬酰胺和还原糖的食品，会导致丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺是在 世界范围内用于合成聚丙烯酰胺的工业化学物质。暴露于该反应性化合物，会导致在组织 中的快速吸收和均匀分布（Barber等人，Neurotoxicology 2001,22,341-353)。在啮齿动 物中，高浓度丙烯酰胺（>2mg/kg体重）的毒理学作用包括神经系统症状、生殖力减弱和癌 症（Friedman, J. Agric. Food Chem.，2003, 51，4504-4526) 〇
[0007] 还已知职业性暴露于高水平的丙烯酰胺会升高人类的神经毒性的发病率（Lo Pachin, Neurotoxicology, 2004, 25, 617-630)，但是没有记载丙稀酰胺对人类生殖的影 响或致癌作用。丙烯酰胺和它的氧化代谢物环氧丙酰胺会与血红蛋白的氨基端缬氨酸 反应，形成加合物。加合物形成的程度是暴露水平的良好标志物，且暗示着接近100 μ g 的日摄入量（Tareke 等人，J. Agric. Food Chem. ,2002, 50, 4998-5006)。尽管最初认为 饮用水、化妆品和吸烟代表着丙稀酰胺背景暴露的唯一主要来源（Bergmark, Chem. Res. Toxicol.，1997, 10, 78-84)，最近的分析表明，油炸的和烘烤的淀粉食品的消耗，构成约 36 % 的丙稀酰胺摄入（Becker 和 Pearson, Dietary habits and nutrient intake in Swedenl997-98〇 Riksmaten 1997-98, 1999)〇
[0008] 饮食丙烯酰胺主要源自热诱导的游离氨基酸天冬酰胺的氨基和还原 糖的羰基之间的反应（Mottram 等人，Nature, 2002, 419, 448-449 ;Stadler 等 人，Nature, 2002, 419, 449-450)。新鲜的马铃薯块茎含有非常高水平的天冬酰胺，但是相对 低浓度的还原糖葡萄糖和果糖。但是，在冷藏期间，通过表达冷诱导的转化酶（该酶催化蔗 糖向葡萄糖和果糖的转化），积累还原糖。
[0009] 以前尝试限制丙烯酰胺在淀粉食品中的积累，没有产生实用的且节省成本的应 用。现有技术的第一种方法是基于调整加工参数，例如表面/体积比，温度和油炸时间。尽 管这些方法的应用可能在减少丙烯酰胺的积累方面是部分有效的，但它会通过减轻颜色、 改变形状和改变口味和质地，改变最终食品的感观特征。这些改变是不希望的。
[0010] 第二种方法是基于，在加热前用天冬酰胺酶（EC 3. 5. I. 1)或glurninase(EC 3. 4. 1. 2)温育部分加工的食品（参见世界专利申请2004/030468 A3和世界专利申请 2004/026042 Al)。该方法是昂贵的，仅能容易地应用于可以与所述酶容易地混合的材料， 例如面粉。 toon] 第三种方法将天冬酰胺竞争剂例如甘氨酸加入部分加工的食品中（关于马铃薯 块茎的世界专利申请2005/025330 Al,关于烤制咖啡豆的美国专利申请2004/0081724 A1，关于可可豆的世界专利申请2005/004620 A1，关于基于玉米的食品的世界专利申请 2005/004628A1)。该方法仅是部分有效的，需要高浓度的添加剂，且因为成本太高而难以广 泛应用。
[0012] 第四种方法在加热前将还原糖改变酶（包括醛糖还原酶）加入食品中（参见美国 专利6989167)。该方法不是非常有效，且因为成本太高而难以广泛应用。
[0013] 第五种方法在加热前给食品包被选自下述的试剂：含有氨基酸的化合物，氨基酸 盐，氨基酸酰胺，氨基酸酯，和其混合物（参见世界专利申请2005/077203A3)。该方法仅 是部分有效的，且因为成本太高而难以广泛应用。
[0014] 第六种方法是基于，选择含有非常低水平的还原糖和天冬酰胺的种质。这样的种 质的可用性，使得将"低糖"和"低天冬酰胺"性状渐渗到食品工业可广泛使用的品种中成 为可能。但是，尚未鉴定出低天冬酰胺作物植物。即使将来发现了这样的种质，将希望的性 状渐渗到商业化品种中也需要至少15-20年。
[0015] 第七种方法遗传地修饰作物，以降低还原糖水平。该方法是基于下调参与淀粉降 解的基因，例如马铃薯淀粉相关的Rl和磷酸化酶-L基因的表达（参见，例如，美国专利申 请2003/0221213 Al)。尽管是部分有效的，从修饰的作物加工的食品仍然含有对照产品的 约三分之一的丙烯酰胺水平。
[0016] 因而，非常需要降低从淀粉作物得到的加工食品中的丙烯酰胺水平的方法。这样 的方法应当是节省成本的，不会降低食品的感观特征。本发明提供了这样的方法。
【发明内容】
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供了一种降低加工食品中的丙烯酰胺水平的新策 略，所述加工食品通过加热作物的淀粉组织来得到。独特地，该策略采用基因工程的方法， 使作物植物的淀粉组织中的天冬酰胺水平降低了至少50 %。
[0018] 在一个实施方案中，通过降低天冬酰胺生物合成的水平和/或增加天冬酰胺代谢 的水平，降低作物植物的淀粉组织中的天冬酰胺水平。任一种机理都可能需要下调或上调 直接或间接参与每个天冬酰胺途径的基因。在一个方面，参与天冬酰胺代谢的基因编码天 冬酰胺酶。在一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因编码天冬酰胺合成酶。
[0019] 在另一个方面，间接参与天冬酰胺途径的基因选自：谷氨酰胺合成酶（GS)基因， 硝酸还原酶（NR)基因，14-3-3基因，和己糖激酶（HXK)基因。
[0020] 在一个方面，通过降低参与天冬酰胺生物合成的至少一个基因的表达，降低天冬 酰胺生物合成的水平。
[0021] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，降低参与天冬酰胺生物合成的基因的表 达，所述表达盒从5'至3'包含，（i)启动子，（ii)包含参与天冬酰胺代谢的至少一个基因 的至少一个片段的序列的至少一个拷贝，和任选地，（iii)第二个启动子或终止子，其中所 述第一个和任选的第二个启动子以趋同方向排列。
[0022] 在一个方面，用于降低参与天冬酰胺生物合成的基因的表达的表达盒含有参与天 冬酰胺代谢的基因的至少一个片段的序列的2个拷贝。
[0023] 在一个方面，所述2个拷贝排列为（i)反向重复序列或（ii)直接重复序列。
[0024] 在一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因分离自：马铃薯，野生马铃薯例如 Solanum phureja,甘薯，山药，咖啡树，可可树，小麦，玉米，燕麦，高梁，或大麦，且 编码天冬酰胺合成酶。
[0025] 在一个方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含与SEQ ID: 1所示序列的至少一个片段 具有至少70 %同一性的序列。
[0026] 在另一个方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含与SEQ ID: 2所示序列的至少一个片 段具有至少70 %同一性的序列。
[0027] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，实现参与天冬酰胺代谢的基因的超量表 达，所述表达盒从5'至3'包含，第一启动子，参与天冬酰胺生物合成的基因，和终止子。
[0028] 在一个方面，参与天冬酰胺代谢的基因分离自：马铃薯，野生马铃薯例如Solanum phureja，甘薯，薯蓣，咖啡树，可可树，小麦，玉米，燕麦，高梁，或大麦，且编码天冬 酰胺酶。
[0029] 在一个方面，所述天冬酰胺酶基因包含与SEQ ID:9, 10, 14, 15, 31，32,或33所示 序列具有至少70%同一性的序列。
[0030] 在另一个方面，所述天冬酰胺酶基因包含与SEQ ID: 14所示序列具有至少70%同 一"性的序列。
[0031] 在另一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因是谷氨酰胺合成酶或己糖激酶基 因。
[0032] 在一个方面，所述启动子是下述基因的启动子：（i)马铃薯颗粒结合的淀粉合酶 基因，（ii)马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，（iii)马铃薯泛素-7基因，（iv)马铃薯块 茎特异蛋白（patatin)基因，（V)马铃薯类黄酮单加氧酶基因。
[0033] 在一个方面，马铃薯颗粒结合的淀粉合酶基因的启动子与SEQ ID NO:8的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的启动子与SEQ ID N0:7的 至少一部分具有至少70%同一性，马铃薯泛素-7基因的启动子与SEQ ID N0:21的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯块茎特异性蛋白基因的启动子与SEQ ID N0:22的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯类黄酮单加氧酶基因的启动子与SEQ IDN0:13的至少一 部分具有至少70%同一性。
[0034] 在另一个方面，所述启动子是在用于食品加工的淀粉作物的块茎、根或种子中表 达的基因的启动子。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明提供了降低食品中丙烯酰胺水平的方法，所述食品 通过加热作物的组织并同时降低该组织中天冬酰胺和还原糖的水平来得到。在一个实施方 案中，所述组织是作物或植物的淀粉组织。
[0036] 在一个方面，通过下述方式实现天冬酰胺和还原糖水平的同时降低：（i)下调参 与天冬酰胺生物合成的基因的表达，或超量表达参与天冬酰胺代谢的基因，和（ii)下调参 与淀粉降解的至少一个基因的表达。
[0037] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，下调参与淀粉降解的基因的表达，所述表 达盒从5'至3'包含，（i)启动子，（ii)包含参与淀粉降解的基因的至少一个片段的序列 的至少一个拷贝，和任选地，（iii)第二个启动子或终止子，其中所述第一个和任选的第二 个启动子以趋同方向排列。
[0038] 在一个方面，参与淀粉降解的基因选自：（i)淀粉-相关的Rl基因，和（ii)淀 粉-相关的磷酸化酶-L基因。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过同时降低组织中天冬酰胺和还原糖的水 平，降低通过加热作物的组织得到的食品中丙烯酰胺的水平并同时提高该食品的感官特征 的方法。在一个实施方案中，所述组织是作物或植物的淀粉组织。
[0040] 在一个方面，通过采用"多基因靶向"构建体，实现同时降低，所述"多基因靶向"构 建体包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含（i)可操作地连接到启动子上的 天冬酰胺酶基因，或（ii)可操作地连接到启动子上的天冬酰胺合成酶基因片段的至少一 个拷贝，所述第二表达盒包含DNA区段的至少一个拷贝，所述DNA区段含有可操作地连接到 启动子上的Rl基因片段和磷酸化酶基因片段，其中所述第一和第二表达盒可以是相同的 表达盒。
[0041] 在一个实施方案中，植物包含用"多基因靶向"构建体稳定转化的至少一个细胞。 在另一个实施方案中，所述植物是具有块茎的。在另一个实施方案中，所述具有块茎的植物 是马铃薯植物。在另一个实施方案中，所述具有块茎的植物含有稳定掺入它的基因组中的 盒。
[0042] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎加工的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，且（b)所述产品具有比从相同植物品种的非转基 因块茎生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度。
[0043] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎生产的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，（b)所述产品具有比从相同物种的非转基因块茎 生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度，且（c)所述产品还表现出比从相同物种的非转基因 块茎生产的等同产品更低的非酶性褐变速率。
[0044] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎生产的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，（b)所述产品具有比从相同物种的非转基因块茎 生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度，且（c)所述产品还表现出比从相同品种的非转基因 块茎生产的等同产品更低的非酶性褐变速率，且（d)所述产品还表现出比从相同品种的非 转基因块茎生产的等同产品增强的感官特征。在一个实施方案中，所述可食用的植物产品 具有比从没有根据本发明的方法修饰的植物生产的等同产品改善的感官特征。在一个实施 方案中，所述可食用的植物产品具有选自下述的至少一种改善的感官特征：外观，风味，香 气，和质地。
[0045] 在一个实施方案中，所述转基因块茎是马铃薯。在另一个实施方案中，所述产品是 炸薯条。在另一个实施方案中，所述产品是马铃薯片。
[0046] 在另一个实施方案中，所述转基因块茎是马铃薯，且所述转基因块茎产品在 4°C -12°C储存约1-30周时，其葡萄糖水平比在与该转基因块茎相同储存条件下储存的相 同物种的非转基因块茎的葡萄糖水平的50%还低。
[0047] 在一个实施方案中，所述植物选自：马铃薯，玉米，咖啡，可可，和小麦。
[0048] 在另一个实施方案中，用选自下述的细菌株转化所述植物：根癌农杆菌，三 叶草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛叶杆菌，苜蓿中华根瘤菌和百脉根中慢生根瘤菌 (MesoRhizobium loti)〇
[0049] 在一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸序列，其包含编码多肽的核酸序列，所 述多肽能降低植物中的天冬酰胺水平，并从而降低该植物的加工产品中的丙烯酰胺水平。
[0050] 在一个实施方案中，所述核酸序列与选自SEQ ID NO:9, 10, 14, 15, 31，32,和33的 序列或其变体或片段具有至少70%同一性，且所述核酸编码具有天冬酰胺酶活性的多肽。
[0051] 在另一个实施方案中，所述变体与SEQ ID N0:9, 10, 14, 15, 31，32,和33中的任 一个序列的序列同一性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75 %,74%,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64%,63 %,62 %,61 % , 或 60%〇
[0052] 在另一个方面，提供了分离的多核苷酸序列，其包含编码天冬酰胺酶的核酸序列， 所述天冬酰胺酶能降低植物中的天冬酰胺水平，并从而降低该植物的加工产品中的丙烯酰 胺水平。
[0053] 在另一个方面，本发明提供了具有降低的天冬酰胺酶表达水平的转基因植物，其 可以用于生产含有低丙烯酰胺含量的加工食品。
[0054] 在另一个方面，本发明提供了具有低丙烯酰胺含量的食品，其可以通过加工具有 降低的天冬酰胺含量的转基因块茎得到。
[0055] 基于美国食品药品管理局数据（www. cfsan. fda. gov/_ dms/acrydata. html)，在 大量快餐连锁餐馆中生产的典型炸薯条含有超过十亿分之100份（PPb)的丙烯酰胺。这样 的典型炸薯条中丙烯酰胺的平均量是404ppb，通过消耗炸薯条平均每日摄入的丙烯酰胺水 平是0.07微克/kg体重/天。结果，炸薯条代表着16%的丙烯酰胺总饮食摄入。烘箱烘烤 的薯条和由商业处理机生产的马铃薯片中丙烯酰胺的平均量分别是698ppb和597ppb。因 而，马铃薯-衍生的加工食品（包括炸薯条，烘箱烘烤的薯条，和马铃薯片）代表着38% 的丙烯酰胺总饮食摄入。
[0056] 根据本发明，在从本发明的特定品种的转基因植物生产的块茎得到的炸薯条、烤 薯条或马铃薯片中存在的丙烯酰胺水平，比从相同品种的非转基因植物得到的炸薯条、烤 薯条或马铃薯片中的丙烯酰胺水平低超过2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10 倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍，20倍，或超过20倍。
[0057] 以十亿分之......份表示，从本发明的块茎生产的炸薯条可以具有l_20ppb，20-40p pb, 40_60ppb, 60_80ppb,或 80-100ppb 的丙稀酰胺。
[0058] 以十亿分之……份表示，从本发明的块茎生产的烘箱烘烤的薯条、马铃薯片或薯 饼（hash brown)可以具有 l-2〇ppb，2〇-40ppb，4〇-6〇ppb，6〇- 8〇ppb，8〇-100ppb, IOO-I2Opp b, 120-140ppb, 140-160ppb, 160-180ppb,或 180-200ppb 的丙烯酰胺。
[0059] 本发明不限于降低块茎的油炸食品和马铃薯片产品中的丙烯酰胺水平。可以根据 本发明处理其它食物，以降低丙烯酰胺水平。
[0060] 早餐谷类中的丙烯酰胺水平可以从约50-250ppb降低至低于40ppb的水平，优选 降低至低于20ppb的水平。
[0061] 脆饼，如Dare Breton Thin Wheat Crackers和Wasa Original Crispbread Fiber Rye中的丙稀酰胺水平可以从约300_500ppb降低至低于IOOppb的水平，优选降低至低于 50ppb的水平。
[0062] 巧克力，如Ghirardelli无糖可可或Hershey可可中的丙稀酰胺水平可以从约 300_900ppb降低至低于200ppb的水平，优选降低至低于50ppb的水平。
[0063] 饼干中的丙烯酰胺水平可以从约50_200ppb降低至低于40ppb的水平，优选降低 至低于20ppb的水平。
[0064] 咖啡粉中的丙烯酰胺水平可以从约175_350ppb降低至低于60ppb的水平，优选降 低至低于30ppb的水平。
[0065] 小麦面包中的丙稀酰胺水平可以从约50_150ppb降低至低于30ppb的水平，优选 降低至低于15ppb的水平。
[0066] 应当理解，许多因素会影响最终的食品中的丙烯酰胺水平。这些因素包括作物、品 种、生长条件、收获的种子或块茎的贮存条件、和加工变量，例如加热稳定、加热时间、油炸 使用的油的类型和暴露的表面。
[0067] 本发明所述方法的应用，会使丙烯酰胺水平降低至少约5%、至少约10%、至少 约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、 50%，至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90 %或超过约90%。
[0068] 附图简述
[0 069] 图 I: (A)pSM1148, (B)pSM1151,和（C)pSM658 的简图。LB =左 T-DNA 边 界，P:Agp =马铃薯Agp启动子，2a = ast2基因片段的反义拷贝，la = astl基因片段的 反义拷贝，lb = astl基因片段的有义拷贝，2b = ast2基因片段的有义拷贝，P:Gbss =马 铃薯Gbss启动子，T:nos =农杆菌胭脂碱合酶基因的终止子，P:nos =农杆菌胭脂碱合酶 基因的启动子，RB =右T-DNA边界，P:Ubi7 =马铃薯泛素-7基因的启动子。
[0070] 图2:Russet Boise构建体。PF =启动子片段，GF =基因片段。
[0071] 优选实施方案的详述
[0072] 本发明提供了用于降低丙烯酰胺水平的多核苷酸序列和方法。
[0073] 本发明使用本领域技术人员众所周知的术语和短语。如果没有另外定义，此 处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的 相同含义。一般地，本文使用的命名，细胞培养、分子遗传学和核酸化学中的实验方法， 和在此描述的杂交是本领域公知和常用的。对于重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物 培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学 分析和药物制剂和递送，使用标准技术。一般地，根据厂家的说明进行酶促反应和纯化 和 / 或分离步骤。一般根据常规方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, edited by Sambrook&Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，2001)，进行这些技术和操作。
[0074] 丙烯酰胺：丙烯酰胺单体被认为是有毒的，会直接影响神经系统。它被视作致 癌物。丙烯酰胺会容易地透过完整皮肤从水溶液吸附。分子式是C3H5N0;结构：CH2 = CH-C0-NH2。
[0075] 农杆菌或细菌转化：如本领域众所周知的，用于转化植物细胞的重组质粒转化农 杆菌通常是根癌农杆菌或发根农杆菌的减毒（disarmed)和有毒的衍生物。在感染植株、外 植体、细胞或原生质体后，农杆菌会将DNA区段从质粒载体转移至所述植物细胞核。所述载 体通常含有位于T-DNA或P-DNA的边界之间的需要的多核苷酸。但是，可以使用能转化植 物细胞的任意细菌，例如，三叶草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛叶杆菌，苜蓿中华根瘤菌和 百脉根中慢生根瘤菌。
[0076] 被子植物：具有包裹在子房中的种子的维管植物。被子植物是开花的种子植物， 所述花生产果实。被子植物分为双子叶和单子叶植物。
[0077] 天冬酰胺生物合成：在植物中发生的生成天冬酰胺的酶催化的反应。
[0078] 天冬酰胺代谢：在植物中发生的将天冬酰胺转化成其它化合物的酶催化的反应。
[0079] 天冬酰胺酶：在多种植物、动物和细菌细胞中发现的天冬酰胺酶，是参与天冬酰 胺代谢的酶。它会催化天冬酰胺的脱氨作用，产生天冬氨酸和铵离子，导致游离循环天冬酰 胺的消耗。
[0080] 天冬酰胺合成酶：该酶参与天冬酰胺生物合成，并催化从天冬氨酸合成天冬酰 胺。
[0081] 抗生素抗性：细胞在有抗生素存在下存活的能力。本文使用的抗生素抗性源自抗 生素抗性基因在宿主细胞中的表达。细胞可以具有对任意抗生素的抗性。常用抗生素的实 例包括卡那霉素和潮霉素。
[0082] 双子叶植物：胚具有2瓣种子或子叶的开花植物，分支叶脉，花瓣数是4或5的倍 数。双子叶植物的实例包括、但不限于，马铃薯，甜菜，绿花椰菜，木薯，甘薯，胡椒， 猩猩木，菜豆，苜蓿，大豆，和鳄梨。
[0083]内源的：从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物 种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或 cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。
[0084] 表达盒：多核苷酸，其从5'至3'包含，（a)第一个启动子，（b)包含⑴基因或 基因片段的至少一个拷贝或（ii)基因启动子片段的至少一个拷贝的序列，和（c)以与第一 个启动子相反方向排列的终止子或第二个启动子。
[0085] 外源的：关于核酸"外源的"是指，该核酸来源于非植物生物体、或来源于与待转 化的植物不同物种的植物、或来源于与待转化植物不是互交可孕的植物，不属于目标植物 的物种。根据本发明，外源的DNA或RNA代表天然地存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼 或鸟类的遗传组成中，但不天然地存在于待转化的植物中的核酸。因而，外源核酸是编码核 酸，例如，编码不由被转化植物天然地产生的多肽。外源核酸不是必须编码蛋白产物。
[0086] 基因：基因是含有合成产物、多肽链或RNA分子所需的所有信息的DNA分子区段， 其包含编码序列和非编码序列。基因也可以代表多个序列，它们中的每一个可以独立表达， 或可以编码表现出相同功能活性的轻微不同的蛋白。例如，天冬酰胺合成酶1和2基因可 以统一称作一个基因。
[0087] 遗传元件："遗传元件"是任意离散的核苷酸序列，例如、但不限于，启动子，基因， 终止子，内含子，增强子，间隔区，5' -非翻译区，3' -非翻译区，或重组酶识别位点。
[0088] 遗传修饰：通过应用分子和细胞生物学方法，将DNA稳定导入某些生物体的基因 组中。
[0089] 裸子植物：如本文使用的，指具有没有子房的种子的种子植物。裸子植物的实例 包括针叶树，苏铁科植物，银杏，和麻黄。
[0090] 导入：如本文使用的，是指通过包括感染、转染、转化和转导的方法将核酸序列插 入到细胞中。
[0091] 单子叶植物：胚芽具有一个子叶或籽叶的开花植物，平行叶脉，花瓣数是3的倍 数。单子叶植物的实例包括、但不限于，玉米，稻，燕麦，小麦，大麦，和高梁。
[0092] 天然的：从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物种 在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或 cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。
[0093] 天然DNA:从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物 种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的任意核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA 或cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。换而言之，天然的遗传元件代表植 物育种者通过经典植物育种来改进植物所可以使用的所有遗传物质。根据本发明，天然核 酸的任何变体也认为是"天然的"。例如，天然DNA可以包含点突变，因为这样的点突变会天 然发生。通过采用限制位点，也可以连接2个不同的天然DNA，因为这样的位点普遍存在于 植物基因组中。
[0094] 天然核酸构建体：包含至少一个天然DNA的多核苷酸。
[0095] 可操作地连接：以这样的方式组合两个或多个分子，从而使它们在植物细胞中以 组合方式适当地起作用。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接 到结构基因。
[0096] 超量表达：基因的表达水平高于在非转基因植物中的水平。
[0097] P-DNA:本发明的植物衍生的转运-DNA( "P-DNA"）边界序列的核苷酸序列不同于 任意已知细菌-衍生的T-DNA边界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是说， P-DNA可以用于将一个多核苷酸转运和整合到另一个多核苷酸中。可以将P-DNA插入肿瘤 诱导质粒，例如替代常规T-DNA的来自农杆菌的Ti-质粒，并维持在细菌株中，正如常规转 化质粒一样。可以操纵P-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通过细菌介导的植物转 化整合到植物基因组中。参见 Rommens 等人，W02003/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455,和W02005/004585,它们都在本文中引作参考。
[0098] 表型：表型是植物的区别特征或特性，通过将一个或多个"需要的多核苷酸"和/ 或筛选/选择标记整合到转化的植物的至少一个植物细胞的基因组中，可以根据本发明改 变表型。"需要的多核苷酸"和/或标记可以赋予转化的植物的表型的变化，这通过修饰转 化的植物细胞或植物整体的许多遗传、分子、生化、生理学、形态学或农学特征或性质中的 任意一种来实现。因而，一个或多个稳定整合的需要的多核苷酸在植物基因组中的表达，会 在植物组织中产生降低的丙烯酰胺浓度的表型。
[0099] 植物组织："植物"是植物界许多光合的、真核的、多细胞生物体中的任一种，其特 征性地生成胚、含有叶绿体且具有纤维素细胞壁。可以根据本发明的方法处理植物的一部 分即"植物组织"，以生产转基因植物。根据本发明可以转化许多合适的植物组织，包括、但 不限于，体细胞胚，花粉，叶，茎，愈伤组织，匍匐茎，微块茎，和芽。因而，本发明预见 到被子植物和裸子植物的转化，所述植物例如小麦，玉米，稻谷，大麦，燕麦，甜菜，马 铃薯，番茄，苜蓿，木薯，甘薯，和大豆。根据本发明，"植物组织"也包括植物细胞。植 物细胞包括悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、 花粉、种子和微孢子。植物组织可以处于各种成熟阶段，可以生长在液体或固体培养基中， 或在土壤中或在罐的合适培养基中、温室或田地中。植物组织也指这样的植物、种子、后代、 繁殖体的任意克隆，无论是有性还是无性产生的，和它们的后代，例如插条或种子。特别感 兴趣的是马铃薯，玉米，和小麦。
[0100] 植物转化和细胞培养：泛指遗传修饰植物细胞，并转移到适合的植物培养基，用于 维持、进一步生长、和/或进一步发育的过程。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0101] 加工：从下述物质生产食品的过程：（1)种子，例如，小麦、玉米、咖啡植物或可可 树的种子，（2)块茎，例如，马铃薯块茎，或（3)根，例如，甘薯和山药的根，包含加热至至少 120°C。加工食品的实例包括面包、早餐谷类、馅饼、蛋糕、土司、饼干、小甜饼、比萨饼、椒盐 卷饼、玉米饼、炸薯条、烤薯条、马铃薯片、薯饼、烘烤的咖啡，和可可。
[0102] 后代：本发明的"后代"，例如转基因植物的后代，是由植物或转基因植物生出的、 产生的或衍生的后代。因而，"后代"植物，即"F1"代植物，是通过本发明的方法生产的转 基因植物的子代或后代。转基因植物的后代可以含有它的至少一个、一些或全部细胞基因 组，通过本文所述的方法将需要的多核苷酸整合到亲本转基因植物的细胞中。因而，需要的 多核苷酸由后代植物"传递"或"遗传"。这样在后代植物中遗传的需要的多核苷酸可以停 留在T-DNA或P-DNA构建体内，后者也可以由后代植物从它的亲本遗传。本文使用的术语 "后代"也可以视作一组植物的子代或后代。
[0103] 启动子：启动子意在指核酸，优选结合RNA聚合酶和/或其它转录调节元件的 DNA。象任意的启动子一样，本发明的启动子会促进或控制DNA或RNA的转录，以从可操作地 连接到启动子上的核酸分子产生mRNA分子。如前所述，产生的RNA可以编码蛋白或多肽， 或可以编码RNA干扰或反义分子。
[0104] 启动子是核酸序列，它使与它相关的基因被转录。在原核生物中，启动子通常由在 基因上游-10和-35位置的2个短序列组成，也就是说，在转录方向上是在基因前面。在-10 位置的序列称作普里布诺盒，通常由6个核苷酸TATAAT组成。普里布诺盒是原核生物开始 转录所必需的。在-35位置的另一个序列通常由6个核苷酸TTGACA组成，它的存在会促进 转录速率。
[0105] 真核启动子是更多样的，因此更难以表征，但是存在某些基本特征。例如，真核启 动子通常位于它们最密切相关的基因的上游。启动子可以具有距离它们的转录起点数千 碱基的调节元件，尽管转录复合物形成的某些三级结构可以造成DNA的折叠，这会使这些 调节元件更接近实际转录位点。许多真核启动子含有"TATA盒"序列，通常用核苷酸序列 TATAAA指示。该元件会结合TATA结合蛋白，它辅助RNA聚合酶转录复合物的形成。TATA 盒通常位于转录起点的50碱基内。
[0106] 真核启动子的特征也在于存在某些调节序列，它们结合参与形成转录复合物的转 录因子。一个实例是序列CACGTG指示的E-盒，它会结合基本的螺旋-环-螺旋家族中的 转录因子。也存在高GC核苷酸含量的区域。
[0107] 因此，根据本发明，可以用于设计本发明的需要的多核苷酸的启动子的部分序列 或特定启动子"片段"，例如天冬酰胺合成酶基因的启动子，可以包含或不包含一个或多个 这样的元件或没有这样的元件。在一个实施方案中，本发明的启动子片段序列不是功能性 的，且不含有TATA盒。
[0108] 本发明的构建体的另一个特征是，它会通过2个相反启动子，促进与或不与终止 子直接可操作地相连的多核苷酸的一个或多个拷贝的趋同转录。由于缺失终止信号，从第 一个和第二个启动子转录的RNA分子集合的长度可以是不同的长度。
[0109] 偶然地，例如，转录机制可能继续转录，越过象征着需要的多核苷酸序列的"末端" 的最后一个核苷酸。因此，在该特定排列中，转录终止可能通过下游序列的微弱的或非预期 作用（例如，促进发夹形成）来发生，或通过位于侧接转运DNA整合位点的植物DNA中的非 预期转录终止子的作用来发生。
[0110] 需要的多核苷酸可以以2个不同的方向连接至启动子上。在一个方向，例如"有 义"方向，得到的RNA转录物的至少5' -部分与至少一种靶转录物的至少一部分具有序列 同一性。在指定为"反义"的另一个方向，预测转录物的至少5'-部分与至少一种靶转录物 的反向互补序列的至少一部分相同或同源。
[0111] 植物启动子是能启动在植物细胞中的转录的启动子，无论它的起源是否是植物细 胞。示例性植物启动子包括、但不限于，从包含要在植物细胞中表达的基因的植物、植物病 毒和细菌（例如农杆菌或根瘤菌）得到的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括，优 先启动在某些组织（例如木质部，叶，根，或种子）中的转录的启动子。这样的启动子称 作组织优选的启动子。仅启动在某些组织中的转录的启动子称作组织特异性的启动子。细 胞类型特异性的启动子主要驱动在一个或多个器官的某些细胞类型（例如，根或叶中的维 管细胞）中的表达。诱导型或抑制型启动子是在环境控制下的启动子。可能影响诱导型启 动子的转录的环境条件的实例包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞 类型特异性的和诱导型的启动子构成非组成型启动子的类型。组成型启动子是在大多数环 境条件下和在大多数植物部分中有活性的启动子。
[0112] 多核苷酸是核苷酸序列，其包含基因编码序列或其片段（包含至少15个连续核苷 酸，优选至少30个连续核苷酸，和更优选至少50个连续核苷酸），启动子，内含子，增 强子区域，聚腺苷酸化位点，翻译起始位点，5'或3'非翻译区，报道基因，选择标记等。 多核苷酸可以包含单链或双链DNA或RNA。多核苷酸可以包含修饰的碱基或修饰的主链。 多核苷酸可以是基因组的、RNA转录物（例如mRNA)或加工过的核苷酸序列（例如cDNA)。 多核苷酸可以包含有义或反义方向的序列。
[0113] 分离的多核苷酸是并非处于它的天然状态的多核苷酸序列，例如，该多核苷酸包 含天然不存在的核苷酸序列，或该多核苷酸与它通常接近的核苷酸序列分离，或接近与它 通常不接近的核苷酸序列。
[0114] 种子："种子"可以视作含有胚的成熟的植物胚珠，和植物的繁殖部分，作为块茎或 孢子。种子可以在农杆菌介导的转化之前在黑暗中温育，例如，以促进萌芽。种子也可以在 温育前灭菌，例如通过用漂白剂简单处理。得到的幼苗然后可以暴露于目标农杆菌菌株。
[0115] 选择/筛选标记：在植物或植物组织中表达时，可以将它们与不表达该基因的其 它植物或植物组织区分开的基因。筛选操作可能需要测定由筛选标记基因编码的蛋白的表 达。选择标记的实例包括编码卡那霉素和遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（NptII)基 因，编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶（HptII)基因，或其他本领域已知的类似基因。
[0116] 感官特征：专业训练的个体组可以评定食品的感官特征，例如外观，风味，香气， 和质地。在实施例4中，描述了从Rl和磷酰酶-L基因表达水平下调的块茎得到的炸薯条 的等级。从实施例5所述的块茎得到的炸薯条也表现出增强的感官特征。因而，本发明预 见到，提高从已经根据本发明修饰的植物得到的植物产品的感官特征，以操纵它的天冬酰 胺生物合成和代谢途径。
[0117] 序列同一性：在2个核酸或多肽序列的情况下，本文使用的"序列同一性"或"同 一性"包括，当进行比对以得到指定区域上的最大相应性时，2个序列中相同的残基。当 序列同一性百分比用于指蛋白时，认识到不相同的残基位置的差别经常在于保守氨基酸 置换，其中将氨基酸残基置换为具有类似化学性质（例如电荷或疏水性）的其它氨基酸 残基，因此不会改变分子的功能性质。当序列的差异在于保守置换时，可以向上调节序列 同一性百分比，以校正置换的保守性质。差异在于这样的保守置换的序列，被描述为具有 "序列相似性"或"相似性"。进行该调节的方法，是本领域技术人员众所周知的。通常， 这包含，将保守置换评定为部分的、而不是完全的错配，从而增加序列同一性百分比。因 而，例如，当为相同的氨基酸给出1分、且为非保守置换给出〇分时，为保守置换给出〇 至1之间的分数。计算保守置换的评分，例如，根据Meyers和Miller的算法，Computer Applic. Biol. Sci.，4:1117 (1988)例如，在程序 PC/ 基因（Intelligenetics, Mountain View, California, USA)中实现。
[0118] 如本文使用的，序列同一性百分比是指通过在对比窗中对比2个最优比对的序列 而确定的值，其中多核苷酸序列在对比窗中的部分可以相对于用于2个序列的最优比对的 参照序列（它不包含添加或缺失）包含添加或缺失（即，空位）。如下计算百分比：通过测 定2个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以确定匹配位置的数目，将 匹配位置的数目除以对比窗中的位置总数，并将结果乘以100,以确定序列同一性百分比。
[0119] "序列同一性"具有本领域公知的含义，且可以使用公开的技术来计算。参见 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,编（Oxford University Press,1988) ,BI0C0MP UTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith,编（Academic Press,1993) ,COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,PART I,Griffin&Griffin,编·， （Humana Press,1994) ,SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed·，Academic Press(1987)，SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gr ibskov&Devereux，编.（Macmillan Stockton Press, 1991)，和 Carillo&Lipton, SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)。经 常用于测定2个序列之间的同一性或相似性的方法包括、但不限于在⑶IDE TO HUGE COMPUTERS, Bishop, ed.，（Academic Press, 1994)和上面 Carillo&Lipton 中公开的方法。 测定同一性和相似性的方法可以编译成计算机程序。测定2个序列之间的同一性和相似性 的优选计算机程序包括、但不限于GCG程序包（Devereux等人，Nucleic Acids Research 12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul 等人，J.Mol.Biol.215:403(1990))，和 FASTDB (Brutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6:237 (1990)) 〇
[0120] 沉默：基因或基因片段从启动子向终止子的单向的和不受干扰的转录，可以触发 靶基因的转录后沉默。植物中转录后基因沉默的起始表达盒包含以反义（McCormick等 人，美国专利6617496;Shewmaker等人，美国专利5107065)或有义（van der Krol等 人，Plant细胞2:291-299, 1990)方向位于转录起始和终止的调节序列之间的单个基因片 段。在拟南芥中，依赖于RNA的RNA聚合酶对得到的转录物的识别，会导致双链（ds) RNA的 生成。Dicer-样（Del)蛋白例如Dcl4对该dsRNA的切割，会产生21个核苷酸（nt)的小干 扰RNA (siRNA)。这些siRNA与包含Argonaute (Ago)家族成员在内的蛋白络合，生成RNA-诱 导的沉默复合物（RISC)。RISC然后靶向同源RNA，进行核酸内切。
[0121] 更有效的沉默构建体含有有义和反义组分，生成折叠成发夹结构的RNA分子 (Waterhouse 等人，Proc Natl Acad Sci U S A 95:13959-13964,1998)。推断反向重复序 列转基因的表达生成的高dsRNA水平会促进多个Dcl的活性。拟南芥中组合Dcl敲除的分 析，支持了该理论，也将Dcl4鉴别为参与RNA切割的蛋白之一。
[0122] 基于常规有义、反义和双链（ds)RNA的基因沉默构建体的一种组分是转录终止 子。WO 2006/036739证实，当基因片段位于2个方向相反且有功能活性的启动子之间时，该 调节元件变得退化。得到的趋同转录会触发至少象单向"启动子-至-终止子"转录一样 有效的基因沉默。除了短的各种大小且未聚腺苷酸化的RNA以外，无终止子的盒生成罕见 的更长的转录物，它到达侧接启动子中。用启动子-衍生的序列替代基因片段，会进一步增 加基因沉默的程度。
[0123] 在本发明的一个优选实施方案中，需要的多核苷酸包含靶基因启动子的部分序列 或与靶基因启动子的一部分具有序列同一性的部分序列。因此，本发明的需要的多核苷酸 含有感兴趣的特定靶基因启动子的特异性片段。
[0124] 需要的多核苷酸可以可操作地连接到一个或多个功能启动子上。本发明考虑的不 同构建体包括，但不限于：（1)构建体，其中所述需要的多核苷酸包含一个或多个启动子片 段序列，且在两端可操作地连接到功能性"驱动"启动子上。这2个功能性启动子以趋同方 向排列，以便转录需要的多核苷酸的每条链；（2)构建体，其中所述需要的多核苷酸在它的 5' -末端或它的3' -末端可操作地连接一个功能性启动子，且所述需要的多核苷酸也在它 的非启动子末端可操作地连接功能性终止子序列；(3)构建体，其中所述需要的多核苷酸 在它的5' -末端或它的3' -末端可操作地连接一个功能性启动子，但是其中所述需要的多 核苷酸没有可操作地连接终止子；或（4)盒，其中所述需要的多核苷酸包含一个或多个启 动子片段序列，但是没有可操作地连接任意功能性启动子或终止子。
[0125] 因此，本发明的构建体可以包含2个或多个"驱动"启动子，其侧接一个或多个需 要的多核苷酸或其侧接需要的多核苷酸的拷贝，以便使需要的多核苷酸的2条链进行转 录。也就是说，一个启动子可以定向，以便启动需要的多核苷酸的5' -末端的转录，而第二 个启动子可以可操作地定向，以便启动相同的需要的多核苷酸的3' -末端的转录。相反方 向的启动子可以侧接需要的多核苷酸的多个拷贝。因此，"拷贝数"可以变化，使得构建体可 以包含需要的多核苷酸的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 或超 过100个拷贝，或其间的任意整数，其可以侧接定向的'驱动'启动子，以便诱导趋同转录。
[0126] 如果2个盒都不包含终止子序列，则这样的构建体由于趋同转录排列，可以生成 不同长度的RNA转录物。
[0127] 因此，在该情况下，可能存在部分或完全转录的RNA转录物的亚群，所述RNA转录 物包含从各个盒转录的需要的多核苷酸的部分或全长序列。或者，在没有功能性终止子的 情况下，转录机制可以前进超过需要的多核苷酸末端，以生成比需要的多核苷酸的长度更 长的转录物。
[0128] 因此，在包含需要的多核苷酸的2个拷贝的构建体中，其中一个多核苷酸可以是 彼此以方向互补方向定向或不是如此，且其中多核苷酸可操作地连接到启动子上以诱导趋 同转录，且在构建体中没有功能性终止子，从一个需要的多核苷酸启动的转录机制可以继 续转录需要的多核苷酸的其它拷贝，反之亦然。需要的多核苷酸的多个拷贝可以以不同的 排列定向：在构建体中存在需要的多核苷酸的2个拷贝的情况下，这些拷贝可以是例如以 相同方向定向、彼此相反的方向，或彼此反向互补的方向。
[0129] 在一个需要的多核苷酸与另一个多核苷酸以方向互补方向进行定向的排列中，可 以生成RNA转录物，其不仅包含第一多核苷酸的"有义"序列，而且包含来自第二多核苷酸 的"反义"序列。如果第一和第二多核苷酸包含相同的或基本上相同的DNA序列，则单个RNA 转录物可以包含彼此互补的2个区域，且它们因此可以退火。因此，这样转录的单个RNA转 录物可以形成部分或完全的发夹双链体结构。
[0130] 另一方面，如果生成这样一个长转录物的2个拷贝，一个来自一个启动子，则将存 在2个RNA分子，其中的每个具有彼此序列互补的区域。因此，第一个RNA转录物的"有义" 区域可以退火于第二个RNA转录物的"反义"区域，反之亦然。因此，在该排列中，可以形成 另一个RNA双链体，其由2个分开的RNA转录物组成，这不同于形成自单个自互补的RNA转 录物的发夹双链体。
[0131] 或者，需要的多核苷酸的2个拷贝可以是相同的方向，以便在转录连读的情况下， 从一个启动子生成的长RNA转录物可以包含，例如，需要的多核苷酸的第一个拷贝的有义 序列，和需要的多核苷酸的第二个拷贝的有义序列。因此，从另一个趋同方向的启动子生成 的RNA转录物可以包含需要的多核苷酸的第二个拷贝的有义序列，和第一多核苷酸的反义 序列。因此，可能两个RNA转录物都不含有精确互补的区域，因此，可能两个RNA转录物都 不折叠到自身上，生成发夹结构。另一方面，2个单独的RNA转录物可以彼此杂交和退火，形 成RNA双链体。
[0132] 因此，在一个方面，本发明提供了构建体，其缺少终止子或缺少前面有自我剪接核 酶编码DNA区域的终止子，但是其包含可操作地连接到需要的多核苷酸上的第一个启动 子。
[0133] 组织：用于生产食品的植物的任意部分。组织可以是马铃薯块茎，甘薯根，或玉 米植物种子。
[0134] 转录终止子：本发明的表达载体一般在转录起始调节区的相反末端具有转录终止 区。可以选择转录终止区，用来稳定mRNA以增加表达和/或用于将聚腺苷酸尾部添加到基 因转录产物。当3个肽链终止密码子中的任一个进入核糖体上的位点时，新生多肽的翻译 会发生终止。翻译终止密码子是UAA，UAG，和UGA。
[0135] 在本发明中，转录终止子源自基因，或更优选地，源自不代表基因、但是代表基因 间DNA的序列。例如，可以使用来自马铃薯泛素基因的终止子序列，且描述在SEQ ID N0:5 中。
[0136] 转运DNA (T-DNA):转运DNA是由T-DNA边界或P-DNA边界描绘的DNA区段，分别 建立T-DNA或P-DNA。T-DNA是一种遗传元件，众所周知它是能将包含在它的边界内的核苷 酸序列整合到另一个基因组中的元件。在这方面，T-DNA通常侧接2个"边界"序列。本发 明的需要的多核苷酸和选择标记可以位于T-DNA的左边界样序列和右边界样序列之间。包 含在T-DNA内的需要的多核苷酸和选择标记可以可操作地连接许多不同的、植物特异性的 (即，天然的）或外源的核酸，如促进它的表达的启动子和终止子调节元件，所述表达即由 需要的多核苷酸或选择标记编码的DNA序列的转录和/或翻译。
[0137] 植物细胞的转化：将核酸稳定地插入植物细胞的基因组中的过程。转化可以在天 然的或人工的条件下利用本领域公知的各种方法来进行。转化可以依靠任何已知的方法， 来将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中，包括农杆菌介导的转化方案如'精制转化'或 '精确育种'、病毒感染、噬菌体颈须（whishkers)、电穿孔、显微注射、聚乙二醇处理、热激、 脂转染和粒子轰击。
[0138] 转基因植物：本发明的转基因植物是包含至少一个其中已经稳定整合了外源核 酸的细胞基因组的植物。根据本发明，转基因植物是包含仅一个遗传修饰的细胞和细胞基 因组的植物，或包含一些遗传修饰的细胞的植物，或其中所有细胞都被遗传修饰的植物。本 发明的转基因植物可以是仅在该植物的某些部分中表达需要的多核苷酸（即，外源核酸） 的植物。因而，转基因植物可以仅在它的结构的某些部分中含有遗传修饰的细胞。
[0139] 变体：本文使用的"变体"被理解为是指与标准的或给定的特定基因或蛋白的核苷 酸或氨基酸序列有区别的核苷酸或氨基酸序列。术语"异构体""同种型"和"类似物"也是 指核苷酸或氨基酸序列的"变体"形式。通过添加、去除或取代一个或多个氨基酸而改变的 氨基酸序列，或在核苷酸序列中的变化，可被认为是"变体"序列。变体可具有"保守性"变 化，其中被取代的氨基酸具有类似的结构或化学性质，例如，用异亮氨酸替换亮氨酸。变体 也可具有"非保守性"变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的较小的变异也可包括氨基酸 缺失或插入，或二者。利用本领域公知的计算机程序，例如Vector NTI Suite (InforMax， MD)软件，可以获得在确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失方面的指导。"变体"也 可以指"改组基因"，例如在Maxygen的专利中所述的那些。
[0140] 应当理解，本发明不限于在此描述的特定方法、方案、载体和试剂等，这些都可以 变化。还需要理解的是，本文使用的专有名词仅用于描述特定实施方式的目的，不意在限制 本发明的范围。必须指出，本文使用的和在附随的权利要求中，单数形式"一个"、"一种"和 "该"包括复数的引用，除非上下文中另有明显的指示。因而，例如，提及"一个基因"是指一 个或多个基因，包括本领域技术人员公知的其等同方案等。实际上，本领域技术人员可以使 用在此描述的方法来在植物宿主系统中表达任何天然的基因（目前或后来知道的）。
[0141] 多核苷酸序列
[0142] 本发明涉及分离的核酸分子，其包含具有选自下述任意多核苷酸序列的序列 的多核苷酸：SEQ ID N0:l，2,3,4,9，10，14，15,23,24,或 25。本发明也提供了 SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25的多核苷酸序列的功能性片段。本发明还提供了与 SEQ ID勵:1，2,3,4,9，10，14，15,23,24，或25中的任意多核苷酸序列互补的核酸或其片 段，以及核酸，其包含至少15个连续碱基，且与SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或 25中的任意多核苷酸序列杂交。
[0143] "分离的"核酸分子是指已经从它的天然环境取出的核酸分子，即DNA或RNA。例 如，包含在DNA构建体中的重组DNA分子被认为出于本发明的目的而分离。分离的DNA分子 的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中的（部分地或基本上） 纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录物。根据本发明 的分离的核酸分子还包括合成生产的这样的分子。
[0144] 本发明的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA，或DNA的形式，包括，例如，通 过克隆或合成生产的cDNA和基因组DNA。DNA或RNA可以是双链的或单链的。单链DNA可 以是编码链，也称作有义链，或它可以是非编码链，也称作反义链。
[0145] 除非另有说明，通过使用自动化DNA测序仪（例如来自Applied Biosystems, Inc 的373型）测定本文DNA分子的序列，确定所有核苷酸序列。因此，如本领域已知的，对于 通过该自动化方案测定的任意DNA序列，本文测定的任意核苷酸序列可以含有一些错误。 自动化测定的核苷酸序列通常与测序的DNA分子的实际核苷酸序列具有至少约95%同一 性，更通常至少约96% -至少约99. 9%同一性。通过其它方案，包括本领域众所周知的手 工DNA测序方法，可以更精确地测定实际序列。也如本领域已知的，测定的核苷酸序列相对 于实际序列的单个插入或缺失，会造成核苷酸序列翻译中的移码，使得由测定的核苷酸序 列编码的预测氨基酸序列从这样的插入或缺失点开始，可能完全不同于由测序的DNA分子 实际编码的氨基酸序列。
[0146] 本文所述的每个"核苷酸序列"都表示为脱氧核糖核苷酸（缩写为A，G，C和T)的 序列。但是，核酸分子或多核苷酸的"核苷酸序列"是指，对于DNA分子或多核苷酸而言，是 脱氧核糖核苷酸序列，对于RNA分子或多核苷酸而言，是核糖核苷酸（A，G，C和U)的对应序 列，其中在指定的脱氧核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核苷酸（T)被替换为核糖核苷酸尿苷 ⑶。
[0147] 本发明也涉及本文所述分离的核酸分子的片段。优选地，DNA片段的长度包含至 少15个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，它们可用作诊断探针 和引物。当然，最高达本发明核酸分子的整个长度的更大核酸片段也可以根据常规杂交 技术在诊断上用作探针，或用作通过聚合酶链式反应（PCR)扩增靶序列的引物，如例如在 Molecular Cloning，A Laboratory Manual,第 3 版，Sambrook&Russel.编，（2001) ,Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述，它的整个公开内容在本文中引作参考。长度是 至少20个核苷酸的片段是指，例如，包括20或更多个来自SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21的核 苷酸序列的连续碱基的片段。使用技术人员熟知的DNA合成的常规方法，可以产生含有在 SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21中列出的核苷酸序列的核酸。例如，限制内切核酸酶切割或声处 理剪切，可以容易地用于产生不同大小的片段。或者，根据已知的技术，可以合成地制备本 发明的DNA片段。
[0148] 在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含可在严格杂交条件下与上 述本发明的核酸分子的多核苷酸的一部分杂交的多核苷酸。与多核苷酸的"一部分"杂交 的多核苷酸是指，与参照多核苷酸的至少约15个核苷酸、更优选至少约20个核苷酸、更优 选至少约30个核苷酸、甚至更优选超过30个核苷酸杂交的多核苷酸（DNA或RNA)。这些与 参照片段杂交的片段可以用作诊断探针和引物。本文使用的探针定义为，SEQ ID N0:l-230 所述核酸序列之一的至少约100个连续碱基。为了本发明的目的，当在6X SSC、0. 5% SDS、 5X Denhardt溶液和100 μ g非特异性载体DNA的杂交溶液中形成双链复合物时，2个序列 杂交。参见Ausubel等人，2. 9部分，增补27 (1994)。序列可以在"中等严格性"杂交，所 述"中等严格性"定义为60°C的温度，在6X SSC、0. 5% SDS、5X Denhardt溶液和100 μ g非 特异性载体DNA的杂交溶液中。对于"高严格性"杂交，温度升高至68°C。在中等严格性 杂交反应后，在室温在2X SSC+0. 05% SDS的溶液中洗涤核苷酸5次，随后在60°C用0.1 X 35〇+0.1%303洗涤111。对于高严格性，洗涤温度升高至68°〇。为了本发明的目的，杂交的 核苷酸是使用Ing具有10, OOOcpm/ng比放射性的放射标记的探针检测的核苷酸，其中杂交 的核苷酸在70°C曝光于X-线胶片不超过72小时后可以清楚地看到。
[0149] 本发明涉及这样的核酸分子，其与SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21所述的核酸序列具 有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一 性。但是，优选的是与SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21中的任一个所述的核酸序列具有至少95%、 96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸分子。2个核酸序列之间的差异可以发生在参 照核苷酸序列的5'或3'末端位置，或这些末端位置之间的任意位置，单个地散布在参照序 列的核苷酸中或参照序列的一个或多个连续基团中。
[0150] 作为实践物质，任意特定核酸分子与参照核苷酸序列是否具有至少95%、96%、 97%、98%或99%同一性是指，使用本领域众所周知的标准算法，在2个分子之间对比， 且可以使用可公开得到的计算机程序例如BLASTN算法来常规地测定。参见Altschul等 人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)。
[0151] 序列分析
[0152] 为对比目的而比对序列的方法是本领域众所周知的。通过下述算法可以为对比 目的而进行序列的最优比对：Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同 源性算法；Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比对算法；Pearson 和Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988)的相似性检索方法；这些算法的计算机化 执行，包括，但不限于：Intelligenetics，Mountain View，Cal ifornia 的 PC/基因程序中 的 CLUSTAL ;Wisconsin Genetics 软件包，Genetics Computer Group(GCG), 575Science Dr.，Madison, Wiscons in, USA 中的 GAP, BESTFIT, BLAST、FASTA 和 TFASTA ;所述 CLUSTAL 程序详细记载在 Higgins 和 Sharp,基因 73:237244 (1988) ;Higgins 和 Sharp, CABIOS 5:151153(1989) ;Corpet,等人，Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988) ;Huang， 等人，Computer Applications in the Biosciences 8:155-65(1992)，和 Pearson,等 人，Methods in Molecular Biology 24:307-331(1994)。
[0153] 可以用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括：针对核苷酸数据库序 列的核苷酸查询序列的BLASTN ;针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX ; 针对蛋白数据库序列的蛋白查询序列的BLASTP ;针对核苷酸数据库序列的蛋白查 询序列的TBLASTN ;和针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见， Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel,等人，Eds. , Greene Publishing 和 Wiley_Interscience，New York(1995) ;Altschul 等人，J. Mol. Biol·, 215:403-410(1990);和，Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)。
[0154] 用于进行BLAST分析的软件可公开得到，例如，通过国家生物技术信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。该算法包含，首先识别高评分序列对（HSP)，这通过识 别查询序列中的长度W的短字来实现，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或 满足一些正值的阈值评分T。T称作邻域字评分阈值。这些起始邻域字命中作为启动检索的 种子，所述检索会发现含有它们的更长的HSP。所述字命中然后沿着每个序列向两个方向延 伸，远至可以增加累积比对评分。如下计算累积评分：对于核苷酸序列，使用参数M(-对匹 配残基的奖励分；总是>〇)和N(错配残基的罚分；总是〈0)。对于氨基酸序列，使用评分矩 阵来计算累积评分。在下述情况时，停止每个方向的字命中延伸：累积比对评分从它的最大 达到值下降X ;累积评分达到O或以下，这归因于一个或多个负评分的残基比对的积累；或 达到任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程 序（对于核苷酸序列）使用的缺省值是，字长（W)为11，期望值（E)为10,截止值为100, M =5，N = -4,和2条链的对比。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是，字长（W)为 3,期望值（E)为 10，BL0SUM62 评分矩阵（SMHenikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 89:10915)。
[0155] 除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法也进行2个序列之间的相似性的统 计分析（参见，例如，Karlin&Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5877(1993))。 BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总概率（P (N))，它指示着2个核苷酸或氨基酸 序列之间随机发生匹配的概率。
[0156] 使用 CLUSTAL 比对方法（Higgins 和 Sharp(1989)CABI0S. 5:151153)，利用缺省 参数（GAP PENALTY =10, GAP LENGTH PENALTY =10)，可以进行序列的多种比对。使 用CLUSTAL方法的逐对比对的缺省参数是KTUPLE I，GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5和 DIAGONALS SAVED = 5〇
[0157] 下述运行参数优选地用于使用BLASTN测定比对和相似性，这导致多核苷酸序列 的 E 值和百分比同一性：Unix 运行命令：blastall-p blastn-d embldb-e 10 - G〇-E〇-r 1-v 30-b 30-i queryseq - o results ;参数是：-p程序名[字符串];-d数据库[字符 串];_e期望值（E)[实数];-G打开间隙的成本（零调用缺省行为）[整数];-E延伸空位 的成本（零调用缺省行为）[整数];- r核苷酸匹配的奖励（仅blastn)[整数];-V -行描 述的数目（V)[整数];_b显示的比对的数目（B)[整数];-i查询文件[文件输入];和-〇 BLAST报告输出文件[文件输出]任选的。
[0158] 由BLASTN、FASTA、BLASTP或类似算法生成的查询序列对一个或多个数据库序列 的"命中"，会比对和识别序列的类似部分。命中按照相似性程度和序列重叠的长度的顺序 来排列。数据库序列的命中通常代表在查询序列的仅一部分序列长度上的重叠。
[0159] BLASTN, FASTA和BLASTP算法也生成比对的"期望"值。期望值（E)指示着当检索 某些大小的数据库时，可以"期望"随机看到的对某些数目的连续序列的命中数目。期望值 用作确定对数据库（例如优选的EMBL数据库）的命中是否指示真实相似性的显著性阈值。 例如，指定给多核苷酸命中的〇. IE值被解释为是指，在EMBL数据库大小的数据库中，可能 期望到看到在比对的序列部分的0. 1匹配，仅仅随机地具有类似评分。通过该标准，多核苷 酸序列的比对的和匹配的部分则具有90%的概率是相同的。对于在比对的和匹配的部分具 有0. 01或更小的E值的序列，使用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库中随机发现匹配的 概率是1 %或更小。
[0160] 根据一个实施方案，"变体"多核苷酸，参考本发明的每个多核苷酸，优选地包含 具有与本发明的每个多核苷酸相同数目或比其更少的核酸、并且与本发明的多核苷酸比较 时，生成0. 01或更小的E值。也就是说，变体多核苷酸是具有至少99%概率与本发明多核 苷酸相同的任意序列，使用设定为上述参数的BLASTN、FASTA或BLASTP算法测得具有0. 01 或更小的E值。
[0161] 或者，本发明的变体多核苷酸会在严格条件下与SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或这些序列的互补序列、反向 序列或反向互补序列杂交。
[0162] 本发明也包括不同于公开的序列的多核苷酸，但是作为遗传密码简并的结果，其 编码与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的多肽。因而，作为保守取代的结果，本发明预 见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸 序列或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列的多核苷酸。另外，作为缺失和 /或插入总计小于10%总序列长度的结果，本发明也预见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或它们的互补序列、反向互补 序列或反向序列的序列的多核苷酸。
[0163] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，变体多核苷酸优选 地具有与本发明的多核苷酸共有的其它结构和/或功能特征。除了它们的一级结构与本 发明的多核苷酸具有高度的相似性以外，与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能 与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地具有至少一种下述特征：（i)它们含有读码 框或部分读码框，其编码基本上具有与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的功能性质的多 肽；或（ii)它们具有共同的结构域。
[0164] 元件和DNA序列的来源
[0165] 本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一个或多个植物基因组内源的。因 此，在本发明的一个具体实施方案中，为最终的转运盒选择的所有元件和DNA序列都是待 转化的植物的基因组内源的或天然的。例如，所有序列可以来自马铃薯基因组。或者，一个 或多个元件或DNA序列可以是与待转化的植物物种不同的植物基因组内源的，但是其可以 在任意情况下在宿主植物细胞中起作用。这样的植物包括马铃薯，番茄，和苜蓿植物。本 发明也包括使用一个或多个来自与待转化的植物互交可孕的植物的遗传元件。
[0166] 在这点上，本发明的"植物"包括、但不限于，马铃薯，番茄，鳄梨，苜蓿，甜菜， 木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麦，稻，大麦，和高梁。因而，植物可以是单 子叶植物或双子叶植物。"植物"和"植物材料"也包括植物细胞，种子，植物后代，繁殖 体，无论是有性还是无性产生的，和它们中的任一种的子代，例如插条或种子。"植物材料" 可以是指植物细胞，细胞悬浮培养物，愈伤组织，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶， 根，芽，配子体，孢子体，花粉，种子，正在发芽的幼苗，和微孢子。植物可以处于各种 成熟阶段，可以生长在液体或固体培养物中，或罐中的土壤或合适的培养基中、温室或田地 中。导入植物中的先导序列、尾随序列或基因序列的表达可以是暂时的或永久的。
[0167] 在这方面，本发明的植物衍生的转运-DNA("P_DNA"）边界序列的核苷酸序列不同 于任意已知细菌-衍生的T-DNA边界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是 说，P-DNA可以用于将一个多核苷酸转运和整合到另一个多核苷酸中。可以将P-DNA插入 肿瘤诱导质粒，例如替代常规T-DNA的来自农杆菌的Ti-质粒，并维持在细菌株中，正如常 规转化质粒一样。可以操纵P-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通过细菌介导的植 物转化掺入植物基因组中。参见Rommens等人TO2003/069980, US-2003-0221213, US-2004 -0107455,和W02005/004585,它们都在本文中引作参考。
[0168] 因而，P-DNA边界序列与来自农杆菌物种（例如根癌农杆菌或发根农杆菌）的已 知 T-DNA 边界序列相差 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,或更多 个核苷酸。
[0169] P-DNA边界序列的核苷酸序列与农杆菌T-DNA边界序列的相似性不大于99 %、 98 %,97 %,96 %,95 %,94 %,93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %, 83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %, 68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %,62 %,61 %,60 %,59 %,58 %,57 %,56 %,55 %,54 %, 53%、52%、51%或 50%。
[0170] 开发了鉴别和分离来自植物（尤其是马铃薯和小麦）的转运DNA的方法，和使用 在本文中引作参考的US-2004-0107455中所述的边界基序共有序列。
[0171] 在这方面，本发明的植物衍生的DNA、例如任一种本文公开的序列、切割位点、区 域或元件是功能性的，如果它能促进它所连接的多核苷酸向另一个核酸分子（例如植物染 色体）中的转运和整合，转化频率是约99%、约98%、约97%、约96%、约95%、约94%、 约 93 %、约 92 %、约 91 %、约 90 %、约 89 %、约 88 %、约 87 %、约 86 %、约 85 %、约 84 %、 约 83 %、约 82 %、约 81 %、约 80 %、约 79 %、约 78 %、约 77 %、约 76 %、约 75 %、约 74 %、 约 73 %、约 72 %、约 71 %、约 70 %、约 69 %、约 68 %、约 67 %、约 66 %、约 65 %、约 64 %、 约 63 %、约 62 %、约 61 %、约 60 %、约 59 %、约 58 %、约 57 %、约 56 %、约 55 %、约 54 %、 约 53 %、约 52 %、约 51 %、约 50 %、约 49 %、约 48 %、约 47 %、约 46 %、约 45 %、约 44 %、 约 43 %、约 42 %、约 41 %、约 40 %、约 39 %、约 38 %、约 37 %、约 36 %、约 35 %、约 34 %、 约 33%、约 32%、约 31%、约 30%、约 29%、约 28%、约 27%、约 26%、约 25%、约 24%、约 23%、约22%、约21%、约20%、约15%，或约5%或至少约1%。
[0172] 可以修饰或突变任一种这样的转化相关的序列和元件，以改变转化效率。可以将 其它多核苷酸序列添加到本发明的转化序列上。例如，可以修饰它以具有5'-和3'-多克 隆位点或其它限制位点。例如，可以修饰本文公开的切割位点的序列，以增加来自附随载体 的主链DNA不整合到植物基因组中的概率。
[0173] 可以将任意的需要的多核苷酸插入本文所述的任意切割或边界序列之间。例如， 需要的多核苷酸可以是植物物种天然的野生型或修饰的基因，或它可以是来自非植物基因 组的基因。例如，当转化马铃薯植物时，可以制备包含可操作地连接到目标马铃薯基因或其 片段上的马铃薯特异性启动子和马铃薯特异性终止子的表达盒。表达盒可以含有其它马铃 薯遗传元件，例如与基因的5' -末端符合读码框地融合的信号肽序列，和马铃薯转录增强 子。本发明不限于这样的排列，可以构建转化盒，使得需要的多核苷酸尽管可操作地连接到 启动子上，但不会可操作地连接到终止子序列上。
[0174] 当从植物鉴定和分离转化-相关的序列或元件（例如本文所述的那些）时，且如 果该序列或元件随后用于转化相同物种的植物，该序列或元件可以描述为所述植物基因组 "天然的"。
[0175] 因而，"天然的"遗传元件是指天然存在于、源自或属于待转化植物的基因组的核 酸。以相同的脉络，术语"内源"也可以用于鉴别植物"天然的"特定核酸，例如，DNA或 RNA，或蛋白。内源是指起源自该生物体的元件。因而，从待转化的植物或植物物种的基因 组分离的、或从与待转化的植物物种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的任意的 核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生 的。换而言之，天然的遗传元件代表植物育种者可用于通过经典植物培育来改良植物的所 有遗传物质。根据本发明，天然核酸的任意变体也视作"天然的"。在这方面，"天然"核酸也 可以分离自植物或其性别相容的物种，并经修饰或突变，使得得到的变体的核苷酸序列与 从植物分离的未修饰的天然核酸的相似性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、 93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %, 78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %, 63%、62%、61%，或60%。天然核酸变体的核苷酸序列的相似性也可以小于约60%、小于 约55 %或小于约50%。
[0176] 从植物分离的"天然"核酸也可以编码从该核酸转录和翻译的天然存在的蛋白产 物的变体。因而，天然核酸可以编码这样的蛋白，它与在分离核酸的植物中表达的未修饰 的天然蛋白的氨基酸序列的相似性大于或等于99 %、98 %、97 %、96 %、95 %、94 %、93 %、 92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %, 77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %, 62%、61%，或 60%。
[0177] 启动子
[0178] 本发明的多核苷酸可以用于特异性地指导多肽或蛋白在植物组织中的表达。本 发明的核酸也可以用于特异性地指导反义RNA或参与RNA干扰（RNAi)的RNA例如小干扰 RNA(SiRNA)在植物组织中的表达，其可以用于抑制或完全阻断靶基因的表达。如本文使用 的，"编码产物"是指可操作地连接到启动子上的核酸的最终产物。例如，蛋白或多肽是编码 产物，以及反义RNA或siRNA，它是编码反义RNA的核酸的最终产物。编码产物也可以是未 翻译的mRNA。术语多肽和蛋白在本文中可互换地使用。如本文所使用的，启动子是指核酸， 优选结合RNA聚合酶和/或其它转录调节元件的DNA。象任意的启动子一样，本发明的启动 子会促进或控制DNA或RNA的转录，以从可操作地连接到启动子上的核酸分子产生mRNA分 子。RNA可以编码蛋白或多肽，或可以编码RNA干扰或反义分子。如本文使用的，"可操作 地连接到"是指DNA的化学融合、连接或合成，使得启动子-核酸序列组合以适合将所述核 酸序列转录成RNA区段的方向形成。本发明的启动子也可以含有得到的mRNA转录物的一 些或所有5'非翻译区（5'UTR)。另一方面，本发明的启动子不一定需要具有任何5'UTR。
[0179] 本文使用的启动子也可以包括调节元件。相反地，调节元件也可以与启动子分开。 调节元件会将许多重要特征赋予给启动子区域。有些元件会结合转录因子，后者增强可操 作地连接的核酸的转录速率。其它元件会结合抑制转录活性的阻抑物。转录因子对启动子 活性的影响，可能决定启动子活性是高还是低，即所述启动子是"强"还是"弱"。
[0180] 在另一个实施方案中，组成型启动子可以用于表达本发明的多核苷酸序列。
[0181] 在另一个实施方案中，许多诱导型植物基因启动子可以用于表达本发明的多核苷 酸序列。诱导型启动子会调节反应于环境、激素或化学信号的基因表达。激素诱导型启动 子的实例包括植物生长素诱导型启动子（Baumann等人，Plant Cell 11:323-334(1999))， 细胞分裂素诱导型启动子（Guevara-Garcia Plant Mol. Biol. 38:743-753(1998))，和赤霉 素反应性性启动子（Shi等人，Plant Mol.Biol.38:1053-1060(1998))。另外，反应于热、 光、创伤、病原体抗性和化学物质（例如茉莉酮酸甲酯或水杨酸）的启动子，可以用于表达 本发明的多核苷酸序列。
[0182] 在一个实施方案中，所述启动子是颗粒结合的淀粉合酶启动子，马铃薯ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶基因启动子，或类黄酮3'-单加氧酶基因启动子。在另一个实施方案中，所 述启动子是种子特异性启动子。
[0183] 本发明也包括不同于公开的序列的多核苷酸，但是作为遗传密码简并的结果，其 编码与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的多肽。因而，作为保守取代的结果，本发明预 见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸 序列或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列的多核苷酸。另外，作为缺失和 /或插入总计小于10%总序列长度的结果，本发明也预见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或它们的互补序列、反向互补 序列或反向序列的序列的多核苷酸。
[0184] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，变体多核苷酸优选 地具有与本发明的多核苷酸共有的其它结构和/或功能特征。除了它们的一级结构与本 发明的多核苷酸具有高度的相似性以外，与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能 与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地具有至少一种下述特征：（i)它们含有读码 框或部分读码框，其编码基本上具有与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的功能性质的多 肽；或（ii)它们具有共同的结构域。
[0185] 元件和DNA序列的来源
[0186] 本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一个或多个植物基因组内源的。因 此，在本发明的一个具体实施方案中，为最终的转运盒选择的所有元件和DNA序列都是待 转化的植物的基因组内源的或天然的。例如，所有序列可以来自马铃薯基因组。或者，一个 或多个元件或DNA序列可以是与待转化的植物物种不同的植物基因组内源的，但是其可以 在任意情况下在宿主植物细胞中起作用。这样的植物包括马铃薯，番茄，和苜蓿植物。本 发明也包括使用一个或多个来自与待转化的植物互交可孕的植物的遗传元件。
[0187] 在这点上，本发明的"植物"包括、但不限于，马铃薯，番茄，鳄梨，苜蓿，甜菜， 木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麦，稻，大麦，和高梁。因而，植物可以是单 子叶植物或双子叶植物。"植物"和"植物材料"也包括植物细胞，种子，植物后代，繁殖 体，无论是有性还是无性产生的，和它们中的任一种的子代，例如插条或种子。"植物材料" 可以是指植物细胞，细胞悬浮培养物，愈伤组织，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶， 根，芽，配子体，孢子体，花粉，种子，正在发芽的幼苗，和微孢子。植物可以处于各种 成熟阶段，可以生长在液体或固体培养物中，或罐中的土壤或合适的培养基中、温室或田地 中。导入植物中的先导序列、尾随序列或基因序列的表达可以是暂时的或永久的。
[0188] 核酸构建体
[0189] 本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子和多肽序列的构建体。在一个实施方 案中，本发明的DNA构建体是源自农杆菌的Ti-质粒。
[0190] 在开发本发明的核酸构建体中，构建体或其片段的各种组分通常插入方便的克隆 载体中，例如，能在细菌宿主如大肠杆菌中复制的质粒。存在许多已经在文献中描述的载 体，其中的许多是可商业得到的。每次克隆后，可以分离含有需要的插入片段的克隆载体， 并进行其它操作，例如限制消化，插入新的片段或核苷酸，连接，缺失，突变，切除，等， 以改变需要的序列的组分。完成构建体后，然后可以根据转化宿主细胞的方式，将它转移至 用于其它操作的适当载体中。
[0191] 本发明的重组DNA分子通常包括选择标记，以便可以从未转化的细胞中鉴定和 选择转化的细胞。这样的标记的实例包括、但不限于，新霉素磷酸转移酶（nptll)基因 (Potrykus等人，Mol. Gen.基因 t. 199:183-188 (1985))，它赋予卡那霉素抗性。使用适当 的抗生素例如卡那霉素或G418,可以选择表达nptll基因的细胞。其它常用的选择标记包 括bar基因，它赋予双丙氨磷抗性；突变的EPSP合酶基因（Hinchee等人，Bio/Technology 6:915-922 (1988))，它赋予草甘膦抗性；和突变的乙酰乳酸合酶基因（ALS)，它赋予咪唑啉 酮或磺酰脲抗性（欧洲专利申请154, 204, 1985)。
[0192] 另外，载体可以包括特定宿主细胞的复制起点（复制子）。各种原核复制子是本领 域技术人员众所周知的，并起指导重组分子在原核宿主细胞中的自主复制和维持的作用。
[0193] 本发明也提供了包含本发明的DNA构建体的宿主细胞。如本文使用的，宿主细胞 指最终在其中表达编码产物的细胞。因此，宿主细胞可以是单个细胞、细胞培养物或作为生 物体的一部分的细胞。宿主细胞也可以是胚、胚乳、精子或卵细胞，或受精卵的一部分。
[0194] 因此，本发明也提供了植物或植物细胞，其包含本发明的DNA构建体。优选地，所 述植物是被子植物或裸子植物。本发明的表达构建体可以用于转化许多植物，包括单子叶 植物（例如小麦，草地草，玉米，稻，燕麦，小麦，大麦，高梁，兰花，鸢尾，百合，洋 葱，香蕉，甘蔗，和棕榈），双子叶植物（例如，拟南芥，马铃薯，烟草，番茄，鳄梨，胡 椒，甜菜，绿花椰菜，木薯，甘薯，棉花，猩猩木，豆类，苜蓿，大豆，豌豆，菜豆，黄 瓜，葡萄，芸苔，胡萝卜，草莓，莴苣，橡树，楓树，胡桃，玫瑰，薄荷，南瓜，雏菊，和 仙人掌，橡树，桉树，楓树），和裸子植物（例如，苏格兰松；参见Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996)，白云杉（Ellis 等人，Biotechnology 11:84-89,1993)，和落 叶松（Huang 等人，In Vitro Cell 27:201-207,1991)。
[0195] 植物转化和再生
[0196] 通过本领域已知的将重组序列导入靶宿主细胞中的标准操作，可以将本发明的 多核苷酸和多肽导入宿主植物细胞中。这些操作包括、但不限于，转染，感染，转化，天 然摄入，电穿孔，生物射弹和农杆菌。将外源基因导入植物中的方法是本领域已知的， 且可以用于将本发明的构建体插入植物宿主中，包括，生物和物理植物转化方法。参见， 例如，Miki 等人，1993, ''Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", 见:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 和 Thompson, 编.，CRC Press，Inc.，Boca Raton,第67-88页。选择的方法可以随宿主植物而变化，包 括化学转染方法例如磷酸钙，微生物介导的基因转移例如农杆菌（Horsch等人，Science 227:1229-31,1985)，电穿孔，显微注射，和生物射弹。优选的转化方法包括精确育种（参 见：美国专利申请 2003/0221213A1, 2004/0107455A1,和 2005/0229267A1)和精制转化（参 见美国专利申请2005/0034188A1)。
[0197] 因此，本发明也提供了植物或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸或多肽。在一个 实施方案中，所述植物是被子植物或裸子植物。超出植物的普通含义，术语"植物"也意在 指植物的果实、种子、花、球花等。本发明的植物可以是直接转染的，这是指将载体直接导入 植物中，例如通过农杆菌，或所述植物可以是转染的植物的后代。后代也可以通过转染的植 物的无性繁殖来得到。第二代或后代植物可以通过或不通过有性生殖（即受精）来生成。 此外，所述植物可以是配子体（单倍体阶段）或孢子体（二倍体阶段）。
[0198] 在这点上，本发明考虑用一个或多个遗传上源自植物的转化元件转化植物。本发 明考虑转化的"全天然"方案，由此仅植物的天然转化元件通过转化最终整合到目标植物 中。在这方面，本发明包括仅用植物物种天然的遗传转化元件转化特定植物物种。天然方 案也可以指，特定转化元件分离自同一待转化的植物、同一植物物种或与待转化的植物在 性别上互交可孕的植物。
[0199] 另一方面，所述待转化的植物可以用转化盒转化，所述转化盒含有一个或多个源 自不同物种植物的遗传元件和序列。可能希望使用例如切割位点，它在用于转化番茄或胡 椒植物的转化盒或质粒中是马铃薯基因组天然的。
[0200] 但是，本发明不限于，天然的或全天然的方案。本发明的转化盒或质粒也可以包含 来自其它生物体的序列和元件，例如来自细菌物种。
[0201] 下面的实施例作为本发明的特定的和优选的实施方案的代表来予以阐述。这些实 施例不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。应当理解，可以作出许多变化和修改，同 时仍然在本发明的精神和范围内。 实施例
[0202] 实施例1
[0203] 天冬酰胺合成酶基因的下调的表达
[0204] 本实施例证实，参与作物淀粉组织中天冬酰胺生物合成的基因的下调的表达，会 降低这些淀粉组织中天冬酰胺的量，从而降低加热这些淀粉组织得到的食品中丙烯酰胺的 量。
[0205] 在SEQ ID NO: 1中显示了马铃薯天冬酰胺合成酶-I(Astl)基因的序列。在SEQ ID N0:2中显示了马铃薯天冬酰胺合成酶-2(Ast2)基因的部分序列。
[0206] 连接SEQ ID N0:3和4所示的这些基因的片段，以建立SEQ ID N0:5。作为反向重 复序列并被SEQ ID N0:6所示的间隔区隔开，将得到的DNA区段的2个拷贝插入ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶（Agp)和颗粒结合的淀粉合酶（Gbss)基因（分别是SEQ ID NO: 7和8)的趋 同定向的启动子之间。
[0207] 将得到的沉默构建体插入已经含有新霉素磷酸转移酶（nptll)选择标记基因的 表达盒的T-DNA边界之间。
[0208] 如下将命名为pSM1148的含有该T-DNA的二元载体（图1A)导入农杆菌LBA4404。 在有1 μ g载体DNA存在下，在冰上温育感受态LB4404细胞（50 μ L) 5min，在液氮中冷冻 约15s，在37°C温育5min。加入ImL的培养液后，在28°C培养细胞3h，铺板到含有链霉素 (100mg/L)和卡那霉素（100mg/L)的培养液/琼脂上。然后从单个LBA4404菌落的过夜培 养物分离载体DNA，并通过限制分析进行检查，以证实完整质粒DNA的存在。
[0209] 通过使10倍稀释的过夜生长的农杆菌培养物生长5-6小时，在2, 800RPM沉淀15 分钟，用添加了鹿糖（3%，pH 5. 7)的MS液体培养基（Phytotechnology)洗绦，重新悬浮 在相同培养基中直到〇D6(l(lnm为0. 2。混合重新悬浮的细胞，用于感染马铃薯品种"Ranger Russet" 的 0· 4-0. 6mm 结间区段。
[0210] 感染的茎在含68/1琼脂的共培养培养基（1/101^盐，3%蔗糖，？!15.7)上在 Percival生长室（16小时光照）中25°C培养2天，随后转移到含特美汀（150mg/L)和卡 那霉素（lOOmg/L)的愈伤组织诱导培养基（CM,添加了 3%蔗糖3、2. 5mg/L玉米素核苷、 0. lmg/L萘乙酸和6g/L琼脂的MS培养基）上。在CM上培养1个月后，将外植体转移至 含有特美汀和卡那霉素（分别是150和100mg/L)的芽诱导培养基（SM,添加了 3%蔗糖、 2. 5mg/L玉米素核苷、0. 3mg/L赤霉酸GA3和6g/L琼脂的MS培养基），直到发芽。将在再生 期末期发出的芽转移至含有3%蔗糖、6g/L琼脂和特美汀（150mg/L)的MS培养基。将转基 因植物转移至土壤，置于温室中。
[0211] 3 个月后，收获块莖，根据 Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL (2002)，第 17 版，AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA Official Method 982. 30,分析天冬酰胺水平。该分析证实，26株pSM1148植物中的17株仅含有对 照植物中存在的约25% -50%的天冬酰胺（表1)。
[0212] 将来自一些低天冬酰胺植物的块茎切片，漂白，平常油煎（par-fried)，并精制 油煎，生产炸薯条。将这些炸薯条在液氮中粉碎成细粉，在干冰上运送到Covance实验 室。在Covance，通过进行液相色谱/质谱/质谱（LC/MS/MS)(美国食品和药品管理局， 植物以及乳制品和饮料的食品安全中心和应用营养办公室，"食品中丙烯酰胺的检测和定 量"，2002)，测定丙烯酰胺水平。表2证实，来自低天冬酰胺pSM48植物的薯条积累的丙烯 酰胺少于在对照薯条中生成的丙烯酰胺的约1/3。
[0213] 作为使用Agp和Gbss启动子作为调节元件的一个替代方案，也可以使用2个Gbss 启动子。将含有反向重复序列的构建体导入T-DNA边界之间，以生成二元载体pSIM1151，所 述反向重复序列包含插入2个Gbss启动子之间的Astl和Ast2基因片段（图1B)。该载体 用于以与关于PSM1148所述类似的方式生产转基因马铃薯系。此外，Ast基因-衍生的序 列可以插入启动子和终止子之间。
[0214] 对于任意的Ast基因，可能存在具有高度序列相似性的其它序列。可以使用这样 的同源序列来生产沉默构建体。例如，番茄Ast基因的片段可以用于沉默马铃薯中的同源 Ast基因 〇
[0215] 鉴定植物衍生的Ast基因之后，为该基因的PCR-扩增设计基因特异性的引物。根 据本领域已知的方法，进行PCR扩增，然后将PCR扩增的天冬酰胺酶基因克隆进克隆载体 中。
[0216] 可以通过检索数据库来识别Ast基因，或从植物DNA分离。来自马铃薯以外的作 物的Ast基因的一个实例是SEQ ID NO: 34和35所示的来自小麦的Ast基因。同时沉默小 麦谷粒中的这些基因，可以降低面粉中的天冬酰胺水平，从而降低例如面包、饼干、小甜饼 或薄脆饼中的丙烯酰胺水平。
[0217] 除了使用Ast基因片段来生产沉默构建体以外，也可以使用从Ast基因的启动子 得到的片段。通过使用反向PCR等方法，可以分离这样的启动子，然后可以将特定150-600 个碱基对的启动子片段的2个拷贝作为反向重复序列插入启动子和终止子之间，或2个趋 同方向的启动子之间（参见：R〇mmens等人，世界专利申请2006/036739 A2,它在本文中 引作参考）。
[0218] 实施例2
[0219] 天冬酰胺酶基因的超量表达
[0220] 本实施例证实，参与作物淀粉组织中天冬酰胺代谢的基因的超量表达，会降低这 些淀粉组织中天冬酰胺的量，从而降低加热这些淀粉组织得到的食物中丙烯酰胺的量。
[0221] 在SEQ ID N0:9中显示了来自马铃薯品种Ranger Russet的马铃薯天冬酰胺酶 (Asgl)基因的序列。分别在SEQ ID NO: 10和11中显示了对应的读码框和预测的氨基酸序 列。含有插入在Agp启动子和Ubi3终止子之间的Asgl基因的二元载体（SEQ ID N0:12) 命名为pSM658(图1C)。
[0222] 通过应用定量实时反转录酶PCR，测定块茎中Asgl基因的表达水平。表3证实，25 株PSM658植物中的18株的块茎超量表达Asgl基因约2至20倍。这些块茎用于生产炸 薯条。化学分析证实，2个转基因系的炸薯条含有降低水平的丙烯酰胺（表4)。
[0223] 也可以使用其它块茎特异性启动子来驱动Asgl基因的表达。质粒pSM757含有 可操作地连接到Asgl基因上的Gbss启动子。用该质粒的转运DNA转化马铃薯，会生成卡 那霉素抗性的、超量表达Asgl基因的植物。可以用于驱动马铃薯块茎中的天冬酰胺酶表达 的其它启动子，可以选自马铃薯块茎特异性蛋白启动子，冷诱导型启动子，和类黄酮化合 物_3'_单加氧酶（Fmo)启动子。一个Fmo启动子如SEQ ID NO: 13所示。该启动子在半成 熟的和成熟的块茎中是有活性的，但是在小块茎中是无活性的。
[0224] 除了使用Asgl以外，也可以采用其它天冬酰胺酶基因 。SEQ ID N0:14显示了替 代性马铃薯天冬酰胺酶Asg2基因的cDNA序列。天冬酰胺酶基因的其它实例包括大肠杆菌 (登记号Z1051m ;SEQIDN0:31)、农杆菌（登记号Atu3044;SEQIDN0:32)、大麦（登记号 AF308474;SEQ ID N0:33)的天冬酰胺酶基因，和编码具有基序pfam01112. 12的蛋白的任 意基因（Marchler-Bauer 等人，Nucleic Acids Res 33, D192-6, 2005) 〇
[0225] 在SEQ ID NO: 15中显示了小麦的天冬酰胺酶基因的序列。在SEQ ID NO: 16中描 述了预测的氨基酸序列。
[0226] 对于任意的天冬酰胺酶基因，可能存在具有高度序列相似性的其它天冬酰胺酶序 列。例如，通过检索数据库，例如由NCBI维护的那些，可以鉴别植物衍生的天冬酰胺酶基 因。
[0227] 鉴别植物衍生的天冬酰胺酶基因之后，为天冬酰胺酶基因的PCR-扩增设计基因 特异性的引物。根据本领域已知的方法，进行PCR扩增，然后将PCR扩增的天冬酰胺酶基因 克隆进克隆载体中。
[0228] 将天冬酰胺酶可操作地连接到种子特异性的启动子上，例如SEQ ID NO: 17所述的 小麦嗓呤二氢吲噪（puroindoline)基因启动子。使用生产低天冬酰胺小麦的常规转化方 法，导入包含得到的表达盒的转运DNA。从小麦种子得到的面粉会在加热过程中积累更少的 丙烯酰胺。
[0229] 实施例3
[0230] 谷氨酰胺合成酶的超量表达
[0231] 谷氨酰胺合成酶基因的超量表达会导致降低水平的天冬酰胺。可以将编码具有谷 氨酰胺合成酶活性的蛋白的任意序列可操作地连接到在目标植物器官（例如马铃薯块茎） 中表达的启动子上。马铃薯含有3个相关的谷氨酰胺合成酶基因，如SEQ ID NO. :28-30所 示。包含每个这样的基因的一个片段的DNA区段可以用于有效地下调谷氨酰胺合成酶活 性。为此目的，可以将该区段的至少一个拷贝插入2个趋同启动子之间，或启动子和终止子 之间。使用任意的转化方法，可以将得到的表达盒导入目标植物。然后可以选择生产低天 冬酰胺植物器官的转基因植物。这些植物器官的热加工会提供含有比从对应器官得到的产 品更低的丙烯酰胺的产物。例如，加工过的转基因块茎会产生这样的炸薯条，其含有比从 未转化的块莖得到的炸薯条更低的丙稀酰胺水平。Harrison和合作者（Plant Physiology 133:252-262, 2003)已经描述了谷氨酰胺合成酶超量表达对天冬酰胺水平的影响。但是，这 些作者没有预见到降低的天冬酰胺水平对强烈减少的热诱导的丙烯酰胺积累的影响。
[0232] 类似地，可以下调显示出硝酸还原酶活性的内源基因的表达。为此目的，可以表达 该基因的一部分或硝酸还原酶基因的启动子的至少一个拷贝。可以筛选转基因植物的硝 酸还原酶基因表达水平，然后可以筛选表现出降低水平的系的降低的天冬酰胺水平。也可 以沉默己糖激酶基因并增加天冬氨酸水平，同时降低天冬酰胺水平。以前已经描述了硝酸 还原酶和己糖激酶基因的超量表达与增加的天冬酰胺水平之间的关联（Roland等人，Annu Rev Plant Biol 57:675-709, 2006 ;Szopa，Biochem Soc Trans 30:405-410, 2002)。但是， 作者没有预见到最终降低食物中的丙烯酰胺水平的相应方案。
[0233] 显然，存在通过改变直接或间接参与天冬酰胺的合成或代谢的基因的表达，修饰 植物中的天冬酰胺水平的其它策略。我们的结果暗示着，任一种这样的方法都可以用于生 产低丙烯酰胺食物。
[023 4] 实施例4
[0235] 同时下调淀粉降解和天冬酰胺生物合成基因的表达
[0236] 本实施例证实，同时下调分别参与作物淀粉组织的淀粉降解和天冬酰胺生物合成 基因的表达，可以降低加热这些淀粉组织得到的食物中的丙烯酰胺积累。
[0237] 分2步制备转基因植物，其生产具有低水平的还原糖和天冬酰胺的块茎。首先，用 二元载体 PSIM371 的 P-DNA 转化植物。该 P-DNA 含有包含 PP0(SEQ ID N0:18)、R1(SEQ ID N0:19)和phL(SEQ ID N0:20)基因的片段的多核苷酸的2个拷贝，其作为反向重复序列插 入Gbss启动子和Ubi 3终止子之间。
[0238] 使用携带pSM371和LifeSupport载体pSM368的农杆菌株（它含有插入在T-DNA 边界之间的nptll和codA基因的表达盒）来感染21，900个马铃薯茎外植体。2天共培养 阶段后，将感染的外植体暴露于卡那霉素5天，以选择瞬时nptll基因表达。为了预防含 有稳定整合的T-DNA的细胞的增殖，随后将外植体转移至含有5-氟胞嘧啶（5FC)的培养基 中。codA基因产物会将该化合物转化成无毒的5-氟尿嘧啶（5FU) (Perera等人，1993)。对 双重选择后存活的共3, 822个芽进行基因型分析，分析P-DNA的存在和来自T-DNA或质粒 主链的任意外源DNA的缺失。该分析鉴定出256个能生根的全天然DNA(基因内的）芽，种 入土壤中，在生长室中生长6周。为了筛选PPO活性，将儿茶酚溶液移液到收获的约2-cM 小块茎的切口表面上。在温室中培养在儿茶酚诱导的块茎褐变中抑制的48个系3个月，以 生产半成熟的块茎，用于生化分析剩余的PPO活性水平。该分析证实，PPO基因沉默构建体 的应用使PPO活性降低了约90%。随后繁殖48个基因内系和未转化的Ranger Russet和 Russet Burbank对照植物，并在爱达荷州阿柏丁（Idaho, Aberdeen)的田地中生长。
[0239] 在冷藏3和6个月后，分析所有基因内系和对照系的成熟块茎的葡萄糖水平。大 多数系（43)表现出比已经沉默了仅一个淀粉相关基因的对照系更大的冷诱导的甜化减少 (约60% )。源自植物371-28和371-38的沉默块茎的炸薯条含有的神经毒素丙烯酰胺少 于在对照油炸食品中积累的1/3(表4)。可以的减少在预料之中，因为丙烯酰胺主要源自热 诱导的还原糖羰基和天冬酰胺之间的反应（Mottram等人，2002 ;Stadler等人，2002)。
[0240] 由8位专业训练的个体组评价改良的炸薯条的感官特征。源自修饰的Ranger Russet块莖的炸薯条表现出比来自Ranger Russet或Russet Burbank的炸薯条更好的视 觉外观。此外，基因内的炸薯条表现出明显更好的总香气，这可以通过位于鼻腔顶部的嗅觉 上皮感知。对于已经在4°C储存10周的块茎，观察到了类似的趋势。实际上，冷藏的基因内 系371-28, 30, 38,和68仍然满足或超过了新鲜的未转化的品种的感官特征。
[0241] 用PSM1148再次转化一种低糖马铃薯系。与来自原始pSM1148植物的炸薯条相 比，来自卡那霉素抗性的双重转化体的炸薯条通常表现出进一步降低的丙烯酰胺水平。因 而，该双重转化体会生成可以用于得到炸薯条的块茎，所述食品（i)含有降低水平的丙烯 酰胺，且（ii)表现出增强的感官特征。
[0242] 实施例5
[0243] 降低马铃薯块茎中的天冬酰胺水平和冷诱导的甜化的全天然DNA转化方法
[0244] 本实施例描述了使用全天然DNA转化方法来降低马铃薯块茎中的天冬酰胺水平 和冷诱导的甜化。从这些块茎得到的加工食品含有降低水平的丙烯酰胺。
[0245] 用于转化的含有插入马铃薯-衍生的边界区域之间的2个表达盒的转运DNA如 SEQ ID N0:23 所示（图 2)。第一表达盒包含含有 Ppo(SEQ ID N0:24)、PhL(SEQ ID N0:25) 和Rl (SEQ ID N0:26)基因的启动子片段的DNA区段的2个拷贝，其作为反向重复序列插入 Agp基因的功能活性启动子和泛素-3基因的终止子之间。第二表达盒包含含有Astl、Ast2 和Pp0 (SEQ ID NO: 27)基因的片段的DNA区段的2个拷贝，其作为反向重复序列插入Gbss 基因的2个功能活性的和趋同方向的启动子之间。
[0246] 将含有转运DNA和农杆菌异戊烯基转移酶（ipt)基因的表达盒的质粒导入农杆菌 LBA4404,使用无标记的转化方法（参见：Craig Richael, "generation of marker-free and backbone-free transgenic plants using a single binary approach，临时专利申 请60/765, 177,它在本文中引作参考），将得到的菌株用于转化马铃薯品种，例如Ranger Russet和Atlantic。使没有表现出细胞因子表型（特征是矮化的生长和不能生根）的转 化过的植物生成块茎。有些系的块茎会表现出低水平的Ppo酶活性，这可以通过将0. 5mL 的50mM儿茶酚移液到新鲜切口的块茎表面上来测试。通过在50mM 3-(N-吗啉代）丙磺酸 缓冲液PH 6.5 (5mL)中混合粉末状的块茎（Ig)，可以更精确地测定Ppo酶活性的水平。沉 淀固体级分后，可以随时间测定0D410的变化。通过在约4°C温育块茎，进一步测试含有小 于25% Ppo酶活性的块茎的系。至少1个月后，可以测定葡萄糖水平，例如，通过使用葡萄 糖氧化酶/过氧化物酶试剂（Megazyme, Ireland)。可以分析表现出>75%降低的ppo活性 水平和>50%降低的冷诱导的甜化的块茎的系的游离天冬酰胺水平。如果游离天冬酰胺水 平降低了约>50%，可以加工块茎，并分析丙烯酰胺水平。确实含有低天冬酰胺水平以及低 Ppo和低的冷诱导的甜化的转化系，可以考虑用于批量扩大和商业生产。源自优选系的块茎 的炸薯条含有更少的还原糖，因而可能减少漂白时间和保持原始的马铃薯味道。此外，由于 缺少糖末端和黑点挫伤，增强了它们的视觉吸引力。炸薯条也具有更好的香气，并积累降低 水平的丙烯酰胺，这可以通过用于评价炸薯条的感官特征的感官组来测定。
[0247] 实施例6
[0248] TILLING
[0249] 通过突变，也可以下调参与天冬酰胺（例如天冬酰胺合成酶）的生物合成的基因 的表达。实现该目标的一种方法称作'靶向诱导的基因组中的局部损伤'（TILLING)。该方 法组合了甲磺酸乙酯（EMS)-诱导的诱变的效率和变性高效液相色谱（DHPLC)的能力，以通 过异源双链体分析检测碱基对变化。该方法会产生宽范围的突变等位基因，是快速且可自 动化的，适用于可以化学诱变的任意生物体。在基本的TILLING方法中，通过EMS处理来 诱变种子。使得到的Ml植物自受精，将M2代个体用于制备进行突变筛选的DNA样品，同 时将它们的种子存货。合并DNA样品。在微量滴定板上排列各样品组，进行基因特异性的 PCR (McCal Ium 等人，Nat Biotechnol 18:455-457)。
[0250] TILLING有多种替代方案。例如，可以使用不同类型的诱变剂，例如快速中子或二 环氧丁烷（DEB)。所有这些方法可以连接到反向遗传学平台，以筛选和分离预选择的基因的 突变体。这些方法已经详细描述在，例如，Wang等人，Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, Volume I,2006,Global Science Books。
[0251] 此外，可以简单地筛选可得到的种质的低天冬酰胺表型。因而，分子植物培育、突 变培育和系选择都会提供可以得到'低天冬酰胺'品种的方法。
[0252] 实施例7
[0253] 降低天冬酰胺水平
[0254] 通过改进种植者的操作，也可以降低天冬酰胺水平。例如，碳可以抑制天冬酰胺 合成酶基因 (Koch KE. Carbohydrate-modulated gene express ion in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol47:509_540, 1996)。通过降低土壤中的氮/硫比，也可以 减少天冬酰胺积累。相对较低的氮水平会导致富含N的化合物的浓度的降低和含S代谢物 (例如半胱氨酸，谷胱甘肽，和S-腺苷酰甲硫氨酸）的增加。因而，含有相对高C、高S和 低N的土壤可以用于生产具有相对低天冬酰胺的食品。
[0255] 表
[0256] 表1. 3个月龄的温室生长的马铃薯系的块茎中的天冬酰胺水平
[0257]
[0258]
[0259] 表2.从3个月龄的温室生长的马铃薯系的块茎得到的炸薯条中的丙烯酰胺水平。 根据美国食品和药品管理局，植物以及乳制品和饮料的食品安全中心和应用营养办公室， "食品中丙烯酰胺的检测和定量"（2002)，测定丙烯酰胺水平。
[0260]
[0261] 表3.通过定量实时RT-PCR测得的6周龄生长室生长的马铃薯系的马铃薯块茎中 天冬酰胺酶-1基因的表达水平
[0262]
^ Im ο η ΓΕν
[0263] 表^从3个月龄温室生长的马铃薯系
块茎得到^勺炸薯条中的丙'酰胺水平
[0264]
【主权项】
1. 一种降低热加工的植物产品中的丙烯酰胺含量的方法，其包含降低用于生产该产品 的植物中的天冬酰胺水平。2. 权利要求1的方法，其中降低天冬酰胺水平的步骤包含：在植物中表达第一多核苷 酸，其中所述多核苷酸包含至少一个下述成分的完整或部分序列：（i)参与天冬酰胺生物 合成的基因或基因的启动子，和（b)参与天冬酰胺代谢的基因。3. 权利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸包含下述成分的至少一个：(a)来自选自 (i)天冬酰胺合成酶基因、（ii)硝酸还原酶基因、和（iii)己糖激酶基因的基因或所述基因 的启动子的完整或部分有义和/或反义序列，其中完整或部分序列的表达下调该基因的内 源拷贝的mRNA水平，和（b)选自（i)天冬酰胺酶基因和（ii)谷氨酰胺合成酶基因的基因 的完整或部分序列，其中超量表达所述序列，以上调该基因的总mRNA水平。4. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺合成酶基因的至少一部 分，且包含与SEQIDNO: 1或2所述序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列。5. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含功能上有活性的天冬酰胺酶基因， 且包含与SEQIDN0:9、14或31-33所述序列具有至少70%同一性的序列。6. 权利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸可操作地连接到至少一个组织特异性植 物启动子上。7. 权利要求6的方法，其中所述启动子是块茎特异性或种子特异性启动子。8. 权利要求7的方法，其中所述启动子与马铃薯颗粒结合的淀粉合酶启动子、马铃薯 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子、马铃薯块茎特异性蛋白启动子、马铃薯类黄酮3' -单 加氧酶基因启动子、或小麦嘌呤吲哚基因启动子的至少一部分具有至少70%同一性。9. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯颗粒结合的淀粉合酶启动子包含SEQIDNO:8 所述序列的至少一部分。10. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子包含SEQ IDN0:7所述序列的至少一部分。11. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯块茎特异性蛋白基因启动子包含SEQID NO:22所述序列的至少一部分。12. 权利要求8的方法，其中所述类黄酮单加氧酶基因启动子包含在SEQIDNO: 13所 述序列上游的序列的至少一部分。13. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺生物合成基因的有义和 /或反义片段的至少一个拷贝，且被表达，以下调用于生产热加工食品的植物组织中的总天 冬酰胺合成酶mRNA水平。14. 权利要求13的方法，其中所述第一多核苷酸在它的5'-末端可操作地连接到到启 动子上，且在它的3' -末端可操作地连接到启动子上。15. 权利要求2的方法，还包含表达第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成分的至少 一个：（i)选自Rl基因和磷酸化酶L基因的基因的至少一个拷贝，其是有义和/或反义方 向。16. 权利要求15的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于转运DNA内，且包含与SEQ IDN0:23所示序列具有至少70%同一性的序列。17. 权利要求1的方法，其中所述植物是具有块茎的植物。18. 从转基因植物的组织得到的热加工产品，所述组织包含第一多核苷酸，所述多核 苷酸包含参与天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代谢的基因的完整或部分序列，其中所述产品 具有比从其它方面相同的非转基因植物的对应组织制备的热加工产品更低的丙烯酰胺浓 度。19. 权利要求18的热加工产品，其中从转基因植物制备的产品具有比从野生型块茎制 备的等同产品改进的感官特征。20. 权利要求18的热加工产品，其中所述转基因植物是具有块茎的植物。21. 权利要求20的热加工产品，其中具有块茎的植物的产品是炸薯条、马铃薯片、炸薯 片、马铃薯或烤马铃薯。22. 权利要求18的热加工产品，其中转基因植物的细胞还包含第二多核苷酸，所述多 核苷酸包含下述成分的至少一个：（i)与Rl基因或基因片段相对应的有义和/或反义序 列，和（ii)与磷酸化酶L基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列。23. 权利要求18的热加工产品，其中所述产品的丙烯酰胺浓度比非转基因植物的热加 工产品中的丙烯酰胺浓度低至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约 40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%。24. -种植物，其在基因组中包含第一多核苷酸，所述多核苷酸包含参与天冬酰胺生物 合成或天冬酰胺代谢的基因的完整或部分序列。25. 权利要求24的植物，其中所述植物是具有块茎的。26. 权利要求25的植物，其中具有块茎的植物是马铃薯植物。27. 权利要求24的植物，还在基因组中包含第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成 分的至少一个：（i)与Rl基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列，和（ii)与磷酸化 酶L基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列。28. 分离的多核苷酸序列，其包含编码能降低植物中的丙烯酰胺水平的多肽的核酸序 列。29. 权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述核酸序列选自：SEQIDN0:l、2、9、10、 14、15和28-35,或其变体、片段、互补序列或反向互补序列，且所述核酸编码具有天冬酰胺 酶活性的多肽。30. 权利要求29的分离的多核苷酸，其中所述变体的序列与SEQIDNO: 1、2、17、20、 21中的任一个序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61% 或 60 %的序列同一性。31. 从具有降低的天冬酰胺的植物组织生产可食用植物产品的方法，其包含（1)增加 所述植物组织中的天冬酰胺酶水平，或（2)降低所述植物组织中的天冬酰胺合成酶水平。32. 权利要求31的方法，其中增加植物细胞中的天冬酰胺酶水平的步骤包含在该细胞 中表达天冬酰胺酶基因。33. 权利要求31的方法，其中降低植物细胞中的天冬酰胺合成酶水平的步骤包含在该 植物细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸包含（i)Rl基因、（ii)磷酸化酶L基因和（iii)天 冬酰胺合成酶基因的至少一个片段，其是有义和/或反义方向。34. 权利要求31的方法，其中所述可食用植物产品是块茎、炸薯条、马铃薯片、炸薯片、 烤马铃薯或脱水的马铃薯。35. 权利要求31的方法，其中与天冬酰胺酶水平没有增加或天冬酰胺合成酶水平没有 降低的植物产品中的丙烯酰胺水平相比，所述可食用植物产品在被加热后具有更低的丙烯 酰胺水平。36. 生产具有低水平的丙烯酰胺的可食用植物产品的方法，其包含（i)下调天冬酰胺 生物合成基因的表达和/或上调参与天冬酰胺代谢基因的基因的表达，和（ii)下调植物 组织中（a)Rl基因和（b)磷酸化酶L基因中的至少一个基因的表达或活性，所述植物组织 产生用于制备产品的植物、种子或果实。37. 权利要求36的方法，其中下调Rl基因、磷酸化酶L基因和天冬酰胺生物合成基因 的步骤包含：在植物细胞中以有义和/或反义方向表达（i)Rl基因、（ii)磷酸化酶L基因 和（iii)天冬酰胺合成酶基因的至少一个片段。38. 权利要求36的方法，其中所述可食用植物产品是块茎、炸薯条、马铃薯片、炸薯片 或烤马铃薯。39. 权利要求36的方法，其中与非转基因植物的植物产品中的丙烯酰胺水平相比，所 述可食用植物产品在被加热后具有更低的丙烯酰胺水平。40. 生产可食用转基因植物产品的方法，所述产品在被加热后具有比来自非转基因植 物的等同加热产品的丙烯酰胺水平更低的丙烯酰胺水平，该方法包含通过改变参与植物中 天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代谢的基因的表达水平，降低转基因植物中的天冬酰胺水 平。41. 权利要求40的方法，其中通过以有义和/或反义方向表达来自天冬酰胺合成酶基 因、硝酸还原酶基因或己糖激酶基因的完整或部分序列的至少一个拷贝，降低天冬酰胺水 平。42. 权利要求41的方法，其中通过在植物中表达来自天冬酰胺酶基因或谷氨酰胺合成 酶基因的完整或功能上有活性的部分序列，降低天冬酰胺水平。43. 在马铃薯块茎中超量表达基因的方法，该方法是通过将该基因可操作地连接到与 SEQIDNO: 13所示序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列上。44. 权利要求1的方法，其中降低植物淀粉组织中的天冬酰胺水平。45. 权利要求36的方法，其中所述可食用植物产品具有与未修饰的等同产品相比改善 的感官特征。46. 权利要求45的方法，其中所述可食用植物产品具有选自下述的至少一种改善的感 官特征：外观、风味、香气和质地。
【专利摘要】本发明涉及低丙烯酰胺食品。本发明提供了从植物分离的多核苷酸和多肽序列，降低植物中游离天冬酰胺水平的方法，生产含有降低水平的丙烯酰胺的热加工食品的方法，和通过这些方法得到的植物和食物。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/55, A23L1/015, C12N15/82, A23L1/217
【公开号】CN104894159
【申请号】CN201510301163
【发明人】C.罗门斯
【申请人】J.R.西姆普罗特公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2006年9月19日
【公告号】CA2623266A1, CN101313070A, CN101313070B, DE602006016489D1, EP1974039A2, EP1974039B1, EP2333076A2, EP2333076A3, EP2333076B1, US20070074304, WO2007035752A2, WO2007035752A3
【专利说明】低丙烯酰胺食品
[0001] 本申请为申请号为200680043287. X的分案申请，要求2005年9月20日的优先权。
[0002] 优先权申请的交叉参考
[0003] 本非临时美国专利申请要求享有2005年9月20日提交的美国临时申请系列号 60/718, 335和2006年7月28日提交的美国临时申请系列号60/833, 788的优先权，二者的 内容在这里引作参考。 发明领域
[0004] 本发明涉及在植物中，例如在这些植物的富含淀粉的贮藏器官中下调和上调基因 的遗传方法，以降低在这些器官的加工相关的加热后积累的丙烯酰胺的水平。
[0005] 发明背景
[0006] 加热含有游离天冬酰胺和还原糖的食品，会导致丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺是在 世界范围内用于合成聚丙烯酰胺的工业化学物质。暴露于该反应性化合物，会导致在组织 中的快速吸收和均匀分布（Barber等人，Neurotoxicology 2001,22,341-353)。在啮齿动 物中，高浓度丙烯酰胺（>2mg/kg体重）的毒理学作用包括神经系统症状、生殖力减弱和癌 症（Friedman, J. Agric. Food Chem.，2003, 51，4504-4526) 〇
[0007] 还已知职业性暴露于高水平的丙烯酰胺会升高人类的神经毒性的发病率（Lo Pachin, Neurotoxicology, 2004, 25, 617-630)，但是没有记载丙稀酰胺对人类生殖的影 响或致癌作用。丙烯酰胺和它的氧化代谢物环氧丙酰胺会与血红蛋白的氨基端缬氨酸 反应，形成加合物。加合物形成的程度是暴露水平的良好标志物，且暗示着接近100 μ g 的日摄入量（Tareke 等人，J. Agric. Food Chem. ,2002, 50, 4998-5006)。尽管最初认为 饮用水、化妆品和吸烟代表着丙稀酰胺背景暴露的唯一主要来源（Bergmark, Chem. Res. Toxicol.，1997, 10, 78-84)，最近的分析表明，油炸的和烘烤的淀粉食品的消耗，构成约 36 % 的丙稀酰胺摄入（Becker 和 Pearson, Dietary habits and nutrient intake in Swedenl997-98〇 Riksmaten 1997-98, 1999)〇
[0008] 饮食丙烯酰胺主要源自热诱导的游离氨基酸天冬酰胺的氨基和还原 糖的羰基之间的反应（Mottram 等人，Nature, 2002, 419, 448-449 ;Stadler 等 人，Nature, 2002, 419, 449-450)。新鲜的马铃薯块茎含有非常高水平的天冬酰胺，但是相对 低浓度的还原糖葡萄糖和果糖。但是，在冷藏期间，通过表达冷诱导的转化酶（该酶催化蔗 糖向葡萄糖和果糖的转化），积累还原糖。
[0009] 以前尝试限制丙烯酰胺在淀粉食品中的积累，没有产生实用的且节省成本的应 用。现有技术的第一种方法是基于调整加工参数，例如表面/体积比，温度和油炸时间。尽 管这些方法的应用可能在减少丙烯酰胺的积累方面是部分有效的，但它会通过减轻颜色、 改变形状和改变口味和质地，改变最终食品的感观特征。这些改变是不希望的。
[0010] 第二种方法是基于，在加热前用天冬酰胺酶（EC 3. 5. I. 1)或glurninase(EC 3. 4. 1. 2)温育部分加工的食品（参见世界专利申请2004/030468 A3和世界专利申请 2004/026042 Al)。该方法是昂贵的，仅能容易地应用于可以与所述酶容易地混合的材料， 例如面粉。 toon] 第三种方法将天冬酰胺竞争剂例如甘氨酸加入部分加工的食品中（关于马铃薯 块茎的世界专利申请2005/025330 Al,关于烤制咖啡豆的美国专利申请2004/0081724 A1，关于可可豆的世界专利申请2005/004620 A1，关于基于玉米的食品的世界专利申请 2005/004628A1)。该方法仅是部分有效的，需要高浓度的添加剂，且因为成本太高而难以广 泛应用。
[0012] 第四种方法在加热前将还原糖改变酶（包括醛糖还原酶）加入食品中（参见美国 专利6989167)。该方法不是非常有效，且因为成本太高而难以广泛应用。
[0013] 第五种方法在加热前给食品包被选自下述的试剂：含有氨基酸的化合物，氨基酸 盐，氨基酸酰胺，氨基酸酯，和其混合物（参见世界专利申请2005/077203A3)。该方法仅 是部分有效的，且因为成本太高而难以广泛应用。
[0014] 第六种方法是基于，选择含有非常低水平的还原糖和天冬酰胺的种质。这样的种 质的可用性，使得将"低糖"和"低天冬酰胺"性状渐渗到食品工业可广泛使用的品种中成 为可能。但是，尚未鉴定出低天冬酰胺作物植物。即使将来发现了这样的种质，将希望的性 状渐渗到商业化品种中也需要至少15-20年。
[0015] 第七种方法遗传地修饰作物，以降低还原糖水平。该方法是基于下调参与淀粉降 解的基因，例如马铃薯淀粉相关的Rl和磷酸化酶-L基因的表达（参见，例如，美国专利申 请2003/0221213 Al)。尽管是部分有效的，从修饰的作物加工的食品仍然含有对照产品的 约三分之一的丙烯酰胺水平。
[0016] 因而，非常需要降低从淀粉作物得到的加工食品中的丙烯酰胺水平的方法。这样 的方法应当是节省成本的，不会降低食品的感观特征。本发明提供了这样的方法。
【发明内容】
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供了一种降低加工食品中的丙烯酰胺水平的新策 略，所述加工食品通过加热作物的淀粉组织来得到。独特地，该策略采用基因工程的方法， 使作物植物的淀粉组织中的天冬酰胺水平降低了至少50 %。
[0018] 在一个实施方案中，通过降低天冬酰胺生物合成的水平和/或增加天冬酰胺代谢 的水平，降低作物植物的淀粉组织中的天冬酰胺水平。任一种机理都可能需要下调或上调 直接或间接参与每个天冬酰胺途径的基因。在一个方面，参与天冬酰胺代谢的基因编码天 冬酰胺酶。在一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因编码天冬酰胺合成酶。
[0019] 在另一个方面，间接参与天冬酰胺途径的基因选自：谷氨酰胺合成酶（GS)基因， 硝酸还原酶（NR)基因，14-3-3基因，和己糖激酶（HXK)基因。
[0020] 在一个方面，通过降低参与天冬酰胺生物合成的至少一个基因的表达，降低天冬 酰胺生物合成的水平。
[0021] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，降低参与天冬酰胺生物合成的基因的表 达，所述表达盒从5'至3'包含，（i)启动子，（ii)包含参与天冬酰胺代谢的至少一个基因 的至少一个片段的序列的至少一个拷贝，和任选地，（iii)第二个启动子或终止子，其中所 述第一个和任选的第二个启动子以趋同方向排列。
[0022] 在一个方面，用于降低参与天冬酰胺生物合成的基因的表达的表达盒含有参与天 冬酰胺代谢的基因的至少一个片段的序列的2个拷贝。
[0023] 在一个方面，所述2个拷贝排列为（i)反向重复序列或（ii)直接重复序列。
[0024] 在一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因分离自：马铃薯，野生马铃薯例如 Solanum phureja,甘薯，山药，咖啡树，可可树，小麦，玉米，燕麦，高梁，或大麦，且 编码天冬酰胺合成酶。
[0025] 在一个方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含与SEQ ID: 1所示序列的至少一个片段 具有至少70 %同一性的序列。
[0026] 在另一个方面，所述天冬酰胺合成酶基因包含与SEQ ID: 2所示序列的至少一个片 段具有至少70 %同一性的序列。
[0027] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，实现参与天冬酰胺代谢的基因的超量表 达，所述表达盒从5'至3'包含，第一启动子，参与天冬酰胺生物合成的基因，和终止子。
[0028] 在一个方面，参与天冬酰胺代谢的基因分离自：马铃薯，野生马铃薯例如Solanum phureja，甘薯，薯蓣，咖啡树，可可树，小麦，玉米，燕麦，高梁，或大麦，且编码天冬 酰胺酶。
[0029] 在一个方面，所述天冬酰胺酶基因包含与SEQ ID:9, 10, 14, 15, 31，32,或33所示 序列具有至少70%同一性的序列。
[0030] 在另一个方面，所述天冬酰胺酶基因包含与SEQ ID: 14所示序列具有至少70%同 一"性的序列。
[0031] 在另一个方面，参与天冬酰胺生物合成的基因是谷氨酰胺合成酶或己糖激酶基 因。
[0032] 在一个方面，所述启动子是下述基因的启动子：（i)马铃薯颗粒结合的淀粉合酶 基因，（ii)马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因，（iii)马铃薯泛素-7基因，（iv)马铃薯块 茎特异蛋白（patatin)基因，（V)马铃薯类黄酮单加氧酶基因。
[0033] 在一个方面，马铃薯颗粒结合的淀粉合酶基因的启动子与SEQ ID NO:8的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因的启动子与SEQ ID N0:7的 至少一部分具有至少70%同一性，马铃薯泛素-7基因的启动子与SEQ ID N0:21的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯块茎特异性蛋白基因的启动子与SEQ ID N0:22的至少一 部分具有至少70%同一性，马铃薯类黄酮单加氧酶基因的启动子与SEQ IDN0:13的至少一 部分具有至少70%同一性。
[0034] 在另一个方面，所述启动子是在用于食品加工的淀粉作物的块茎、根或种子中表 达的基因的启动子。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明提供了降低食品中丙烯酰胺水平的方法，所述食品 通过加热作物的组织并同时降低该组织中天冬酰胺和还原糖的水平来得到。在一个实施方 案中，所述组织是作物或植物的淀粉组织。
[0036] 在一个方面，通过下述方式实现天冬酰胺和还原糖水平的同时降低：（i)下调参 与天冬酰胺生物合成的基因的表达，或超量表达参与天冬酰胺代谢的基因，和（ii)下调参 与淀粉降解的至少一个基因的表达。
[0037] 在一个方面，通过向植物中导入表达盒，下调参与淀粉降解的基因的表达，所述表 达盒从5'至3'包含，（i)启动子，（ii)包含参与淀粉降解的基因的至少一个片段的序列 的至少一个拷贝，和任选地，（iii)第二个启动子或终止子，其中所述第一个和任选的第二 个启动子以趋同方向排列。
[0038] 在一个方面，参与淀粉降解的基因选自：（i)淀粉-相关的Rl基因，和（ii)淀 粉-相关的磷酸化酶-L基因。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明提供了通过同时降低组织中天冬酰胺和还原糖的水 平，降低通过加热作物的组织得到的食品中丙烯酰胺的水平并同时提高该食品的感官特征 的方法。在一个实施方案中，所述组织是作物或植物的淀粉组织。
[0040] 在一个方面，通过采用"多基因靶向"构建体，实现同时降低，所述"多基因靶向"构 建体包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒包含（i)可操作地连接到启动子上的 天冬酰胺酶基因，或（ii)可操作地连接到启动子上的天冬酰胺合成酶基因片段的至少一 个拷贝，所述第二表达盒包含DNA区段的至少一个拷贝，所述DNA区段含有可操作地连接到 启动子上的Rl基因片段和磷酸化酶基因片段，其中所述第一和第二表达盒可以是相同的 表达盒。
[0041] 在一个实施方案中，植物包含用"多基因靶向"构建体稳定转化的至少一个细胞。 在另一个实施方案中，所述植物是具有块茎的。在另一个实施方案中，所述具有块茎的植物 是马铃薯植物。在另一个实施方案中，所述具有块茎的植物含有稳定掺入它的基因组中的 盒。
[0042] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎加工的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，且（b)所述产品具有比从相同植物品种的非转基 因块茎生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度。
[0043] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎生产的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，（b)所述产品具有比从相同物种的非转基因块茎 生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度，且（c)所述产品还表现出比从相同物种的非转基因 块茎生产的等同产品更低的非酶性褐变速率。
[0044] 在另一个方面，本发明提供了从转基因块茎生产的产品，其中（a)转基因块茎的 至少一个细胞包含"多基因靶向"构建体，（b)所述产品具有比从相同物种的非转基因块茎 生产的等同产品更低的丙烯酰胺浓度，且（c)所述产品还表现出比从相同品种的非转基因 块茎生产的等同产品更低的非酶性褐变速率，且（d)所述产品还表现出比从相同品种的非 转基因块茎生产的等同产品增强的感官特征。在一个实施方案中，所述可食用的植物产品 具有比从没有根据本发明的方法修饰的植物生产的等同产品改善的感官特征。在一个实施 方案中，所述可食用的植物产品具有选自下述的至少一种改善的感官特征：外观，风味，香 气，和质地。
[0045] 在一个实施方案中，所述转基因块茎是马铃薯。在另一个实施方案中，所述产品是 炸薯条。在另一个实施方案中，所述产品是马铃薯片。
[0046] 在另一个实施方案中，所述转基因块茎是马铃薯，且所述转基因块茎产品在 4°C -12°C储存约1-30周时，其葡萄糖水平比在与该转基因块茎相同储存条件下储存的相 同物种的非转基因块茎的葡萄糖水平的50%还低。
[0047] 在一个实施方案中，所述植物选自：马铃薯，玉米，咖啡，可可，和小麦。
[0048] 在另一个实施方案中，用选自下述的细菌株转化所述植物：根癌农杆菌，三 叶草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛叶杆菌，苜蓿中华根瘤菌和百脉根中慢生根瘤菌 (MesoRhizobium loti)〇
[0049] 在一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸序列，其包含编码多肽的核酸序列，所 述多肽能降低植物中的天冬酰胺水平，并从而降低该植物的加工产品中的丙烯酰胺水平。
[0050] 在一个实施方案中，所述核酸序列与选自SEQ ID NO:9, 10, 14, 15, 31，32,和33的 序列或其变体或片段具有至少70%同一性，且所述核酸编码具有天冬酰胺酶活性的多肽。
[0051] 在另一个实施方案中，所述变体与SEQ ID N0:9, 10, 14, 15, 31，32,和33中的任 一个序列的序列同一性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75 %,74%,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64%,63 %,62 %,61 % , 或 60%〇
[0052] 在另一个方面，提供了分离的多核苷酸序列，其包含编码天冬酰胺酶的核酸序列， 所述天冬酰胺酶能降低植物中的天冬酰胺水平，并从而降低该植物的加工产品中的丙烯酰 胺水平。
[0053] 在另一个方面，本发明提供了具有降低的天冬酰胺酶表达水平的转基因植物，其 可以用于生产含有低丙烯酰胺含量的加工食品。
[0054] 在另一个方面，本发明提供了具有低丙烯酰胺含量的食品，其可以通过加工具有 降低的天冬酰胺含量的转基因块茎得到。
[0055] 基于美国食品药品管理局数据（www. cfsan. fda. gov/_ dms/acrydata. html)，在 大量快餐连锁餐馆中生产的典型炸薯条含有超过十亿分之100份（PPb)的丙烯酰胺。这样 的典型炸薯条中丙烯酰胺的平均量是404ppb，通过消耗炸薯条平均每日摄入的丙烯酰胺水 平是0.07微克/kg体重/天。结果，炸薯条代表着16%的丙烯酰胺总饮食摄入。烘箱烘烤 的薯条和由商业处理机生产的马铃薯片中丙烯酰胺的平均量分别是698ppb和597ppb。因 而，马铃薯-衍生的加工食品（包括炸薯条，烘箱烘烤的薯条，和马铃薯片）代表着38% 的丙烯酰胺总饮食摄入。
[0056] 根据本发明，在从本发明的特定品种的转基因植物生产的块茎得到的炸薯条、烤 薯条或马铃薯片中存在的丙烯酰胺水平，比从相同品种的非转基因植物得到的炸薯条、烤 薯条或马铃薯片中的丙烯酰胺水平低超过2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10 倍，11倍，12倍，13倍，14倍，15倍，16倍，17倍，18倍，19倍，20倍，或超过20倍。
[0057] 以十亿分之......份表示，从本发明的块茎生产的炸薯条可以具有l_20ppb，20-40p pb, 40_60ppb, 60_80ppb,或 80-100ppb 的丙稀酰胺。
[0058] 以十亿分之……份表示，从本发明的块茎生产的烘箱烘烤的薯条、马铃薯片或薯 饼（hash brown)可以具有 l-2〇ppb，2〇-40ppb，4〇-6〇ppb，6〇- 8〇ppb，8〇-100ppb, IOO-I2Opp b, 120-140ppb, 140-160ppb, 160-180ppb,或 180-200ppb 的丙烯酰胺。
[0059] 本发明不限于降低块茎的油炸食品和马铃薯片产品中的丙烯酰胺水平。可以根据 本发明处理其它食物，以降低丙烯酰胺水平。
[0060] 早餐谷类中的丙烯酰胺水平可以从约50-250ppb降低至低于40ppb的水平，优选 降低至低于20ppb的水平。
[0061] 脆饼，如Dare Breton Thin Wheat Crackers和Wasa Original Crispbread Fiber Rye中的丙稀酰胺水平可以从约300_500ppb降低至低于IOOppb的水平，优选降低至低于 50ppb的水平。
[0062] 巧克力，如Ghirardelli无糖可可或Hershey可可中的丙稀酰胺水平可以从约 300_900ppb降低至低于200ppb的水平，优选降低至低于50ppb的水平。
[0063] 饼干中的丙烯酰胺水平可以从约50_200ppb降低至低于40ppb的水平，优选降低 至低于20ppb的水平。
[0064] 咖啡粉中的丙烯酰胺水平可以从约175_350ppb降低至低于60ppb的水平，优选降 低至低于30ppb的水平。
[0065] 小麦面包中的丙稀酰胺水平可以从约50_150ppb降低至低于30ppb的水平，优选 降低至低于15ppb的水平。
[0066] 应当理解，许多因素会影响最终的食品中的丙烯酰胺水平。这些因素包括作物、品 种、生长条件、收获的种子或块茎的贮存条件、和加工变量，例如加热稳定、加热时间、油炸 使用的油的类型和暴露的表面。
[0067] 本发明所述方法的应用，会使丙烯酰胺水平降低至少约5%、至少约10%、至少 约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、 50%，至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90 %或超过约90%。
[0068] 附图简述
[0 069] 图 I: (A)pSM1148, (B)pSM1151,和（C)pSM658 的简图。LB =左 T-DNA 边 界，P:Agp =马铃薯Agp启动子，2a = ast2基因片段的反义拷贝，la = astl基因片段的 反义拷贝，lb = astl基因片段的有义拷贝，2b = ast2基因片段的有义拷贝，P:Gbss =马 铃薯Gbss启动子，T:nos =农杆菌胭脂碱合酶基因的终止子，P:nos =农杆菌胭脂碱合酶 基因的启动子，RB =右T-DNA边界，P:Ubi7 =马铃薯泛素-7基因的启动子。
[0070] 图2:Russet Boise构建体。PF =启动子片段，GF =基因片段。
[0071] 优选实施方案的详述
[0072] 本发明提供了用于降低丙烯酰胺水平的多核苷酸序列和方法。
[0073] 本发明使用本领域技术人员众所周知的术语和短语。如果没有另外定义，此 处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的 相同含义。一般地，本文使用的命名，细胞培养、分子遗传学和核酸化学中的实验方法， 和在此描述的杂交是本领域公知和常用的。对于重组核酸方法、多核苷酸合成、微生物 培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学 分析和药物制剂和递送，使用标准技术。一般地，根据厂家的说明进行酶促反应和纯化 和 / 或分离步骤。一般根据常规方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, edited by Sambrook&Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，2001)，进行这些技术和操作。
[0074] 丙烯酰胺：丙烯酰胺单体被认为是有毒的，会直接影响神经系统。它被视作致 癌物。丙烯酰胺会容易地透过完整皮肤从水溶液吸附。分子式是C3H5N0;结构：CH2 = CH-C0-NH2。
[0075] 农杆菌或细菌转化：如本领域众所周知的，用于转化植物细胞的重组质粒转化农 杆菌通常是根癌农杆菌或发根农杆菌的减毒（disarmed)和有毒的衍生物。在感染植株、外 植体、细胞或原生质体后，农杆菌会将DNA区段从质粒载体转移至所述植物细胞核。所述载 体通常含有位于T-DNA或P-DNA的边界之间的需要的多核苷酸。但是，可以使用能转化植 物细胞的任意细菌，例如，三叶草根瘤菌，豌豆根瘤菌，紫金牛叶杆菌，苜蓿中华根瘤菌和 百脉根中慢生根瘤菌。
[0076] 被子植物：具有包裹在子房中的种子的维管植物。被子植物是开花的种子植物， 所述花生产果实。被子植物分为双子叶和单子叶植物。
[0077] 天冬酰胺生物合成：在植物中发生的生成天冬酰胺的酶催化的反应。
[0078] 天冬酰胺代谢：在植物中发生的将天冬酰胺转化成其它化合物的酶催化的反应。
[0079] 天冬酰胺酶：在多种植物、动物和细菌细胞中发现的天冬酰胺酶，是参与天冬酰 胺代谢的酶。它会催化天冬酰胺的脱氨作用，产生天冬氨酸和铵离子，导致游离循环天冬酰 胺的消耗。
[0080] 天冬酰胺合成酶：该酶参与天冬酰胺生物合成，并催化从天冬氨酸合成天冬酰 胺。
[0081] 抗生素抗性：细胞在有抗生素存在下存活的能力。本文使用的抗生素抗性源自抗 生素抗性基因在宿主细胞中的表达。细胞可以具有对任意抗生素的抗性。常用抗生素的实 例包括卡那霉素和潮霉素。
[0082] 双子叶植物：胚具有2瓣种子或子叶的开花植物，分支叶脉，花瓣数是4或5的倍 数。双子叶植物的实例包括、但不限于，马铃薯，甜菜，绿花椰菜，木薯，甘薯，胡椒， 猩猩木，菜豆，苜蓿，大豆，和鳄梨。
[0083]内源的：从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物 种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或 cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。
[0084] 表达盒：多核苷酸，其从5'至3'包含，（a)第一个启动子，（b)包含⑴基因或 基因片段的至少一个拷贝或（ii)基因启动子片段的至少一个拷贝的序列，和（c)以与第一 个启动子相反方向排列的终止子或第二个启动子。
[0085] 外源的：关于核酸"外源的"是指，该核酸来源于非植物生物体、或来源于与待转 化的植物不同物种的植物、或来源于与待转化植物不是互交可孕的植物，不属于目标植物 的物种。根据本发明，外源的DNA或RNA代表天然地存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼 或鸟类的遗传组成中，但不天然地存在于待转化的植物中的核酸。因而，外源核酸是编码核 酸，例如，编码不由被转化植物天然地产生的多肽。外源核酸不是必须编码蛋白产物。
[0086] 基因：基因是含有合成产物、多肽链或RNA分子所需的所有信息的DNA分子区段， 其包含编码序列和非编码序列。基因也可以代表多个序列，它们中的每一个可以独立表达， 或可以编码表现出相同功能活性的轻微不同的蛋白。例如，天冬酰胺合成酶1和2基因可 以统一称作一个基因。
[0087] 遗传元件："遗传元件"是任意离散的核苷酸序列，例如、但不限于，启动子，基因， 终止子，内含子，增强子，间隔区，5' -非翻译区，3' -非翻译区，或重组酶识别位点。
[0088] 遗传修饰：通过应用分子和细胞生物学方法，将DNA稳定导入某些生物体的基因 组中。
[0089] 裸子植物：如本文使用的，指具有没有子房的种子的种子植物。裸子植物的实例 包括针叶树，苏铁科植物，银杏，和麻黄。
[0090] 导入：如本文使用的，是指通过包括感染、转染、转化和转导的方法将核酸序列插 入到细胞中。
[0091] 单子叶植物：胚芽具有一个子叶或籽叶的开花植物，平行叶脉，花瓣数是3的倍 数。单子叶植物的实例包括、但不限于，玉米，稻，燕麦，小麦，大麦，和高梁。
[0092] 天然的：从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物种 在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或 cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。
[0093] 天然DNA:从待转化的植物或植物物种的基因组分离的、或从与待转化的植物物 种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的任意核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA 或cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生的。换而言之，天然的遗传元件代表植 物育种者通过经典植物育种来改进植物所可以使用的所有遗传物质。根据本发明，天然核 酸的任何变体也认为是"天然的"。例如，天然DNA可以包含点突变，因为这样的点突变会天 然发生。通过采用限制位点，也可以连接2个不同的天然DNA，因为这样的位点普遍存在于 植物基因组中。
[0094] 天然核酸构建体：包含至少一个天然DNA的多核苷酸。
[0095] 可操作地连接：以这样的方式组合两个或多个分子，从而使它们在植物细胞中以 组合方式适当地起作用。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接 到结构基因。
[0096] 超量表达：基因的表达水平高于在非转基因植物中的水平。
[0097] P-DNA:本发明的植物衍生的转运-DNA( "P-DNA"）边界序列的核苷酸序列不同于 任意已知细菌-衍生的T-DNA边界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是说， P-DNA可以用于将一个多核苷酸转运和整合到另一个多核苷酸中。可以将P-DNA插入肿瘤 诱导质粒，例如替代常规T-DNA的来自农杆菌的Ti-质粒，并维持在细菌株中，正如常规转 化质粒一样。可以操纵P-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通过细菌介导的植物转 化整合到植物基因组中。参见 Rommens 等人，W02003/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455,和W02005/004585,它们都在本文中引作参考。
[0098] 表型：表型是植物的区别特征或特性，通过将一个或多个"需要的多核苷酸"和/ 或筛选/选择标记整合到转化的植物的至少一个植物细胞的基因组中，可以根据本发明改 变表型。"需要的多核苷酸"和/或标记可以赋予转化的植物的表型的变化，这通过修饰转 化的植物细胞或植物整体的许多遗传、分子、生化、生理学、形态学或农学特征或性质中的 任意一种来实现。因而，一个或多个稳定整合的需要的多核苷酸在植物基因组中的表达，会 在植物组织中产生降低的丙烯酰胺浓度的表型。
[0099] 植物组织："植物"是植物界许多光合的、真核的、多细胞生物体中的任一种，其特 征性地生成胚、含有叶绿体且具有纤维素细胞壁。可以根据本发明的方法处理植物的一部 分即"植物组织"，以生产转基因植物。根据本发明可以转化许多合适的植物组织，包括、但 不限于，体细胞胚，花粉，叶，茎，愈伤组织，匍匐茎，微块茎，和芽。因而，本发明预见 到被子植物和裸子植物的转化，所述植物例如小麦，玉米，稻谷，大麦，燕麦，甜菜，马 铃薯，番茄，苜蓿，木薯，甘薯，和大豆。根据本发明，"植物组织"也包括植物细胞。植 物细胞包括悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、 花粉、种子和微孢子。植物组织可以处于各种成熟阶段，可以生长在液体或固体培养基中， 或在土壤中或在罐的合适培养基中、温室或田地中。植物组织也指这样的植物、种子、后代、 繁殖体的任意克隆，无论是有性还是无性产生的，和它们的后代，例如插条或种子。特别感 兴趣的是马铃薯，玉米，和小麦。
[0100] 植物转化和细胞培养：泛指遗传修饰植物细胞，并转移到适合的植物培养基，用于 维持、进一步生长、和/或进一步发育的过程。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。
[0101] 加工：从下述物质生产食品的过程：（1)种子，例如，小麦、玉米、咖啡植物或可可 树的种子，（2)块茎，例如，马铃薯块茎，或（3)根，例如，甘薯和山药的根，包含加热至至少 120°C。加工食品的实例包括面包、早餐谷类、馅饼、蛋糕、土司、饼干、小甜饼、比萨饼、椒盐 卷饼、玉米饼、炸薯条、烤薯条、马铃薯片、薯饼、烘烤的咖啡，和可可。
[0102] 后代：本发明的"后代"，例如转基因植物的后代，是由植物或转基因植物生出的、 产生的或衍生的后代。因而，"后代"植物，即"F1"代植物，是通过本发明的方法生产的转 基因植物的子代或后代。转基因植物的后代可以含有它的至少一个、一些或全部细胞基因 组，通过本文所述的方法将需要的多核苷酸整合到亲本转基因植物的细胞中。因而，需要的 多核苷酸由后代植物"传递"或"遗传"。这样在后代植物中遗传的需要的多核苷酸可以停 留在T-DNA或P-DNA构建体内，后者也可以由后代植物从它的亲本遗传。本文使用的术语 "后代"也可以视作一组植物的子代或后代。
[0103] 启动子：启动子意在指核酸，优选结合RNA聚合酶和/或其它转录调节元件的 DNA。象任意的启动子一样，本发明的启动子会促进或控制DNA或RNA的转录，以从可操作地 连接到启动子上的核酸分子产生mRNA分子。如前所述，产生的RNA可以编码蛋白或多肽， 或可以编码RNA干扰或反义分子。
[0104] 启动子是核酸序列，它使与它相关的基因被转录。在原核生物中，启动子通常由在 基因上游-10和-35位置的2个短序列组成，也就是说，在转录方向上是在基因前面。在-10 位置的序列称作普里布诺盒，通常由6个核苷酸TATAAT组成。普里布诺盒是原核生物开始 转录所必需的。在-35位置的另一个序列通常由6个核苷酸TTGACA组成，它的存在会促进 转录速率。
[0105] 真核启动子是更多样的，因此更难以表征，但是存在某些基本特征。例如，真核启 动子通常位于它们最密切相关的基因的上游。启动子可以具有距离它们的转录起点数千 碱基的调节元件，尽管转录复合物形成的某些三级结构可以造成DNA的折叠，这会使这些 调节元件更接近实际转录位点。许多真核启动子含有"TATA盒"序列，通常用核苷酸序列 TATAAA指示。该元件会结合TATA结合蛋白，它辅助RNA聚合酶转录复合物的形成。TATA 盒通常位于转录起点的50碱基内。
[0106] 真核启动子的特征也在于存在某些调节序列，它们结合参与形成转录复合物的转 录因子。一个实例是序列CACGTG指示的E-盒，它会结合基本的螺旋-环-螺旋家族中的 转录因子。也存在高GC核苷酸含量的区域。
[0107] 因此，根据本发明，可以用于设计本发明的需要的多核苷酸的启动子的部分序列 或特定启动子"片段"，例如天冬酰胺合成酶基因的启动子，可以包含或不包含一个或多个 这样的元件或没有这样的元件。在一个实施方案中，本发明的启动子片段序列不是功能性 的，且不含有TATA盒。
[0108] 本发明的构建体的另一个特征是，它会通过2个相反启动子，促进与或不与终止 子直接可操作地相连的多核苷酸的一个或多个拷贝的趋同转录。由于缺失终止信号，从第 一个和第二个启动子转录的RNA分子集合的长度可以是不同的长度。
[0109] 偶然地，例如，转录机制可能继续转录，越过象征着需要的多核苷酸序列的"末端" 的最后一个核苷酸。因此，在该特定排列中，转录终止可能通过下游序列的微弱的或非预期 作用（例如，促进发夹形成）来发生，或通过位于侧接转运DNA整合位点的植物DNA中的非 预期转录终止子的作用来发生。
[0110] 需要的多核苷酸可以以2个不同的方向连接至启动子上。在一个方向，例如"有 义"方向，得到的RNA转录物的至少5' -部分与至少一种靶转录物的至少一部分具有序列 同一性。在指定为"反义"的另一个方向，预测转录物的至少5'-部分与至少一种靶转录物 的反向互补序列的至少一部分相同或同源。
[0111] 植物启动子是能启动在植物细胞中的转录的启动子，无论它的起源是否是植物细 胞。示例性植物启动子包括、但不限于，从包含要在植物细胞中表达的基因的植物、植物病 毒和细菌（例如农杆菌或根瘤菌）得到的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括，优 先启动在某些组织（例如木质部，叶，根，或种子）中的转录的启动子。这样的启动子称 作组织优选的启动子。仅启动在某些组织中的转录的启动子称作组织特异性的启动子。细 胞类型特异性的启动子主要驱动在一个或多个器官的某些细胞类型（例如，根或叶中的维 管细胞）中的表达。诱导型或抑制型启动子是在环境控制下的启动子。可能影响诱导型启 动子的转录的环境条件的实例包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞 类型特异性的和诱导型的启动子构成非组成型启动子的类型。组成型启动子是在大多数环 境条件下和在大多数植物部分中有活性的启动子。
[0112] 多核苷酸是核苷酸序列，其包含基因编码序列或其片段（包含至少15个连续核苷 酸，优选至少30个连续核苷酸，和更优选至少50个连续核苷酸），启动子，内含子，增 强子区域，聚腺苷酸化位点，翻译起始位点，5'或3'非翻译区，报道基因，选择标记等。 多核苷酸可以包含单链或双链DNA或RNA。多核苷酸可以包含修饰的碱基或修饰的主链。 多核苷酸可以是基因组的、RNA转录物（例如mRNA)或加工过的核苷酸序列（例如cDNA)。 多核苷酸可以包含有义或反义方向的序列。
[0113] 分离的多核苷酸是并非处于它的天然状态的多核苷酸序列，例如，该多核苷酸包 含天然不存在的核苷酸序列，或该多核苷酸与它通常接近的核苷酸序列分离，或接近与它 通常不接近的核苷酸序列。
[0114] 种子："种子"可以视作含有胚的成熟的植物胚珠，和植物的繁殖部分，作为块茎或 孢子。种子可以在农杆菌介导的转化之前在黑暗中温育，例如，以促进萌芽。种子也可以在 温育前灭菌，例如通过用漂白剂简单处理。得到的幼苗然后可以暴露于目标农杆菌菌株。
[0115] 选择/筛选标记：在植物或植物组织中表达时，可以将它们与不表达该基因的其 它植物或植物组织区分开的基因。筛选操作可能需要测定由筛选标记基因编码的蛋白的表 达。选择标记的实例包括编码卡那霉素和遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶（NptII)基 因，编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶（HptII)基因，或其他本领域已知的类似基因。
[0116] 感官特征：专业训练的个体组可以评定食品的感官特征，例如外观，风味，香气， 和质地。在实施例4中，描述了从Rl和磷酰酶-L基因表达水平下调的块茎得到的炸薯条 的等级。从实施例5所述的块茎得到的炸薯条也表现出增强的感官特征。因而，本发明预 见到，提高从已经根据本发明修饰的植物得到的植物产品的感官特征，以操纵它的天冬酰 胺生物合成和代谢途径。
[0117] 序列同一性：在2个核酸或多肽序列的情况下，本文使用的"序列同一性"或"同 一性"包括，当进行比对以得到指定区域上的最大相应性时，2个序列中相同的残基。当 序列同一性百分比用于指蛋白时，认识到不相同的残基位置的差别经常在于保守氨基酸 置换，其中将氨基酸残基置换为具有类似化学性质（例如电荷或疏水性）的其它氨基酸 残基，因此不会改变分子的功能性质。当序列的差异在于保守置换时，可以向上调节序列 同一性百分比，以校正置换的保守性质。差异在于这样的保守置换的序列，被描述为具有 "序列相似性"或"相似性"。进行该调节的方法，是本领域技术人员众所周知的。通常， 这包含，将保守置换评定为部分的、而不是完全的错配，从而增加序列同一性百分比。因 而，例如，当为相同的氨基酸给出1分、且为非保守置换给出〇分时，为保守置换给出〇 至1之间的分数。计算保守置换的评分，例如，根据Meyers和Miller的算法，Computer Applic. Biol. Sci.，4:1117 (1988)例如，在程序 PC/ 基因（Intelligenetics, Mountain View, California, USA)中实现。
[0118] 如本文使用的，序列同一性百分比是指通过在对比窗中对比2个最优比对的序列 而确定的值，其中多核苷酸序列在对比窗中的部分可以相对于用于2个序列的最优比对的 参照序列（它不包含添加或缺失）包含添加或缺失（即，空位）。如下计算百分比：通过测 定2个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以确定匹配位置的数目，将 匹配位置的数目除以对比窗中的位置总数，并将结果乘以100,以确定序列同一性百分比。
[0119] "序列同一性"具有本领域公知的含义，且可以使用公开的技术来计算。参见 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,编（Oxford University Press,1988) ,BI0C0MP UTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith,编（Academic Press,1993) ,COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,PART I,Griffin&Griffin,编·， （Humana Press,1994) ,SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed·，Academic Press(1987)，SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gr ibskov&Devereux，编.（Macmillan Stockton Press, 1991)，和 Carillo&Lipton, SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)。经 常用于测定2个序列之间的同一性或相似性的方法包括、但不限于在⑶IDE TO HUGE COMPUTERS, Bishop, ed.，（Academic Press, 1994)和上面 Carillo&Lipton 中公开的方法。 测定同一性和相似性的方法可以编译成计算机程序。测定2个序列之间的同一性和相似性 的优选计算机程序包括、但不限于GCG程序包（Devereux等人，Nucleic Acids Research 12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul 等人，J.Mol.Biol.215:403(1990))，和 FASTDB (Brutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6:237 (1990)) 〇
[0120] 沉默：基因或基因片段从启动子向终止子的单向的和不受干扰的转录，可以触发 靶基因的转录后沉默。植物中转录后基因沉默的起始表达盒包含以反义（McCormick等 人，美国专利6617496;Shewmaker等人，美国专利5107065)或有义（van der Krol等 人，Plant细胞2:291-299, 1990)方向位于转录起始和终止的调节序列之间的单个基因片 段。在拟南芥中，依赖于RNA的RNA聚合酶对得到的转录物的识别，会导致双链（ds) RNA的 生成。Dicer-样（Del)蛋白例如Dcl4对该dsRNA的切割，会产生21个核苷酸（nt)的小干 扰RNA (siRNA)。这些siRNA与包含Argonaute (Ago)家族成员在内的蛋白络合，生成RNA-诱 导的沉默复合物（RISC)。RISC然后靶向同源RNA，进行核酸内切。
[0121] 更有效的沉默构建体含有有义和反义组分，生成折叠成发夹结构的RNA分子 (Waterhouse 等人，Proc Natl Acad Sci U S A 95:13959-13964,1998)。推断反向重复序 列转基因的表达生成的高dsRNA水平会促进多个Dcl的活性。拟南芥中组合Dcl敲除的分 析，支持了该理论，也将Dcl4鉴别为参与RNA切割的蛋白之一。
[0122] 基于常规有义、反义和双链（ds)RNA的基因沉默构建体的一种组分是转录终止 子。WO 2006/036739证实，当基因片段位于2个方向相反且有功能活性的启动子之间时，该 调节元件变得退化。得到的趋同转录会触发至少象单向"启动子-至-终止子"转录一样 有效的基因沉默。除了短的各种大小且未聚腺苷酸化的RNA以外，无终止子的盒生成罕见 的更长的转录物，它到达侧接启动子中。用启动子-衍生的序列替代基因片段，会进一步增 加基因沉默的程度。
[0123] 在本发明的一个优选实施方案中，需要的多核苷酸包含靶基因启动子的部分序列 或与靶基因启动子的一部分具有序列同一性的部分序列。因此，本发明的需要的多核苷酸 含有感兴趣的特定靶基因启动子的特异性片段。
[0124] 需要的多核苷酸可以可操作地连接到一个或多个功能启动子上。本发明考虑的不 同构建体包括，但不限于：（1)构建体，其中所述需要的多核苷酸包含一个或多个启动子片 段序列，且在两端可操作地连接到功能性"驱动"启动子上。这2个功能性启动子以趋同方 向排列，以便转录需要的多核苷酸的每条链；（2)构建体，其中所述需要的多核苷酸在它的 5' -末端或它的3' -末端可操作地连接一个功能性启动子，且所述需要的多核苷酸也在它 的非启动子末端可操作地连接功能性终止子序列；(3)构建体，其中所述需要的多核苷酸 在它的5' -末端或它的3' -末端可操作地连接一个功能性启动子，但是其中所述需要的多 核苷酸没有可操作地连接终止子；或（4)盒，其中所述需要的多核苷酸包含一个或多个启 动子片段序列，但是没有可操作地连接任意功能性启动子或终止子。
[0125] 因此，本发明的构建体可以包含2个或多个"驱动"启动子，其侧接一个或多个需 要的多核苷酸或其侧接需要的多核苷酸的拷贝，以便使需要的多核苷酸的2条链进行转 录。也就是说，一个启动子可以定向，以便启动需要的多核苷酸的5' -末端的转录，而第二 个启动子可以可操作地定向，以便启动相同的需要的多核苷酸的3' -末端的转录。相反方 向的启动子可以侧接需要的多核苷酸的多个拷贝。因此，"拷贝数"可以变化，使得构建体可 以包含需要的多核苷酸的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 或超 过100个拷贝，或其间的任意整数，其可以侧接定向的'驱动'启动子，以便诱导趋同转录。
[0126] 如果2个盒都不包含终止子序列，则这样的构建体由于趋同转录排列，可以生成 不同长度的RNA转录物。
[0127] 因此，在该情况下，可能存在部分或完全转录的RNA转录物的亚群，所述RNA转录 物包含从各个盒转录的需要的多核苷酸的部分或全长序列。或者，在没有功能性终止子的 情况下，转录机制可以前进超过需要的多核苷酸末端，以生成比需要的多核苷酸的长度更 长的转录物。
[0128] 因此，在包含需要的多核苷酸的2个拷贝的构建体中，其中一个多核苷酸可以是 彼此以方向互补方向定向或不是如此，且其中多核苷酸可操作地连接到启动子上以诱导趋 同转录，且在构建体中没有功能性终止子，从一个需要的多核苷酸启动的转录机制可以继 续转录需要的多核苷酸的其它拷贝，反之亦然。需要的多核苷酸的多个拷贝可以以不同的 排列定向：在构建体中存在需要的多核苷酸的2个拷贝的情况下，这些拷贝可以是例如以 相同方向定向、彼此相反的方向，或彼此反向互补的方向。
[0129] 在一个需要的多核苷酸与另一个多核苷酸以方向互补方向进行定向的排列中，可 以生成RNA转录物，其不仅包含第一多核苷酸的"有义"序列，而且包含来自第二多核苷酸 的"反义"序列。如果第一和第二多核苷酸包含相同的或基本上相同的DNA序列，则单个RNA 转录物可以包含彼此互补的2个区域，且它们因此可以退火。因此，这样转录的单个RNA转 录物可以形成部分或完全的发夹双链体结构。
[0130] 另一方面，如果生成这样一个长转录物的2个拷贝，一个来自一个启动子，则将存 在2个RNA分子，其中的每个具有彼此序列互补的区域。因此，第一个RNA转录物的"有义" 区域可以退火于第二个RNA转录物的"反义"区域，反之亦然。因此，在该排列中，可以形成 另一个RNA双链体，其由2个分开的RNA转录物组成，这不同于形成自单个自互补的RNA转 录物的发夹双链体。
[0131] 或者，需要的多核苷酸的2个拷贝可以是相同的方向，以便在转录连读的情况下， 从一个启动子生成的长RNA转录物可以包含，例如，需要的多核苷酸的第一个拷贝的有义 序列，和需要的多核苷酸的第二个拷贝的有义序列。因此，从另一个趋同方向的启动子生成 的RNA转录物可以包含需要的多核苷酸的第二个拷贝的有义序列，和第一多核苷酸的反义 序列。因此，可能两个RNA转录物都不含有精确互补的区域，因此，可能两个RNA转录物都 不折叠到自身上，生成发夹结构。另一方面，2个单独的RNA转录物可以彼此杂交和退火，形 成RNA双链体。
[0132] 因此，在一个方面，本发明提供了构建体，其缺少终止子或缺少前面有自我剪接核 酶编码DNA区域的终止子，但是其包含可操作地连接到需要的多核苷酸上的第一个启动 子。
[0133] 组织：用于生产食品的植物的任意部分。组织可以是马铃薯块茎，甘薯根，或玉 米植物种子。
[0134] 转录终止子：本发明的表达载体一般在转录起始调节区的相反末端具有转录终止 区。可以选择转录终止区，用来稳定mRNA以增加表达和/或用于将聚腺苷酸尾部添加到基 因转录产物。当3个肽链终止密码子中的任一个进入核糖体上的位点时，新生多肽的翻译 会发生终止。翻译终止密码子是UAA，UAG，和UGA。
[0135] 在本发明中，转录终止子源自基因，或更优选地，源自不代表基因、但是代表基因 间DNA的序列。例如，可以使用来自马铃薯泛素基因的终止子序列，且描述在SEQ ID N0:5 中。
[0136] 转运DNA (T-DNA):转运DNA是由T-DNA边界或P-DNA边界描绘的DNA区段，分别 建立T-DNA或P-DNA。T-DNA是一种遗传元件，众所周知它是能将包含在它的边界内的核苷 酸序列整合到另一个基因组中的元件。在这方面，T-DNA通常侧接2个"边界"序列。本发 明的需要的多核苷酸和选择标记可以位于T-DNA的左边界样序列和右边界样序列之间。包 含在T-DNA内的需要的多核苷酸和选择标记可以可操作地连接许多不同的、植物特异性的 (即，天然的）或外源的核酸，如促进它的表达的启动子和终止子调节元件，所述表达即由 需要的多核苷酸或选择标记编码的DNA序列的转录和/或翻译。
[0137] 植物细胞的转化：将核酸稳定地插入植物细胞的基因组中的过程。转化可以在天 然的或人工的条件下利用本领域公知的各种方法来进行。转化可以依靠任何已知的方法， 来将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中，包括农杆菌介导的转化方案如'精制转化'或 '精确育种'、病毒感染、噬菌体颈须（whishkers)、电穿孔、显微注射、聚乙二醇处理、热激、 脂转染和粒子轰击。
[0138] 转基因植物：本发明的转基因植物是包含至少一个其中已经稳定整合了外源核 酸的细胞基因组的植物。根据本发明，转基因植物是包含仅一个遗传修饰的细胞和细胞基 因组的植物，或包含一些遗传修饰的细胞的植物，或其中所有细胞都被遗传修饰的植物。本 发明的转基因植物可以是仅在该植物的某些部分中表达需要的多核苷酸（即，外源核酸） 的植物。因而，转基因植物可以仅在它的结构的某些部分中含有遗传修饰的细胞。
[0139] 变体：本文使用的"变体"被理解为是指与标准的或给定的特定基因或蛋白的核苷 酸或氨基酸序列有区别的核苷酸或氨基酸序列。术语"异构体""同种型"和"类似物"也是 指核苷酸或氨基酸序列的"变体"形式。通过添加、去除或取代一个或多个氨基酸而改变的 氨基酸序列，或在核苷酸序列中的变化，可被认为是"变体"序列。变体可具有"保守性"变 化，其中被取代的氨基酸具有类似的结构或化学性质，例如，用异亮氨酸替换亮氨酸。变体 也可具有"非保守性"变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的较小的变异也可包括氨基酸 缺失或插入，或二者。利用本领域公知的计算机程序，例如Vector NTI Suite (InforMax， MD)软件，可以获得在确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失方面的指导。"变体"也 可以指"改组基因"，例如在Maxygen的专利中所述的那些。
[0140] 应当理解，本发明不限于在此描述的特定方法、方案、载体和试剂等，这些都可以 变化。还需要理解的是，本文使用的专有名词仅用于描述特定实施方式的目的，不意在限制 本发明的范围。必须指出，本文使用的和在附随的权利要求中，单数形式"一个"、"一种"和 "该"包括复数的引用，除非上下文中另有明显的指示。因而，例如，提及"一个基因"是指一 个或多个基因，包括本领域技术人员公知的其等同方案等。实际上，本领域技术人员可以使 用在此描述的方法来在植物宿主系统中表达任何天然的基因（目前或后来知道的）。
[0141] 多核苷酸序列
[0142] 本发明涉及分离的核酸分子，其包含具有选自下述任意多核苷酸序列的序列 的多核苷酸：SEQ ID N0:l，2,3,4,9，10，14，15,23,24,或 25。本发明也提供了 SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25的多核苷酸序列的功能性片段。本发明还提供了与 SEQ ID勵:1，2,3,4,9，10，14，15,23,24，或25中的任意多核苷酸序列互补的核酸或其片 段，以及核酸，其包含至少15个连续碱基，且与SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或 25中的任意多核苷酸序列杂交。
[0143] "分离的"核酸分子是指已经从它的天然环境取出的核酸分子，即DNA或RNA。例 如，包含在DNA构建体中的重组DNA分子被认为出于本发明的目的而分离。分离的DNA分子 的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或在溶液中的（部分地或基本上） 纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录物。根据本发明 的分离的核酸分子还包括合成生产的这样的分子。
[0144] 本发明的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA，或DNA的形式，包括，例如，通 过克隆或合成生产的cDNA和基因组DNA。DNA或RNA可以是双链的或单链的。单链DNA可 以是编码链，也称作有义链，或它可以是非编码链，也称作反义链。
[0145] 除非另有说明，通过使用自动化DNA测序仪（例如来自Applied Biosystems, Inc 的373型）测定本文DNA分子的序列，确定所有核苷酸序列。因此，如本领域已知的，对于 通过该自动化方案测定的任意DNA序列，本文测定的任意核苷酸序列可以含有一些错误。 自动化测定的核苷酸序列通常与测序的DNA分子的实际核苷酸序列具有至少约95%同一 性，更通常至少约96% -至少约99. 9%同一性。通过其它方案，包括本领域众所周知的手 工DNA测序方法，可以更精确地测定实际序列。也如本领域已知的，测定的核苷酸序列相对 于实际序列的单个插入或缺失，会造成核苷酸序列翻译中的移码，使得由测定的核苷酸序 列编码的预测氨基酸序列从这样的插入或缺失点开始，可能完全不同于由测序的DNA分子 实际编码的氨基酸序列。
[0146] 本文所述的每个"核苷酸序列"都表示为脱氧核糖核苷酸（缩写为A，G，C和T)的 序列。但是，核酸分子或多核苷酸的"核苷酸序列"是指，对于DNA分子或多核苷酸而言，是 脱氧核糖核苷酸序列，对于RNA分子或多核苷酸而言，是核糖核苷酸（A，G，C和U)的对应序 列，其中在指定的脱氧核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核苷酸（T)被替换为核糖核苷酸尿苷 ⑶。
[0147] 本发明也涉及本文所述分离的核酸分子的片段。优选地，DNA片段的长度包含至 少15个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，它们可用作诊断探针 和引物。当然，最高达本发明核酸分子的整个长度的更大核酸片段也可以根据常规杂交 技术在诊断上用作探针，或用作通过聚合酶链式反应（PCR)扩增靶序列的引物，如例如在 Molecular Cloning，A Laboratory Manual,第 3 版，Sambrook&Russel.编，（2001) ,Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述，它的整个公开内容在本文中引作参考。长度是 至少20个核苷酸的片段是指，例如，包括20或更多个来自SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21的核 苷酸序列的连续碱基的片段。使用技术人员熟知的DNA合成的常规方法，可以产生含有在 SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21中列出的核苷酸序列的核酸。例如，限制内切核酸酶切割或声处 理剪切，可以容易地用于产生不同大小的片段。或者，根据已知的技术，可以合成地制备本 发明的DNA片段。
[0148] 在另一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含可在严格杂交条件下与上 述本发明的核酸分子的多核苷酸的一部分杂交的多核苷酸。与多核苷酸的"一部分"杂交 的多核苷酸是指，与参照多核苷酸的至少约15个核苷酸、更优选至少约20个核苷酸、更优 选至少约30个核苷酸、甚至更优选超过30个核苷酸杂交的多核苷酸（DNA或RNA)。这些与 参照片段杂交的片段可以用作诊断探针和引物。本文使用的探针定义为，SEQ ID N0:l-230 所述核酸序列之一的至少约100个连续碱基。为了本发明的目的，当在6X SSC、0. 5% SDS、 5X Denhardt溶液和100 μ g非特异性载体DNA的杂交溶液中形成双链复合物时，2个序列 杂交。参见Ausubel等人，2. 9部分，增补27 (1994)。序列可以在"中等严格性"杂交，所 述"中等严格性"定义为60°C的温度，在6X SSC、0. 5% SDS、5X Denhardt溶液和100 μ g非 特异性载体DNA的杂交溶液中。对于"高严格性"杂交，温度升高至68°C。在中等严格性 杂交反应后，在室温在2X SSC+0. 05% SDS的溶液中洗涤核苷酸5次，随后在60°C用0.1 X 35〇+0.1%303洗涤111。对于高严格性，洗涤温度升高至68°〇。为了本发明的目的，杂交的 核苷酸是使用Ing具有10, OOOcpm/ng比放射性的放射标记的探针检测的核苷酸，其中杂交 的核苷酸在70°C曝光于X-线胶片不超过72小时后可以清楚地看到。
[0149] 本发明涉及这样的核酸分子，其与SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21所述的核酸序列具 有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一 性。但是，优选的是与SEQ ID NO: 1，2, 17, 20, 21中的任一个所述的核酸序列具有至少95%、 96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸分子。2个核酸序列之间的差异可以发生在参 照核苷酸序列的5'或3'末端位置，或这些末端位置之间的任意位置，单个地散布在参照序 列的核苷酸中或参照序列的一个或多个连续基团中。
[0150] 作为实践物质，任意特定核酸分子与参照核苷酸序列是否具有至少95%、96%、 97%、98%或99%同一性是指，使用本领域众所周知的标准算法，在2个分子之间对比， 且可以使用可公开得到的计算机程序例如BLASTN算法来常规地测定。参见Altschul等 人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)。
[0151] 序列分析
[0152] 为对比目的而比对序列的方法是本领域众所周知的。通过下述算法可以为对比 目的而进行序列的最优比对：Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同 源性算法；Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比对算法；Pearson 和Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988)的相似性检索方法；这些算法的计算机化 执行，包括，但不限于：Intelligenetics，Mountain View，Cal ifornia 的 PC/基因程序中 的 CLUSTAL ;Wisconsin Genetics 软件包，Genetics Computer Group(GCG), 575Science Dr.，Madison, Wiscons in, USA 中的 GAP, BESTFIT, BLAST、FASTA 和 TFASTA ;所述 CLUSTAL 程序详细记载在 Higgins 和 Sharp,基因 73:237244 (1988) ;Higgins 和 Sharp, CABIOS 5:151153(1989) ;Corpet,等人，Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988) ;Huang， 等人，Computer Applications in the Biosciences 8:155-65(1992)，和 Pearson,等 人，Methods in Molecular Biology 24:307-331(1994)。
[0153] 可以用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括：针对核苷酸数据库序 列的核苷酸查询序列的BLASTN ;针对蛋白数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX ; 针对蛋白数据库序列的蛋白查询序列的BLASTP ;针对核苷酸数据库序列的蛋白查 询序列的TBLASTN ;和针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见， Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel,等人，Eds. , Greene Publishing 和 Wiley_Interscience，New York(1995) ;Altschul 等人，J. Mol. Biol·, 215:403-410(1990);和，Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)。
[0154] 用于进行BLAST分析的软件可公开得到，例如，通过国家生物技术信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。该算法包含，首先识别高评分序列对（HSP)，这通过识 别查询序列中的长度W的短字来实现，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或 满足一些正值的阈值评分T。T称作邻域字评分阈值。这些起始邻域字命中作为启动检索的 种子，所述检索会发现含有它们的更长的HSP。所述字命中然后沿着每个序列向两个方向延 伸，远至可以增加累积比对评分。如下计算累积评分：对于核苷酸序列，使用参数M(-对匹 配残基的奖励分；总是>〇)和N(错配残基的罚分；总是〈0)。对于氨基酸序列，使用评分矩 阵来计算累积评分。在下述情况时，停止每个方向的字命中延伸：累积比对评分从它的最大 达到值下降X ;累积评分达到O或以下，这归因于一个或多个负评分的残基比对的积累；或 达到任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程 序（对于核苷酸序列）使用的缺省值是，字长（W)为11，期望值（E)为10,截止值为100, M =5，N = -4,和2条链的对比。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是，字长（W)为 3,期望值（E)为 10，BL0SUM62 评分矩阵（SMHenikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 89:10915)。
[0155] 除了计算序列同一性百分比以外，BLAST算法也进行2个序列之间的相似性的统 计分析（参见，例如，Karlin&Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5877(1993))。 BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总概率（P (N))，它指示着2个核苷酸或氨基酸 序列之间随机发生匹配的概率。
[0156] 使用 CLUSTAL 比对方法（Higgins 和 Sharp(1989)CABI0S. 5:151153)，利用缺省 参数（GAP PENALTY =10, GAP LENGTH PENALTY =10)，可以进行序列的多种比对。使 用CLUSTAL方法的逐对比对的缺省参数是KTUPLE I，GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5和 DIAGONALS SAVED = 5〇
[0157] 下述运行参数优选地用于使用BLASTN测定比对和相似性，这导致多核苷酸序列 的 E 值和百分比同一性：Unix 运行命令：blastall-p blastn-d embldb-e 10 - G〇-E〇-r 1-v 30-b 30-i queryseq - o results ;参数是：-p程序名[字符串];-d数据库[字符 串];_e期望值（E)[实数];-G打开间隙的成本（零调用缺省行为）[整数];-E延伸空位 的成本（零调用缺省行为）[整数];- r核苷酸匹配的奖励（仅blastn)[整数];-V -行描 述的数目（V)[整数];_b显示的比对的数目（B)[整数];-i查询文件[文件输入];和-〇 BLAST报告输出文件[文件输出]任选的。
[0158] 由BLASTN、FASTA、BLASTP或类似算法生成的查询序列对一个或多个数据库序列 的"命中"，会比对和识别序列的类似部分。命中按照相似性程度和序列重叠的长度的顺序 来排列。数据库序列的命中通常代表在查询序列的仅一部分序列长度上的重叠。
[0159] BLASTN, FASTA和BLASTP算法也生成比对的"期望"值。期望值（E)指示着当检索 某些大小的数据库时，可以"期望"随机看到的对某些数目的连续序列的命中数目。期望值 用作确定对数据库（例如优选的EMBL数据库）的命中是否指示真实相似性的显著性阈值。 例如，指定给多核苷酸命中的〇. IE值被解释为是指，在EMBL数据库大小的数据库中，可能 期望到看到在比对的序列部分的0. 1匹配，仅仅随机地具有类似评分。通过该标准，多核苷 酸序列的比对的和匹配的部分则具有90%的概率是相同的。对于在比对的和匹配的部分具 有0. 01或更小的E值的序列，使用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库中随机发现匹配的 概率是1 %或更小。
[0160] 根据一个实施方案，"变体"多核苷酸，参考本发明的每个多核苷酸，优选地包含 具有与本发明的每个多核苷酸相同数目或比其更少的核酸、并且与本发明的多核苷酸比较 时，生成0. 01或更小的E值。也就是说，变体多核苷酸是具有至少99%概率与本发明多核 苷酸相同的任意序列，使用设定为上述参数的BLASTN、FASTA或BLASTP算法测得具有0. 01 或更小的E值。
[0161] 或者，本发明的变体多核苷酸会在严格条件下与SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或这些序列的互补序列、反向 序列或反向互补序列杂交。
[0162] 本发明也包括不同于公开的序列的多核苷酸，但是作为遗传密码简并的结果，其 编码与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的多肽。因而，作为保守取代的结果，本发明预 见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸 序列或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列的多核苷酸。另外，作为缺失和 /或插入总计小于10%总序列长度的结果，本发明也预见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或它们的互补序列、反向互补 序列或反向序列的序列的多核苷酸。
[0163] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，变体多核苷酸优选 地具有与本发明的多核苷酸共有的其它结构和/或功能特征。除了它们的一级结构与本 发明的多核苷酸具有高度的相似性以外，与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能 与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地具有至少一种下述特征：（i)它们含有读码 框或部分读码框，其编码基本上具有与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的功能性质的多 肽；或（ii)它们具有共同的结构域。
[0164] 元件和DNA序列的来源
[0165] 本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一个或多个植物基因组内源的。因 此，在本发明的一个具体实施方案中，为最终的转运盒选择的所有元件和DNA序列都是待 转化的植物的基因组内源的或天然的。例如，所有序列可以来自马铃薯基因组。或者，一个 或多个元件或DNA序列可以是与待转化的植物物种不同的植物基因组内源的，但是其可以 在任意情况下在宿主植物细胞中起作用。这样的植物包括马铃薯，番茄，和苜蓿植物。本 发明也包括使用一个或多个来自与待转化的植物互交可孕的植物的遗传元件。
[0166] 在这点上，本发明的"植物"包括、但不限于，马铃薯，番茄，鳄梨，苜蓿，甜菜， 木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麦，稻，大麦，和高梁。因而，植物可以是单 子叶植物或双子叶植物。"植物"和"植物材料"也包括植物细胞，种子，植物后代，繁殖 体，无论是有性还是无性产生的，和它们中的任一种的子代，例如插条或种子。"植物材料" 可以是指植物细胞，细胞悬浮培养物，愈伤组织，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶， 根，芽，配子体，孢子体，花粉，种子，正在发芽的幼苗，和微孢子。植物可以处于各种 成熟阶段，可以生长在液体或固体培养物中，或罐中的土壤或合适的培养基中、温室或田地 中。导入植物中的先导序列、尾随序列或基因序列的表达可以是暂时的或永久的。
[0167] 在这方面，本发明的植物衍生的转运-DNA("P_DNA"）边界序列的核苷酸序列不同 于任意已知细菌-衍生的T-DNA边界序列，但是它的功能用于基本上相同的目的。也就是 说，P-DNA可以用于将一个多核苷酸转运和整合到另一个多核苷酸中。可以将P-DNA插入 肿瘤诱导质粒，例如替代常规T-DNA的来自农杆菌的Ti-质粒，并维持在细菌株中，正如常 规转化质粒一样。可以操纵P-DNA，以便含有需要的多核苷酸，后者用于通过细菌介导的植 物转化掺入植物基因组中。参见Rommens等人TO2003/069980, US-2003-0221213, US-2004 -0107455,和W02005/004585,它们都在本文中引作参考。
[0168] 因而，P-DNA边界序列与来自农杆菌物种（例如根癌农杆菌或发根农杆菌）的已 知 T-DNA 边界序列相差 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,或更多 个核苷酸。
[0169] P-DNA边界序列的核苷酸序列与农杆菌T-DNA边界序列的相似性不大于99 %、 98 %,97 %,96 %,95 %,94 %,93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %, 83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %, 68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %,62 %,61 %,60 %,59 %,58 %,57 %,56 %,55 %,54 %, 53%、52%、51%或 50%。
[0170] 开发了鉴别和分离来自植物（尤其是马铃薯和小麦）的转运DNA的方法，和使用 在本文中引作参考的US-2004-0107455中所述的边界基序共有序列。
[0171] 在这方面，本发明的植物衍生的DNA、例如任一种本文公开的序列、切割位点、区 域或元件是功能性的，如果它能促进它所连接的多核苷酸向另一个核酸分子（例如植物染 色体）中的转运和整合，转化频率是约99%、约98%、约97%、约96%、约95%、约94%、 约 93 %、约 92 %、约 91 %、约 90 %、约 89 %、约 88 %、约 87 %、约 86 %、约 85 %、约 84 %、 约 83 %、约 82 %、约 81 %、约 80 %、约 79 %、约 78 %、约 77 %、约 76 %、约 75 %、约 74 %、 约 73 %、约 72 %、约 71 %、约 70 %、约 69 %、约 68 %、约 67 %、约 66 %、约 65 %、约 64 %、 约 63 %、约 62 %、约 61 %、约 60 %、约 59 %、约 58 %、约 57 %、约 56 %、约 55 %、约 54 %、 约 53 %、约 52 %、约 51 %、约 50 %、约 49 %、约 48 %、约 47 %、约 46 %、约 45 %、约 44 %、 约 43 %、约 42 %、约 41 %、约 40 %、约 39 %、约 38 %、约 37 %、约 36 %、约 35 %、约 34 %、 约 33%、约 32%、约 31%、约 30%、约 29%、约 28%、约 27%、约 26%、约 25%、约 24%、约 23%、约22%、约21%、约20%、约15%，或约5%或至少约1%。
[0172] 可以修饰或突变任一种这样的转化相关的序列和元件，以改变转化效率。可以将 其它多核苷酸序列添加到本发明的转化序列上。例如，可以修饰它以具有5'-和3'-多克 隆位点或其它限制位点。例如，可以修饰本文公开的切割位点的序列，以增加来自附随载体 的主链DNA不整合到植物基因组中的概率。
[0173] 可以将任意的需要的多核苷酸插入本文所述的任意切割或边界序列之间。例如， 需要的多核苷酸可以是植物物种天然的野生型或修饰的基因，或它可以是来自非植物基因 组的基因。例如，当转化马铃薯植物时，可以制备包含可操作地连接到目标马铃薯基因或其 片段上的马铃薯特异性启动子和马铃薯特异性终止子的表达盒。表达盒可以含有其它马铃 薯遗传元件，例如与基因的5' -末端符合读码框地融合的信号肽序列，和马铃薯转录增强 子。本发明不限于这样的排列，可以构建转化盒，使得需要的多核苷酸尽管可操作地连接到 启动子上，但不会可操作地连接到终止子序列上。
[0174] 当从植物鉴定和分离转化-相关的序列或元件（例如本文所述的那些）时，且如 果该序列或元件随后用于转化相同物种的植物，该序列或元件可以描述为所述植物基因组 "天然的"。
[0175] 因而，"天然的"遗传元件是指天然存在于、源自或属于待转化植物的基因组的核 酸。以相同的脉络，术语"内源"也可以用于鉴别植物"天然的"特定核酸，例如，DNA或 RNA，或蛋白。内源是指起源自该生物体的元件。因而，从待转化的植物或植物物种的基因 组分离的、或从与待转化的植物物种在性别上相容或互交可孕的植物或物种分离的任意的 核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，对于所述植物物种是"天然的"，即天生 的。换而言之，天然的遗传元件代表植物育种者可用于通过经典植物培育来改良植物的所 有遗传物质。根据本发明，天然核酸的任意变体也视作"天然的"。在这方面，"天然"核酸也 可以分离自植物或其性别相容的物种，并经修饰或突变，使得得到的变体的核苷酸序列与 从植物分离的未修饰的天然核酸的相似性大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、 93 %,92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %, 78 %,77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %, 63%、62%、61%，或60%。天然核酸变体的核苷酸序列的相似性也可以小于约60%、小于 约55 %或小于约50%。
[0176] 从植物分离的"天然"核酸也可以编码从该核酸转录和翻译的天然存在的蛋白产 物的变体。因而，天然核酸可以编码这样的蛋白，它与在分离核酸的植物中表达的未修饰 的天然蛋白的氨基酸序列的相似性大于或等于99 %、98 %、97 %、96 %、95 %、94 %、93 %、 92 %,91 %,90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %, 77 %,76 %,75 %,74 %,73 %,72 %,71 %,70 %,69 %,68 %,67 %,66 %,65 %,64 %,63 %, 62%、61%，或 60%。
[0177] 启动子
[0178] 本发明的多核苷酸可以用于特异性地指导多肽或蛋白在植物组织中的表达。本 发明的核酸也可以用于特异性地指导反义RNA或参与RNA干扰（RNAi)的RNA例如小干扰 RNA(SiRNA)在植物组织中的表达，其可以用于抑制或完全阻断靶基因的表达。如本文使用 的，"编码产物"是指可操作地连接到启动子上的核酸的最终产物。例如，蛋白或多肽是编码 产物，以及反义RNA或siRNA，它是编码反义RNA的核酸的最终产物。编码产物也可以是未 翻译的mRNA。术语多肽和蛋白在本文中可互换地使用。如本文所使用的，启动子是指核酸， 优选结合RNA聚合酶和/或其它转录调节元件的DNA。象任意的启动子一样，本发明的启动 子会促进或控制DNA或RNA的转录，以从可操作地连接到启动子上的核酸分子产生mRNA分 子。RNA可以编码蛋白或多肽，或可以编码RNA干扰或反义分子。如本文使用的，"可操作 地连接到"是指DNA的化学融合、连接或合成，使得启动子-核酸序列组合以适合将所述核 酸序列转录成RNA区段的方向形成。本发明的启动子也可以含有得到的mRNA转录物的一 些或所有5'非翻译区（5'UTR)。另一方面，本发明的启动子不一定需要具有任何5'UTR。
[0179] 本文使用的启动子也可以包括调节元件。相反地，调节元件也可以与启动子分开。 调节元件会将许多重要特征赋予给启动子区域。有些元件会结合转录因子，后者增强可操 作地连接的核酸的转录速率。其它元件会结合抑制转录活性的阻抑物。转录因子对启动子 活性的影响，可能决定启动子活性是高还是低，即所述启动子是"强"还是"弱"。
[0180] 在另一个实施方案中，组成型启动子可以用于表达本发明的多核苷酸序列。
[0181] 在另一个实施方案中，许多诱导型植物基因启动子可以用于表达本发明的多核苷 酸序列。诱导型启动子会调节反应于环境、激素或化学信号的基因表达。激素诱导型启动 子的实例包括植物生长素诱导型启动子（Baumann等人，Plant Cell 11:323-334(1999))， 细胞分裂素诱导型启动子（Guevara-Garcia Plant Mol. Biol. 38:743-753(1998))，和赤霉 素反应性性启动子（Shi等人，Plant Mol.Biol.38:1053-1060(1998))。另外，反应于热、 光、创伤、病原体抗性和化学物质（例如茉莉酮酸甲酯或水杨酸）的启动子，可以用于表达 本发明的多核苷酸序列。
[0182] 在一个实施方案中，所述启动子是颗粒结合的淀粉合酶启动子，马铃薯ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶基因启动子，或类黄酮3'-单加氧酶基因启动子。在另一个实施方案中，所 述启动子是种子特异性启动子。
[0183] 本发明也包括不同于公开的序列的多核苷酸，但是作为遗传密码简并的结果，其 编码与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的多肽。因而，作为保守取代的结果，本发明预 见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸 序列或它们的互补序列、反向序列或反向互补序列的序列的多核苷酸。另外，作为缺失和 /或插入总计小于10%总序列长度的结果，本发明也预见到且包括，包含不同于SEQ ID NO: 1，2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24,或25所述的多核苷酸序列或它们的互补序列、反向互补 序列或反向序列的序列的多核苷酸。
[0184] 除了与本发明的多核苷酸序列具有指定的百分比同一性以外，变体多核苷酸优选 地具有与本发明的多核苷酸共有的其它结构和/或功能特征。除了它们的一级结构与本 发明的多核苷酸具有高度的相似性以外，与本发明的多核苷酸具有指定程度的同一性或能 与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸，优选地具有至少一种下述特征：（i)它们含有读码 框或部分读码框，其编码基本上具有与本发明的多核苷酸编码的多肽相同的功能性质的多 肽；或（ii)它们具有共同的结构域。
[0185] 元件和DNA序列的来源
[0186] 本文所述的任意或所有元件和DNA序列可以是一个或多个植物基因组内源的。因 此，在本发明的一个具体实施方案中，为最终的转运盒选择的所有元件和DNA序列都是待 转化的植物的基因组内源的或天然的。例如，所有序列可以来自马铃薯基因组。或者，一个 或多个元件或DNA序列可以是与待转化的植物物种不同的植物基因组内源的，但是其可以 在任意情况下在宿主植物细胞中起作用。这样的植物包括马铃薯，番茄，和苜蓿植物。本 发明也包括使用一个或多个来自与待转化的植物互交可孕的植物的遗传元件。
[0187] 在这点上，本发明的"植物"包括、但不限于，马铃薯，番茄，鳄梨，苜蓿，甜菜， 木薯，甘薯，大豆，豌豆，菜豆，玉米，小麦，稻，大麦，和高梁。因而，植物可以是单 子叶植物或双子叶植物。"植物"和"植物材料"也包括植物细胞，种子，植物后代，繁殖 体，无论是有性还是无性产生的，和它们中的任一种的子代，例如插条或种子。"植物材料" 可以是指植物细胞，细胞悬浮培养物，愈伤组织，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶， 根，芽，配子体，孢子体，花粉，种子，正在发芽的幼苗，和微孢子。植物可以处于各种 成熟阶段，可以生长在液体或固体培养物中，或罐中的土壤或合适的培养基中、温室或田地 中。导入植物中的先导序列、尾随序列或基因序列的表达可以是暂时的或永久的。
[0188] 核酸构建体
[0189] 本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子和多肽序列的构建体。在一个实施方 案中，本发明的DNA构建体是源自农杆菌的Ti-质粒。
[0190] 在开发本发明的核酸构建体中，构建体或其片段的各种组分通常插入方便的克隆 载体中，例如，能在细菌宿主如大肠杆菌中复制的质粒。存在许多已经在文献中描述的载 体，其中的许多是可商业得到的。每次克隆后，可以分离含有需要的插入片段的克隆载体， 并进行其它操作，例如限制消化，插入新的片段或核苷酸，连接，缺失，突变，切除，等， 以改变需要的序列的组分。完成构建体后，然后可以根据转化宿主细胞的方式，将它转移至 用于其它操作的适当载体中。
[0191] 本发明的重组DNA分子通常包括选择标记，以便可以从未转化的细胞中鉴定和 选择转化的细胞。这样的标记的实例包括、但不限于，新霉素磷酸转移酶（nptll)基因 (Potrykus等人，Mol. Gen.基因 t. 199:183-188 (1985))，它赋予卡那霉素抗性。使用适当 的抗生素例如卡那霉素或G418,可以选择表达nptll基因的细胞。其它常用的选择标记包 括bar基因，它赋予双丙氨磷抗性；突变的EPSP合酶基因（Hinchee等人，Bio/Technology 6:915-922 (1988))，它赋予草甘膦抗性；和突变的乙酰乳酸合酶基因（ALS)，它赋予咪唑啉 酮或磺酰脲抗性（欧洲专利申请154, 204, 1985)。
[0192] 另外，载体可以包括特定宿主细胞的复制起点（复制子）。各种原核复制子是本领 域技术人员众所周知的，并起指导重组分子在原核宿主细胞中的自主复制和维持的作用。
[0193] 本发明也提供了包含本发明的DNA构建体的宿主细胞。如本文使用的，宿主细胞 指最终在其中表达编码产物的细胞。因此，宿主细胞可以是单个细胞、细胞培养物或作为生 物体的一部分的细胞。宿主细胞也可以是胚、胚乳、精子或卵细胞，或受精卵的一部分。
[0194] 因此，本发明也提供了植物或植物细胞，其包含本发明的DNA构建体。优选地，所 述植物是被子植物或裸子植物。本发明的表达构建体可以用于转化许多植物，包括单子叶 植物（例如小麦，草地草，玉米，稻，燕麦，小麦，大麦，高梁，兰花，鸢尾，百合，洋 葱，香蕉，甘蔗，和棕榈），双子叶植物（例如，拟南芥，马铃薯，烟草，番茄，鳄梨，胡 椒，甜菜，绿花椰菜，木薯，甘薯，棉花，猩猩木，豆类，苜蓿，大豆，豌豆，菜豆，黄 瓜，葡萄，芸苔，胡萝卜，草莓，莴苣，橡树，楓树，胡桃，玫瑰，薄荷，南瓜，雏菊，和 仙人掌，橡树，桉树，楓树），和裸子植物（例如，苏格兰松；参见Aronen, Finnish Forest Res. Papers, Vol. 595, 1996)，白云杉（Ellis 等人，Biotechnology 11:84-89,1993)，和落 叶松（Huang 等人，In Vitro Cell 27:201-207,1991)。
[0195] 植物转化和再生
[0196] 通过本领域已知的将重组序列导入靶宿主细胞中的标准操作，可以将本发明的 多核苷酸和多肽导入宿主植物细胞中。这些操作包括、但不限于，转染，感染，转化，天 然摄入，电穿孔，生物射弹和农杆菌。将外源基因导入植物中的方法是本领域已知的， 且可以用于将本发明的构建体插入植物宿主中，包括，生物和物理植物转化方法。参见， 例如，Miki 等人，1993, ''Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", 见:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 和 Thompson, 编.，CRC Press，Inc.，Boca Raton,第67-88页。选择的方法可以随宿主植物而变化，包 括化学转染方法例如磷酸钙，微生物介导的基因转移例如农杆菌（Horsch等人，Science 227:1229-31,1985)，电穿孔，显微注射，和生物射弹。优选的转化方法包括精确育种（参 见：美国专利申请 2003/0221213A1, 2004/0107455A1,和 2005/0229267A1)和精制转化（参 见美国专利申请2005/0034188A1)。
[0197] 因此，本发明也提供了植物或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸或多肽。在一个 实施方案中，所述植物是被子植物或裸子植物。超出植物的普通含义，术语"植物"也意在 指植物的果实、种子、花、球花等。本发明的植物可以是直接转染的，这是指将载体直接导入 植物中，例如通过农杆菌，或所述植物可以是转染的植物的后代。后代也可以通过转染的植 物的无性繁殖来得到。第二代或后代植物可以通过或不通过有性生殖（即受精）来生成。 此外，所述植物可以是配子体（单倍体阶段）或孢子体（二倍体阶段）。
[0198] 在这点上，本发明考虑用一个或多个遗传上源自植物的转化元件转化植物。本发 明考虑转化的"全天然"方案，由此仅植物的天然转化元件通过转化最终整合到目标植物 中。在这方面，本发明包括仅用植物物种天然的遗传转化元件转化特定植物物种。天然方 案也可以指，特定转化元件分离自同一待转化的植物、同一植物物种或与待转化的植物在 性别上互交可孕的植物。
[0199] 另一方面，所述待转化的植物可以用转化盒转化，所述转化盒含有一个或多个源 自不同物种植物的遗传元件和序列。可能希望使用例如切割位点，它在用于转化番茄或胡 椒植物的转化盒或质粒中是马铃薯基因组天然的。
[0200] 但是，本发明不限于，天然的或全天然的方案。本发明的转化盒或质粒也可以包含 来自其它生物体的序列和元件，例如来自细菌物种。
[0201] 下面的实施例作为本发明的特定的和优选的实施方案的代表来予以阐述。这些实 施例不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。应当理解，可以作出许多变化和修改，同 时仍然在本发明的精神和范围内。 实施例
[0202] 实施例1
[0203] 天冬酰胺合成酶基因的下调的表达
[0204] 本实施例证实，参与作物淀粉组织中天冬酰胺生物合成的基因的下调的表达，会 降低这些淀粉组织中天冬酰胺的量，从而降低加热这些淀粉组织得到的食品中丙烯酰胺的 量。
[0205] 在SEQ ID NO: 1中显示了马铃薯天冬酰胺合成酶-I(Astl)基因的序列。在SEQ ID N0:2中显示了马铃薯天冬酰胺合成酶-2(Ast2)基因的部分序列。
[0206] 连接SEQ ID N0:3和4所示的这些基因的片段，以建立SEQ ID N0:5。作为反向重 复序列并被SEQ ID N0:6所示的间隔区隔开，将得到的DNA区段的2个拷贝插入ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶（Agp)和颗粒结合的淀粉合酶（Gbss)基因（分别是SEQ ID NO: 7和8)的趋 同定向的启动子之间。
[0207] 将得到的沉默构建体插入已经含有新霉素磷酸转移酶（nptll)选择标记基因的 表达盒的T-DNA边界之间。
[0208] 如下将命名为pSM1148的含有该T-DNA的二元载体（图1A)导入农杆菌LBA4404。 在有1 μ g载体DNA存在下，在冰上温育感受态LB4404细胞（50 μ L) 5min，在液氮中冷冻 约15s，在37°C温育5min。加入ImL的培养液后，在28°C培养细胞3h，铺板到含有链霉素 (100mg/L)和卡那霉素（100mg/L)的培养液/琼脂上。然后从单个LBA4404菌落的过夜培 养物分离载体DNA，并通过限制分析进行检查，以证实完整质粒DNA的存在。
[0209] 通过使10倍稀释的过夜生长的农杆菌培养物生长5-6小时，在2, 800RPM沉淀15 分钟，用添加了鹿糖（3%，pH 5. 7)的MS液体培养基（Phytotechnology)洗绦，重新悬浮 在相同培养基中直到〇D6(l(lnm为0. 2。混合重新悬浮的细胞，用于感染马铃薯品种"Ranger Russet" 的 0· 4-0. 6mm 结间区段。
[0210] 感染的茎在含68/1琼脂的共培养培养基（1/101^盐，3%蔗糖，？!15.7)上在 Percival生长室（16小时光照）中25°C培养2天，随后转移到含特美汀（150mg/L)和卡 那霉素（lOOmg/L)的愈伤组织诱导培养基（CM,添加了 3%蔗糖3、2. 5mg/L玉米素核苷、 0. lmg/L萘乙酸和6g/L琼脂的MS培养基）上。在CM上培养1个月后，将外植体转移至 含有特美汀和卡那霉素（分别是150和100mg/L)的芽诱导培养基（SM,添加了 3%蔗糖、 2. 5mg/L玉米素核苷、0. 3mg/L赤霉酸GA3和6g/L琼脂的MS培养基），直到发芽。将在再生 期末期发出的芽转移至含有3%蔗糖、6g/L琼脂和特美汀（150mg/L)的MS培养基。将转基 因植物转移至土壤，置于温室中。
[0211] 3 个月后，收获块莖，根据 Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL (2002)，第 17 版，AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA Official Method 982. 30,分析天冬酰胺水平。该分析证实，26株pSM1148植物中的17株仅含有对 照植物中存在的约25% -50%的天冬酰胺（表1)。
[0212] 将来自一些低天冬酰胺植物的块茎切片，漂白，平常油煎（par-fried)，并精制 油煎，生产炸薯条。将这些炸薯条在液氮中粉碎成细粉，在干冰上运送到Covance实验 室。在Covance，通过进行液相色谱/质谱/质谱（LC/MS/MS)(美国食品和药品管理局， 植物以及乳制品和饮料的食品安全中心和应用营养办公室，"食品中丙烯酰胺的检测和定 量"，2002)，测定丙烯酰胺水平。表2证实，来自低天冬酰胺pSM48植物的薯条积累的丙烯 酰胺少于在对照薯条中生成的丙烯酰胺的约1/3。
[0213] 作为使用Agp和Gbss启动子作为调节元件的一个替代方案，也可以使用2个Gbss 启动子。将含有反向重复序列的构建体导入T-DNA边界之间，以生成二元载体pSIM1151，所 述反向重复序列包含插入2个Gbss启动子之间的Astl和Ast2基因片段（图1B)。该载体 用于以与关于PSM1148所述类似的方式生产转基因马铃薯系。此外，Ast基因-衍生的序 列可以插入启动子和终止子之间。
[0214] 对于任意的Ast基因，可能存在具有高度序列相似性的其它序列。可以使用这样 的同源序列来生产沉默构建体。例如，番茄Ast基因的片段可以用于沉默马铃薯中的同源 Ast基因 〇
[0215] 鉴定植物衍生的Ast基因之后，为该基因的PCR-扩增设计基因特异性的引物。根 据本领域已知的方法，进行PCR扩增，然后将PCR扩增的天冬酰胺酶基因克隆进克隆载体 中。
[0216] 可以通过检索数据库来识别Ast基因，或从植物DNA分离。来自马铃薯以外的作 物的Ast基因的一个实例是SEQ ID NO: 34和35所示的来自小麦的Ast基因。同时沉默小 麦谷粒中的这些基因，可以降低面粉中的天冬酰胺水平，从而降低例如面包、饼干、小甜饼 或薄脆饼中的丙烯酰胺水平。
[0217] 除了使用Ast基因片段来生产沉默构建体以外，也可以使用从Ast基因的启动子 得到的片段。通过使用反向PCR等方法，可以分离这样的启动子，然后可以将特定150-600 个碱基对的启动子片段的2个拷贝作为反向重复序列插入启动子和终止子之间，或2个趋 同方向的启动子之间（参见：R〇mmens等人，世界专利申请2006/036739 A2,它在本文中 引作参考）。
[0218] 实施例2
[0219] 天冬酰胺酶基因的超量表达
[0220] 本实施例证实，参与作物淀粉组织中天冬酰胺代谢的基因的超量表达，会降低这 些淀粉组织中天冬酰胺的量，从而降低加热这些淀粉组织得到的食物中丙烯酰胺的量。
[0221] 在SEQ ID N0:9中显示了来自马铃薯品种Ranger Russet的马铃薯天冬酰胺酶 (Asgl)基因的序列。分别在SEQ ID NO: 10和11中显示了对应的读码框和预测的氨基酸序 列。含有插入在Agp启动子和Ubi3终止子之间的Asgl基因的二元载体（SEQ ID N0:12) 命名为pSM658(图1C)。
[0222] 通过应用定量实时反转录酶PCR，测定块茎中Asgl基因的表达水平。表3证实，25 株PSM658植物中的18株的块茎超量表达Asgl基因约2至20倍。这些块茎用于生产炸 薯条。化学分析证实，2个转基因系的炸薯条含有降低水平的丙烯酰胺（表4)。
[0223] 也可以使用其它块茎特异性启动子来驱动Asgl基因的表达。质粒pSM757含有 可操作地连接到Asgl基因上的Gbss启动子。用该质粒的转运DNA转化马铃薯，会生成卡 那霉素抗性的、超量表达Asgl基因的植物。可以用于驱动马铃薯块茎中的天冬酰胺酶表达 的其它启动子，可以选自马铃薯块茎特异性蛋白启动子，冷诱导型启动子，和类黄酮化合 物_3'_单加氧酶（Fmo)启动子。一个Fmo启动子如SEQ ID NO: 13所示。该启动子在半成 熟的和成熟的块茎中是有活性的，但是在小块茎中是无活性的。
[0224] 除了使用Asgl以外，也可以采用其它天冬酰胺酶基因 。SEQ ID N0:14显示了替 代性马铃薯天冬酰胺酶Asg2基因的cDNA序列。天冬酰胺酶基因的其它实例包括大肠杆菌 (登记号Z1051m ;SEQIDN0:31)、农杆菌（登记号Atu3044;SEQIDN0:32)、大麦（登记号 AF308474;SEQ ID N0:33)的天冬酰胺酶基因，和编码具有基序pfam01112. 12的蛋白的任 意基因（Marchler-Bauer 等人，Nucleic Acids Res 33, D192-6, 2005) 〇
[0225] 在SEQ ID NO: 15中显示了小麦的天冬酰胺酶基因的序列。在SEQ ID NO: 16中描 述了预测的氨基酸序列。
[0226] 对于任意的天冬酰胺酶基因，可能存在具有高度序列相似性的其它天冬酰胺酶序 列。例如，通过检索数据库，例如由NCBI维护的那些，可以鉴别植物衍生的天冬酰胺酶基 因。
[0227] 鉴别植物衍生的天冬酰胺酶基因之后，为天冬酰胺酶基因的PCR-扩增设计基因 特异性的引物。根据本领域已知的方法，进行PCR扩增，然后将PCR扩增的天冬酰胺酶基因 克隆进克隆载体中。
[0228] 将天冬酰胺酶可操作地连接到种子特异性的启动子上，例如SEQ ID NO: 17所述的 小麦嗓呤二氢吲噪（puroindoline)基因启动子。使用生产低天冬酰胺小麦的常规转化方 法，导入包含得到的表达盒的转运DNA。从小麦种子得到的面粉会在加热过程中积累更少的 丙烯酰胺。
[0229] 实施例3
[0230] 谷氨酰胺合成酶的超量表达
[0231] 谷氨酰胺合成酶基因的超量表达会导致降低水平的天冬酰胺。可以将编码具有谷 氨酰胺合成酶活性的蛋白的任意序列可操作地连接到在目标植物器官（例如马铃薯块茎） 中表达的启动子上。马铃薯含有3个相关的谷氨酰胺合成酶基因，如SEQ ID NO. :28-30所 示。包含每个这样的基因的一个片段的DNA区段可以用于有效地下调谷氨酰胺合成酶活 性。为此目的，可以将该区段的至少一个拷贝插入2个趋同启动子之间，或启动子和终止子 之间。使用任意的转化方法，可以将得到的表达盒导入目标植物。然后可以选择生产低天 冬酰胺植物器官的转基因植物。这些植物器官的热加工会提供含有比从对应器官得到的产 品更低的丙烯酰胺的产物。例如，加工过的转基因块茎会产生这样的炸薯条，其含有比从 未转化的块莖得到的炸薯条更低的丙稀酰胺水平。Harrison和合作者（Plant Physiology 133:252-262, 2003)已经描述了谷氨酰胺合成酶超量表达对天冬酰胺水平的影响。但是，这 些作者没有预见到降低的天冬酰胺水平对强烈减少的热诱导的丙烯酰胺积累的影响。
[0232] 类似地，可以下调显示出硝酸还原酶活性的内源基因的表达。为此目的，可以表达 该基因的一部分或硝酸还原酶基因的启动子的至少一个拷贝。可以筛选转基因植物的硝 酸还原酶基因表达水平，然后可以筛选表现出降低水平的系的降低的天冬酰胺水平。也可 以沉默己糖激酶基因并增加天冬氨酸水平，同时降低天冬酰胺水平。以前已经描述了硝酸 还原酶和己糖激酶基因的超量表达与增加的天冬酰胺水平之间的关联（Roland等人，Annu Rev Plant Biol 57:675-709, 2006 ;Szopa，Biochem Soc Trans 30:405-410, 2002)。但是， 作者没有预见到最终降低食物中的丙烯酰胺水平的相应方案。
[0233] 显然，存在通过改变直接或间接参与天冬酰胺的合成或代谢的基因的表达，修饰 植物中的天冬酰胺水平的其它策略。我们的结果暗示着，任一种这样的方法都可以用于生 产低丙烯酰胺食物。
[023 4] 实施例4
[0235] 同时下调淀粉降解和天冬酰胺生物合成基因的表达
[0236] 本实施例证实，同时下调分别参与作物淀粉组织的淀粉降解和天冬酰胺生物合成 基因的表达，可以降低加热这些淀粉组织得到的食物中的丙烯酰胺积累。
[0237] 分2步制备转基因植物，其生产具有低水平的还原糖和天冬酰胺的块茎。首先，用 二元载体 PSIM371 的 P-DNA 转化植物。该 P-DNA 含有包含 PP0(SEQ ID N0:18)、R1(SEQ ID N0:19)和phL(SEQ ID N0:20)基因的片段的多核苷酸的2个拷贝，其作为反向重复序列插 入Gbss启动子和Ubi 3终止子之间。
[0238] 使用携带pSM371和LifeSupport载体pSM368的农杆菌株（它含有插入在T-DNA 边界之间的nptll和codA基因的表达盒）来感染21，900个马铃薯茎外植体。2天共培养 阶段后，将感染的外植体暴露于卡那霉素5天，以选择瞬时nptll基因表达。为了预防含 有稳定整合的T-DNA的细胞的增殖，随后将外植体转移至含有5-氟胞嘧啶（5FC)的培养基 中。codA基因产物会将该化合物转化成无毒的5-氟尿嘧啶（5FU) (Perera等人，1993)。对 双重选择后存活的共3, 822个芽进行基因型分析，分析P-DNA的存在和来自T-DNA或质粒 主链的任意外源DNA的缺失。该分析鉴定出256个能生根的全天然DNA(基因内的）芽，种 入土壤中，在生长室中生长6周。为了筛选PPO活性，将儿茶酚溶液移液到收获的约2-cM 小块茎的切口表面上。在温室中培养在儿茶酚诱导的块茎褐变中抑制的48个系3个月，以 生产半成熟的块茎，用于生化分析剩余的PPO活性水平。该分析证实，PPO基因沉默构建体 的应用使PPO活性降低了约90%。随后繁殖48个基因内系和未转化的Ranger Russet和 Russet Burbank对照植物，并在爱达荷州阿柏丁（Idaho, Aberdeen)的田地中生长。
[0239] 在冷藏3和6个月后，分析所有基因内系和对照系的成熟块茎的葡萄糖水平。大 多数系（43)表现出比已经沉默了仅一个淀粉相关基因的对照系更大的冷诱导的甜化减少 (约60% )。源自植物371-28和371-38的沉默块茎的炸薯条含有的神经毒素丙烯酰胺少 于在对照油炸食品中积累的1/3(表4)。可以的减少在预料之中，因为丙烯酰胺主要源自热 诱导的还原糖羰基和天冬酰胺之间的反应（Mottram等人，2002 ;Stadler等人，2002)。
[0240] 由8位专业训练的个体组评价改良的炸薯条的感官特征。源自修饰的Ranger Russet块莖的炸薯条表现出比来自Ranger Russet或Russet Burbank的炸薯条更好的视 觉外观。此外，基因内的炸薯条表现出明显更好的总香气，这可以通过位于鼻腔顶部的嗅觉 上皮感知。对于已经在4°C储存10周的块茎，观察到了类似的趋势。实际上，冷藏的基因内 系371-28, 30, 38,和68仍然满足或超过了新鲜的未转化的品种的感官特征。
[0241] 用PSM1148再次转化一种低糖马铃薯系。与来自原始pSM1148植物的炸薯条相 比，来自卡那霉素抗性的双重转化体的炸薯条通常表现出进一步降低的丙烯酰胺水平。因 而，该双重转化体会生成可以用于得到炸薯条的块茎，所述食品（i)含有降低水平的丙烯 酰胺，且（ii)表现出增强的感官特征。
[0242] 实施例5
[0243] 降低马铃薯块茎中的天冬酰胺水平和冷诱导的甜化的全天然DNA转化方法
[0244] 本实施例描述了使用全天然DNA转化方法来降低马铃薯块茎中的天冬酰胺水平 和冷诱导的甜化。从这些块茎得到的加工食品含有降低水平的丙烯酰胺。
[0245] 用于转化的含有插入马铃薯-衍生的边界区域之间的2个表达盒的转运DNA如 SEQ ID N0:23 所示（图 2)。第一表达盒包含含有 Ppo(SEQ ID N0:24)、PhL(SEQ ID N0:25) 和Rl (SEQ ID N0:26)基因的启动子片段的DNA区段的2个拷贝，其作为反向重复序列插入 Agp基因的功能活性启动子和泛素-3基因的终止子之间。第二表达盒包含含有Astl、Ast2 和Pp0 (SEQ ID NO: 27)基因的片段的DNA区段的2个拷贝，其作为反向重复序列插入Gbss 基因的2个功能活性的和趋同方向的启动子之间。
[0246] 将含有转运DNA和农杆菌异戊烯基转移酶（ipt)基因的表达盒的质粒导入农杆菌 LBA4404,使用无标记的转化方法（参见：Craig Richael, "generation of marker-free and backbone-free transgenic plants using a single binary approach，临时专利申 请60/765, 177,它在本文中引作参考），将得到的菌株用于转化马铃薯品种，例如Ranger Russet和Atlantic。使没有表现出细胞因子表型（特征是矮化的生长和不能生根）的转 化过的植物生成块茎。有些系的块茎会表现出低水平的Ppo酶活性，这可以通过将0. 5mL 的50mM儿茶酚移液到新鲜切口的块茎表面上来测试。通过在50mM 3-(N-吗啉代）丙磺酸 缓冲液PH 6.5 (5mL)中混合粉末状的块茎（Ig)，可以更精确地测定Ppo酶活性的水平。沉 淀固体级分后，可以随时间测定0D410的变化。通过在约4°C温育块茎，进一步测试含有小 于25% Ppo酶活性的块茎的系。至少1个月后，可以测定葡萄糖水平，例如，通过使用葡萄 糖氧化酶/过氧化物酶试剂（Megazyme, Ireland)。可以分析表现出>75%降低的ppo活性 水平和>50%降低的冷诱导的甜化的块茎的系的游离天冬酰胺水平。如果游离天冬酰胺水 平降低了约>50%，可以加工块茎，并分析丙烯酰胺水平。确实含有低天冬酰胺水平以及低 Ppo和低的冷诱导的甜化的转化系，可以考虑用于批量扩大和商业生产。源自优选系的块茎 的炸薯条含有更少的还原糖，因而可能减少漂白时间和保持原始的马铃薯味道。此外，由于 缺少糖末端和黑点挫伤，增强了它们的视觉吸引力。炸薯条也具有更好的香气，并积累降低 水平的丙烯酰胺，这可以通过用于评价炸薯条的感官特征的感官组来测定。
[0247] 实施例6
[0248] TILLING
[0249] 通过突变，也可以下调参与天冬酰胺（例如天冬酰胺合成酶）的生物合成的基因 的表达。实现该目标的一种方法称作'靶向诱导的基因组中的局部损伤'（TILLING)。该方 法组合了甲磺酸乙酯（EMS)-诱导的诱变的效率和变性高效液相色谱（DHPLC)的能力，以通 过异源双链体分析检测碱基对变化。该方法会产生宽范围的突变等位基因，是快速且可自 动化的，适用于可以化学诱变的任意生物体。在基本的TILLING方法中，通过EMS处理来 诱变种子。使得到的Ml植物自受精，将M2代个体用于制备进行突变筛选的DNA样品，同 时将它们的种子存货。合并DNA样品。在微量滴定板上排列各样品组，进行基因特异性的 PCR (McCal Ium 等人，Nat Biotechnol 18:455-457)。
[0250] TILLING有多种替代方案。例如，可以使用不同类型的诱变剂，例如快速中子或二 环氧丁烷（DEB)。所有这些方法可以连接到反向遗传学平台，以筛选和分离预选择的基因的 突变体。这些方法已经详细描述在，例如，Wang等人，Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, Volume I,2006,Global Science Books。
[0251] 此外，可以简单地筛选可得到的种质的低天冬酰胺表型。因而，分子植物培育、突 变培育和系选择都会提供可以得到'低天冬酰胺'品种的方法。
[0252] 实施例7
[0253] 降低天冬酰胺水平
[0254] 通过改进种植者的操作，也可以降低天冬酰胺水平。例如，碳可以抑制天冬酰胺 合成酶基因 (Koch KE. Carbohydrate-modulated gene express ion in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol47:509_540, 1996)。通过降低土壤中的氮/硫比，也可以 减少天冬酰胺积累。相对较低的氮水平会导致富含N的化合物的浓度的降低和含S代谢物 (例如半胱氨酸，谷胱甘肽，和S-腺苷酰甲硫氨酸）的增加。因而，含有相对高C、高S和 低N的土壤可以用于生产具有相对低天冬酰胺的食品。
[0255] 表
[0256] 表1. 3个月龄的温室生长的马铃薯系的块茎中的天冬酰胺水平
[0257]
[0258]
[0259] 表2.从3个月龄的温室生长的马铃薯系的块茎得到的炸薯条中的丙烯酰胺水平。 根据美国食品和药品管理局，植物以及乳制品和饮料的食品安全中心和应用营养办公室， "食品中丙烯酰胺的检测和定量"（2002)，测定丙烯酰胺水平。
[0260]
[0261] 表3.通过定量实时RT-PCR测得的6周龄生长室生长的马铃薯系的马铃薯块茎中 天冬酰胺酶-1基因的表达水平
[0262]
^ Im ο η ΓΕν
[0263] 表^从3个月龄温室生长的马铃薯系
块茎得到^勺炸薯条中的丙'酰胺水平
[0264]
【主权项】
1. 一种降低热加工的植物产品中的丙烯酰胺含量的方法，其包含降低用于生产该产品 的植物中的天冬酰胺水平。2. 权利要求1的方法，其中降低天冬酰胺水平的步骤包含：在植物中表达第一多核苷 酸，其中所述多核苷酸包含至少一个下述成分的完整或部分序列：（i)参与天冬酰胺生物 合成的基因或基因的启动子，和（b)参与天冬酰胺代谢的基因。3. 权利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸包含下述成分的至少一个：(a)来自选自 (i)天冬酰胺合成酶基因、（ii)硝酸还原酶基因、和（iii)己糖激酶基因的基因或所述基因 的启动子的完整或部分有义和/或反义序列，其中完整或部分序列的表达下调该基因的内 源拷贝的mRNA水平，和（b)选自（i)天冬酰胺酶基因和（ii)谷氨酰胺合成酶基因的基因 的完整或部分序列，其中超量表达所述序列，以上调该基因的总mRNA水平。4. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺合成酶基因的至少一部 分，且包含与SEQIDNO: 1或2所述序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列。5. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含功能上有活性的天冬酰胺酶基因， 且包含与SEQIDN0:9、14或31-33所述序列具有至少70%同一性的序列。6. 权利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸可操作地连接到至少一个组织特异性植 物启动子上。7. 权利要求6的方法，其中所述启动子是块茎特异性或种子特异性启动子。8. 权利要求7的方法，其中所述启动子与马铃薯颗粒结合的淀粉合酶启动子、马铃薯 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子、马铃薯块茎特异性蛋白启动子、马铃薯类黄酮3' -单 加氧酶基因启动子、或小麦嘌呤吲哚基因启动子的至少一部分具有至少70%同一性。9. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯颗粒结合的淀粉合酶启动子包含SEQIDNO:8 所述序列的至少一部分。10. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子包含SEQ IDN0:7所述序列的至少一部分。11. 权利要求8的方法，其中所述马铃薯块茎特异性蛋白基因启动子包含SEQID NO:22所述序列的至少一部分。12. 权利要求8的方法，其中所述类黄酮单加氧酶基因启动子包含在SEQIDNO: 13所 述序列上游的序列的至少一部分。13. 权利要求3的方法，其中所述第一多核苷酸包含天冬酰胺生物合成基因的有义和 /或反义片段的至少一个拷贝，且被表达，以下调用于生产热加工食品的植物组织中的总天 冬酰胺合成酶mRNA水平。14. 权利要求13的方法，其中所述第一多核苷酸在它的5'-末端可操作地连接到到启 动子上，且在它的3' -末端可操作地连接到启动子上。15. 权利要求2的方法，还包含表达第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成分的至少 一个：（i)选自Rl基因和磷酸化酶L基因的基因的至少一个拷贝，其是有义和/或反义方 向。16. 权利要求15的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于转运DNA内，且包含与SEQ IDN0:23所示序列具有至少70%同一性的序列。17. 权利要求1的方法，其中所述植物是具有块茎的植物。18. 从转基因植物的组织得到的热加工产品，所述组织包含第一多核苷酸，所述多核 苷酸包含参与天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代谢的基因的完整或部分序列，其中所述产品 具有比从其它方面相同的非转基因植物的对应组织制备的热加工产品更低的丙烯酰胺浓 度。19. 权利要求18的热加工产品，其中从转基因植物制备的产品具有比从野生型块茎制 备的等同产品改进的感官特征。20. 权利要求18的热加工产品，其中所述转基因植物是具有块茎的植物。21. 权利要求20的热加工产品，其中具有块茎的植物的产品是炸薯条、马铃薯片、炸薯 片、马铃薯或烤马铃薯。22. 权利要求18的热加工产品，其中转基因植物的细胞还包含第二多核苷酸，所述多 核苷酸包含下述成分的至少一个：（i)与Rl基因或基因片段相对应的有义和/或反义序 列，和（ii)与磷酸化酶L基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列。23. 权利要求18的热加工产品，其中所述产品的丙烯酰胺浓度比非转基因植物的热加 工产品中的丙烯酰胺浓度低至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约 40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%。24. -种植物，其在基因组中包含第一多核苷酸，所述多核苷酸包含参与天冬酰胺生物 合成或天冬酰胺代谢的基因的完整或部分序列。25. 权利要求24的植物，其中所述植物是具有块茎的。26. 权利要求25的植物，其中具有块茎的植物是马铃薯植物。27. 权利要求24的植物，还在基因组中包含第二多核苷酸，所述多核苷酸包含下述成 分的至少一个：（i)与Rl基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列，和（ii)与磷酸化 酶L基因或基因片段相对应的有义和/或反义序列。28. 分离的多核苷酸序列，其包含编码能降低植物中的丙烯酰胺水平的多肽的核酸序 列。29. 权利要求28的分离的多核苷酸，其中所述核酸序列选自：SEQIDN0:l、2、9、10、 14、15和28-35,或其变体、片段、互补序列或反向互补序列，且所述核酸编码具有天冬酰胺 酶活性的多肽。30. 权利要求29的分离的多核苷酸，其中所述变体的序列与SEQIDNO: 1、2、17、20、 21中的任一个序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90 %,89 %,88 %,87 %,86 %,85 %,84 %,83 %,82 %,81 %,80 %,79 %,78 %,77 %,76 %, 75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61% 或 60 %的序列同一性。31. 从具有降低的天冬酰胺的植物组织生产可食用植物产品的方法，其包含（1)增加 所述植物组织中的天冬酰胺酶水平，或（2)降低所述植物组织中的天冬酰胺合成酶水平。32. 权利要求31的方法，其中增加植物细胞中的天冬酰胺酶水平的步骤包含在该细胞 中表达天冬酰胺酶基因。33. 权利要求31的方法，其中降低植物细胞中的天冬酰胺合成酶水平的步骤包含在该 植物细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸包含（i)Rl基因、（ii)磷酸化酶L基因和（iii)天 冬酰胺合成酶基因的至少一个片段，其是有义和/或反义方向。34. 权利要求31的方法，其中所述可食用植物产品是块茎、炸薯条、马铃薯片、炸薯片、 烤马铃薯或脱水的马铃薯。35. 权利要求31的方法，其中与天冬酰胺酶水平没有增加或天冬酰胺合成酶水平没有 降低的植物产品中的丙烯酰胺水平相比，所述可食用植物产品在被加热后具有更低的丙烯 酰胺水平。36. 生产具有低水平的丙烯酰胺的可食用植物产品的方法，其包含（i)下调天冬酰胺 生物合成基因的表达和/或上调参与天冬酰胺代谢基因的基因的表达，和（ii)下调植物 组织中（a)Rl基因和（b)磷酸化酶L基因中的至少一个基因的表达或活性，所述植物组织 产生用于制备产品的植物、种子或果实。37. 权利要求36的方法，其中下调Rl基因、磷酸化酶L基因和天冬酰胺生物合成基因 的步骤包含：在植物细胞中以有义和/或反义方向表达（i)Rl基因、（ii)磷酸化酶L基因 和（iii)天冬酰胺合成酶基因的至少一个片段。38. 权利要求36的方法，其中所述可食用植物产品是块茎、炸薯条、马铃薯片、炸薯片 或烤马铃薯。39. 权利要求36的方法，其中与非转基因植物的植物产品中的丙烯酰胺水平相比，所 述可食用植物产品在被加热后具有更低的丙烯酰胺水平。40. 生产可食用转基因植物产品的方法，所述产品在被加热后具有比来自非转基因植 物的等同加热产品的丙烯酰胺水平更低的丙烯酰胺水平，该方法包含通过改变参与植物中 天冬酰胺生物合成或天冬酰胺代谢的基因的表达水平，降低转基因植物中的天冬酰胺水 平。41. 权利要求40的方法，其中通过以有义和/或反义方向表达来自天冬酰胺合成酶基 因、硝酸还原酶基因或己糖激酶基因的完整或部分序列的至少一个拷贝，降低天冬酰胺水 平。42. 权利要求41的方法，其中通过在植物中表达来自天冬酰胺酶基因或谷氨酰胺合成 酶基因的完整或功能上有活性的部分序列，降低天冬酰胺水平。43. 在马铃薯块茎中超量表达基因的方法，该方法是通过将该基因可操作地连接到与 SEQIDNO: 13所示序列的至少一部分具有至少70%同一性的序列上。44. 权利要求1的方法，其中降低植物淀粉组织中的天冬酰胺水平。45. 权利要求36的方法，其中所述可食用植物产品具有与未修饰的等同产品相比改善 的感官特征。46. 权利要求45的方法，其中所述可食用植物产品具有选自下述的至少一种改善的感 官特征：外观、风味、香气和质地。
【专利摘要】本发明涉及低丙烯酰胺食品。本发明提供了从植物分离的多核苷酸和多肽序列，降低植物中游离天冬酰胺水平的方法，生产含有降低水平的丙烯酰胺的热加工食品的方法，和通过这些方法得到的植物和食物。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/55, A23L1/015, C12N15/82, A23L1/217
【公开号】CN104894159
【申请号】CN201510301163
【发明人】C.罗门斯
【申请人】J.R.西姆普罗特公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2006年9月19日
【公告号】CA2623266A1, CN101313070A, CN101313070B, DE602006016489D1, EP1974039A2, EP1974039B1, EP2333076A2, EP2333076A3, EP2333076B1, US20070074304, WO2007035752A2, WO2007035752A3
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