双基因表达载体及其构建和应用方法
双基因表达载体及其构建和应用方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域；涉及一种双基因表达载体、引物、及其构建和 应用方法，尤指一种用PCR快速构建双基因表达载体的方法及该方法构建的双基因表达载 体在植物新品种培育中的应用。
【背景技术】：
[0002] 随着基因组的不断揭晓，新的功能基因不断出现，越来越多的育种研宄者将目光 投向基因工程研宄，并取得了较快进展。但是，大多数转化技术只是单个基因改良单一性 状。由于生物体的大部分性状往往是多基因控制，即要求多个相关基因的协同表达。因此， 双基因或多基因聚合改良同一性状或多个性状的研宄应运而生。双基因聚合在拟南芥、水 稻、杨树、烟草等植物中已开始研宄。这些研宄通常要将同时表达的两个基因通过PCR扩增 后酶切，通过三步酶切、三步连接，分次将基因1、基因2和-nos-35S-片段插入空表达载体 中；或者将一个基因插入空表达载体后，将另一个基因与表达载体中的报告基因转换。方法 复杂，耗时费力。如何利用快速构建双基因甚至多基因表达载体用于多种性状的改良，成为 一个亟待研宄和解决的问题。本发明提供了一种快速构建双基因表达载体的方法，为双基 因甚至多基因的聚合转化与品种改良利用提供一条快速途径。
【发明内容】
：
[0003] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于PCR的 双基因表达载体快速构建法，构建的载体和专用引物对及应用，具体地说，就是用两轮PCR， 快速将两个目的基因和含有终止子启动子的-nos-35S-片段连接成一个整体结构，构建成 表达载体，用于基因工程改良植物两种以上的性状。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是：
[0005] 双基因表达载体的构建方法：
[0006] 根据目的基因 MtDREBIC、RcXET和-nos-35S-片段设计的引物对对目的基因 MtDREBlC、RcXET和中间插入的终止子启动子序列-nos-35S-片段进行第一轮PCR扩增，将 得到的三个片段进行第二轮PCR扩增连接起来得到一个整体MtDREBlC-nos-35S-RcXET结 构，然后克隆到空白质粒中。
[0007] 上述方法中设计引物对如下：
[0008] a : 5 ' -CGGGATCC CTJATCT JCAGJTC￡AACTJTO -3?；
[0009] b : 5 ' -ACGCGTCGACT -3 ' ；
[0010] C :ATTGCCAAATGTTTGAACGATC 丄-
[0011] d :迎座赫'紐I GATCGTTCAAACATTTGGCAAT ;
[0012] e : CGTGTTCTCTCCAAATGAAATGA ;
[0013] f :TCATTTCATTTGGAGAGAACACG 。―
[0014] 上述方法中第一轮PCR :
[0015] 用3对引物a/b，c/d，e/f分别扩增MtDREBlC、RcXET和-nos-35S-片段三个片段；
[0016] 第二轮 PCR :
[0017] 以a/f为引物对，以第一轮PCR得到的三条纯化片段为模板进行PCR扩增，得到一 个整体 MtDREBlC-nos-35S-RcXET 片段。
[0018] 第一轮PCR反应条件：
[0019] 50μ1 反应体系中加入：10XBuffer 5μ1 ;dNTP 2·5μ1 ;Pfu 酶0·25μ1 ;上、下 游引物各2. 5μ1 ;含目的基因或者-nos-35S-片段的质粒15ng;ddH20加至50μ1 ;PCR反 应程序94°C -40s，50°C -lmin，72°C -lmin，30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，为下一 步连接备用；
[0020] 第二轮PCR反应条件：
[0021] 50μ1 反应体系中加入：IOXBuffer 5 μ I ;dNTP 2. 5 μ I ;Pfu 酶 0· 25 μ 1 ; 引物a和f各2. 5μ1;三条纯化目的条带各15ng ;ddH20加至50 μ I ;PCR反应程序 94°C -40s，50°C -lmin，72°C _3min，30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，备用。
[0022] 上述方法中将第二轮产生的目的条带克隆到pGEM-T载体中进行PCR和测序验证； 最后将获得测序验证的连接产物克隆到pBin438空载体，具体将获得测序验证的连接产 物，连同pBin438空载体用BamHI和Sail进行双酶切，以连接产物/空载体以3/1比例混 合用T4连接酶进行连接，转化ToplO感受态，在含50mg/L卡那霉素培养基上进行筛选；挑 选含50mg/L卡那霉素培养基上生长良好的单菌落，先进行PCR检测，获PCR验证后提取质 粒进行酶切检验。
[0023] 双基因表达载体：是由上述的方法构建的。
[0024] 所述的双基因表达载体的应用方法：将所述的双基因表达载体转入月季中，以提 高其耐寒性和抗矮化，具体如下：
[0025] 1)先将所述的双基因表达载体用CaCl2转化法导入农杆菌GV3101，构建转化用工 程菌株；
[0026] 2)采用半透明愈伤组织为转化材料，将工程菌株进行转化，最后进行抗生素的筛 选。
[0027] 本发明根据三个片段（两个基因及含有终止子启动子的-nos-35S-片段）设计 3个引物对，其特点是：正向引物取目的基因 MtDREBlC的前20bp加酶切位点；反向引物根 据目的基因 RcXET的序列的后20bp加相应的酶切位点；中间引物有四条，两两反向互补： 每条中间引物分两部分.分别横跨目的基因和终止子/启动子序列，如两条横跨MtDREBlC 和-nos-终止子，另两条横跨35S启动子和RcXET基因。Nos-终止子用于MtDREBlC基因的 终止；35S启动子用于RcXET基因的启动。
[0028] 本发明选用MtDREBlC和RcXET基因聚合月季，主要基于两点：一是MtDREBlC基因 经鉴定是转录因子基因，能显著提高月季的耐寒性，但过量表达引起植株矮化；RcXET基因 是从月季中克隆获得，与月季生长、尤其是茎和根的伸长密切相关，通过基因工程方法，将 两个基因聚合，转化月季，使两个基因在月季中同时表达，可能既增强月季的耐逆性，又可 能解决DREBl类基因过量表达引起的矮化问题。
[0029] 本发明仅用两轮PCR和一个亚克隆，就可以获得将MtDREBlC、nos-35S和RcXET三 个片段连接在一起形成MtDREBlC-nos-35S-RcXET的三片段连接序列，时间只约为三天。现 有技术通常要将三个片段逐一连接到载体上，每连接一个片段要经过PCR扩增、双酶切、连 接和亚克隆几个步骤，三个片段要分三次连接，比较顺利的话也需20天以上。但不顺利 的时候居多，原因在于：很多植物表达载体往往只有两个可用的酶切位点，第一次采用双 酶切连入一个片段，需花3天左右时间，但如果要连接两个以上片段，必须从第二个片段 开始采用单酶切连接，这就涉及到方向问题，也就是说，从第二个片段开始正向连接的可 能性只有50%，要经过筛选找到正确的连接克隆，才能进行下一步工作；三个以上片段的 连接更复杂，需将其中相邻的两个片段先用不同的酶进行酶切和连接，再作为一个整体的 片段接入已连入一个片段的表达载体上，过程相当复杂和耗时，耗时一般在一个月以上。
【附图说明】：
[0030] 图1:用基于PCR方法构建MtDREBlC-nos-35S-RcXET的反应过程示意图。实 线及实线箭头表示nos-35S序列，两端用虚线及虚线箭头表示MtDREBlC和RcXET基因 序列。中间引物（b，c，d，e)由两部分组成，分别涵盖两端连接序列；两端引物a和f分 别含BamHI和Sail酶切位点。第一轮PCR产生三个中间产物，第二轮PCR产物全长 MtDREBlC-nos-35S-RcXET序列，两端含BamHI和Sail酶切位点，以便插入含CaMV35S启动 子和nos终止子的pBin438表达载体用于基因转化和同时表达两个基因。
[0031] 图2 :用PCR法将MtDREBlC和RcXET序列连接到nos-35S两端，形 成MtDREBlC-nos-35S-RcXET结构。A、序列连接示意图：两边的虚线分别代表 MtDREBlC(780bp)和RcXET(933bp)基因；黑色长方形代表nos终止子，白色箭头代表35S启 动子，nos-35S为一起扩增的片段，总长1787bp。目的连接产物为3500bp。B、PCR产物电泳 图显示，用 3 条带 MtDREBlC (780bp,第 1 道）、nos-35S (1787bp，第 2 道）和 RcXET (933bp，第 3道）作混合模板，扩增出的产物MtDREBlC-nos-35S-RcXET条带特异性非常明显（3500bp， 第4道）。将纯化的3500bp连接产物（第5道）插入3000bp的pGEM-T Easy Vector克隆 载体和约13000bp的pBin438植物表达载体，提纯质粒进行酶切，结果显示连接产物在两个 载体中存在（第6、7道）。
[0032] 图3:中国月季基因转化。A、从叶片产生的胚性愈伤用于基因转化；B、转化的愈伤 在SM筛选培养基上培养6周分化的球形胚；C、在含抗生素的SM培养基上培养12周后部分 球形胚褐化或死亡，同时也有心形胚产生；D-F、在含抗生素的SM约16-20周后有体胚出现； G-I、体胚在转移到含抗生素的SP培养基后有抗生素小植株能继续生长，大多褐化死亡。
[0033] 图4:中国月季转基因株系PCR检测。以10个转化植株和1个对照植株叶片DNA 为模板、以Pl和P2为引物（见实施例中材料与方法）进行PCR扩增。PCR扩增产物的电泳 检测。M :DNA Marker ;CK+:以 pBin438-MtDREBlC-nos-35S-RcXET 质粒为模板；1-10 :转基 因植株；CK-:野生型中国月季DNA为模板的阴性对照。
[0034] 图5:再生月季Southern杂交分析。+ :扩增MtDREBlC的PCR产物为阳性对照；泳 道1-10:从PCR检测阳性再生月季植株中（编号为1、2、5、7、8、10)提取的基因组0嫩进行 BamHI酶切；W :从野生型月季中提取的基因组DNA(作阴性对照）。
[0035] 图6:月季转基因株系表达检测.RcXET的荧光定量PCR结果显示其表达量大约增 强了约4. 6倍，Xl为转化株系，X2为对照株系，Actin (Al, A2)为看家基
[0036] 因，计算结果根据公式：表达量倍数=4. 6。
[0037] 图7:月季转化株系耐寒性检测。Control :再生植株在正常培养条件下培养15天， 转到2°C驯化10天；freezing stress :驯化小植株置于-6°C寒处理60小时转到25±2°C 正常条件下培养14天。各株系幸存率（处理后存活数/处理前株数）标于图下方。W :作 非转基因对照的野生型植株；T2-T10 :S〇uthern杂交阳性转化株系。
[0038] 图8:双基因 MtDREBIC/RcXET过量表达植株的表型。
【具体实施方式】：
[0039] 以下将对本发明作进一步地说明，而不会形成对本发明的限制。
[0040] MtDREBlC和RcXET基因为本实验室克隆，GenBank的注册号分别为DQ267620和 ⑶320707(见序列表）。扩增终 止子启动子序列-nos-35S-片段（见序列表）以pBI121为 模板。引物对由美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen公司）合成。
[0041] 实施例1、用PCR法快速构建双表达载体：
[0042] 材料：含 MtDREBlC 和 RcXET 基因的 pGEM-T Easy Vector 质粒（Promega)克隆载 体和 pBI 121 质粒（AF485783) (Clontech) 〇
[0043] 1、第一轮 PCR :用 3 对引物（a/b, c/d, e/f)分别扩增 MtDREBIC、RcXET 和-11〇8-355-片段三个片段。5(^1反应体系中加入：10\81^€615以1;(1阶132.54 1; Pfu酶0.25μ1 ;上、下游引物各2.5μ1 ;含目的条带质粒（两个基因分别用含目的基 因的克隆质粒；nos-35S以ρΒΙ121表达载体）15ng ;ddH20加至50μ1。PCR反应程序 94°C -40s, 50°C -lmin, 72°C -Imin, 30个循环。目的条带进行切胶回收纯化，为下一步连接 备用。见图1。
[0044] 2、第二轮PCR :以a/f为引物对，以三条纯化片段为模板进行PCR扩 增。50μ1 反应体系中加入：10XBuffer 5μ1 ;dNTP 2·5μ1 ;Pfu 酶 0·25μ1 ;引 物a和f各2. 5μ1;三条纯化目的条带各约15ng;ddH20加至50μ1。PCR反应程序 94°C -40s，50°C -lmin, 72°C _3min，30个循环。目的条带进行切胶回收纯化，作为亚克隆和 表达载体构建备用。
[0045] 3、亚克隆与测序将第二轮PCR产生的目的条带约3500bp用pGEM-T载体连接试剂 盒进行TA连接，克隆到pGEM-T (Promega) easy vector载体（Promega)中进行PCR和测序 验证。
[0046] 4、双基因表达载体构建：将获得测序验证的连接产物，连同pBin438 (Clontech，） 空载体用BamHI和Sail进行双酶切，以连接产物/空载体以3/1比例混合用T4连接酶进 行连接，转化ToplO感受态，在含50mg/L卡那霉素培养基上进行筛选。挑选含50mg/L卡那 霉素培养基上生长良好的单菌落，先进行PCR检测，获PCR验证后提取质粒进行酶切检验， 见图2。
[0047] 实施例2、基于PCR快速构建的双基因表达载体在基因工程改良月季两个性状方 面的应用：
[0048] 材料：农杆菌GV3101，中国月季月月红。
[0049] 1、工程菌株构建：将MtDREBIC/RcXET双表达载体用CaCl2转化法导入农杆菌 GV3101，构建转化用工程菌株，用于基因转化。
[0050] 2、中国月季月月红转化：采用半透明愈伤组织为转化材料，以含 pBin438-MtDREBlC-nos-35S-RcXET的工程菌株进行转化，在含抗生素的筛选培养基上培养 6周分化出更多的球形胚，但球形胚有部分会褐化，在培养12周后部分球形胚甚至死亡， 但同时也有心形胚产生。在含抗生素的培养基上约16-20周后有体胚出现，这些体胚在转 移到含抗生素的芽分化培养基后有少量抗抗生素小植株能继续生长，大多褐化死亡（见图 3) 〇
[0051] 3、转化植株的分子检测：
[0052] (I) PCR检测：选取在筛选培养基上10株再生植株（以1个野生型植株为对照）， 进行PCR检测。检测体系：25 μ 1中含50ng基因组DNA (用Nucleon Hytopure plant DNA extraction kit (Amersham)提取），引物用npt II序列（AF485783)设计，正向引物为 Pl:5' -CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3'反向引物为 P2:5' -GCGGCGATACC GTAAAGCA C-3'。 PCR 程序：94°C _3min ;94°C -30s ;55°C -30s ;72°C -Imin ;30 个循环，结果见图 4,有 6 个株 系获得PCR验证。
[0053] (2) Southern检测：以PCR检测的阳性转基因株系的新鲜叶片为DNA提取材料。提 取DNA用BamHI按说明书进行月季基因组（设阴性对照）酶切。杂交方法参照DIG High Prime DNA Labeling Kit I(Roche)手册。结果如图5示，有5个株系获得Southern验证。
[0054] (3)荧光定量PCR检测：为检验RcXET基因是否增加了表达量，对RcXET进行荧光 定量PCR检测，发现其表达量增加了 4. 6倍.说明在两个目的基因 MtDREBlC和RcXET之间 插入35S启动子是成功的。
[0055] 4、转化植株的生理检测：为鉴定双基因聚合转化是否增强了转基因植株耐寒性， 将5个转基因株系和对照各10-20个芽置于-6°C进行寒处理2. 5天后，置于25±2°C正常 条件下培养14天。结果显示，对照的芽都不能恢复生长；而Southern杂交阳性转化株系 均有一定比例的存活率（T2 :55· 0% ;Τ5:52· 6% ;Τ7:20· 0% ;Τ8:70· 6% ;Τ10:45· 5% )，并 能恢复生长（图7)。结果说明，转MtDREBIC/RcXET基因的耐寒性大大增强。
[0056] 5、转化植株的生长情况：通过对转化植株的生长势进行检测统计，发现转化植株 不仅没有矮化现象，其植株平均总高度的增长速率（生长速率）与野生型相比，明显有增 加。在第6-8周，两者相差最大，约达5-7cm。这一结果表明，转MtDREBIC/RcXET基因可增 强转化株系的生长速率（图8)。
[0057] 因此，本发明用PCR方法快速构建双基因表达载体是成功的，可用于双基因甚至 多基因同时表达的。
【主权项】
1. 双基因表达载体的构建方法，其特征在于， 根据目的基因MtDREBIC、RcXET和-nos-35S-片段设计的引物对对目的基因MtDREBIC、RcXET和中间插入的终止子启动子序列-nos-35S-片段进行第一轮PCR扩增，将得到的三个 片段进行第二轮PCR扩增连接起来得到一个整体MtDREBlC-n〇s-35S-RcXET结构，然后克隆 到空白质粒中。2. 根据权利要求1所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 设计引物对如下： a :5' -CGGGATCCCTTATCTTCAGTTCCAACTTTCAC-3' ； b :5' -ACGCGTCGACTGCCTCTTCTTGTTCCTCAT-3' ； c ：ATTGCCAAATGTTTGAACGATCCTAAAAAATTCCATTTTCCTAC ： d ：GTAGGAAAATGGAATTTTTTAGGATCGTTCAAACATTTGGCAAT ； e ：TTGTCTGTGCAACACAGAGAGCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGA ； f ： TCATTTCATTTGGAGAGAACACGCTCTCTGTGTTGCACAGACAA 〇3. 根据权利要求2所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 第一轮PCR: 用3对引物a/b，c/d，e/f分别扩增MtDREBIC、RcXET和-nos-35S-片段三个片段； 第二轮PCR : 以a/f为引物对，以第一轮PCR得到的三条纯化片段为模板进行PCR扩增，得到一个整 体MtDREBlC-nos-35S-RcXET片段。4. 根据权利要求3所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 第一轮PCR反应条件： 50yl反应体系中加入：10XBuffer 5yl;dNTP 2.5yl;Pfu酶0.25yl;上、下游引 物各2. 5 y 1 ;含目的基因或者-nos-35S-片段的质粒15ng ;ddH20加至50 y I ;PCR反应程 序94°C -40s, 50°C -lmin, 72°C -Imin, 30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，为下一步连 接备用； 第二轮PCR反应条件： 50yl反应体系中加入：IOXBufTer5yI;dNTP2. 5yI;Pfu酶 0? 25y1 ;引 物a和f各2. 5yl;三条纯化目的条带各15ng;ddH20加至50yI;PCR反应程序 94°C-40s，50°C-lmin, 72°C_3min，30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，备用。5. 根据权利要求1所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 将第二轮产生的目的条带克隆到PGEM-T载体中进行PCR和测序验证； 最后将获得测序验证的连接产物克隆到pBin438空载体。6. 根据权利要求5所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 将获得测序验证的连接产物，连同pBin438空载体用BamHI和Sail进行双酶切，以连 接产物/空载体以3/1比例混合用T4连接酶进行连接，转化ToplO感受态，在含50mg/L 卡那霉素培养基上进行筛选；挑选含50mg/L卡那霉素培养基上生长良好的单菌落，先进行 PCR检测，获PCR验证后提取质粒进彳丁酶切检验。7. 双基因表达载体，其特征在于：是由权利要求1-6任一项所述的方法构建的。8. 用于构建权利要求7所述的双基因表达载体的引物对，其特征在于， a :5' -CGGGATCCCTTATCTTCAGTTCCAACTTTCAC-3' ； b :5' -ACGCGTCGACTGCCTCTTCTTGTTCCTCAT-3' ； c ：ATTGCCAAATGTTTGAACGATCCTAAAAAATTCCATTTTCCTAC ： d ：GTAGGAAAATGGAATTTTTTAGGATCGTTCAAACATTTGGCAAT ； e ：TTGTCTGTGCAACACAGAGAGCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGA ； f ： TCATTTCATTTGGAGAGAACACGCTCTCTGTGTTGCACAGACAA 〇9. 权利要求7所述的双基因表达载体的应用方法，其特征在于： 将所述的双基因表达载体转入月季中，以提高其耐寒性和抗矮化。10. 根据权利要求9所述的双基因表达载体的应用方法，其特征在于： 1)先将所述的双基因表达载体用CaCl2转化法导入农杆菌GV3101，构建转化用工程菌 株； 2) 采用半透明愈伤组织为转化材料，将工程菌株进行转化，最后进行抗生素的筛选。
【专利摘要】双基因表达载体及其构建和应用方法。本发明是以根据两个目的基因MtDREB1C和RcXET同时表达设计引物对，对目的基因及中间插入的终止子启动子序列-nos-35S-进行PCR扩增，仅用一个PCR快速将两个目的基因、中间插入的终止子启动子序列连接成一个整体MtDREB1C-nos-35S-RcXET结构序列。将该序列插入pBin438表达载体并转化农杆菌GV3101，进一步转化中国月季，获得了再生植株。有6株再生植株获得PCR验证，其中5株获Southern杂交的验证。生理检测结果表明，部分转化植株的耐寒性、耐旱性优于非转化植株(MtDREB1C表达结果)，生长速率也明显增强(RcXET表达结果)。该方法可用于需要两个以上基因同时表达的表达载体快速构建。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN104894161
【申请号】CN201510329462
【发明人】陈己任, 陈彦斌, 熊兴耀, 邓子牛
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月15日
【技术领域】：
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域；涉及一种双基因表达载体、引物、及其构建和 应用方法，尤指一种用PCR快速构建双基因表达载体的方法及该方法构建的双基因表达载 体在植物新品种培育中的应用。
【背景技术】：
[0002] 随着基因组的不断揭晓，新的功能基因不断出现，越来越多的育种研宄者将目光 投向基因工程研宄，并取得了较快进展。但是，大多数转化技术只是单个基因改良单一性 状。由于生物体的大部分性状往往是多基因控制，即要求多个相关基因的协同表达。因此， 双基因或多基因聚合改良同一性状或多个性状的研宄应运而生。双基因聚合在拟南芥、水 稻、杨树、烟草等植物中已开始研宄。这些研宄通常要将同时表达的两个基因通过PCR扩增 后酶切，通过三步酶切、三步连接，分次将基因1、基因2和-nos-35S-片段插入空表达载体 中；或者将一个基因插入空表达载体后，将另一个基因与表达载体中的报告基因转换。方法 复杂，耗时费力。如何利用快速构建双基因甚至多基因表达载体用于多种性状的改良，成为 一个亟待研宄和解决的问题。本发明提供了一种快速构建双基因表达载体的方法，为双基 因甚至多基因的聚合转化与品种改良利用提供一条快速途径。
【发明内容】
：
[0003] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于PCR的 双基因表达载体快速构建法，构建的载体和专用引物对及应用，具体地说，就是用两轮PCR， 快速将两个目的基因和含有终止子启动子的-nos-35S-片段连接成一个整体结构，构建成 表达载体，用于基因工程改良植物两种以上的性状。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是：
[0005] 双基因表达载体的构建方法：
[0006] 根据目的基因 MtDREBIC、RcXET和-nos-35S-片段设计的引物对对目的基因 MtDREBlC、RcXET和中间插入的终止子启动子序列-nos-35S-片段进行第一轮PCR扩增，将 得到的三个片段进行第二轮PCR扩增连接起来得到一个整体MtDREBlC-nos-35S-RcXET结 构，然后克隆到空白质粒中。
[0007] 上述方法中设计引物对如下：
[0008] a : 5 ' -CGGGATCC CTJATCT JCAGJTC￡AACTJTO -3?；
[0009] b : 5 ' -ACGCGTCGACT -3 ' ；
[0010] C :ATTGCCAAATGTTTGAACGATC 丄-
[0011] d :迎座赫'紐I GATCGTTCAAACATTTGGCAAT ;
[0012] e : CGTGTTCTCTCCAAATGAAATGA ;
[0013] f :TCATTTCATTTGGAGAGAACACG 。―
[0014] 上述方法中第一轮PCR :
[0015] 用3对引物a/b，c/d，e/f分别扩增MtDREBlC、RcXET和-nos-35S-片段三个片段；
[0016] 第二轮 PCR :
[0017] 以a/f为引物对，以第一轮PCR得到的三条纯化片段为模板进行PCR扩增，得到一 个整体 MtDREBlC-nos-35S-RcXET 片段。
[0018] 第一轮PCR反应条件：
[0019] 50μ1 反应体系中加入：10XBuffer 5μ1 ;dNTP 2·5μ1 ;Pfu 酶0·25μ1 ;上、下 游引物各2. 5μ1 ;含目的基因或者-nos-35S-片段的质粒15ng;ddH20加至50μ1 ;PCR反 应程序94°C -40s，50°C -lmin，72°C -lmin，30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，为下一 步连接备用；
[0020] 第二轮PCR反应条件：
[0021] 50μ1 反应体系中加入：IOXBuffer 5 μ I ;dNTP 2. 5 μ I ;Pfu 酶 0· 25 μ 1 ; 引物a和f各2. 5μ1;三条纯化目的条带各15ng ;ddH20加至50 μ I ;PCR反应程序 94°C -40s，50°C -lmin，72°C _3min，30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，备用。
[0022] 上述方法中将第二轮产生的目的条带克隆到pGEM-T载体中进行PCR和测序验证； 最后将获得测序验证的连接产物克隆到pBin438空载体，具体将获得测序验证的连接产 物，连同pBin438空载体用BamHI和Sail进行双酶切，以连接产物/空载体以3/1比例混 合用T4连接酶进行连接，转化ToplO感受态，在含50mg/L卡那霉素培养基上进行筛选；挑 选含50mg/L卡那霉素培养基上生长良好的单菌落，先进行PCR检测，获PCR验证后提取质 粒进行酶切检验。
[0023] 双基因表达载体：是由上述的方法构建的。
[0024] 所述的双基因表达载体的应用方法：将所述的双基因表达载体转入月季中，以提 高其耐寒性和抗矮化，具体如下：
[0025] 1)先将所述的双基因表达载体用CaCl2转化法导入农杆菌GV3101，构建转化用工 程菌株；
[0026] 2)采用半透明愈伤组织为转化材料，将工程菌株进行转化，最后进行抗生素的筛 选。
[0027] 本发明根据三个片段（两个基因及含有终止子启动子的-nos-35S-片段）设计 3个引物对，其特点是：正向引物取目的基因 MtDREBlC的前20bp加酶切位点；反向引物根 据目的基因 RcXET的序列的后20bp加相应的酶切位点；中间引物有四条，两两反向互补： 每条中间引物分两部分.分别横跨目的基因和终止子/启动子序列，如两条横跨MtDREBlC 和-nos-终止子，另两条横跨35S启动子和RcXET基因。Nos-终止子用于MtDREBlC基因的 终止；35S启动子用于RcXET基因的启动。
[0028] 本发明选用MtDREBlC和RcXET基因聚合月季，主要基于两点：一是MtDREBlC基因 经鉴定是转录因子基因，能显著提高月季的耐寒性，但过量表达引起植株矮化；RcXET基因 是从月季中克隆获得，与月季生长、尤其是茎和根的伸长密切相关，通过基因工程方法，将 两个基因聚合，转化月季，使两个基因在月季中同时表达，可能既增强月季的耐逆性，又可 能解决DREBl类基因过量表达引起的矮化问题。
[0029] 本发明仅用两轮PCR和一个亚克隆，就可以获得将MtDREBlC、nos-35S和RcXET三 个片段连接在一起形成MtDREBlC-nos-35S-RcXET的三片段连接序列，时间只约为三天。现 有技术通常要将三个片段逐一连接到载体上，每连接一个片段要经过PCR扩增、双酶切、连 接和亚克隆几个步骤，三个片段要分三次连接，比较顺利的话也需20天以上。但不顺利 的时候居多，原因在于：很多植物表达载体往往只有两个可用的酶切位点，第一次采用双 酶切连入一个片段，需花3天左右时间，但如果要连接两个以上片段，必须从第二个片段 开始采用单酶切连接，这就涉及到方向问题，也就是说，从第二个片段开始正向连接的可 能性只有50%，要经过筛选找到正确的连接克隆，才能进行下一步工作；三个以上片段的 连接更复杂，需将其中相邻的两个片段先用不同的酶进行酶切和连接，再作为一个整体的 片段接入已连入一个片段的表达载体上，过程相当复杂和耗时，耗时一般在一个月以上。
【附图说明】：
[0030] 图1:用基于PCR方法构建MtDREBlC-nos-35S-RcXET的反应过程示意图。实 线及实线箭头表示nos-35S序列，两端用虚线及虚线箭头表示MtDREBlC和RcXET基因 序列。中间引物（b，c，d，e)由两部分组成，分别涵盖两端连接序列；两端引物a和f分 别含BamHI和Sail酶切位点。第一轮PCR产生三个中间产物，第二轮PCR产物全长 MtDREBlC-nos-35S-RcXET序列，两端含BamHI和Sail酶切位点，以便插入含CaMV35S启动 子和nos终止子的pBin438表达载体用于基因转化和同时表达两个基因。
[0031] 图2 :用PCR法将MtDREBlC和RcXET序列连接到nos-35S两端，形 成MtDREBlC-nos-35S-RcXET结构。A、序列连接示意图：两边的虚线分别代表 MtDREBlC(780bp)和RcXET(933bp)基因；黑色长方形代表nos终止子，白色箭头代表35S启 动子，nos-35S为一起扩增的片段，总长1787bp。目的连接产物为3500bp。B、PCR产物电泳 图显示，用 3 条带 MtDREBlC (780bp,第 1 道）、nos-35S (1787bp，第 2 道）和 RcXET (933bp，第 3道）作混合模板，扩增出的产物MtDREBlC-nos-35S-RcXET条带特异性非常明显（3500bp， 第4道）。将纯化的3500bp连接产物（第5道）插入3000bp的pGEM-T Easy Vector克隆 载体和约13000bp的pBin438植物表达载体，提纯质粒进行酶切，结果显示连接产物在两个 载体中存在（第6、7道）。
[0032] 图3:中国月季基因转化。A、从叶片产生的胚性愈伤用于基因转化；B、转化的愈伤 在SM筛选培养基上培养6周分化的球形胚；C、在含抗生素的SM培养基上培养12周后部分 球形胚褐化或死亡，同时也有心形胚产生；D-F、在含抗生素的SM约16-20周后有体胚出现； G-I、体胚在转移到含抗生素的SP培养基后有抗生素小植株能继续生长，大多褐化死亡。
[0033] 图4:中国月季转基因株系PCR检测。以10个转化植株和1个对照植株叶片DNA 为模板、以Pl和P2为引物（见实施例中材料与方法）进行PCR扩增。PCR扩增产物的电泳 检测。M :DNA Marker ;CK+:以 pBin438-MtDREBlC-nos-35S-RcXET 质粒为模板；1-10 :转基 因植株；CK-:野生型中国月季DNA为模板的阴性对照。
[0034] 图5:再生月季Southern杂交分析。+ :扩增MtDREBlC的PCR产物为阳性对照；泳 道1-10:从PCR检测阳性再生月季植株中（编号为1、2、5、7、8、10)提取的基因组0嫩进行 BamHI酶切；W :从野生型月季中提取的基因组DNA(作阴性对照）。
[0035] 图6:月季转基因株系表达检测.RcXET的荧光定量PCR结果显示其表达量大约增 强了约4. 6倍，Xl为转化株系，X2为对照株系，Actin (Al, A2)为看家基
[0036] 因，计算结果根据公式：表达量倍数=4. 6。
[0037] 图7:月季转化株系耐寒性检测。Control :再生植株在正常培养条件下培养15天， 转到2°C驯化10天；freezing stress :驯化小植株置于-6°C寒处理60小时转到25±2°C 正常条件下培养14天。各株系幸存率（处理后存活数/处理前株数）标于图下方。W :作 非转基因对照的野生型植株；T2-T10 :S〇uthern杂交阳性转化株系。
[0038] 图8:双基因 MtDREBIC/RcXET过量表达植株的表型。
【具体实施方式】：
[0039] 以下将对本发明作进一步地说明，而不会形成对本发明的限制。
[0040] MtDREBlC和RcXET基因为本实验室克隆，GenBank的注册号分别为DQ267620和 ⑶320707(见序列表）。扩增终 止子启动子序列-nos-35S-片段（见序列表）以pBI121为 模板。引物对由美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen公司）合成。
[0041] 实施例1、用PCR法快速构建双表达载体：
[0042] 材料：含 MtDREBlC 和 RcXET 基因的 pGEM-T Easy Vector 质粒（Promega)克隆载 体和 pBI 121 质粒（AF485783) (Clontech) 〇
[0043] 1、第一轮 PCR :用 3 对引物（a/b, c/d, e/f)分别扩增 MtDREBIC、RcXET 和-11〇8-355-片段三个片段。5(^1反应体系中加入：10\81^€615以1;(1阶132.54 1; Pfu酶0.25μ1 ;上、下游引物各2.5μ1 ;含目的条带质粒（两个基因分别用含目的基 因的克隆质粒；nos-35S以ρΒΙ121表达载体）15ng ;ddH20加至50μ1。PCR反应程序 94°C -40s, 50°C -lmin, 72°C -Imin, 30个循环。目的条带进行切胶回收纯化，为下一步连接 备用。见图1。
[0044] 2、第二轮PCR :以a/f为引物对，以三条纯化片段为模板进行PCR扩 增。50μ1 反应体系中加入：10XBuffer 5μ1 ;dNTP 2·5μ1 ;Pfu 酶 0·25μ1 ;引 物a和f各2. 5μ1;三条纯化目的条带各约15ng;ddH20加至50μ1。PCR反应程序 94°C -40s，50°C -lmin, 72°C _3min，30个循环。目的条带进行切胶回收纯化，作为亚克隆和 表达载体构建备用。
[0045] 3、亚克隆与测序将第二轮PCR产生的目的条带约3500bp用pGEM-T载体连接试剂 盒进行TA连接，克隆到pGEM-T (Promega) easy vector载体（Promega)中进行PCR和测序 验证。
[0046] 4、双基因表达载体构建：将获得测序验证的连接产物，连同pBin438 (Clontech，） 空载体用BamHI和Sail进行双酶切，以连接产物/空载体以3/1比例混合用T4连接酶进 行连接，转化ToplO感受态，在含50mg/L卡那霉素培养基上进行筛选。挑选含50mg/L卡那 霉素培养基上生长良好的单菌落，先进行PCR检测，获PCR验证后提取质粒进行酶切检验， 见图2。
[0047] 实施例2、基于PCR快速构建的双基因表达载体在基因工程改良月季两个性状方 面的应用：
[0048] 材料：农杆菌GV3101，中国月季月月红。
[0049] 1、工程菌株构建：将MtDREBIC/RcXET双表达载体用CaCl2转化法导入农杆菌 GV3101，构建转化用工程菌株，用于基因转化。
[0050] 2、中国月季月月红转化：采用半透明愈伤组织为转化材料，以含 pBin438-MtDREBlC-nos-35S-RcXET的工程菌株进行转化，在含抗生素的筛选培养基上培养 6周分化出更多的球形胚，但球形胚有部分会褐化，在培养12周后部分球形胚甚至死亡， 但同时也有心形胚产生。在含抗生素的培养基上约16-20周后有体胚出现，这些体胚在转 移到含抗生素的芽分化培养基后有少量抗抗生素小植株能继续生长，大多褐化死亡（见图 3) 〇
[0051] 3、转化植株的分子检测：
[0052] (I) PCR检测：选取在筛选培养基上10株再生植株（以1个野生型植株为对照）， 进行PCR检测。检测体系：25 μ 1中含50ng基因组DNA (用Nucleon Hytopure plant DNA extraction kit (Amersham)提取），引物用npt II序列（AF485783)设计，正向引物为 Pl:5' -CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3'反向引物为 P2:5' -GCGGCGATACC GTAAAGCA C-3'。 PCR 程序：94°C _3min ;94°C -30s ;55°C -30s ;72°C -Imin ;30 个循环，结果见图 4,有 6 个株 系获得PCR验证。
[0053] (2) Southern检测：以PCR检测的阳性转基因株系的新鲜叶片为DNA提取材料。提 取DNA用BamHI按说明书进行月季基因组（设阴性对照）酶切。杂交方法参照DIG High Prime DNA Labeling Kit I(Roche)手册。结果如图5示，有5个株系获得Southern验证。
[0054] (3)荧光定量PCR检测：为检验RcXET基因是否增加了表达量，对RcXET进行荧光 定量PCR检测，发现其表达量增加了 4. 6倍.说明在两个目的基因 MtDREBlC和RcXET之间 插入35S启动子是成功的。
[0055] 4、转化植株的生理检测：为鉴定双基因聚合转化是否增强了转基因植株耐寒性， 将5个转基因株系和对照各10-20个芽置于-6°C进行寒处理2. 5天后，置于25±2°C正常 条件下培养14天。结果显示，对照的芽都不能恢复生长；而Southern杂交阳性转化株系 均有一定比例的存活率（T2 :55· 0% ;Τ5:52· 6% ;Τ7:20· 0% ;Τ8:70· 6% ;Τ10:45· 5% )，并 能恢复生长（图7)。结果说明，转MtDREBIC/RcXET基因的耐寒性大大增强。
[0056] 5、转化植株的生长情况：通过对转化植株的生长势进行检测统计，发现转化植株 不仅没有矮化现象，其植株平均总高度的增长速率（生长速率）与野生型相比，明显有增 加。在第6-8周，两者相差最大，约达5-7cm。这一结果表明，转MtDREBIC/RcXET基因可增 强转化株系的生长速率（图8)。
[0057] 因此，本发明用PCR方法快速构建双基因表达载体是成功的，可用于双基因甚至 多基因同时表达的。
【主权项】
1. 双基因表达载体的构建方法，其特征在于， 根据目的基因MtDREBIC、RcXET和-nos-35S-片段设计的引物对对目的基因MtDREBIC、RcXET和中间插入的终止子启动子序列-nos-35S-片段进行第一轮PCR扩增，将得到的三个 片段进行第二轮PCR扩增连接起来得到一个整体MtDREBlC-n〇s-35S-RcXET结构，然后克隆 到空白质粒中。2. 根据权利要求1所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 设计引物对如下： a :5' -CGGGATCCCTTATCTTCAGTTCCAACTTTCAC-3' ； b :5' -ACGCGTCGACTGCCTCTTCTTGTTCCTCAT-3' ； c ：ATTGCCAAATGTTTGAACGATCCTAAAAAATTCCATTTTCCTAC ： d ：GTAGGAAAATGGAATTTTTTAGGATCGTTCAAACATTTGGCAAT ； e ：TTGTCTGTGCAACACAGAGAGCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGA ； f ： TCATTTCATTTGGAGAGAACACGCTCTCTGTGTTGCACAGACAA 〇3. 根据权利要求2所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 第一轮PCR: 用3对引物a/b，c/d，e/f分别扩增MtDREBIC、RcXET和-nos-35S-片段三个片段； 第二轮PCR : 以a/f为引物对，以第一轮PCR得到的三条纯化片段为模板进行PCR扩增，得到一个整 体MtDREBlC-nos-35S-RcXET片段。4. 根据权利要求3所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 第一轮PCR反应条件： 50yl反应体系中加入：10XBuffer 5yl;dNTP 2.5yl;Pfu酶0.25yl;上、下游引 物各2. 5 y 1 ;含目的基因或者-nos-35S-片段的质粒15ng ;ddH20加至50 y I ;PCR反应程 序94°C -40s, 50°C -lmin, 72°C -Imin, 30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，为下一步连 接备用； 第二轮PCR反应条件： 50yl反应体系中加入：IOXBufTer5yI;dNTP2. 5yI;Pfu酶 0? 25y1 ;引 物a和f各2. 5yl;三条纯化目的条带各15ng;ddH20加至50yI;PCR反应程序 94°C-40s，50°C-lmin, 72°C_3min，30个循环；目的条带进行切胶回收纯化，备用。5. 根据权利要求1所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 将第二轮产生的目的条带克隆到PGEM-T载体中进行PCR和测序验证； 最后将获得测序验证的连接产物克隆到pBin438空载体。6. 根据权利要求5所述的双基因表达载体的构建方法，其特征在于： 将获得测序验证的连接产物，连同pBin438空载体用BamHI和Sail进行双酶切，以连 接产物/空载体以3/1比例混合用T4连接酶进行连接，转化ToplO感受态，在含50mg/L 卡那霉素培养基上进行筛选；挑选含50mg/L卡那霉素培养基上生长良好的单菌落，先进行 PCR检测，获PCR验证后提取质粒进彳丁酶切检验。7. 双基因表达载体，其特征在于：是由权利要求1-6任一项所述的方法构建的。8. 用于构建权利要求7所述的双基因表达载体的引物对，其特征在于， a :5' -CGGGATCCCTTATCTTCAGTTCCAACTTTCAC-3' ； b :5' -ACGCGTCGACTGCCTCTTCTTGTTCCTCAT-3' ； c ：ATTGCCAAATGTTTGAACGATCCTAAAAAATTCCATTTTCCTAC ： d ：GTAGGAAAATGGAATTTTTTAGGATCGTTCAAACATTTGGCAAT ； e ：TTGTCTGTGCAACACAGAGAGCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGA ； f ： TCATTTCATTTGGAGAGAACACGCTCTCTGTGTTGCACAGACAA 〇9. 权利要求7所述的双基因表达载体的应用方法，其特征在于： 将所述的双基因表达载体转入月季中，以提高其耐寒性和抗矮化。10. 根据权利要求9所述的双基因表达载体的应用方法，其特征在于： 1)先将所述的双基因表达载体用CaCl2转化法导入农杆菌GV3101，构建转化用工程菌 株； 2) 采用半透明愈伤组织为转化材料，将工程菌株进行转化，最后进行抗生素的筛选。
【专利摘要】双基因表达载体及其构建和应用方法。本发明是以根据两个目的基因MtDREB1C和RcXET同时表达设计引物对，对目的基因及中间插入的终止子启动子序列-nos-35S-进行PCR扩增，仅用一个PCR快速将两个目的基因、中间插入的终止子启动子序列连接成一个整体MtDREB1C-nos-35S-RcXET结构序列。将该序列插入pBin438表达载体并转化农杆菌GV3101，进一步转化中国月季，获得了再生植株。有6株再生植株获得PCR验证，其中5株获Southern杂交的验证。生理检测结果表明，部分转化植株的耐寒性、耐旱性优于非转化植株(MtDREB1C表达结果)，生长速率也明显增强(RcXET表达结果)。该方法可用于需要两个以上基因同时表达的表达载体快速构建。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN104894161
【申请号】CN201510329462
【发明人】陈己任, 陈彦斌, 熊兴耀, 邓子牛
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月15日
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