一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法
一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，以孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得成活的孤雌生殖的哺乳动物个体的技术，属于繁殖生物学领域。
【背景技术】
[0002]孤雌生殖是指在无雄性配子参与的情况下，由雌性配子被激活并发育为一个胚胎甚至个体的无性生殖过程。孤雌生殖对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要的应用价值。加之由于父系基因的缺失，孤雌生殖对研究哺乳动物的胚胎、胎盘的生长发育和印记基因有重要意义。经孤雌生殖而产生的个体在动物遗传学和动物育种中都具有重要的价值，是研究人类遗传疾病以及发育迟缓等疾病的理想模型。
[0003]但是哺乳动物在自然条件下无法自发进行孤雌生殖。通常是通过人工体外激活，哺乳动物的成熟卵母细胞可以发育为孤雌胚胎，虽然其在体内能进一步发育，但是各种哺乳动物都是着床后不久便停止发育。
[0004]因此，怎样促使猪的孤雌胚胎在体内发育时间延长并最终获得孤雌生殖个体一直是技术热点，也是一个技术难题。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明提供一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，针对哺乳动物孤雌生殖的胚胎在体内只能发育到早期的情况，利用体细胞核移植技术，延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得存活的孤雌生殖哺乳动物。
[0006]为解决技术问题，本发明采用的技术方案:一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法按照下面步骤进行:
第一步、获得哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞
对成熟的哺乳动物卵母细胞进行进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕妈妈体内，诊断为妊娠后根据不同的哺乳动物在不同的日龄取出成活孤雌胎儿，建立哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞系(G0代)；
第二步、通过第一代克隆获得哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞首先，将第一步分离的哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞(G0代)作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植，将重构胚移植到代孕妈妈体内发育，待妊娠期满后获得成活的孤雌生殖哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过该哺乳动物在自然条件下孤雌生殖胎儿在体内成活日龄的成活第一代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(Gl代)；
第三步、通过第二代甚至第三代、第四代克隆最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物将第二步获得的Gl代哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母猪体内发育，待妊娠期满后获得第二代孤雌生殖的克隆哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(G2代)。以此类推，进行第三代、甚至是第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物。
[0007]在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆猪，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆哺乳动物组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆哺乳动物。
[0008]本发明中的哺乳动物成熟卵母细胞孤雌激活、孤雌胎儿成纤维细胞系的建立、体细胞核移植技术均采用各种哺乳动物现有的技术完成。
[0009]本发明的有益效果:本发明利用体细胞核移植技术的基因组重组原理，使孤雌胎儿的成纤维细胞的基因组重组，实现了孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。本方法都基于成熟的技术，可控性高，实用性强。
[0010]实施例1
利用体细胞核移植技术连续克隆小鼠胎儿成纤维细胞，并最终获得存活的孤雌生殖小鼠个体，具体实施方法如下:
第一步、获得小鼠孤雌胎儿成纤维细胞；
从小鼠(早)输卵管内取出成熟的卵母细胞，进行孤雌激活获得孤雌胚胎，并将孤雌胚胎移植到发情的代孕鼠体内继续发育。
[0011]对怀孕8-10日龄的代孕小鼠进行剖腹手术，获取孤雌胚胎，用含有0.1%胶原酶对存活的孤雌胚胎组织进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，获得GO代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞。
[0012]第二步、通过第一代克隆获得猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞
首先，将分离的GO代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植构建重构胚，并进行激活，将重构胚移植到代孕小鼠体内继续发育。
[0013]对怀孕超过11日龄以上的代孕小鼠进行剖腹手术，获取第一代孤雌生殖克隆胚胎(或胎儿)，用含有0.1%胶原酶对存活的孤雌胚胎(或胎儿)进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，建立Gl代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞。
[0014]第三步、通过第二代克隆获得孤雌生殖小鼠个体或胎儿
将第二步获得的Gl代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕小鼠体内发育，待妊娠期19.5天剖腹产获得第二代孤雌生殖小鼠个体；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(如14日龄以上)，并分离培养孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞(G2代)。
[0015]第四步、通过第三代、甚至第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖小鼠。
[0016]在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖小鼠个体，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖小鼠组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖小鼠个体。
[0017]本发明以哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得的孤雌生殖的个体的技术，克服了的哺乳动物 孤雌生殖的胚胎在体内只能早期发育的难题，延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得出生的孤雌生殖哺乳动物个体，实现了哺乳动物孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。
[0018]实施例2
利用体细胞核移植技术连续克隆牛孤雌胎儿成纤维细胞，并最终获得存活的孤雌生殖牛个体，具体实施方法如下:
第一步、获得牛的孤雌胎儿成纤维细胞；
从屠宰场收集牛的卵巢，保存在生理盐水内运送回实验室。挑取牛的卵母细胞并进行体外成熟培养。对成熟的卵母细胞进行孤雌激活获得孤雌胚胎，并将孤雌胚胎移植到代孕母牛体内继续发育。
[0019]在第23天对代孕母牛进行妊娠诊断，对怀孕30日龄以前的代孕母牛进行剖腹手术，获取30日龄以前的孤雌胚胎，把存活的孤雌胚胎去头、尾、四肢、内脏，剪碎剩余部分组织，用含有0.1%胶原酶进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，获得GO代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞。
[0020]第二步、通过第一代克隆获得牛孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞
首先，将分离的GO代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植构建重构胚，并进行激活，将重构胚移植到代孕母牛体内继续发育。
[0021]对怀孕超过30日龄的代孕母牛进行剖腹手术，获取第一代孤雌生殖克隆胎儿，用含有0.1%胶原酶对存活的孤雌生殖胎儿进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，建立Gl代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞。
[0022]第三步、通过第二代克隆获得孤雌生殖克隆牛个体或胎儿
将第二步获得的Gl代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母牛体内发育，待妊娠期280天后剖腹产获得第二代孤雌生殖克隆牛个体；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(如40日龄以上)，并分离培养孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞(G2代)。
[0023]第四步、通过第三代、甚至第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆牛在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆牛个体，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆牛组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆牛个体。
[0024]本发明以哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得的孤雌生殖的个体的技术，克服了的哺乳动物孤雌生殖的胚胎在体内只能早期发育的难题，延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得出生的孤雌生殖哺乳动物个体，实现了哺乳动物孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。
[0025]本发明通过实施例进行说明的内容，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明专利进行各种变换及等同代替，因此，本发明专利不局限于所公开的具体实施过程，而应当包括落入本发明专利权利要求范围内的全部实施方案。
【主权项】
1.一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，其特征在于，所述的生产孤雌生殖哺乳动物的方法按照下面步骤进行: 第一步、获得哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞 对成熟的哺乳动物卵母细胞进行进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕妈妈体内，诊断为妊娠后根据不同的哺乳动物在不同的日龄取出成活孤雌胎儿，建立哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞系(GO代)； 第二步、通过第一代克隆获得哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞首先，将第一步分离的哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞(G0代)作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植，将重构胚移植到代孕妈妈体内发育，待妊娠期满后获得成活的孤雌生殖哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过该哺乳动物在自然条件下孤雌生殖胎儿在体内成活日龄的成活第一代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(Gl代)； 第三步、通过第二代甚至第三代、第四代克隆最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物将第二步获得的Gl代哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母猪体内发育，待妊娠期满后获得第二代孤雌生殖的克隆哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(G2代)。2.以此类推，进行第三代、甚至是第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物。3.根据权利要求1所述的一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，其特征在于，在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆猪，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆哺乳动物组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆哺乳动物。
【专利摘要】本发明涉及一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，属于繁殖生物学领域。本发明包括哺乳动物的卵母细胞孤雌激活、孤雌胚胎移植、孤雌胎儿成纤维细胞的分离和连续的体细胞核移植；本发明将去脂后的成熟哺乳动物卵母细胞进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕妈妈体内，诊断为妊娠后根据不同的哺乳动物在不同的日龄取出成活孤雌胎儿，建立哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞系，并将其作为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得哺乳动物的孤雌生殖个体，此技术克服了哺乳动物孤雌生殖胚胎在体内早期停止发育的情况，成功延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/877
【公开号】CN104894166
【申请号】CN201410076057
【发明人】魏红江, 卿玉波, 富国文, 潘伟荣, 李鸿辉, 成文敏, 赵红业
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，以孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得成活的孤雌生殖的哺乳动物个体的技术，属于繁殖生物学领域。
【背景技术】
[0002]孤雌生殖是指在无雄性配子参与的情况下，由雌性配子被激活并发育为一个胚胎甚至个体的无性生殖过程。孤雌生殖对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要的应用价值。加之由于父系基因的缺失，孤雌生殖对研究哺乳动物的胚胎、胎盘的生长发育和印记基因有重要意义。经孤雌生殖而产生的个体在动物遗传学和动物育种中都具有重要的价值，是研究人类遗传疾病以及发育迟缓等疾病的理想模型。
[0003]但是哺乳动物在自然条件下无法自发进行孤雌生殖。通常是通过人工体外激活，哺乳动物的成熟卵母细胞可以发育为孤雌胚胎，虽然其在体内能进一步发育，但是各种哺乳动物都是着床后不久便停止发育。
[0004]因此，怎样促使猪的孤雌胚胎在体内发育时间延长并最终获得孤雌生殖个体一直是技术热点，也是一个技术难题。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明提供一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，针对哺乳动物孤雌生殖的胚胎在体内只能发育到早期的情况，利用体细胞核移植技术，延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得存活的孤雌生殖哺乳动物。
[0006]为解决技术问题，本发明采用的技术方案:一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法按照下面步骤进行:
第一步、获得哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞
对成熟的哺乳动物卵母细胞进行进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕妈妈体内，诊断为妊娠后根据不同的哺乳动物在不同的日龄取出成活孤雌胎儿，建立哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞系(G0代)；
第二步、通过第一代克隆获得哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞首先，将第一步分离的哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞(G0代)作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植，将重构胚移植到代孕妈妈体内发育，待妊娠期满后获得成活的孤雌生殖哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过该哺乳动物在自然条件下孤雌生殖胎儿在体内成活日龄的成活第一代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(Gl代)；
第三步、通过第二代甚至第三代、第四代克隆最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物将第二步获得的Gl代哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母猪体内发育，待妊娠期满后获得第二代孤雌生殖的克隆哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(G2代)。以此类推，进行第三代、甚至是第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物。
[0007]在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆猪，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆哺乳动物组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆哺乳动物。
[0008]本发明中的哺乳动物成熟卵母细胞孤雌激活、孤雌胎儿成纤维细胞系的建立、体细胞核移植技术均采用各种哺乳动物现有的技术完成。
[0009]本发明的有益效果:本发明利用体细胞核移植技术的基因组重组原理，使孤雌胎儿的成纤维细胞的基因组重组，实现了孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。本方法都基于成熟的技术，可控性高，实用性强。
[0010]实施例1
利用体细胞核移植技术连续克隆小鼠胎儿成纤维细胞，并最终获得存活的孤雌生殖小鼠个体，具体实施方法如下:
第一步、获得小鼠孤雌胎儿成纤维细胞；
从小鼠(早)输卵管内取出成熟的卵母细胞，进行孤雌激活获得孤雌胚胎，并将孤雌胚胎移植到发情的代孕鼠体内继续发育。
[0011]对怀孕8-10日龄的代孕小鼠进行剖腹手术，获取孤雌胚胎，用含有0.1%胶原酶对存活的孤雌胚胎组织进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，获得GO代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞。
[0012]第二步、通过第一代克隆获得猪孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞
首先，将分离的GO代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植构建重构胚，并进行激活，将重构胚移植到代孕小鼠体内继续发育。
[0013]对怀孕超过11日龄以上的代孕小鼠进行剖腹手术，获取第一代孤雌生殖克隆胚胎(或胎儿)，用含有0.1%胶原酶对存活的孤雌胚胎(或胎儿)进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，建立Gl代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞。
[0014]第三步、通过第二代克隆获得孤雌生殖小鼠个体或胎儿
将第二步获得的Gl代孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕小鼠体内发育，待妊娠期19.5天剖腹产获得第二代孤雌生殖小鼠个体；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(如14日龄以上)，并分离培养孤雌生殖小鼠胎儿成纤维细胞(G2代)。
[0015]第四步、通过第三代、甚至第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖小鼠。
[0016]在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖小鼠个体，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖小鼠组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖小鼠个体。
[0017]本发明以哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得的孤雌生殖的个体的技术，克服了的哺乳动物 孤雌生殖的胚胎在体内只能早期发育的难题，延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得出生的孤雌生殖哺乳动物个体，实现了哺乳动物孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。
[0018]实施例2
利用体细胞核移植技术连续克隆牛孤雌胎儿成纤维细胞，并最终获得存活的孤雌生殖牛个体，具体实施方法如下:
第一步、获得牛的孤雌胎儿成纤维细胞；
从屠宰场收集牛的卵巢，保存在生理盐水内运送回实验室。挑取牛的卵母细胞并进行体外成熟培养。对成熟的卵母细胞进行孤雌激活获得孤雌胚胎，并将孤雌胚胎移植到代孕母牛体内继续发育。
[0019]在第23天对代孕母牛进行妊娠诊断，对怀孕30日龄以前的代孕母牛进行剖腹手术，获取30日龄以前的孤雌胚胎，把存活的孤雌胚胎去头、尾、四肢、内脏，剪碎剩余部分组织，用含有0.1%胶原酶进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，获得GO代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞。
[0020]第二步、通过第一代克隆获得牛孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞
首先，将分离的GO代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植构建重构胚，并进行激活，将重构胚移植到代孕母牛体内继续发育。
[0021]对怀孕超过30日龄的代孕母牛进行剖腹手术，获取第一代孤雌生殖克隆胎儿，用含有0.1%胶原酶对存活的孤雌生殖胎儿进行消化，分离胎儿成纤维细胞；待细胞生长汇集达到90%以上时进行传代、冷冻保存，建立Gl代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞。
[0022]第三步、通过第二代克隆获得孤雌生殖克隆牛个体或胎儿
将第二步获得的Gl代孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母牛体内发育，待妊娠期280天后剖腹产获得第二代孤雌生殖克隆牛个体；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(如40日龄以上)，并分离培养孤雌生殖牛胎儿成纤维细胞(G2代)。
[0023]第四步、通过第三代、甚至第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆牛在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆牛个体，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆牛组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆牛个体。
[0024]本发明以哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得的孤雌生殖的个体的技术，克服了的哺乳动物孤雌生殖的胚胎在体内只能早期发育的难题，延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得出生的孤雌生殖哺乳动物个体，实现了哺乳动物孤雌胎儿在体内发育时间的延长直至出生。
[0025]本发明通过实施例进行说明的内容，在不脱离本发明范围的情况下，还可以对本发明专利进行各种变换及等同代替，因此，本发明专利不局限于所公开的具体实施过程，而应当包括落入本发明专利权利要求范围内的全部实施方案。
【主权项】
1.一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，其特征在于，所述的生产孤雌生殖哺乳动物的方法按照下面步骤进行: 第一步、获得哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞 对成熟的哺乳动物卵母细胞进行进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕妈妈体内，诊断为妊娠后根据不同的哺乳动物在不同的日龄取出成活孤雌胎儿，建立哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞系(GO代)； 第二步、通过第一代克隆获得哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞首先，将第一步分离的哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞(G0代)作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第一代体细胞核移植，将重构胚移植到代孕妈妈体内发育，待妊娠期满后获得成活的孤雌生殖哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过该哺乳动物在自然条件下孤雌生殖胎儿在体内成活日龄的成活第一代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(Gl代)； 第三步、通过第二代甚至第三代、第四代克隆最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物将第二步获得的Gl代哺乳动物孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术进行第二代体细胞核移植，将重构胚胎移植到代孕母猪体内发育，待妊娠期满后获得第二代孤雌生殖的克隆哺乳动物；如果孤雌生殖的克隆胚胎不能发育到妊娠后期，则手术获取能正常发育超过第一代孤雌生殖克隆胎儿在体内成活日龄的成活第二代孤雌生殖的克隆胎儿(在体内成活时间越长越好)，并分离培养该哺乳动物的孤雌生殖的克隆胎儿成纤维细胞(G2代)。2.以此类推，进行第三代、甚至是第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物。3.根据权利要求1所述的一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，其特征在于，在第三步中，当第二代克隆不能获得成活的孤雌生殖克隆猪，则取比第一代孤雌克隆胎儿更进一步发育的胎儿或出生后因畸形等原因死亡的孤雌生殖克隆哺乳动物组织，建立成纤维细胞系，进行第三代克隆，以此类推甚至进行第四代克隆，直至最终获得成活的孤雌生殖克隆哺乳动物。
【专利摘要】本发明涉及一种利用连续克隆技术生产孤雌生殖哺乳动物的方法，属于繁殖生物学领域。本发明包括哺乳动物的卵母细胞孤雌激活、孤雌胚胎移植、孤雌胎儿成纤维细胞的分离和连续的体细胞核移植；本发明将去脂后的成熟哺乳动物卵母细胞进行孤雌激活获得孤雌胚胎，移植到代孕妈妈体内，诊断为妊娠后根据不同的哺乳动物在不同的日龄取出成活孤雌胎儿，建立哺乳动物孤雌胎儿成纤维细胞系，并将其作为最初供体细胞，利用体细胞核移植技术进行连续克隆获得哺乳动物的孤雌生殖个体，此技术克服了哺乳动物孤雌生殖胚胎在体内早期停止发育的情况，成功延长哺乳动物的孤雌胚胎在体内的发育时间，并最终获得成活的孤雌生殖哺乳动物。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/877
【公开号】CN104894166
【申请号】CN201410076057
【发明人】魏红江, 卿玉波, 富国文, 潘伟荣, 李鸿辉, 成文敏, 赵红业
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月4日
最新回复(0)