一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用
一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶 类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产， 具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目 标产物的生产水平，具有非常重要的意义。
[0003] 基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研宄手段，通常是指含已知序列的 DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组，整合至细胞受体基因组中，在特异性靶位点上增 加外源DNA片段，或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定 点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此，基因打靶技术在功能基因组 学以及菌株的基因工程改造研宄中发挥着至关重要的作用。随着大量组学数据的不断公 布，功能基因组学研宄以及基因工程改造往往涉及到多基因、多位点，而且还会用到多种研 宄策略。因此一种高效的遗传操作平台将可以为土曲霉功能基因组学研宄以及菌株基因工 程改造提供很大的便利。
[0004] 在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径（Non-homologous End Joining，NHEJ)，从而导致外源DNA主要以随机插入方式整合到基因组上，同源重组效 率低下，使得基因打靶技术的应用受到了严重制约。
[0005] 筛选标签是遗传操作过程中所需要的一种重要元件，外源DNA需要与筛选标签一 起整合到基因组上，然后再通过筛选标签的表型被筛选出来。而在土曲霉中可用的筛选标 签非常少，无法满足对多基因、多位点进行遗传改造的需求。位点特异性重组系统是一种重 要的分子遗传操作工具，在多种原核生物和真核生物中都成功应用于筛选标签的切除。其 原理是重组酶识别并结合到具有特殊DNA序列的靶位点上，催化重组反应，使得位于靶位 点之间的DNA片段被剔除。常用的位点特异性重组系统有Cre/loxP系统、β -rec/six系 统和Flp/FRT系统，但在传统应用过程中需要以穿梭质粒形式或基因组整合形式向细胞中 导入重组酶表达元件，通过在细胞内表达出重组酶作用于识别位点对筛选标签进行切除。 pyrG(乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因）是一种与尿嘧啶营养缺陷型菌株搭配使用的营养选择 型标签，基于PryG作为筛选标签的转化系统具有双向筛选功能的特征，筛选标签存在与否 都可以通过相应的筛选培养基进行筛选。因此搭配位点特异性重组系统使用，会使得筛选 标签的剔除更加尚效、易行。
【发明内容】
[0006] 为解决土曲霉菌种的同源重组能力低，筛选标签数量少导致基因打靶技术在土曲 霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种用于提高基因打靶技术在 土曲霉中应用效率的方法，所采取的技术方案如下：
[0007] 本发明的目的在于提供一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法， 该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提 高外源DNA的同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛 选标签的遗传转化系统，最后以直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组 系统切除两侧带有同向IoxP序列的筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能 再次用于基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化，以该方式实现筛选标签的循环利用。
[0008] 所述方法的步骤如下：
[0009] 1)以土曲霉为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因，构建外源DNA同源重组概 率提高的重组菌；
[0010] 2)在步骤1)所得重组菌的基础上敲除PyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株， 再以所得的尿喃啶营养缺陷型菌株为受体菌，以两端带有IoxP位点的PyrG基因表达元件 (loxP-pyrGl-loxP)作为筛选标记进行回补实验验证，建立基于pyrG筛选标记和尿喃啶营 养缺陷菌株的遗传转化系统，同时获得整合有ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌；
[0011] 3)利用步骤2)所得的整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌，结合改良的位 点特异性重组系统切除筛选标记，获得的ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签被切除的尿嘧啶营养 缺陷型重组菌，在该重组菌中ΙοχΡ-pyrGl-loxP可以再次作为筛选标签进行再次的基因工 程改造。该方式使得ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签可以多次、重复被应用于菌株的基因工程 改造，从而使遗传改造工作不受筛选标签数量所限制。
[0012] 所述方法的步骤如下：
[0013] 1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因（或lig4基因），构建外源DNA 同源重组概率提高的重组菌At- Δ ku80 (或At- Δ lig4);
[0014] 2)构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-K0,敲除步骤1)所得重组菌At-Aku80的pyrG 基因，获得PyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At- Λ ku80- Λ pyrG ;
[0015] 3)以曲霉的pyrG基因的表达框元件pyrGl为筛选标签构建以ku80基因上下游序 列作为同源臂的打靶元件ku80-pyrGl-gfp，将打靶元件ku80-pyrGl-gfp转化入步骤2)所 得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-AkuSO-ApyrG中进行回补实验验证，经过培养筛选以及 验证后，获得基于尿喃啶营养缺陷型重组菌At-Δ ku80-Δ pyrG和pyrGl的遗传转化系统， 获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标记的的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP ;
[0016] 4)制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl_loxP的原生质体，向所得的原生质 体内导入Cre重组酶切除筛选标签pyrGl，通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrGl 筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At- Δ ku80_ Δ pyrGl-loxP。
[0017] 重组菌 At-Δ ku8〇-ApyrGl-IoxP 恢复了步骤 2)所获得重组菌 At-Δ ku8〇-Δ pyrG 的尿嘧啶营养缺陷的特征，可再次作为受体菌用于基于pyrGl筛选标签的遗传转化。
[0018] 优选地，步骤1)所述敲除ku80基因，是通过PCR扩增出基因 ku80的上游序列 U-ku80和下游序列D-ku80,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA 片段分别与上游U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别 扩增出打祀元件ku80_A和打祀元件ku80_B，再将打祀元件ku80_A和打祀元件ku80_B转化 到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后筛选敲除ku80基因的转化子。
[0019] 优选地，步骤1)所述敲除lig4基因，是通过PCR扩增出基因 lig4的上游序列 U-lig4和下游序列D-lig4,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA 片段分别与上游U-lig4和下游序列D-lig4进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别 扩增出打祀元件lig4_A和打祀元件Iig4-B，再将打祀元件Iig4-A和打祀元件Iig4-B转化 到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后筛选敲除lig4基因的转化子。
[0020] 优选地，步骤2)所述构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO,是以土曲霉的基因组为 模板，设计引物通过PCR分别扩增出pyrG基因的上游序列U-pryG和下游序列D-pyrG，通过 融合PCR将U-pryG和D-pyrG进行融合，再以融合片段为模板，通过巢式PCR扩增出pyrG 基因的打革El元件PyrG-KO ;
[0021] 优选地，步骤3)所述构建打革El元件ku80-pyrGl_gfp，是人工合成带有两个同向 IoxP序列位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，再将该DNA片段克隆到载体 pUC57simple上，获得载体PalcA-syn ;以黑曲霉C〇827基因组为模板，设计引物通过PCR扩 增获得黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，将筛选标签pyrGl克隆到载体 PalcA-syn上的两个同向IoxP位点之间，获得质粒pXH103 ;再以pSGF957为模板，设计引物 进行PCR扩增gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC表达元件连接到质粒pXH103上，获得质粒 PXH104;再以土曲霉基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增ku80基因的下游和上游同 源臂，并先后克隆到质粒PXH104上，获得质粒pXH106,再以质粒pXH106为模板，通过PCR扩 增获得打祀元件ku80-pyrGl-gfp ;
[0022] 优选地，步骤4)所述导入Cre重组酶切除筛选标签pyrGl，是向已制备好的 100 μ L重组菌At- Δ ku8〇-pyrGl-loxP的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1 μ g pyrGl 片段和10 μ L 40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入1ml STC溶液后于30°C下孵育 30min，孵育结束后与含有I. 2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混 合后倾注于含有I. 2M山梨醇，lg/L 5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基 平板上，在30°C、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子传代纯化3-5次，筛选验 证后获得筛选标签pyrGl被切除的尿喃啶营养缺陷重组菌At- Δ ku80- Δ pyrGl-loxP，该重 组菌在CD平板上无法生长，可再次作为受体菌用于基于pyrGl筛选标签的遗传转化。
[0023] 优选地，所述方法的具体步骤如下：
[0024] 1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，以质粒pPTR II为模板，以SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组 为模板，以SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出上游序列 U-ku80;以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 7所示核苷酸序 列为引物，通过PCR扩增出上游序列D-ku80 ;通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQ ID NO. 8-SEQ ID NO. 9所示核 苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQ ID NO. 10-SEQ ID NO. 11所 示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B ;再将打靶元件ku80-A和打靶元件 ku80-B转化到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得 敲除ku80基因的重组菌At-Δ ku80 ;
[0025] 2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 13所示 核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的上游序列U-pyrG ;再以土曲霉CICC40205的基因组为 模板，以如SEQ ID NO. 14-SEQ ID NO. 15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序 列D-pyrG ;再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为 模板，以如SEQ ID NO. 16-SEQ ID NO. 17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基 因的打革G元件pyrG-KO,再制备步骤1)所得重组菌At-Aku80的原生质体，再将pyrG基因 的打革G元件pyrG-KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿喃啶营养 缺陷型菌株At- Δ ku80_ Δ pyrG ;
[0026] 3)通过人工合成带有两个同向IoxP序列位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，再将该DNA片段克隆到载体PUC57simple上，获得载体PalcA-syn ;以黑曲霉 Co827基因组为模板，以如SEQ ID NO. 18-SEQ ID NO. 19所示核苷酸序列为引物，通过PCR 扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，再将筛选标签pyrGl克隆到载 体PalcA-syn上，获得质粒pXH103,获得如SEQ ID NO. 26所示的两侧带有同向IoxP位点 序列的 PyrGl 筛选标签 loxP-pyrG-loxP ;再以 pSGF957 为模板，以如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID NO. 21所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC 片段连接到质粒PXH103上，获得质粒pXH104 ;再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如 SEQ ID NO. 22-SEQ ID NO. 23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源 臂片段，再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105 ; 再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO. 24-SEQ ID NO. 25所示核苷酸序 列为引物，通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源 臂片段连接到质粒PXH105上，获得质粒pXH106 ;最后再以质粒pXH106为模板，以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80-pyrGl-gfp ;再将 打靶元件 ku80-pyrGl-gfp转化入步骤2)所得的尿喃啶营养缺陷型菌株At- Δ ku80- Δ pyrG中，经过 培养筛选后获得带有1〇1?15^61-1(??的重组菌41：-八1〇18〇15^61-1(??;从而证明成功建 立了基于尿嘧啶营养缺陷重组菌和PyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统。
[0027] 4)制备步骤3)所得重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP的原生质体，向已制备好的 100 μ L浓度为IO8个/mL的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1 μ g pyrGl片段和10 μ L 40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育 结束后与含有I. 2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注 于含有I. 2M山梨醇，lg/L 5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基平板中， 在30°C、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子接种到⑶FU平板上于32°C下培 养5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，获得pyrGl筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷 型重组菌At- Λ ku80_ Λ pyrGl-loxP ;从而实现筛选标签的循环利用，突破遗传改造受筛选 标签数量的限制；
[0028] 所述任一方法用于制备土曲霉重组菌。
[0029] 所述任一方法制备的土曲霉重组菌重组菌。
[0030] 表达元件：能在细胞内有效驱动目的基因转录表达的DNA片段，包括启动子、基因 和终止子。
[0031] 本发明有益效果：
[0032] 通过本发明提供的方法进行基因打靶技术的应用，具有基因打靶效率高、筛选标 签可反复使用的优点，包括同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法 简单易行、筛选标签可循环利用等，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行多基因、 多位点、多策略的遗传改造提供基础支持。
[0033] 本发明通过在土曲霉内敲除ku80基因或lig4基因的方式提高了外源DNA与基因 组发生同源重组的概率，基于尿嘧啶营养缺陷型突变株和PyrG筛选标记建立可双向筛选 遗传转化系统，通过直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用Cre/loxP位点特异性重组系 统实现特定筛选标签的高效切除，从而建立了一个同源重组高效的、改造不受筛选标签数 量限制的高效基因打靶平台。
[0034] 本发明首次在土曲霉中通过敲除ku80或lig4的方式提高外源DNA同源重组效 率，针对野生型菌株中基因敲除效率低（只有约10% )，本发明采用split-marker方法对 ku80或lig4进行敲除，敲除成功率达到50%。采用位点特异性重组系统切除筛选标签的 传统方法主要有两种：一种是将重组酶基因的表达元件克隆到可在宿主中自主复制的质粒 上，并转化到宿主中，通过在宿主体内表达重组酶对位于特异性识别位点间的筛选标签进 行切除，随后再通过反复传代筛选使质粒随机丢失；第二种方法是将重组酶基因的诱导型 表达元件与筛选标签串联并在两侧加上同向特异性识别位点，然后转化、整合到宿主菌染 色体上，通过合适的诱导条件诱导重组酶在体内表达，对位于特异性识别位点内的筛选标 签及重组酶表达元件进行切除。这两种传统方法实施过程复杂，条件苛刻，例如异源的重组 酶基因是否表达以及表达活性都是未知的。第一种方法需要一种在曲霉中非常少见的自主 复制质粒以及一个额外的抗性筛选标签，而且后期的质粒丢失偶然因素大；第二种方法则 需要一种优秀的诱导型启动子，而这种启动子在曲霉中很少见，上述因素限制了通过位点 特异性重组系统切除曲霉内的筛选标签。
[0035] 本发明首次在土曲霉中通过位点特异性重组系统实现筛选标签的切除，而且是通 过将Cre重组酶直接导入至细胞内进行筛选标签的切除，使用的筛选标签是可双向筛选的 PyrG基因，过程相对简单，不需要构建重组酶基因表达元件，不需要土曲霉自主复制质粒和 诱导型启动子，不需要经历质粒丢失过程。本发明实施例涉及的基于PyrG基因的转化体系 中，尿嘧啶营养缺陷型菌株是通过PyrG完全敲除的方式获得，相对于诱变方法获得的菌株 而言遗传稳定性更好。Sc筛选标签的筛选体系中需要硒酸盐作为筛选药物，而硒酸盐在使 用过程中对实验人员有安全隐患，作为剧毒药品受到管制，购买十分困难，丝状真菌中目前 只有在米曲霉中成功建立了基于sC的遗传转化系统；硝酸还原酶niaD筛选标签的筛选体 系中也要使用高浓度的氯酸盐，制备过程麻烦，而且niaD营养缺陷型菌株的自发回复概率 高，筛选过程中假阳性高；相对而言，PyrG筛选标记筛选过程简单，涉及的药品5-氟乳清 酸、尿嘧啶或尿苷酸容易购买且价格便宜。但是并非是所有物种中都成功建立了基于PyrG 筛选标签的转化系统，而且同一物种中的不同菌株在建立该遗传转化系统时也难度不一， 例如研宄人员发现很多米曲霉菌株无法获得PyrG基因失活缺陷型菌株，因而只在少数几 株米曲霉菌株中成功建立了该遗传转化系统。
【附图说明】
[0036] 图1为实施例1提供的土曲霉pdc基因敲除原理不意图。
[0037] 图2为敲除土曲霉CICC40205菌株pdc基因所得转化子的基因组PCR验证；
[0038] (图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果， 图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是 CICC40205 野生型菌株作为对照， 1-20为所获得转化子）。
[0039] 图3为敲除ku80基因的打靶元件及其发生同源重组敲除ku80基因的示意图；
[0040] (F1 是引物 Uku80-F，F2 是引物 Cku80-F，F3 是引物 PtrA-F，F4 是引物 ptrA-F171， Rl是引物Dku80-R，R2是引物Cku80-R，R3是引物ptrA-R，R4是引物ptrA-R744，F5是引物 ku8〇-probe-F，R5 是引物 ku8〇-probe-R)。
[0041] 图4为敲除ku80基因所获转化子的基因组PCR验证结果图；
[0042] (图 A 为引物 ptrA-F/ptrA-R(F3/R3)验证结果，图 B 为引物 Uku80-F/ptrA-R(Fl/ R3)验证结果，图C为引物ptrA-F/Dku80-R(F3/Rl)验证结果，图D为引物ku80-probe-F/ ku80-probe-R(F5/R5)验证结果；M 为 Ikb DNA ladder(TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C是CICC40205野生型菌株作为对照，1-4为所获得转化子）。
[0043] 图5为敲除lig4基因的打靶元件及其发生同源重组敲除lig4基因的示意图。
[0044] 图6为本发明实施例提供的敲除lig4基因工程菌株的基因组PCR验证结果；
[0045] (图A为引物ptrA-F/ptrA-R验证结果，图B为引物Ulig4-F/ptrA-R验证结果， 图C为引物ptrA-F/Dlig4-R验证结果，图D为引物Iig4-F/Iig4-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是 CICC40205 野生型菌株作为对照， 八1184为敲除了1184的转化子八1：-八1184)。
[0046] 图7为在工程菌株At-Δ1αι80中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结 果；
[0047] (其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结 果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是工程菌株 At-Δ1αι80 作为对照， 1-19为所获得转化子）。
[0048] 图8为在工程菌株At-Δ lig4中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结 果；
[0049] (其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结 果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 DL2000DNA ladder (TAKARA)，C 是工程菌株 At- Δ lig4 作为对照， 1-19为所获得转化子）。
[0050] 图9为敲除土曲霉pyrG基因原理示意图；
[0051] (其中，pdc为待敲除基因，Up是上游同源臂U-pyrG，Down是下游同源臂D-pyrG, 箭头为引物设计位点）。
[0052] 图10为敲除土曲霉pyrG基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
[0053] (其中，图A为引物hph-F/DpyrG-R验证结果，图B为引物C-F4/C-R验证结果，图 C 为引物 S-pyrG-F/S-pyrG-R 验证结果；M 为200bp DNA Iadder(TAKARA)，Δ1αι80 是工程菌 株At- Δ ku80作为对照，1#、2#为敲除pyrG基因的得转化子）。
[0054] 图11为质粒PalcA-syn的结构示意图。
[0055] 图12为回补元件ku80-pyrGl-gfp及其与ku80位点定点整合原理示意图；
[0056] (其中，ku80-UP、ku80-Dw分别为ku80基因的上下游同源臂，pyrGl为作为筛选标 记的来自黑曲霉PyrG基因表达元件（包括启动子、pyrG基因编码区和终止子），箭头为引 物设计位点）。
[0057] 图13为ku80_pyrGl_gfp元件回补尿喃啶营养缺陷型菌株At-Δ ku8〇-Δ pyrG所 获得转化子的基因组PCR验证结果；
[0058] (其中，图A为引物Uku80-F/pyrGl-R验证结果，图B为引物pyrGl-F/pyrGl-R 验证结果，图C为引物pyrGl-F/TtrpC-R验证结果，图C为引物pyrGl-F/Dku8〇-R验证 结果；M 为 Ikb DNA Iadder(TAKARA)，M2 为 200bp DNA Iadder(TAKARA)，C 是工程菌株 At- Δ ku80_ Δ pyrG作为对照，1-6为回补实验所获得转化子）。
[0059] 图14为直接导入Cre重组酶切除pyrGl筛选标记所得转化子的基因组PCR验证 图；
[0060] (M 为 Ikb DNA ladder (TAKARA)，C 是工程菌株 At-Δ ku8〇-pyrGl_loxP 作为对照， 1-8为回补实验所获得转化子）。
[0061] 图15为切除了 pyrGl筛选标签工程菌株At-Δ1αι80-ApyrGl-IoxP的DNA测序结 果；
[0062] (其中，ku80-UP为ku80基因上游同源臂，IoxP为Cre重组酶特异性识别的IoxP 序列，PalcA为PalcA启动子序列，在工程菌株At-Aku8〇-pyrGl_loxP中pyrGl本位于 ku80-UP和PalcA序列之间）。
【具体实施方式】
[0063] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0064] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0065] 本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒（D6942-01), DNA 片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒（D6492-01),凝胶回收是采用OMEGA 公司 Gel Extraction Kit 试剂盒（D2500-01)。
[0066] CD平板的组成为：3g/L NaNO3,2g/L KCl，lg/L KH2PO4,0· 5g/L MgSO4 ·7Η20,0· 02g/ L FeSO4 · 7H20, lOg/L 葡萄糖，琼脂糖。
[0067] IPM液体培养基：60g/L葡萄糖，2g/L NH4NO3, 20mg/L NH4HPO4, 20mg/L FeSO4,0· 4g/ L MgS04,4. 4mg/L ZnS04,0. 5g/L 玉米浆，pH 3· 5。
[0068] 实施例1分析土曲霉CICC40205野生型菌株中外源DNA同源重组整合概率
[0069] I. 1构建土曲霉丙酮酸脱羧酶基因 pdc (ATET_04633)打靶元件
[0070] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Updc-F(5' -agagggtggt atcattccgttg-3'）、Updc-R(5' -ctttacgcttgcgatcccgaacccctgagtgagaaggaacatg-3'）、 Dpdc-F(5? -cctgggttcgcaaagataattgatccgaaacaacctcaacccg-3, )> Dpdc-R(5? -cgaggtg tgcgcaacaggcatgaatg-3'），以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合 酶（Fermentas，Catalog No. :EP0501)进行 PCR扩增，用引物 Updc-F/Updc-R 可以扩增获得 大小约为1.9kb的pdc基因的上游序列U-pdc，用引物Dpdc-F/Dpdc-R可以扩增获得大小 为2. Ikb的pdc基因下游序列D-pdc。以 DSGF957为樽板，用引物hph-F(5'-TTCGGGATCGCA AGCGTAAAG-3'）和 hph-R(5' -CAATTATCTTTGCGAACCCAGG-3'）进行 PCR 扩增，获得大小约为 2. 2kb的潮霉素抗性筛选标记hph。将所有PCR产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割 胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-pdc片段、D-pdc片段和hph片段进行融合，并以该融 合 PCR 的产物作为模板，以 Cpdc_F(5' -tcgcttccaacaacactcattcc-3'）和 Cpdc_R(5' -tgt cgttggccgtccatcctag-3'）作为引物扩增获得大小约为6. Ikb的pdc基因敲除元件pdc-KO 片段（如图1，其中hph是筛选标记潮霉素抗性基因，pdc为待敲除基因，Up是上游同源臂 U-pdc，Down是下游同源臂D-pdc ;箭头为引物设计位点）。
[0071] L 2原生质体制备
[0072] 将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL液体IPM培养基中，使孢子浓度约为IO7 个/mL，在200rmp、32°C培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用 灭菌的0. 6M MgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取Ig菌丝，加入 1〇1111酶解液，在30 <€、60印1]1处理1-311。酶解液成分为：0.8%纤维素酶（3丨〖1]^，〇3丨31(^ No. :C1184)、0.8%裂解酶（Sigma，Catalog NO. :L1412)、0.4%蜗牛酶（上海生工，Catalog No. :SB0870)、0. 6M MgSO4，经由0. 22μπι的无菌过滤器过滤除菌。将上述酶解后的混合液 先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。4°C、4000rpm离心收集原生质体，用预冷1.0 M山梨醇溶 液洗涤一次，再用预冷的 STC(STC 为 1.0 M 山梨醇，50mM Tris .HCl-pH 8. 0,50mM CaCl2)洗 涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5 X IO7个/ mL，得到原生质体悬液。
[0073] 1. 3原生质体转化及筛选验证
[0074] 向150 μ 1上述原生质体悬液中同时加入10 μ 1的pdc-KO (约3 μ g)，再加入50 μ 1 PSTC(PSTC 为 40% PEG4000,1. 2Μ 山梨醇，50mM Tris-HCl-pH8. 0,50mM CaCl2)，轻轻混匀， 冰浴30min。加入ImL PSTC，混匀后室温放置20min ;然后与15mL上层琼脂（PDB+1. 2M山 梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDA-SH上 (PDA平板+1. 2M山梨醇+100mg/L潮霉素 B)，在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0075] 从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上（PDA平 板+100mg/L潮霉素 B)，在32°C培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取20个转化子 的孢子接种于IPM液体培养基中，30°C、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图 2中所示引物进行基因组PCR验证。如图2A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标 记hph ;如图2B、2C所示，只有10#和17#转化子中pdc-LKO元件是通过同源重组方式整合 到了 Pdc基因位点上。如图2D所示，除10#和17#之外的其他转化子都和对照菌株土曲霉 CICC40205 -样扩增出了 I. 5kb的pdc基因内部片段，这说明这些转化子的pdc基因未被敲 除。由此可知只有10#和17#转化子是外源DNA发生了同源重组，土曲霉CICC40205菌株 中外源DNA的同源重组概率为2/20, g卩10%。
[0076] 实施例2构建敲除ku80基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At- Δ ku80
[0077] 2. 1构建敲除ku80的打靶元件
[0078] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Uku80-F(5'-gtCgtag Ctc ttcttgccatc-3'）、Uku8〇-R(5'-aatgggatcccgtaatcaattgccctcaatcaccatctcccttatc-3'）、 0^8〇-?(5? -caagagcggctcatcgtcaccccattccggcctcgatgtggatgc-3, )>0^80^(5? -tcca cgcggccatcaccgagc-3'），以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，米用pfu DNA聚合酶 (Fermentas, Catalog No. :EP0501)进行 PCR 扩增，用引物 Uku80-F/Uku80-R 可以扩增获得 大小约为I. 5kb的ku80的上游序列U-ku80,用引物Dku80-F/Dku80-R可以扩增获得大小为 I. 5kb 的 ku80 的下游序列 D-ku80。以质粒 pPTR II (TAKARA, Catalog No. :3621)为模板， 以 ptrA_F(5' -gggcaattgattacgggatd'）和 ptrA-R(5' -atggggtgacgatgagccgc-3'）作 为引物扩增获得大小约为2. Okb的ptrA片段，经I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回 收纯化。用融合PCR的方法将U-ku80片段、D-ku80与ptrA片段进行融合，并以该融合PCR 的产物作为模板，以 Cku80_F(5' -gggtttctagaagtcacatc-3'）和 ptrA_R744(5' -atggccca tcgtgaccagtggtac-3'）作为引物扩增获得大小约为3. Okb的ku80敲除元件ku80-A，以Ck uSO-Rb'-atcaccgaccctacgctgtg-3'）和 ptrA_F171(5'-ggtctctcgtgccatgaccagacg-3'） 作为引物扩增获得大小约为2. 6kb的ku80敲除元件ku80-B，如图3。
[0079] 2. 2原生质体转化
[0080] 将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL液体培养基IPM中，如实施例1中描述制 备原生质体溶液，向150 μ 1上述原生质体悬液中同时加入5 μ 1的ku80-A片段（约2 μ g) 和5 μ 1的ku80-B片段（约L 5 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入ImL PSTC，混匀后室温放置20min ;然后与15mL上层琼脂（⑶+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后 48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板⑶SP上（⑶平板+1. 2M山梨醇+0.1 mg/ L吡啶硫胺），在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0081] 2. 3转化子的筛选验证
[0082] 从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板⑶P上（⑶平板+0. lmg/L 吡啶硫胺），在32°C培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。随机挑取4株转化 子于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图3所示引物位点进行了基 因组PCR验证。如图4A所示，以F3/R3为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约 2kb的ptrA目的条带，而出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明这4个转化子中 整合了完整的PtrA筛选标记。如图4B、4C所示，用引物对F1/R3和引物对F3/R1分别进行 PCR检测，结果2#、3#转化子都分别扩增出了大小约为3. 5kb的目的条带，其他转化子则无 条带，这说明2#、3#转化子是打靶元件在ku80位点上发生了同源重组。如图4D所示，用设 计在 ku80 基因内部的引物对 ku8〇-probe_F(5' -gcactctcgaacaggcagtgtc-3'）和 ku80_p robe_R(5' -atcagtcgtgtcgatgtgaactgc-3'）进行 PCR 验证，2#、3# 转化子未能和野生型菌 株WT -样扩增出600bp大小的条带，这说明2#、3#转化子的ku80基因被成功敲除，阳性率 为50%，由此可见本发明所采用的方法进行基因敲除的成功率达到50%，高于普通方法的 10%。将该3#转化子定义为NHEJ途径缺失的土曲霉基因工程菌株At- Δ ku80。
[0083] 实施例3构建敲除lig4基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At-Λ lig4
[0084] 3· 1构建split-marker方法敲除Iig4的打革E元件
[0085] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Ulig4-F(5'-Cggctattct cacgcagctc-3'）、Ulig4_R(5' -aatgggatcccgtaatcaattgccc atacagggtcatcctcggtc-3'）、 Dlig4_F(5' -caagagcggctcatcgtcaccccat AtataatgatagctttgctC-3' ）、Dlig4_R(5' -cgt ttgactgtcgcgacgtttcg-3'），以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合 酶（Fermentas, Catalog No. :EP0501)进行 PCR扩增，用引物 Ulig4_F/Ulig4_R 可以扩增获 得大小约为I. 5kb的ku80的上游序列U-lig4,用引物Dlig4-F/Dlig4-R可以扩增获得大小 为I. 5kb的lig4的下游序列D-lig4,经I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。 用融合PCR的方法将U-lig4片段、D-lig4与ptrA片段（实施例2中所述）进行融合，并 以该融合 PCR 的产物作为模板，以 Clig4_F(5' -gaggtcacagccgagactgc-3'）和 ptrA_R744 (5'-atggcccatcgtgaccagtggtac_3'）作为引物扩增获得大小约为3. Okb的lig4敲除元件 lig4_A，以 Clig4-R(5' -ctttccttggcttcctttcg-3'）和 ptrA-F171 (5' -ggtctctcgtgccatg accagacg-3'）作为引物扩增获得大小约为2. 6kb的lig4敲除元件Iig4-B。3. 2原生质体 转化及筛选
[0086] 如实施例1中所述制备土曲霉CICC40205的原生质体溶液，向150 μ 1该原生质体 悬液中同时加入5 μ 1的Iig4-A片段（约2 μ g)和5 μ 1的Iig4-B片段（约L 5 μ g)，再加 入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加入ImL PSTC，混匀后室温放置20min ;然后与15mL 上层琼脂（⑶+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培 养基平板⑶SP上（⑶平板+1. 2M山梨醇+0. lmg/L吡啶硫胺），在30°C、黑暗条件下培养5 天。3.31ig4基因缺失菌株的验证
[0087] 从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板⑶P上（⑶平板+0. lmg/L 吡啶硫胺），在32°C培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。提取基因组进行 PCR验证后，参照图5(箭头代表引物设计位点）所示引物位点进行了基因组PCR验证，获 得lig4被完全敲除的工程菌株At-Δ lig4。如图6A所示，以ptrA-F/ptrA-R为引物对进 行PCR检测，工程菌株At- Δ lig4扩增出了大小约2kb的ptrA目的条带，而作为对照的出 发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明该菌株中整合了完整的ptrA筛选标记。如图 6B、6C所示，用引物对Ulig4-F/ptrA-R和引物对ptrA-F/Dlig4-R分别进行PCR检测，工程 菌株At-Λ lig4分别扩增出了大小约为3. 5kb的目的条带，而作为对照的出发菌株土曲霉 CICC40205未有该条带，这说明该菌株是打靶元件在lig4位点上发生了同源重组。如图6D 所示，用设计在lig4基因内部的引物对lig4_F(5' -tgcaactccacatgcagtctgac-3'）和Ii g4-R(5'-cggacacaatcaaggatccacg_3'）进行 PCR 验证，工程菌株 At- Δ lig4 未能和野生型 菌株WT-样扩增出大小约为1.5kb的条带，这说明工程菌株At-Alig4的lig4基因被成 功敲除。
[0088] 实施例4分析NHEJ途径缺失基因工程菌株中外源DNA同源重组概率
[0089] 4. 1分析ku80缺失菌株At- Δ ku80中外源DNA同源重组概率
[0090] 接种上述基因工程菌株At- Δ ku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝 培养，参照上述实施例1. 2所描述的方法制备原生质体，向150 μ 1原生质体悬液中同时加 入10 μ 1敲除元件pdc-κο片段（约3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加 入ImL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂（PDB+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂 糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上（PDA平板+1. 2M山 梨醇+100mg/L潮霉素 B)，在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0091] 从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上（PDA平 板+100mg/L潮霉素 B)，在32°C培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子的 孢子接种于IPM液体培养基中，30 °C、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图1 中所示引物进行基因组PCR验证。如图7A所示19个转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标 记hph ;如图4 B、4C所示，除8#转化子外其他转化子都分别扩增到了大小为4. Ikb和4. 3kb 的条带，这说明这些转化子中Pdc-KO元件是通过同源重组方式整合到了 pdc基因位点上。 如图4D所示，只有8#转化子和对照菌株土曲霉CICC40205 -样扩增出了 I. 5kb的pdc基 因内部片段，这说明除8#转化子之外其他18个转化子中pdc基因都被敲除，由此可知只有 8#转化子中的外源DNA没有发生同源重组。ku80缺失菌株At-Δ1αι80中外源DNA的同源 重组概率为18/19,即94. 7%。这说明敲除土曲霉CICC40205的ku80基因使外源DNA的同 源重组概率从10%提高到了 94. 7%。
[0092] 4. 1分析lig4缺失菌株At-Δ lig4中外源DNA同源重组概率
[0093] 接种上述基因工程菌株At-Δ lig4的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝 培养，参照上述实施例1. 2所描述的方法制备原生质体，向150 μ 1原生质体悬液中同时加 入10 μ 1敲除元件pdc-κο片段（约3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加 入ImL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂（PDB+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂 糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上（PDA平板+1. 2M山 梨醇+100mg/L潮霉素 B)，在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0094] 从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上（PDA平 板+100mg/L潮霉素 B)，在32°C培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子 的孢子接种于IPM液体培养基中，30°C、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图 1中所示引物进行基因组PCR验证。如图8A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标 记hph ;如图4B、4C所示，所有19个转化子都分别扩增到了大小约为4. Ikb和4. 3kb的条 带，这说明所有转化子中Pdc-LKO元件都是通过同源重组方式整合到了 pdc基因位点上。如 图4D所示，没有转化子和对照菌株土曲霉CICC40205 -样扩增出了 I. 5kb的pdc基因内 部片段，这说明19个转化子中pdc基因都被敲除。由此可知19个转化子中的外源DNA都 发生了同源重组，lig4缺失菌株At-Δ lig4中外源DNA的同源重组概率为19/19,即100%。 这说明敲除lig4使土曲霉CICC40205中外源DNA的同源重组概率从10%提高到了 100%。
[0095] 实施例5构建尿嘧啶营养缺陷型土曲霉基因工程菌株
[0096] 5. 1构建pyrG打祀元件
[0097] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物UpyrG-F(5' -tccatcc gatggccattcgtggc-3' ）、 UpyrG-R(5' -ctttacgcttgcgatcccgaaaaggtcaattgagacttggacg ac_3'）、DpyrG_Fl(5' -tttcgggatcgcaagcgtaaagatgatgagcatgaagaattatgd'）、DpyrG_R (5' -cgaggtcctaccgatgatgttgc-3'），以土曲霉菌株 CICC40205 的基因组为模板，采用 pfu DNA 聚合酶（Fermentas，Catalog No. :EP0501)进行 PCR 扩增，用引物 UpyrG-F/UpyrG-R 可 以扩增获得大小约为2. 5kb的pyrG的上游序列U-pyrG，用引物DpyrG-Fl/DpyrG-R可以扩 增获得大小为2. 5kb的pyrG下游序列D-pyrG，经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回 收纯化。用融合PCR的方法将U-pyrG片段与D-pyrG片段进行融合，并以该融合PCR的产 物作为模板，以 CpyrG_F(5' -gtcgtaaatcgttctttgtactg-3'）和 CpyrG_R(5' -ggaaccccaga taatgatacatgc-3'）作为引物扩增获得大小约为3kb的pyrG敲除元件pyrG-K0片段（图 9) 〇
[0098] 5. 2原生质体转化及筛选验证
[0099] 接种上述基因工程菌株At- Δ ku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝 培养，参照上述实施例1. 2所描述的方法制备原生质体，向上述原生质体悬液中同时加入 10 μ 1敲除元件pyrG-ΚΟ片段（约3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加 入ImL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂（CD+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖 +2mM尿嘧啶核苷，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板⑶SFU上（⑶ 平板+1. 2M山梨醇+lg/L 5-氟乳清酸+IOmM尿嘧啶核苷），在30°C、黑暗条件下培养7天。 [0100] 从平板上将具有5-氟乳清酸抗性转化子转接至筛选平板⑶FU上（⑶平板+lg/L 5-氟乳清酸+IOmM尿嘧啶核苷），在32 °C培养7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两 次。挑取在⑶FU平板上生长的转化子接种于⑶平板上，32°C培养7天。随机选取2株转 化子在CDFU平板上正常生长而在CD平板上不能正常生长的转化子接种于IPMU液体培养 基（IPM培养液+IOmM尿嘧啶核苷）中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图9所示引物 位点进行基因组PCR验证。用引物打靶元件上特有的引物hph-F与同源臂之外染色体上的 引物DpyrG-R搭配进行PCR检测，如图IOA所示，两个转化子都扩增得到了大小约为2. 5kb 的条带，而出发菌株At- Δ ku80则无此条带，这说明打革El元件在pyrG位点上发生了同源重 组。如图 IOB 所不，以 C_F4(5' -cggatacgtctactccggtaaggc-3'）/C_R(5' -agaaactagcgt ggagactttgcc-3'）为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约I. 2kb的条带，而出 发菌株At-Aku80扩增得到的条带大小为2. lkb，这说明大小约为0. 9kb的pyrG条带被敲 除了。如图IOC所示，用位于pyrG基因内部的引物对S-pyrG_F(5' -actcgcgcccgcacgcac ccgaac-3'）/S-pyrG_R(5' -tccttctggtaccgctggacagc-3'）进行 PCR 检测，结果出发菌株 At-Aku80扩增到了大小约为0. 8kb的pyrG条带，而两个转化子都未能扩增出该条带，这说 明在这两个转化子中PyrG基因被完全敲除。该尿嘧啶营养缺陷型土曲霉基因工程菌株记 为 At-Δ ku80_ Δ pyrG。
[0101] 实施例6建立基于尿嘧啶营养缺陷型的遗传转化系统
[0102] 6. 1构建以pyrGl作为筛选标记的的打靶元件
[0103] 通过基因合成方式合成SEQ ID NO. 1，该序列包括两个同向的IoxP位点、PalcA 启动子以及限制性内切酶位点，该合成的序列最终克隆在pUC57simple载体上，获得载 体 PalcA_syn(图 11)。用 pyrGl-F(5' -ctaat gctagc cagcagggaatacgagctcca-3'）/ pyrG_R(5' -ctaat gctagc gcatcaaatcgtcgtaccgc-3'）作为引物，以黑曲霉 Co827 基因 组为模板进行PCR扩增，获得大小约为I. 5kb黑曲霉的pyrG基因的表达元件，作为筛选 标记pyrGl，通过Nhe I限制性内切酶将pyrGl片段克隆至PalcA-syn载体内，得到质粒 pXH103。用引物 Sgfp-Fl(5' -gat ccatggtgagcaagggcgaggagc-3' ）/TtrpC-Rl(5' -gag ctcgag ttactattgtatacccatcttag-3,),以 pSGF957(参见 Jeong-Gu Kim，Yang Do Choi， Yung-Jin Chang， Soo-Un Kim， Genetic transformation of Monascus purpureus DSM1379, Biotechnology Letters，2003,25:1509 - 1514)为模板进行 PCR 扩增 gfp-TtrpC 片段，将大小约为I. 3kb的条带通过NcoI和XhoI限制性内切酶克隆至质粒pXH103 中，得到质粒 pXH104。用 Dw2-ku80_F(5' -cat ctcgag tccggcctcgatgtggatgc-3'）/ Dw2_ku8〇-R(5' -eta gaattc tccacgcggccatcaccgagc-3' ）作为引物，以 土曲霉 CICC40205基因组为模板进行PCR扩增，将得到的大小约为1.5kb的ku80下游同源臂 片段通过限制性内切酶Xho I和EcoR I克隆至质粒pXH104中，得到质粒pXH105。用 Up2-ku80_F (5' -tea gcggccgc gtcgtagctcttcttgccatc-3'）/Up2_ku8〇-R(5' -ctaat gctagc tcaatcaccatctcccttatc-3'）作为引物，以土曲霉CICC40205基因组为模板进行 PCR扩增，将得到的大小约为I. 5kb的ku80上游同源臂片段，用限制性内切酶Not I和Nhe I进行酶切并回收后，克隆至经Not I和Spe I酶切后的pXH105载体中，得到质粒pXH106。 Cku80-F/Cku80-R为引物，pXH106作为模板，扩增得到大小约为6. 3kb的DNA片段作为打靶 元件 ku8〇-pyrGl_gfp，如图 12。
[0104] 6. 2尿嘧啶营养缺陷型At- Λ ku80_ Λ pyrG作为宿主菌的回补实验
[0105] 接种上述基因工程菌株At- Δ ku80- Δ pyrG的孢子于50mL的IPMU液体培养 基（IPM培养基中补充了 20mM尿嘧啶核苷）中，30°C、200rpm进行菌丝培养，参照上述 实施例1. 2描述的方法制备原生质体，向上述原生质体悬液中同时加入10 μ 1敲除元件 ku80-pyrGl-gfp片段（约 3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入 ImL PSTC， 混匀后室温放置20min，然后与上层琼脂（⑶+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48°C保温） 混合后倾注于再生筛选培养基平板⑶S上（⑶平板+1. 2M山梨醇），在30°C、黑暗条件下培 养7天。
[0106] 选取26个在⑶S平板上生长的转化子转接至筛选平板⑶上，在32°C培养5-7天 进行传代纯化，此传代纯化实验重复5次，这些能在CD平板上稳定生长的转化子都是重新 获得了尿嘧啶合成能力。将所有转化子都转接到CDP上（CD平板+0. lmg/L吡啶硫胺）上， 32°C培养5-7天，发现有24个转化子不能生长，这说明该24个转化子是在ku80基因位置 上发生了同源重组，将上下游同源臂之间的PtrA筛选标签敲除了，从而使菌株失去了吡啶 硫胺抗性，据此可计算出ku80敲除后菌株的同源重组效率为92. 3%。挑取6个在⑶平板 上生长但在CDP平板上不能生长的转化子的孢子，接种于IPM液体培养基中进行培养，收集 菌丝提取基因组，参照图12所示引物位点进行基因组PCR验证。如图13中的电泳检测结 果所示，所有转化子中都有PyrGl筛选标记，并在ku80位点发生了同源重组，这说明pyrGl 筛选标记与尿喃啶营养缺陷型土曲霉菌株At-Δ ku80_ ApyrG搭配，可以建立一个高同源 重组效率的遗传转化系统。其中1#转化子记为At-Aku80-pyrGl-loxP。
[0107] 实施例7应用位点特异性重组系统进行筛选标记的切除
[0108] 7. 1工程菌At-Δ ku8〇-pyrGl_loxP的原生质体制备
[0109] 挑取工程菌At-Aku80-pyrGl-loxP的孢子接种于IPM培养基中，32°C培养14-20 小时，收集菌丝后参照实施例1. 2所描述方法进行原生质体制备，最终原生质体重悬于STC 中，并调整原生质体浓度为IO8个/ml。
[0110] 7. 2直接导入Cre重组酶进行筛选标记的切除
[0111] 取 IOOul 原生质体溶液，加入 2U Cre 重组酶（NEB，Catalog No. :M0298L)、lyg PyrGl片段和10 μ I 40%的PEG4000,混匀后冰浴30min。加入1ml PSTC溶液，30°C孵育 30min。然后与上层琼脂（⑶+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖+2mM尿嘧啶核苷，灭菌后48°C保 温）混合后倾注于再生筛选培养基平板⑶SFU上（⑶平板+1.2M山梨醇+lg/L 5-氟乳清酸 +IOmM Urdine)，在30°C、黑暗条件下培养6-10天。挑取27个生长出来的转化子转接于CDFU 上，在32°C培养5-7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复3-5次。挑取在CDFU平板上生长 的转化子接种于⑶平板上，32°C培养5-7天。随机选取8株在⑶FU平板上正常生长而在⑶ 平板上不能正常生长的转化子接种于IPMU液体培养基（IPM培养液+IOmM尿嘧啶核苷）中 进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图10所示引物U-ku80-F和TtrpC-R进行基因组PCR 验证。如果PyrGl标签被切除则能扩增出大小为3. 3kb的片段，如果pyrGl未能切除，则可 以扩增出大小为4. 8kb的片段。如图14所示，转化子1#、3#、4#、6#、7#、8#的？7冗1标签都被 完全切除了，将1#转化子的验证PCR产物中3. 3kb条带回收纯化后送基因测序，测序引物 为 S-ku8〇-F(5'-ctcctaaacagatataccactc_3'） ，结果显不 ku80_UP 与 PalcA 之间只留下一 个IoxP位点（图15)，pyrGl标签已被切除，该工程菌株被记为At-Δ ku8〇-Δ pyrGl-loxP。 实施过程中发现，使用IOU和2U Cre重组酶都能实现筛选标记的高效切除并获得足够的阳 性转化子，鉴于成本考虑优先选择使用少量Cre重组酶进行筛选标记切除。
[0112] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，其特征在于，是以土曲霉 (Aspergillus terreus)为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA同源重 组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化 系统，最后以直接向原生质体细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除 两侧带有同向IoxP序列的pyrG筛选标签，使菌株重新获得尿喃啶营养缺陷的特征，能再次 用于基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化。2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 以土曲霉为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因，构建外源DNA同源重组概率提 高的重组菌； 2)在步骤1)所得重组菌的基础上敲除pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株，再以 所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株为受体菌，以两端带有同向IoxP位点的PyrG基因表达元件 loxP-pyrGl-loxP作为筛选标签进行回补实验验证，建立基于pyrG筛选标记和尿喃啶营养 缺陷菌株的遗传转化系统，同时获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌； 3)制备步骤2)所得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌的原生质体，直接向原 生质体细胞中导入Cre重组酶，基于位点特异性重组系统切除两侧带有同向IoxP序列的筛 选标记，获得的loxP-pyrGl-loxP筛选标签被切除的尿喃啶营养缺陷型重组菌。3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 以土曲霉CICC40205为出发菌，敲除ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的 重组菌At- Aku80 ; 2)构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO,敲除步骤1)所得重组菌At- Aku80的pyrG基 因，获得PyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At- Aku80-A pyrG ; 3)以两端带有同向IoxP序列的曲霉pyrG基因表达元件pyrGl为筛选标签构建以ku80 基因上下游序列作为同源臂的打革El元件ku80-pyrGl-gfp，将打革巴元件ku80-pyrGl-gfp转 化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At- A ku80- A pyrG中进行回补实验验证，经过 培养筛选以及验证后，建立基于尿喃啶营养缺陷型重组菌At- A ku80- A pyrG和pyrGl的遗 传转化系统，获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标记的的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP ; 4) 制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl-loxP的原生质体，以DNA为辅助载体向 所得的原生质体内导入Cre重组酶切除两侧带有同向IoxP序列的筛选标签pyrGl，通过筛 选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrGl筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组 菌At-Aku8〇-ApyrGl-loxP。4. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述敲除ku80基因，是通过PCR扩增出 基因ku80的上游序列U-ku80和下游序列D-ku80,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过 融合PCR技术将ptrA片段分别与上游U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物 为模板通过PCR分别扩增出打祀元件ku8〇-A和打祀元件ku8〇-B，打祀元件ku8〇-A包括上 游序列U-ku80和ptrA筛选标记的5'端部分序列，打靶元件ku80-B包括ptrA筛选标记的 3'端部分序列和下游序列D-ku80,打靶元件ku80-A的3'端和打靶元件ku80-B的5'端 PtrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为597bp，再将打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B 同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后筛选敲除ku80基因的转化子； 所述敲除lig4基因，是通过PCR扩增出基因lig4的上游序列U-lig4和下游序列 D-lig4,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA片段分别与上游U-lig4和下游序列D-lig4进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别扩增出打靶元件 Iig4-A和打祀元件Iig4-B，打祀元件Iig4-A包括上游序列U-lig4和ptrA筛选标记的5' 端部分序列，打靶元件lig4_B包括ptrA筛选标记的5'端部分序列和下游序列D-lig4,打 靶元件Iig4-A的3'端和打靶元件Iig4-B的5'端的ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长 度为597bp，再将打祀元件Iig4-A和打革El元件Iig4-B转化到制备好的土曲霉原生质体中， 最后筛选敲除lig4基因的转化子。5. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤2)所述构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO， 是以土曲霉的基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增出pyrG基因的上游序列U-pryG 和下游序列D-pyrG，通过融合PCR将U-pryG和D-pyrG进行融合，再以融合片段为模板，通 过巢式PCR扩增出pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO。6. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述构建打革巴元件ku80-pyrGl-gfp，是 合成带有两个同向IoxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，再将所得的 序列克隆到载体pUC57-simple上，获得载体PalcA-syn;以黑曲霉C〇827基因组为模板， 设计引物通过PCR扩增获得黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，将筛选 标签PyrGl克隆到载体PalcA-syn上的两个同向IoxP位点之间，获得质粒pXH103 ;再以 PSGF957为模板，设计引物进行PCR扩增gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC表达元件连接到 质粒PXH103上，获得质粒pXH104 ;再以土曲霉基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增 ku80基因的下游和上游同源臂，并先后克隆到质粒pXH104上，获得质粒pXH106,再以质粒 pXH106为模板，通过PCR扩增获得打祀元件ku80-pyrGl-gfp。7. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述导入Cre重组酶切除筛选标签 PyrGl，是向已制备好的100yL重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、IygpyrGl片段和IOyL40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入Iml PSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育结束后与含有I. 2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿 嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有I. 2M山梨醇，lg/L5-氟乳清酸和IOmM尿 嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板上，在30°C、黑暗条件下培养6-10d，培养结束后挑取 转化子传代纯化3-5次，筛选验证后获得筛选标签pyrGl被切除的尿嘧啶营养缺陷重组 菌At-Aku80-ApyrGl-loxP，该重组菌在⑶平板上无法生长，可再次作为受体菌用于基于 pyrGl筛选标签的遗传转化。8. 权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1)以土曲霉CICC40205为出发菌，以质粒pPTRII为模板，以SEQIDNO. 2-SEQID NO. 3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组为 模板，以SEQIDNO. 4-SEQIDNO. 5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80上游序 列U-ku80 ;以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQIDNO. 6-SEQIDNO. 7所示核苷 酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80下游序列D-ku80 ;通过融合PCR将ptrA片段、上游序 列U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQIDNO. 8-SEQID NO. 9所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQIDNO. 10-SEQ IDNO. 11所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B;再将打靶元件ku80-A 和打革G元件ku80-B同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后吡啶硫胺抗性筛选及基 因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At-Aku80 ; 2) 以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQIDNO. 12-SEQIDNO. 13所示核苷 酸序列为引物，扩增PyrG基因的上游序列U-pyrG;再以土曲霉CICC40205的基因组为模 板，以如SEQIDNO. 14-SEQIDNO. 15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序列 D-pyrG;再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为模 板，以如SEQIDNO. 16-SEQIDNO. 17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基因 的打祀元件pyrG-KO,再制备步骤1)所得重组菌At-Aku80的原生质体，再将pyrG基因的 打革G元件pyrG-KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿喃啶营养缺 陷型菌株At-Aku8〇-ApyrG; 3) 通过人工合成带有两个同向IoxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示，该DNA片段克隆在载体pUC57simple上，获得载体PalcA-syn;以黑曲霉C〇827基因 组为模板，以如SEQIDNO. 18-SEQIDNO. 19所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出黑曲 霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，再将筛选标签pyrGl克隆到载体PalcA-syn 上，获得质粒PXH103,获得如SEQIDNO. 26所示的两侧带有同向IoxP位点序列的pyrGl 筛选标签loxP-pyrG-loxP;再以pSGF957 为模板，以如SEQIDNO. 20-SEQIDNO. 21 所示 核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC，再将gfp-TtrpC片段连接到质粒 PXH103上，获得质粒pXH104 ;再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQIDNO. 22-SEQ IDNO. 23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源臂片段，再将扩 增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105 ;再以土曲霉 CICC40205基因组为模板，以如SEQIDNO. 24-SEQIDNO. 25所示核苷酸序列为引物，通过 PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源臂片段连接到质 粒PXH105上，获得质粒pXH106 ;最后再以质粒pXH106为模板，以SEQIDNO. 8和SEQID NO. 10所示序列为引物扩增出打革巴元件ku80-pyrGl-gfp;再将打革巴元件ku80-pyrGl-gfp转 化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Aku80-ApyrG中，经过培养筛选后获得带 有loxP-pyrGl-loxP的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP;从而证明成功建立了基于尿喃啶营 养缺陷重组菌和pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统； 4) 制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl_loxP的原生质体，向已制备好的100yL 浓度为IO8个AiL的原生质体溶液中加入2UCre重组酶、IygpyrGl片段和IOyL40% 的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入ImlPSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育结 束后与含有I. 2M山梨醇、4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于 含有I. 2M山梨醇，lg/L5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基平板中，在 30°C、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子接种到⑶FU平板上于32°C下培养 5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，再挑取转化子接种到CD平板上，在32°C下培养 5-7天后获得同源重组能力提高，且不受筛选标签数量限制的用于基因打靶的土曲霉重组 菌At-Aku8〇-ApyrGl-loxP。9. 权利要求1-8所述任一方法，其特征在于，用于制备土曲霉重组菌。10. 利用权利要求1-8所述任一方法制备的土曲霉重组菌。
【专利摘要】本发明公开了一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高菌株的外源DNA同源重组概率，再构建pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株，建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后应用Cre/LoxP特异性结合位点重组系统切除筛选标签，重新获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，可再次被用于遗传改造。本发明所提供的方法可构建高效的土曲霉基因打靶平台，具有同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法简单易行、筛选标签可循环利用等优点，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。
【IPC分类】C12N1/15, C12R1/66, C12N15/87
【公开号】CN104894165
【申请号】CN201510275491
【发明人】吕雪峰, 黄雪年, 李建军, 陈梅
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶 类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产， 具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目 标产物的生产水平，具有非常重要的意义。
[0003] 基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研宄手段，通常是指含已知序列的 DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组，整合至细胞受体基因组中，在特异性靶位点上增 加外源DNA片段，或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定 点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此，基因打靶技术在功能基因组 学以及菌株的基因工程改造研宄中发挥着至关重要的作用。随着大量组学数据的不断公 布，功能基因组学研宄以及基因工程改造往往涉及到多基因、多位点，而且还会用到多种研 宄策略。因此一种高效的遗传操作平台将可以为土曲霉功能基因组学研宄以及菌株基因工 程改造提供很大的便利。
[0004] 在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径（Non-homologous End Joining，NHEJ)，从而导致外源DNA主要以随机插入方式整合到基因组上，同源重组效 率低下，使得基因打靶技术的应用受到了严重制约。
[0005] 筛选标签是遗传操作过程中所需要的一种重要元件，外源DNA需要与筛选标签一 起整合到基因组上，然后再通过筛选标签的表型被筛选出来。而在土曲霉中可用的筛选标 签非常少，无法满足对多基因、多位点进行遗传改造的需求。位点特异性重组系统是一种重 要的分子遗传操作工具，在多种原核生物和真核生物中都成功应用于筛选标签的切除。其 原理是重组酶识别并结合到具有特殊DNA序列的靶位点上，催化重组反应，使得位于靶位 点之间的DNA片段被剔除。常用的位点特异性重组系统有Cre/loxP系统、β -rec/six系 统和Flp/FRT系统，但在传统应用过程中需要以穿梭质粒形式或基因组整合形式向细胞中 导入重组酶表达元件，通过在细胞内表达出重组酶作用于识别位点对筛选标签进行切除。 pyrG(乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因）是一种与尿嘧啶营养缺陷型菌株搭配使用的营养选择 型标签，基于PryG作为筛选标签的转化系统具有双向筛选功能的特征，筛选标签存在与否 都可以通过相应的筛选培养基进行筛选。因此搭配位点特异性重组系统使用，会使得筛选 标签的剔除更加尚效、易行。
【发明内容】
[0006] 为解决土曲霉菌种的同源重组能力低，筛选标签数量少导致基因打靶技术在土曲 霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种用于提高基因打靶技术在 土曲霉中应用效率的方法，所采取的技术方案如下：
[0007] 本发明的目的在于提供一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法， 该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提 高外源DNA的同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛 选标签的遗传转化系统，最后以直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组 系统切除两侧带有同向IoxP序列的筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能 再次用于基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化，以该方式实现筛选标签的循环利用。
[0008] 所述方法的步骤如下：
[0009] 1)以土曲霉为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因，构建外源DNA同源重组概 率提高的重组菌；
[0010] 2)在步骤1)所得重组菌的基础上敲除PyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株， 再以所得的尿喃啶营养缺陷型菌株为受体菌，以两端带有IoxP位点的PyrG基因表达元件 (loxP-pyrGl-loxP)作为筛选标记进行回补实验验证，建立基于pyrG筛选标记和尿喃啶营 养缺陷菌株的遗传转化系统，同时获得整合有ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌；
[0011] 3)利用步骤2)所得的整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌，结合改良的位 点特异性重组系统切除筛选标记，获得的ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签被切除的尿嘧啶营养 缺陷型重组菌，在该重组菌中ΙοχΡ-pyrGl-loxP可以再次作为筛选标签进行再次的基因工 程改造。该方式使得ΙοχΡ-pyrGl-loxP筛选标签可以多次、重复被应用于菌株的基因工程 改造，从而使遗传改造工作不受筛选标签数量所限制。
[0012] 所述方法的步骤如下：
[0013] 1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因（或lig4基因），构建外源DNA 同源重组概率提高的重组菌At- Δ ku80 (或At- Δ lig4);
[0014] 2)构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-K0,敲除步骤1)所得重组菌At-Aku80的pyrG 基因，获得PyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At- Λ ku80- Λ pyrG ;
[0015] 3)以曲霉的pyrG基因的表达框元件pyrGl为筛选标签构建以ku80基因上下游序 列作为同源臂的打靶元件ku80-pyrGl-gfp，将打靶元件ku80-pyrGl-gfp转化入步骤2)所 得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-AkuSO-ApyrG中进行回补实验验证，经过培养筛选以及 验证后，获得基于尿喃啶营养缺陷型重组菌At-Δ ku80-Δ pyrG和pyrGl的遗传转化系统， 获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标记的的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP ;
[0016] 4)制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl_loxP的原生质体，向所得的原生质 体内导入Cre重组酶切除筛选标签pyrGl，通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrGl 筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At- Δ ku80_ Δ pyrGl-loxP。
[0017] 重组菌 At-Δ ku8〇-ApyrGl-IoxP 恢复了步骤 2)所获得重组菌 At-Δ ku8〇-Δ pyrG 的尿嘧啶营养缺陷的特征，可再次作为受体菌用于基于pyrGl筛选标签的遗传转化。
[0018] 优选地，步骤1)所述敲除ku80基因，是通过PCR扩增出基因 ku80的上游序列 U-ku80和下游序列D-ku80,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA 片段分别与上游U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别 扩增出打祀元件ku80_A和打祀元件ku80_B，再将打祀元件ku80_A和打祀元件ku80_B转化 到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后筛选敲除ku80基因的转化子。
[0019] 优选地，步骤1)所述敲除lig4基因，是通过PCR扩增出基因 lig4的上游序列 U-lig4和下游序列D-lig4,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA 片段分别与上游U-lig4和下游序列D-lig4进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别 扩增出打祀元件lig4_A和打祀元件Iig4-B，再将打祀元件Iig4-A和打祀元件Iig4-B转化 到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后筛选敲除lig4基因的转化子。
[0020] 优选地，步骤2)所述构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO,是以土曲霉的基因组为 模板，设计引物通过PCR分别扩增出pyrG基因的上游序列U-pryG和下游序列D-pyrG，通过 融合PCR将U-pryG和D-pyrG进行融合，再以融合片段为模板，通过巢式PCR扩增出pyrG 基因的打革El元件PyrG-KO ;
[0021] 优选地，步骤3)所述构建打革El元件ku80-pyrGl_gfp，是人工合成带有两个同向 IoxP序列位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，再将该DNA片段克隆到载体 pUC57simple上，获得载体PalcA-syn ;以黑曲霉C〇827基因组为模板，设计引物通过PCR扩 增获得黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，将筛选标签pyrGl克隆到载体 PalcA-syn上的两个同向IoxP位点之间，获得质粒pXH103 ;再以pSGF957为模板，设计引物 进行PCR扩增gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC表达元件连接到质粒pXH103上，获得质粒 PXH104;再以土曲霉基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增ku80基因的下游和上游同 源臂，并先后克隆到质粒PXH104上，获得质粒pXH106,再以质粒pXH106为模板，通过PCR扩 增获得打祀元件ku80-pyrGl-gfp ;
[0022] 优选地，步骤4)所述导入Cre重组酶切除筛选标签pyrGl，是向已制备好的 100 μ L重组菌At- Δ ku8〇-pyrGl-loxP的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1 μ g pyrGl 片段和10 μ L 40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入1ml STC溶液后于30°C下孵育 30min，孵育结束后与含有I. 2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混 合后倾注于含有I. 2M山梨醇，lg/L 5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基 平板上，在30°C、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子传代纯化3-5次，筛选验 证后获得筛选标签pyrGl被切除的尿喃啶营养缺陷重组菌At- Δ ku80- Δ pyrGl-loxP，该重 组菌在CD平板上无法生长，可再次作为受体菌用于基于pyrGl筛选标签的遗传转化。
[0023] 优选地，所述方法的具体步骤如下：
[0024] 1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，以质粒pPTR II为模板，以SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组 为模板，以SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出上游序列 U-ku80;以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 7所示核苷酸序 列为引物，通过PCR扩增出上游序列D-ku80 ;通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQ ID NO. 8-SEQ ID NO. 9所示核 苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQ ID NO. 10-SEQ ID NO. 11所 示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B ;再将打靶元件ku80-A和打靶元件 ku80-B转化到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得 敲除ku80基因的重组菌At-Δ ku80 ;
[0025] 2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 13所示 核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的上游序列U-pyrG ;再以土曲霉CICC40205的基因组为 模板，以如SEQ ID NO. 14-SEQ ID NO. 15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序 列D-pyrG ;再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为 模板，以如SEQ ID NO. 16-SEQ ID NO. 17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基 因的打革G元件pyrG-KO,再制备步骤1)所得重组菌At-Aku80的原生质体，再将pyrG基因 的打革G元件pyrG-KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿喃啶营养 缺陷型菌株At- Δ ku80_ Δ pyrG ;
[0026] 3)通过人工合成带有两个同向IoxP序列位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，再将该DNA片段克隆到载体PUC57simple上，获得载体PalcA-syn ;以黑曲霉 Co827基因组为模板，以如SEQ ID NO. 18-SEQ ID NO. 19所示核苷酸序列为引物，通过PCR 扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，再将筛选标签pyrGl克隆到载 体PalcA-syn上，获得质粒pXH103,获得如SEQ ID NO. 26所示的两侧带有同向IoxP位点 序列的 PyrGl 筛选标签 loxP-pyrG-loxP ;再以 pSGF957 为模板，以如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID NO. 21所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC 片段连接到质粒PXH103上，获得质粒pXH104 ;再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如 SEQ ID NO. 22-SEQ ID NO. 23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源 臂片段，再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105 ; 再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO. 24-SEQ ID NO. 25所示核苷酸序 列为引物，通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源 臂片段连接到质粒PXH105上，获得质粒pXH106 ;最后再以质粒pXH106为模板，以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80-pyrGl-gfp ;再将 打靶元件 ku80-pyrGl-gfp转化入步骤2)所得的尿喃啶营养缺陷型菌株At- Δ ku80- Δ pyrG中，经过 培养筛选后获得带有1〇1?15^61-1(??的重组菌41：-八1〇18〇15^61-1(??;从而证明成功建 立了基于尿嘧啶营养缺陷重组菌和PyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统。
[0027] 4)制备步骤3)所得重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP的原生质体，向已制备好的 100 μ L浓度为IO8个/mL的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1 μ g pyrGl片段和10 μ L 40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育 结束后与含有I. 2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注 于含有I. 2M山梨醇，lg/L 5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基平板中， 在30°C、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子接种到⑶FU平板上于32°C下培 养5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，获得pyrGl筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷 型重组菌At- Λ ku80_ Λ pyrGl-loxP ;从而实现筛选标签的循环利用，突破遗传改造受筛选 标签数量的限制；
[0028] 所述任一方法用于制备土曲霉重组菌。
[0029] 所述任一方法制备的土曲霉重组菌重组菌。
[0030] 表达元件：能在细胞内有效驱动目的基因转录表达的DNA片段，包括启动子、基因 和终止子。
[0031] 本发明有益效果：
[0032] 通过本发明提供的方法进行基因打靶技术的应用，具有基因打靶效率高、筛选标 签可反复使用的优点，包括同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法 简单易行、筛选标签可循环利用等，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行多基因、 多位点、多策略的遗传改造提供基础支持。
[0033] 本发明通过在土曲霉内敲除ku80基因或lig4基因的方式提高了外源DNA与基因 组发生同源重组的概率，基于尿嘧啶营养缺陷型突变株和PyrG筛选标记建立可双向筛选 遗传转化系统，通过直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用Cre/loxP位点特异性重组系 统实现特定筛选标签的高效切除，从而建立了一个同源重组高效的、改造不受筛选标签数 量限制的高效基因打靶平台。
[0034] 本发明首次在土曲霉中通过敲除ku80或lig4的方式提高外源DNA同源重组效 率，针对野生型菌株中基因敲除效率低（只有约10% )，本发明采用split-marker方法对 ku80或lig4进行敲除，敲除成功率达到50%。采用位点特异性重组系统切除筛选标签的 传统方法主要有两种：一种是将重组酶基因的表达元件克隆到可在宿主中自主复制的质粒 上，并转化到宿主中，通过在宿主体内表达重组酶对位于特异性识别位点间的筛选标签进 行切除，随后再通过反复传代筛选使质粒随机丢失；第二种方法是将重组酶基因的诱导型 表达元件与筛选标签串联并在两侧加上同向特异性识别位点，然后转化、整合到宿主菌染 色体上，通过合适的诱导条件诱导重组酶在体内表达，对位于特异性识别位点内的筛选标 签及重组酶表达元件进行切除。这两种传统方法实施过程复杂，条件苛刻，例如异源的重组 酶基因是否表达以及表达活性都是未知的。第一种方法需要一种在曲霉中非常少见的自主 复制质粒以及一个额外的抗性筛选标签，而且后期的质粒丢失偶然因素大；第二种方法则 需要一种优秀的诱导型启动子，而这种启动子在曲霉中很少见，上述因素限制了通过位点 特异性重组系统切除曲霉内的筛选标签。
[0035] 本发明首次在土曲霉中通过位点特异性重组系统实现筛选标签的切除，而且是通 过将Cre重组酶直接导入至细胞内进行筛选标签的切除，使用的筛选标签是可双向筛选的 PyrG基因，过程相对简单，不需要构建重组酶基因表达元件，不需要土曲霉自主复制质粒和 诱导型启动子，不需要经历质粒丢失过程。本发明实施例涉及的基于PyrG基因的转化体系 中，尿嘧啶营养缺陷型菌株是通过PyrG完全敲除的方式获得，相对于诱变方法获得的菌株 而言遗传稳定性更好。Sc筛选标签的筛选体系中需要硒酸盐作为筛选药物，而硒酸盐在使 用过程中对实验人员有安全隐患，作为剧毒药品受到管制，购买十分困难，丝状真菌中目前 只有在米曲霉中成功建立了基于sC的遗传转化系统；硝酸还原酶niaD筛选标签的筛选体 系中也要使用高浓度的氯酸盐，制备过程麻烦，而且niaD营养缺陷型菌株的自发回复概率 高，筛选过程中假阳性高；相对而言，PyrG筛选标记筛选过程简单，涉及的药品5-氟乳清 酸、尿嘧啶或尿苷酸容易购买且价格便宜。但是并非是所有物种中都成功建立了基于PyrG 筛选标签的转化系统，而且同一物种中的不同菌株在建立该遗传转化系统时也难度不一， 例如研宄人员发现很多米曲霉菌株无法获得PyrG基因失活缺陷型菌株，因而只在少数几 株米曲霉菌株中成功建立了该遗传转化系统。
【附图说明】
[0036] 图1为实施例1提供的土曲霉pdc基因敲除原理不意图。
[0037] 图2为敲除土曲霉CICC40205菌株pdc基因所得转化子的基因组PCR验证；
[0038] (图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果， 图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是 CICC40205 野生型菌株作为对照， 1-20为所获得转化子）。
[0039] 图3为敲除ku80基因的打靶元件及其发生同源重组敲除ku80基因的示意图；
[0040] (F1 是引物 Uku80-F，F2 是引物 Cku80-F，F3 是引物 PtrA-F，F4 是引物 ptrA-F171， Rl是引物Dku80-R，R2是引物Cku80-R，R3是引物ptrA-R，R4是引物ptrA-R744，F5是引物 ku8〇-probe-F，R5 是引物 ku8〇-probe-R)。
[0041] 图4为敲除ku80基因所获转化子的基因组PCR验证结果图；
[0042] (图 A 为引物 ptrA-F/ptrA-R(F3/R3)验证结果，图 B 为引物 Uku80-F/ptrA-R(Fl/ R3)验证结果，图C为引物ptrA-F/Dku80-R(F3/Rl)验证结果，图D为引物ku80-probe-F/ ku80-probe-R(F5/R5)验证结果；M 为 Ikb DNA ladder(TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C是CICC40205野生型菌株作为对照，1-4为所获得转化子）。
[0043] 图5为敲除lig4基因的打靶元件及其发生同源重组敲除lig4基因的示意图。
[0044] 图6为本发明实施例提供的敲除lig4基因工程菌株的基因组PCR验证结果；
[0045] (图A为引物ptrA-F/ptrA-R验证结果，图B为引物Ulig4-F/ptrA-R验证结果， 图C为引物ptrA-F/Dlig4-R验证结果，图D为引物Iig4-F/Iig4-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是 CICC40205 野生型菌株作为对照， 八1184为敲除了1184的转化子八1：-八1184)。
[0046] 图7为在工程菌株At-Δ1αι80中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结 果；
[0047] (其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结 果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是工程菌株 At-Δ1αι80 作为对照， 1-19为所获得转化子）。
[0048] 图8为在工程菌株At-Δ lig4中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结 果；
[0049] (其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结 果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 为 DL2000DNA ladder (TAKARA)，C 是工程菌株 At- Δ lig4 作为对照， 1-19为所获得转化子）。
[0050] 图9为敲除土曲霉pyrG基因原理示意图；
[0051] (其中，pdc为待敲除基因，Up是上游同源臂U-pyrG，Down是下游同源臂D-pyrG, 箭头为引物设计位点）。
[0052] 图10为敲除土曲霉pyrG基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
[0053] (其中，图A为引物hph-F/DpyrG-R验证结果，图B为引物C-F4/C-R验证结果，图 C 为引物 S-pyrG-F/S-pyrG-R 验证结果；M 为200bp DNA Iadder(TAKARA)，Δ1αι80 是工程菌 株At- Δ ku80作为对照，1#、2#为敲除pyrG基因的得转化子）。
[0054] 图11为质粒PalcA-syn的结构示意图。
[0055] 图12为回补元件ku80-pyrGl-gfp及其与ku80位点定点整合原理示意图；
[0056] (其中，ku80-UP、ku80-Dw分别为ku80基因的上下游同源臂，pyrGl为作为筛选标 记的来自黑曲霉PyrG基因表达元件（包括启动子、pyrG基因编码区和终止子），箭头为引 物设计位点）。
[0057] 图13为ku80_pyrGl_gfp元件回补尿喃啶营养缺陷型菌株At-Δ ku8〇-Δ pyrG所 获得转化子的基因组PCR验证结果；
[0058] (其中，图A为引物Uku80-F/pyrGl-R验证结果，图B为引物pyrGl-F/pyrGl-R 验证结果，图C为引物pyrGl-F/TtrpC-R验证结果，图C为引物pyrGl-F/Dku8〇-R验证 结果；M 为 Ikb DNA Iadder(TAKARA)，M2 为 200bp DNA Iadder(TAKARA)，C 是工程菌株 At- Δ ku80_ Δ pyrG作为对照，1-6为回补实验所获得转化子）。
[0059] 图14为直接导入Cre重组酶切除pyrGl筛选标记所得转化子的基因组PCR验证 图；
[0060] (M 为 Ikb DNA ladder (TAKARA)，C 是工程菌株 At-Δ ku8〇-pyrGl_loxP 作为对照， 1-8为回补实验所获得转化子）。
[0061] 图15为切除了 pyrGl筛选标签工程菌株At-Δ1αι80-ApyrGl-IoxP的DNA测序结 果；
[0062] (其中，ku80-UP为ku80基因上游同源臂，IoxP为Cre重组酶特异性识别的IoxP 序列，PalcA为PalcA启动子序列，在工程菌株At-Aku8〇-pyrGl_loxP中pyrGl本位于 ku80-UP和PalcA序列之间）。
【具体实施方式】
[0063] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0064] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0065] 本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒（D6942-01), DNA 片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒（D6492-01),凝胶回收是采用OMEGA 公司 Gel Extraction Kit 试剂盒（D2500-01)。
[0066] CD平板的组成为：3g/L NaNO3,2g/L KCl，lg/L KH2PO4,0· 5g/L MgSO4 ·7Η20,0· 02g/ L FeSO4 · 7H20, lOg/L 葡萄糖，琼脂糖。
[0067] IPM液体培养基：60g/L葡萄糖，2g/L NH4NO3, 20mg/L NH4HPO4, 20mg/L FeSO4,0· 4g/ L MgS04,4. 4mg/L ZnS04,0. 5g/L 玉米浆，pH 3· 5。
[0068] 实施例1分析土曲霉CICC40205野生型菌株中外源DNA同源重组整合概率
[0069] I. 1构建土曲霉丙酮酸脱羧酶基因 pdc (ATET_04633)打靶元件
[0070] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Updc-F(5' -agagggtggt atcattccgttg-3'）、Updc-R(5' -ctttacgcttgcgatcccgaacccctgagtgagaaggaacatg-3'）、 Dpdc-F(5? -cctgggttcgcaaagataattgatccgaaacaacctcaacccg-3, )> Dpdc-R(5? -cgaggtg tgcgcaacaggcatgaatg-3'），以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合 酶（Fermentas，Catalog No. :EP0501)进行 PCR扩增，用引物 Updc-F/Updc-R 可以扩增获得 大小约为1.9kb的pdc基因的上游序列U-pdc，用引物Dpdc-F/Dpdc-R可以扩增获得大小 为2. Ikb的pdc基因下游序列D-pdc。以 DSGF957为樽板，用引物hph-F(5'-TTCGGGATCGCA AGCGTAAAG-3'）和 hph-R(5' -CAATTATCTTTGCGAACCCAGG-3'）进行 PCR 扩增，获得大小约为 2. 2kb的潮霉素抗性筛选标记hph。将所有PCR产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割 胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-pdc片段、D-pdc片段和hph片段进行融合，并以该融 合 PCR 的产物作为模板，以 Cpdc_F(5' -tcgcttccaacaacactcattcc-3'）和 Cpdc_R(5' -tgt cgttggccgtccatcctag-3'）作为引物扩增获得大小约为6. Ikb的pdc基因敲除元件pdc-KO 片段（如图1，其中hph是筛选标记潮霉素抗性基因，pdc为待敲除基因，Up是上游同源臂 U-pdc，Down是下游同源臂D-pdc ;箭头为引物设计位点）。
[0071] L 2原生质体制备
[0072] 将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL液体IPM培养基中，使孢子浓度约为IO7 个/mL，在200rmp、32°C培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用 灭菌的0. 6M MgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取Ig菌丝，加入 1〇1111酶解液，在30 <€、60印1]1处理1-311。酶解液成分为：0.8%纤维素酶（3丨〖1]^，〇3丨31(^ No. :C1184)、0.8%裂解酶（Sigma，Catalog NO. :L1412)、0.4%蜗牛酶（上海生工，Catalog No. :SB0870)、0. 6M MgSO4，经由0. 22μπι的无菌过滤器过滤除菌。将上述酶解后的混合液 先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。4°C、4000rpm离心收集原生质体，用预冷1.0 M山梨醇溶 液洗涤一次，再用预冷的 STC(STC 为 1.0 M 山梨醇，50mM Tris .HCl-pH 8. 0,50mM CaCl2)洗 涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5 X IO7个/ mL，得到原生质体悬液。
[0073] 1. 3原生质体转化及筛选验证
[0074] 向150 μ 1上述原生质体悬液中同时加入10 μ 1的pdc-KO (约3 μ g)，再加入50 μ 1 PSTC(PSTC 为 40% PEG4000,1. 2Μ 山梨醇，50mM Tris-HCl-pH8. 0,50mM CaCl2)，轻轻混匀， 冰浴30min。加入ImL PSTC，混匀后室温放置20min ;然后与15mL上层琼脂（PDB+1. 2M山 梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDA-SH上 (PDA平板+1. 2M山梨醇+100mg/L潮霉素 B)，在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0075] 从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上（PDA平 板+100mg/L潮霉素 B)，在32°C培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取20个转化子 的孢子接种于IPM液体培养基中，30°C、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图 2中所示引物进行基因组PCR验证。如图2A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标 记hph ;如图2B、2C所示，只有10#和17#转化子中pdc-LKO元件是通过同源重组方式整合 到了 Pdc基因位点上。如图2D所示，除10#和17#之外的其他转化子都和对照菌株土曲霉 CICC40205 -样扩增出了 I. 5kb的pdc基因内部片段，这说明这些转化子的pdc基因未被敲 除。由此可知只有10#和17#转化子是外源DNA发生了同源重组，土曲霉CICC40205菌株 中外源DNA的同源重组概率为2/20, g卩10%。
[0076] 实施例2构建敲除ku80基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At- Δ ku80
[0077] 2. 1构建敲除ku80的打靶元件
[0078] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Uku80-F(5'-gtCgtag Ctc ttcttgccatc-3'）、Uku8〇-R(5'-aatgggatcccgtaatcaattgccctcaatcaccatctcccttatc-3'）、 0^8〇-?(5? -caagagcggctcatcgtcaccccattccggcctcgatgtggatgc-3, )>0^80^(5? -tcca cgcggccatcaccgagc-3'），以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，米用pfu DNA聚合酶 (Fermentas, Catalog No. :EP0501)进行 PCR 扩增，用引物 Uku80-F/Uku80-R 可以扩增获得 大小约为I. 5kb的ku80的上游序列U-ku80,用引物Dku80-F/Dku80-R可以扩增获得大小为 I. 5kb 的 ku80 的下游序列 D-ku80。以质粒 pPTR II (TAKARA, Catalog No. :3621)为模板， 以 ptrA_F(5' -gggcaattgattacgggatd'）和 ptrA-R(5' -atggggtgacgatgagccgc-3'）作 为引物扩增获得大小约为2. Okb的ptrA片段，经I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回 收纯化。用融合PCR的方法将U-ku80片段、D-ku80与ptrA片段进行融合，并以该融合PCR 的产物作为模板，以 Cku80_F(5' -gggtttctagaagtcacatc-3'）和 ptrA_R744(5' -atggccca tcgtgaccagtggtac-3'）作为引物扩增获得大小约为3. Okb的ku80敲除元件ku80-A，以Ck uSO-Rb'-atcaccgaccctacgctgtg-3'）和 ptrA_F171(5'-ggtctctcgtgccatgaccagacg-3'） 作为引物扩增获得大小约为2. 6kb的ku80敲除元件ku80-B，如图3。
[0079] 2. 2原生质体转化
[0080] 将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL液体培养基IPM中，如实施例1中描述制 备原生质体溶液，向150 μ 1上述原生质体悬液中同时加入5 μ 1的ku80-A片段（约2 μ g) 和5 μ 1的ku80-B片段（约L 5 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入ImL PSTC，混匀后室温放置20min ;然后与15mL上层琼脂（⑶+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后 48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板⑶SP上（⑶平板+1. 2M山梨醇+0.1 mg/ L吡啶硫胺），在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0081] 2. 3转化子的筛选验证
[0082] 从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板⑶P上（⑶平板+0. lmg/L 吡啶硫胺），在32°C培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。随机挑取4株转化 子于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图3所示引物位点进行了基 因组PCR验证。如图4A所示，以F3/R3为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约 2kb的ptrA目的条带，而出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明这4个转化子中 整合了完整的PtrA筛选标记。如图4B、4C所示，用引物对F1/R3和引物对F3/R1分别进行 PCR检测，结果2#、3#转化子都分别扩增出了大小约为3. 5kb的目的条带，其他转化子则无 条带，这说明2#、3#转化子是打靶元件在ku80位点上发生了同源重组。如图4D所示，用设 计在 ku80 基因内部的引物对 ku8〇-probe_F(5' -gcactctcgaacaggcagtgtc-3'）和 ku80_p robe_R(5' -atcagtcgtgtcgatgtgaactgc-3'）进行 PCR 验证，2#、3# 转化子未能和野生型菌 株WT -样扩增出600bp大小的条带，这说明2#、3#转化子的ku80基因被成功敲除，阳性率 为50%，由此可见本发明所采用的方法进行基因敲除的成功率达到50%，高于普通方法的 10%。将该3#转化子定义为NHEJ途径缺失的土曲霉基因工程菌株At- Δ ku80。
[0083] 实施例3构建敲除lig4基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At-Λ lig4
[0084] 3· 1构建split-marker方法敲除Iig4的打革E元件
[0085] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Ulig4-F(5'-Cggctattct cacgcagctc-3'）、Ulig4_R(5' -aatgggatcccgtaatcaattgccc atacagggtcatcctcggtc-3'）、 Dlig4_F(5' -caagagcggctcatcgtcaccccat AtataatgatagctttgctC-3' ）、Dlig4_R(5' -cgt ttgactgtcgcgacgtttcg-3'），以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合 酶（Fermentas, Catalog No. :EP0501)进行 PCR扩增，用引物 Ulig4_F/Ulig4_R 可以扩增获 得大小约为I. 5kb的ku80的上游序列U-lig4,用引物Dlig4-F/Dlig4-R可以扩增获得大小 为I. 5kb的lig4的下游序列D-lig4,经I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。 用融合PCR的方法将U-lig4片段、D-lig4与ptrA片段（实施例2中所述）进行融合，并 以该融合 PCR 的产物作为模板，以 Clig4_F(5' -gaggtcacagccgagactgc-3'）和 ptrA_R744 (5'-atggcccatcgtgaccagtggtac_3'）作为引物扩增获得大小约为3. Okb的lig4敲除元件 lig4_A，以 Clig4-R(5' -ctttccttggcttcctttcg-3'）和 ptrA-F171 (5' -ggtctctcgtgccatg accagacg-3'）作为引物扩增获得大小约为2. 6kb的lig4敲除元件Iig4-B。3. 2原生质体 转化及筛选
[0086] 如实施例1中所述制备土曲霉CICC40205的原生质体溶液，向150 μ 1该原生质体 悬液中同时加入5 μ 1的Iig4-A片段（约2 μ g)和5 μ 1的Iig4-B片段（约L 5 μ g)，再加 入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加入ImL PSTC，混匀后室温放置20min ;然后与15mL 上层琼脂（⑶+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培 养基平板⑶SP上（⑶平板+1. 2M山梨醇+0. lmg/L吡啶硫胺），在30°C、黑暗条件下培养5 天。3.31ig4基因缺失菌株的验证
[0087] 从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板⑶P上（⑶平板+0. lmg/L 吡啶硫胺），在32°C培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。提取基因组进行 PCR验证后，参照图5(箭头代表引物设计位点）所示引物位点进行了基因组PCR验证，获 得lig4被完全敲除的工程菌株At-Δ lig4。如图6A所示，以ptrA-F/ptrA-R为引物对进 行PCR检测，工程菌株At- Δ lig4扩增出了大小约2kb的ptrA目的条带，而作为对照的出 发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明该菌株中整合了完整的ptrA筛选标记。如图 6B、6C所示，用引物对Ulig4-F/ptrA-R和引物对ptrA-F/Dlig4-R分别进行PCR检测，工程 菌株At-Λ lig4分别扩增出了大小约为3. 5kb的目的条带，而作为对照的出发菌株土曲霉 CICC40205未有该条带，这说明该菌株是打靶元件在lig4位点上发生了同源重组。如图6D 所示，用设计在lig4基因内部的引物对lig4_F(5' -tgcaactccacatgcagtctgac-3'）和Ii g4-R(5'-cggacacaatcaaggatccacg_3'）进行 PCR 验证，工程菌株 At- Δ lig4 未能和野生型 菌株WT-样扩增出大小约为1.5kb的条带，这说明工程菌株At-Alig4的lig4基因被成 功敲除。
[0088] 实施例4分析NHEJ途径缺失基因工程菌株中外源DNA同源重组概率
[0089] 4. 1分析ku80缺失菌株At- Δ ku80中外源DNA同源重组概率
[0090] 接种上述基因工程菌株At- Δ ku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝 培养，参照上述实施例1. 2所描述的方法制备原生质体，向150 μ 1原生质体悬液中同时加 入10 μ 1敲除元件pdc-κο片段（约3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加 入ImL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂（PDB+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂 糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上（PDA平板+1. 2M山 梨醇+100mg/L潮霉素 B)，在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0091] 从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上（PDA平 板+100mg/L潮霉素 B)，在32°C培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子的 孢子接种于IPM液体培养基中，30 °C、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图1 中所示引物进行基因组PCR验证。如图7A所示19个转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标 记hph ;如图4 B、4C所示，除8#转化子外其他转化子都分别扩增到了大小为4. Ikb和4. 3kb 的条带，这说明这些转化子中Pdc-KO元件是通过同源重组方式整合到了 pdc基因位点上。 如图4D所示，只有8#转化子和对照菌株土曲霉CICC40205 -样扩增出了 I. 5kb的pdc基 因内部片段，这说明除8#转化子之外其他18个转化子中pdc基因都被敲除，由此可知只有 8#转化子中的外源DNA没有发生同源重组。ku80缺失菌株At-Δ1αι80中外源DNA的同源 重组概率为18/19,即94. 7%。这说明敲除土曲霉CICC40205的ku80基因使外源DNA的同 源重组概率从10%提高到了 94. 7%。
[0092] 4. 1分析lig4缺失菌株At-Δ lig4中外源DNA同源重组概率
[0093] 接种上述基因工程菌株At-Δ lig4的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝 培养，参照上述实施例1. 2所描述的方法制备原生质体，向150 μ 1原生质体悬液中同时加 入10 μ 1敲除元件pdc-κο片段（约3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加 入ImL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂（PDB+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂 糖，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上（PDA平板+1. 2M山 梨醇+100mg/L潮霉素 B)，在30°C、黑暗条件下培养5天。
[0094] 从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上（PDA平 板+100mg/L潮霉素 B)，在32°C培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子 的孢子接种于IPM液体培养基中，30°C、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图 1中所示引物进行基因组PCR验证。如图8A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标 记hph ;如图4B、4C所示，所有19个转化子都分别扩增到了大小约为4. Ikb和4. 3kb的条 带，这说明所有转化子中Pdc-LKO元件都是通过同源重组方式整合到了 pdc基因位点上。如 图4D所示，没有转化子和对照菌株土曲霉CICC40205 -样扩增出了 I. 5kb的pdc基因内 部片段，这说明19个转化子中pdc基因都被敲除。由此可知19个转化子中的外源DNA都 发生了同源重组，lig4缺失菌株At-Δ lig4中外源DNA的同源重组概率为19/19,即100%。 这说明敲除lig4使土曲霉CICC40205中外源DNA的同源重组概率从10%提高到了 100%。
[0095] 实施例5构建尿嘧啶营养缺陷型土曲霉基因工程菌株
[0096] 5. 1构建pyrG打祀元件
[0097] 根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物UpyrG-F(5' -tccatcc gatggccattcgtggc-3' ）、 UpyrG-R(5' -ctttacgcttgcgatcccgaaaaggtcaattgagacttggacg ac_3'）、DpyrG_Fl(5' -tttcgggatcgcaagcgtaaagatgatgagcatgaagaattatgd'）、DpyrG_R (5' -cgaggtcctaccgatgatgttgc-3'），以土曲霉菌株 CICC40205 的基因组为模板，采用 pfu DNA 聚合酶（Fermentas，Catalog No. :EP0501)进行 PCR 扩增，用引物 UpyrG-F/UpyrG-R 可 以扩增获得大小约为2. 5kb的pyrG的上游序列U-pyrG，用引物DpyrG-Fl/DpyrG-R可以扩 增获得大小为2. 5kb的pyrG下游序列D-pyrG，经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回 收纯化。用融合PCR的方法将U-pyrG片段与D-pyrG片段进行融合，并以该融合PCR的产 物作为模板，以 CpyrG_F(5' -gtcgtaaatcgttctttgtactg-3'）和 CpyrG_R(5' -ggaaccccaga taatgatacatgc-3'）作为引物扩增获得大小约为3kb的pyrG敲除元件pyrG-K0片段（图 9) 〇
[0098] 5. 2原生质体转化及筛选验证
[0099] 接种上述基因工程菌株At- Δ ku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝 培养，参照上述实施例1. 2所描述的方法制备原生质体，向上述原生质体悬液中同时加入 10 μ 1敲除元件pyrG-ΚΟ片段（约3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混勾，冰浴30min。加 入ImL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂（CD+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖 +2mM尿嘧啶核苷，灭菌后48°C保温）混合后倾注于5块再生筛选培养基平板⑶SFU上（⑶ 平板+1. 2M山梨醇+lg/L 5-氟乳清酸+IOmM尿嘧啶核苷），在30°C、黑暗条件下培养7天。 [0100] 从平板上将具有5-氟乳清酸抗性转化子转接至筛选平板⑶FU上（⑶平板+lg/L 5-氟乳清酸+IOmM尿嘧啶核苷），在32 °C培养7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两 次。挑取在⑶FU平板上生长的转化子接种于⑶平板上，32°C培养7天。随机选取2株转 化子在CDFU平板上正常生长而在CD平板上不能正常生长的转化子接种于IPMU液体培养 基（IPM培养液+IOmM尿嘧啶核苷）中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图9所示引物 位点进行基因组PCR验证。用引物打靶元件上特有的引物hph-F与同源臂之外染色体上的 引物DpyrG-R搭配进行PCR检测，如图IOA所示，两个转化子都扩增得到了大小约为2. 5kb 的条带，而出发菌株At- Δ ku80则无此条带，这说明打革El元件在pyrG位点上发生了同源重 组。如图 IOB 所不，以 C_F4(5' -cggatacgtctactccggtaaggc-3'）/C_R(5' -agaaactagcgt ggagactttgcc-3'）为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约I. 2kb的条带，而出 发菌株At-Aku80扩增得到的条带大小为2. lkb，这说明大小约为0. 9kb的pyrG条带被敲 除了。如图IOC所示，用位于pyrG基因内部的引物对S-pyrG_F(5' -actcgcgcccgcacgcac ccgaac-3'）/S-pyrG_R(5' -tccttctggtaccgctggacagc-3'）进行 PCR 检测，结果出发菌株 At-Aku80扩增到了大小约为0. 8kb的pyrG条带，而两个转化子都未能扩增出该条带，这说 明在这两个转化子中PyrG基因被完全敲除。该尿嘧啶营养缺陷型土曲霉基因工程菌株记 为 At-Δ ku80_ Δ pyrG。
[0101] 实施例6建立基于尿嘧啶营养缺陷型的遗传转化系统
[0102] 6. 1构建以pyrGl作为筛选标记的的打靶元件
[0103] 通过基因合成方式合成SEQ ID NO. 1，该序列包括两个同向的IoxP位点、PalcA 启动子以及限制性内切酶位点，该合成的序列最终克隆在pUC57simple载体上，获得载 体 PalcA_syn(图 11)。用 pyrGl-F(5' -ctaat gctagc cagcagggaatacgagctcca-3'）/ pyrG_R(5' -ctaat gctagc gcatcaaatcgtcgtaccgc-3'）作为引物，以黑曲霉 Co827 基因 组为模板进行PCR扩增，获得大小约为I. 5kb黑曲霉的pyrG基因的表达元件，作为筛选 标记pyrGl，通过Nhe I限制性内切酶将pyrGl片段克隆至PalcA-syn载体内，得到质粒 pXH103。用引物 Sgfp-Fl(5' -gat ccatggtgagcaagggcgaggagc-3' ）/TtrpC-Rl(5' -gag ctcgag ttactattgtatacccatcttag-3,),以 pSGF957(参见 Jeong-Gu Kim，Yang Do Choi， Yung-Jin Chang， Soo-Un Kim， Genetic transformation of Monascus purpureus DSM1379, Biotechnology Letters，2003,25:1509 - 1514)为模板进行 PCR 扩增 gfp-TtrpC 片段，将大小约为I. 3kb的条带通过NcoI和XhoI限制性内切酶克隆至质粒pXH103 中，得到质粒 pXH104。用 Dw2-ku80_F(5' -cat ctcgag tccggcctcgatgtggatgc-3'）/ Dw2_ku8〇-R(5' -eta gaattc tccacgcggccatcaccgagc-3' ）作为引物，以 土曲霉 CICC40205基因组为模板进行PCR扩增，将得到的大小约为1.5kb的ku80下游同源臂 片段通过限制性内切酶Xho I和EcoR I克隆至质粒pXH104中，得到质粒pXH105。用 Up2-ku80_F (5' -tea gcggccgc gtcgtagctcttcttgccatc-3'）/Up2_ku8〇-R(5' -ctaat gctagc tcaatcaccatctcccttatc-3'）作为引物，以土曲霉CICC40205基因组为模板进行 PCR扩增，将得到的大小约为I. 5kb的ku80上游同源臂片段，用限制性内切酶Not I和Nhe I进行酶切并回收后，克隆至经Not I和Spe I酶切后的pXH105载体中，得到质粒pXH106。 Cku80-F/Cku80-R为引物，pXH106作为模板，扩增得到大小约为6. 3kb的DNA片段作为打靶 元件 ku8〇-pyrGl_gfp，如图 12。
[0104] 6. 2尿嘧啶营养缺陷型At- Λ ku80_ Λ pyrG作为宿主菌的回补实验
[0105] 接种上述基因工程菌株At- Δ ku80- Δ pyrG的孢子于50mL的IPMU液体培养 基（IPM培养基中补充了 20mM尿嘧啶核苷）中，30°C、200rpm进行菌丝培养，参照上述 实施例1. 2描述的方法制备原生质体，向上述原生质体悬液中同时加入10 μ 1敲除元件 ku80-pyrGl-gfp片段（约 3 μ g)，再加入50 μ I PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入 ImL PSTC， 混匀后室温放置20min，然后与上层琼脂（⑶+1. 2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48°C保温） 混合后倾注于再生筛选培养基平板⑶S上（⑶平板+1. 2M山梨醇），在30°C、黑暗条件下培 养7天。
[0106] 选取26个在⑶S平板上生长的转化子转接至筛选平板⑶上，在32°C培养5-7天 进行传代纯化，此传代纯化实验重复5次，这些能在CD平板上稳定生长的转化子都是重新 获得了尿嘧啶合成能力。将所有转化子都转接到CDP上（CD平板+0. lmg/L吡啶硫胺）上， 32°C培养5-7天，发现有24个转化子不能生长，这说明该24个转化子是在ku80基因位置 上发生了同源重组，将上下游同源臂之间的PtrA筛选标签敲除了，从而使菌株失去了吡啶 硫胺抗性，据此可计算出ku80敲除后菌株的同源重组效率为92. 3%。挑取6个在⑶平板 上生长但在CDP平板上不能生长的转化子的孢子，接种于IPM液体培养基中进行培养，收集 菌丝提取基因组，参照图12所示引物位点进行基因组PCR验证。如图13中的电泳检测结 果所示，所有转化子中都有PyrGl筛选标记，并在ku80位点发生了同源重组，这说明pyrGl 筛选标记与尿喃啶营养缺陷型土曲霉菌株At-Δ ku80_ ApyrG搭配，可以建立一个高同源 重组效率的遗传转化系统。其中1#转化子记为At-Aku80-pyrGl-loxP。
[0107] 实施例7应用位点特异性重组系统进行筛选标记的切除
[0108] 7. 1工程菌At-Δ ku8〇-pyrGl_loxP的原生质体制备
[0109] 挑取工程菌At-Aku80-pyrGl-loxP的孢子接种于IPM培养基中，32°C培养14-20 小时，收集菌丝后参照实施例1. 2所描述方法进行原生质体制备，最终原生质体重悬于STC 中，并调整原生质体浓度为IO8个/ml。
[0110] 7. 2直接导入Cre重组酶进行筛选标记的切除
[0111] 取 IOOul 原生质体溶液，加入 2U Cre 重组酶（NEB，Catalog No. :M0298L)、lyg PyrGl片段和10 μ I 40%的PEG4000,混匀后冰浴30min。加入1ml PSTC溶液，30°C孵育 30min。然后与上层琼脂（⑶+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖+2mM尿嘧啶核苷，灭菌后48°C保 温）混合后倾注于再生筛选培养基平板⑶SFU上（⑶平板+1.2M山梨醇+lg/L 5-氟乳清酸 +IOmM Urdine)，在30°C、黑暗条件下培养6-10天。挑取27个生长出来的转化子转接于CDFU 上，在32°C培养5-7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复3-5次。挑取在CDFU平板上生长 的转化子接种于⑶平板上，32°C培养5-7天。随机选取8株在⑶FU平板上正常生长而在⑶ 平板上不能正常生长的转化子接种于IPMU液体培养基（IPM培养液+IOmM尿嘧啶核苷）中 进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图10所示引物U-ku80-F和TtrpC-R进行基因组PCR 验证。如果PyrGl标签被切除则能扩增出大小为3. 3kb的片段，如果pyrGl未能切除，则可 以扩增出大小为4. 8kb的片段。如图14所示，转化子1#、3#、4#、6#、7#、8#的？7冗1标签都被 完全切除了，将1#转化子的验证PCR产物中3. 3kb条带回收纯化后送基因测序，测序引物 为 S-ku8〇-F(5'-ctcctaaacagatataccactc_3'） ，结果显不 ku80_UP 与 PalcA 之间只留下一 个IoxP位点（图15)，pyrGl标签已被切除，该工程菌株被记为At-Δ ku8〇-Δ pyrGl-loxP。 实施过程中发现，使用IOU和2U Cre重组酶都能实现筛选标记的高效切除并获得足够的阳 性转化子，鉴于成本考虑优先选择使用少量Cre重组酶进行筛选标记切除。
[0112] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，其特征在于，是以土曲霉 (Aspergillus terreus)为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA同源重 组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化 系统，最后以直接向原生质体细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除 两侧带有同向IoxP序列的pyrG筛选标签，使菌株重新获得尿喃啶营养缺陷的特征，能再次 用于基于PyrG基因作为筛选标签的遗传转化。2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 以土曲霉为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因，构建外源DNA同源重组概率提 高的重组菌； 2)在步骤1)所得重组菌的基础上敲除pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株，再以 所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株为受体菌，以两端带有同向IoxP位点的PyrG基因表达元件 loxP-pyrGl-loxP作为筛选标签进行回补实验验证，建立基于pyrG筛选标记和尿喃啶营养 缺陷菌株的遗传转化系统，同时获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌； 3)制备步骤2)所得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标签的重组菌的原生质体，直接向原 生质体细胞中导入Cre重组酶，基于位点特异性重组系统切除两侧带有同向IoxP序列的筛 选标记，获得的loxP-pyrGl-loxP筛选标签被切除的尿喃啶营养缺陷型重组菌。3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 以土曲霉CICC40205为出发菌，敲除ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的 重组菌At- Aku80 ; 2)构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO,敲除步骤1)所得重组菌At- Aku80的pyrG基 因，获得PyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At- Aku80-A pyrG ; 3)以两端带有同向IoxP序列的曲霉pyrG基因表达元件pyrGl为筛选标签构建以ku80 基因上下游序列作为同源臂的打革El元件ku80-pyrGl-gfp，将打革巴元件ku80-pyrGl-gfp转 化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At- A ku80- A pyrG中进行回补实验验证，经过 培养筛选以及验证后，建立基于尿喃啶营养缺陷型重组菌At- A ku80- A pyrG和pyrGl的遗 传转化系统，获得整合有loxP-pyrGl-loxP筛选标记的的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP ; 4) 制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl-loxP的原生质体，以DNA为辅助载体向 所得的原生质体内导入Cre重组酶切除两侧带有同向IoxP序列的筛选标签pyrGl，通过筛 选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrGl筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组 菌At-Aku8〇-ApyrGl-loxP。4. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述敲除ku80基因，是通过PCR扩增出 基因ku80的上游序列U-ku80和下游序列D-ku80,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过 融合PCR技术将ptrA片段分别与上游U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物 为模板通过PCR分别扩增出打祀元件ku8〇-A和打祀元件ku8〇-B，打祀元件ku8〇-A包括上 游序列U-ku80和ptrA筛选标记的5'端部分序列，打靶元件ku80-B包括ptrA筛选标记的 3'端部分序列和下游序列D-ku80,打靶元件ku80-A的3'端和打靶元件ku80-B的5'端 PtrA序列有重叠部分，该重叠部分长度为597bp，再将打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B 同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后筛选敲除ku80基因的转化子； 所述敲除lig4基因，是通过PCR扩增出基因lig4的上游序列U-lig4和下游序列 D-lig4,通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA片段分别与上游U-lig4和下游序列D-lig4进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别扩增出打靶元件 Iig4-A和打祀元件Iig4-B，打祀元件Iig4-A包括上游序列U-lig4和ptrA筛选标记的5' 端部分序列，打靶元件lig4_B包括ptrA筛选标记的5'端部分序列和下游序列D-lig4,打 靶元件Iig4-A的3'端和打靶元件Iig4-B的5'端的ptrA序列有重叠部分，该重叠部分长 度为597bp，再将打祀元件Iig4-A和打革El元件Iig4-B转化到制备好的土曲霉原生质体中， 最后筛选敲除lig4基因的转化子。5. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤2)所述构建pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO， 是以土曲霉的基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增出pyrG基因的上游序列U-pryG 和下游序列D-pyrG，通过融合PCR将U-pryG和D-pyrG进行融合，再以融合片段为模板，通 过巢式PCR扩增出pyrG基因的打革巴元件pyrG-KO。6. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3)所述构建打革巴元件ku80-pyrGl-gfp，是 合成带有两个同向IoxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，再将所得的 序列克隆到载体pUC57-simple上，获得载体PalcA-syn;以黑曲霉C〇827基因组为模板， 设计引物通过PCR扩增获得黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，将筛选 标签PyrGl克隆到载体PalcA-syn上的两个同向IoxP位点之间，获得质粒pXH103 ;再以 PSGF957为模板，设计引物进行PCR扩增gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC表达元件连接到 质粒PXH103上，获得质粒pXH104 ;再以土曲霉基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增 ku80基因的下游和上游同源臂，并先后克隆到质粒pXH104上，获得质粒pXH106,再以质粒 pXH106为模板，通过PCR扩增获得打祀元件ku80-pyrGl-gfp。7. 权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4)所述导入Cre重组酶切除筛选标签 PyrGl，是向已制备好的100yL重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、IygpyrGl片段和IOyL40%的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入Iml PSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育结束后与含有I. 2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿 嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有I. 2M山梨醇，lg/L5-氟乳清酸和IOmM尿 嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板上，在30°C、黑暗条件下培养6-10d，培养结束后挑取 转化子传代纯化3-5次，筛选验证后获得筛选标签pyrGl被切除的尿嘧啶营养缺陷重组 菌At-Aku80-ApyrGl-loxP，该重组菌在⑶平板上无法生长，可再次作为受体菌用于基于 pyrGl筛选标签的遗传转化。8. 权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1)以土曲霉CICC40205为出发菌，以质粒pPTRII为模板，以SEQIDNO. 2-SEQID NO. 3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组为 模板，以SEQIDNO. 4-SEQIDNO. 5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80上游序 列U-ku80 ;以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQIDNO. 6-SEQIDNO. 7所示核苷 酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80下游序列D-ku80 ;通过融合PCR将ptrA片段、上游序 列U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQIDNO. 8-SEQID NO. 9所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQIDNO. 10-SEQ IDNO. 11所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B;再将打靶元件ku80-A 和打革G元件ku80-B同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后吡啶硫胺抗性筛选及基 因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At-Aku80 ; 2) 以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQIDNO. 12-SEQIDNO. 13所示核苷 酸序列为引物，扩增PyrG基因的上游序列U-pyrG;再以土曲霉CICC40205的基因组为模 板，以如SEQIDNO. 14-SEQIDNO. 15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序列 D-pyrG;再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为模 板，以如SEQIDNO. 16-SEQIDNO. 17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基因 的打祀元件pyrG-KO,再制备步骤1)所得重组菌At-Aku80的原生质体，再将pyrG基因的 打革G元件pyrG-KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿喃啶营养缺 陷型菌株At-Aku8〇-ApyrG; 3) 通过人工合成带有两个同向IoxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示，该DNA片段克隆在载体pUC57simple上，获得载体PalcA-syn;以黑曲霉C〇827基因 组为模板，以如SEQIDNO. 18-SEQIDNO. 19所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出黑曲 霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrGl，再将筛选标签pyrGl克隆到载体PalcA-syn 上，获得质粒PXH103,获得如SEQIDNO. 26所示的两侧带有同向IoxP位点序列的pyrGl 筛选标签loxP-pyrG-loxP;再以pSGF957 为模板，以如SEQIDNO. 20-SEQIDNO. 21 所示 核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC，再将gfp-TtrpC片段连接到质粒 PXH103上，获得质粒pXH104 ;再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQIDNO. 22-SEQ IDNO. 23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源臂片段，再将扩 增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105 ;再以土曲霉 CICC40205基因组为模板，以如SEQIDNO. 24-SEQIDNO. 25所示核苷酸序列为引物，通过 PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源臂片段连接到质 粒PXH105上，获得质粒pXH106 ;最后再以质粒pXH106为模板，以SEQIDNO. 8和SEQID NO. 10所示序列为引物扩增出打革巴元件ku80-pyrGl-gfp;再将打革巴元件ku80-pyrGl-gfp转 化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Aku80-ApyrG中，经过培养筛选后获得带 有loxP-pyrGl-loxP的重组菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP;从而证明成功建立了基于尿喃啶营 养缺陷重组菌和pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统； 4) 制备步骤3)所得重组菌At-Aku80-pyrGl_loxP的原生质体，向已制备好的100yL 浓度为IO8个AiL的原生质体溶液中加入2UCre重组酶、IygpyrGl片段和IOyL40% 的PEG4000,混合均匀后冰浴30min，加入ImlPSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育结 束后与含有I. 2M山梨醇、4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于 含有I. 2M山梨醇，lg/L5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生筛选培养基平板中，在 30°C、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子接种到⑶FU平板上于32°C下培养 5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，再挑取转化子接种到CD平板上，在32°C下培养 5-7天后获得同源重组能力提高，且不受筛选标签数量限制的用于基因打靶的土曲霉重组 菌At-Aku8〇-ApyrGl-loxP。9. 权利要求1-8所述任一方法，其特征在于，用于制备土曲霉重组菌。10. 利用权利要求1-8所述任一方法制备的土曲霉重组菌。
【专利摘要】本发明公开了一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高菌株的外源DNA同源重组概率，再构建pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株，建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后应用Cre/LoxP特异性结合位点重组系统切除筛选标签，重新获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，可再次被用于遗传改造。本发明所提供的方法可构建高效的土曲霉基因打靶平台，具有同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法简单易行、筛选标签可循环利用等优点，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。
【IPC分类】C12N1/15, C12R1/66, C12N15/87
【公开号】CN104894165
【申请号】CN201510275491
【发明人】吕雪峰, 黄雪年, 李建军, 陈梅
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
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