利用豆粕粉同步酶解发酵制备(r,r)-2,3-丁二醇的方法
利用豆粕粉同步酶解发酵制备(r,r)-2,3-丁二醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体是一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备 (R，R)-2, 3-丁二醇的方法。
【背景技术】
[0002] 2, 3- 丁二醇（2, 3-butanediol)作为一种大宗的化学产品具有广 泛的应用价值，尤其在化工、食品、燃料及航空航天等领域（Appl Microbiol Biotechnol，2001，55 (1) : 10-18)。同时，通过特定的化学反应，2, 3-丁二醇可以衍生出多种 重要的化学品如3-羟基丁酮、甲乙酮及1，3- 丁二烯。因此，它被视作一种极具潜力的平台 化合物。
[0003] 2, 3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，因此存在三种旋光异构体，分别是 (1?，1?)-2,3-丁二醇、（3,3)-2,3-丁二醇和11168〇-2,3-丁二醇。其中（1?，1?)-2,3-丁二醇不 仅具有混旋型2, 3- 丁二醇的一般功能，还是优良的抗冻剂，也是合成手性试剂和手性配体 的重要中间体，在手性药物的合成中也有潜在的重要应用（催化学报，2013, 34:351-360)。
[0004] 目前，（R，R)-2, 3- 丁二醇的生产主要采用化学合成法，以1- 丁醇经过多步反应得 到2, 3- 丁二醇的外消旋混合物，最后通过外消旋体的拆分得到（R，R) -2, 3- 丁二醇(化学进 展，2010, 22:2450-2461)。化学合成法过程繁琐，而且手性拆分成本高，难以实现大规模生 产。因此，实现单一立体构型2, 3- 丁二醇的研究很有必要。
[0005] 在制备化学品的方法中，微生物制造方法与化学合成法相比，其原料丰富而且 可再生、条件温和、工艺简单、环境友好，因此越来越成为国内外研究开发的热点。具 有良好生产潜力的2, 3-丁二醇合成菌株主要集中于克雷伯氏菌属（Klebsiella)、肠 杆菌属（Enterobacter)、类芽抱杆菌属（Panebacillus)、芽抱杆菌属（Bacillus)及 沙雷氏菌属（S e rr a t i a )。大多数报道的微生物产生的均为混旋型2，3 - 丁二醇，而类 芽孢杆菌属的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)则能够产生光学纯度大 于 98% 的（R，R)-2, 3- 丁二醇（Appl Environ Microbiol, 2011，77:4230-4233;Biore source Techno 1,2012, 124:237-244)。此外，也有利用代谢工程技术构建Bacillus licheniformis、Escherichia coli等重组菌株合成（R，R)_2, 3-丁二醇的报道，但产量比 较低。目前报道的（R，R)-2,3-丁二醇产量最高的是lllg/L，但其发酵培养基中需要加入高 浓度价格昂贵的酵母粉（60g/L)。当酵母粉浓度降低至5g/L的时候，（R，R)-2,3-丁二醇产 量仅为 60g/L (Bioresource Technol, 2012, 124:237-244)。
[0006] 微生物发酵产生（R，R)_2, 3- 丁二醇的同时需要富含氨基酸、维生素、无机盐以及 微量元素的氮源来维持菌体正常生长代谢。由于酵母粉、蛋白胨等氮源由于富含多种上 述营养成分，有利于菌体的生长和发酵。目前对微生物法制备（R，R)_2, 3-丁二醇的文献 报道大多使用这些高价的有机氮源（Bioresource Technol, 2012, 124:237-244; J Biosci Bioeng, 2000, 90:661-664;Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97:585-597)，从而限制了 其工业化生产。微生物发酵的培养基成分对生产成本影响很大，例如乳酸发酵中酵母粉等 氮源的成本占总发酵成本的30%左右（Enzyme Microb Technol, 2000, 26:209-215)。因此 寻找一种既廉价又有效的氮源来替代高价氮源是推进发酵产业化生产（R，R)-2, 3- 丁二醇 的必经之路。
[0007] 此外，通过检索发现与（R，R)-2, 3- 丁二醇制备相关的专利公开文献如下：
[0008] 1、产（R，R)_2, 3- 丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用（【申请号】 201210505523. 2)，公开了一株高产高纯度的（R，R)-2, 3- 丁二醇的基因工程菌及其构建方 法和应用。该发明所述的发酵培养基使用高价的蛋白胨和酵母膏为氮源，未使用豆柏粉为 氮源。
[0009] 2、一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯R，R型2, 3- 丁二醇的方法（【申请号】 200910026807. 1)，公开了一种多粘类芽孢杆菌及制备的方法。该发明的发酵培养基所使用 的有机氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉。其中使用豆饼粉为有机 氮源时（R，R)-2, 3- 丁二醇产量仅为18. 2g/L。该发明未使用豆柏粉为氮源。
[0010] 豆饼粉和豆柏粉是大豆提取豆油之后的剩余物，但成分有所区别。采用压榨法提 取油之后的剩余物为豆饼粉，豆油的残留量较高；而采用有机溶剂提取豆油之后剩余物为 豆柏粉，豆油的残留量低，价格低廉(过程工程学报，2007, 7:149-151 )。
[0011] 由此可见，目前（R，R)_2, 3-丁二醇的发酵生产主要以高价的酵母粉、蛋白胨、牛 肉膏等为有机氮源，成本较高，大规模生产时原料来源将受到限制。
[0012] 通过检索，未见有关采用廉价的豆柏粉作为有机氮源生产（R，R)-2, 3-丁二醇的 方法报道。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)-2, 3- 丁二醇的方 法，它能够采用廉价的豆柏粉替代或减少酵母粉等高价氮源的用量，降低（R，R)-2, 3- 丁二 醇的生产成本。
[0014] 本发明的技术方案为：一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)-2, 3-丁二醇的 方法，包括如下步骤：
[0015] 将类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.)接种到以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养 基中进行发酵培养，发酵培养温度为37-40°C，发酵时间26小时，所述发酵培养基于121°C 下高压灭菌20min，所得发酵液中即含有（R，R) -2, 3- 丁二醇；所述豆柏粉在所述发酵培 养基中的终浓度为10_80g/L ;所述类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.)为多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)。
[0016] 所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养包括豆柏粉及其水解液。
[0017] 所述发酵培养基还含有中性蛋白酶，所述中性蛋白酶在所述发酵培养基中的 终浓度可为0. 1-0. 8g/L。由于酶解与发酵同步进行，简化了操作步骤，降低了高纯度 (R，R) -2, 3- 丁二醇的生产成本。
[0018] 所述发酵培养基还含有乙酸钠以提高（R，R)-2, 3- 丁二醇的产量。
[0019] 所述发酵培养基还含有Tween-80以提高（R，R)-2, 3- 丁二醇的产量。
[0020] 本发明突出的实质性特点和显著进步在于：
[0021] 本发明选择廉价氮源豆柏粉代替现有技术的（R，R)-2, 3- 丁二醇发酵常规培养基 中的高价氮源，从而减少了酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等高价氮源的用量，更加适合用于大规 模工业化生产（R，R)-2, 3-丁二醇。发酵液中添加了中性蛋白酶，使得豆柏粉的酶解与发酵 同步进行，能够有效简化操作步骤，进一步降低高纯度（R，R)-2, 3-丁二醇的生产成本。此 外，发酵培养基中添加了乙酸钠和Tween-80,也能够有效提高（R，R) -2, 3- 丁二醇的产量。
[0022] 本发明所述廉价氮源还可以是上述豆柏粉及其水解液，或者豆柏粉及其水解液与 酵母粉等联用的氮源；即当单独使用豆柏粉及其水解液时（R，R)-2, 3-丁二醇生产能力达 到极限，可以选择与酵母粉、蛋白胨等氮源联合使用，使得（R，R)_2, 3-丁二醇生产能力进 一步提商。
【具体实施方式】
[0023] 本发明使用的菌种可以从菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集、基因工程改 造或者其他途径获得。涉及的专业术语是本领域中常见的专业术语，实施例是说明性的，而 不是限定性的，不能被解释为限定本发明的保护范围。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例为锥形瓶振荡法利用豆柏粉为有机氮源在37°C条件下发酵制备 (R，R)-2, 3- 丁二醇的方法，包括如下步骤：
[0028] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacillus polymyxa DSM365,该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
[0029] 种子培养基：蔗糖 100g/L，酵母粉 30g/L，（NH4) 2S043g/L，MgSO4 · 7H200. 3g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min。
[0030] 发酵培养基：蔗糖 l〇〇g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0031] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paeniba cillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0032] 将种子液按体积分数10%的接种量转接到60mL发酵培养基中进行震荡培养，发酵 温度分别为37 °C，摇床转速280rpm。发酵26小时后取发酵液离心测定（R，R)-2, 3- 丁二 醇、（S, S) -2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇的浓度，并计算糖醇转化率和（R, R) -2, 3- 丁二 醇光学纯度。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 结果如表1所示。
[0033] 表1以豆柏粉为有机氮源在37°C条件下的发酵结果
[0034]
[0035] 实施例2
[0036] 本实施例为锥形瓶振荡法利用豆柏粉为有机氮源在38. 5°C条件下发酵制备 (R，R)-2, 3-丁二醇的方法，包括如下步骤：
[0037] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacilluspolymyxa DSM365,该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
[0038] 种子培养基：蔗糖 100g/L，酵母粉 30g/L，（NH4) 2S043g/L，MgSO4 · 7H200. 3g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min。
[0039] 发酵培养基：蔗糖 100g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0040] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0041] 将种子液按体积分数10%的接种量转接到60mL发酵培养基中进行震荡培养，发酵 温度分别为38. 5°C，摇床转速280rpm。发酵26小时后取发酵液离心测定（R，R) -2, 3- 丁二 醇、（S, S) -2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇的浓度，并计算糖醇转化率和（R, R) -2, 3- 丁二 醇光学纯度。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 结果如表2所示。
[0042] 表2以豆柏粉为有机氮源在38. 5°C条件下的发酵结果
[0043]
[0044] 实施例3
[0045] 本实施例为锥形瓶振荡法利用豆柏粉为有机氮源在40°C条件下发酵制备 (R，R)-2, 3- 丁二醇的方法，包括如下步骤：
[0046] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacilluspolymyxa DSM365,该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
[0047] 种子培养基：蔗糖 100g/L，酵母粉 30g/L，（NH4) 2S043g/L，MgSO4 · 7H200. 3g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min。
[0048] 发酵培养基：蔗糖 100g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0049] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0050] 将种子液按体积分数10%的接种量转接到60mL发酵培养基中进行震荡培养，发酵 温度分别为40°C，摇床转速280rpm。发酵26小时后取发酵液离心测定（R，R)-2,3-丁二 醇、（S, S) -2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇的浓度，并计算糖醇转化率和（R, R) -2, 3- 丁二 醇光学纯度。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 结果如表3所不。
[0051] 表3以豆柏粉为有机氮源在40°C条件下的发酵结果
[0052]
[0053]
[0054] 实施例4
[0055] 分批补料发酵模式利用豆柏粉为有机氮源高效生产（R，R) -2, 3- 丁二醇
[0056] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacilluspolymyxa DSM365〇
[0057] 种子培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：蔗糖100g/L，酵母粉30g/L， (NH 4) 2S043g/L，MgSO4 · 7Η200· 3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6.0。121°C 高压灭菌 20min。
[0058] 发酵培养基：蔗糖 80g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0059] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0060] 上海保兴BI0TECH3升发酵罐中加入1. 5升发酵培养基，将种子液按体积分数10% 的接种量转接到发酵培养基中进行培养，发酵温度40°C，搅拌速度为500rpm。发酵10小时 后补加5%浓度的蔗糖，之后每隔8h补加5%浓度的蔗糖。通过5次补料，在发酵72h结束 时，（R，R) -2, 3- 丁二醇浓度为92. 5g/L，光学纯度为98. 3%。
[0061] 这一结果表明本发明具有重要的经济效益，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365在以豆柏粉为唯一氮源发酵生产（R，R)-2,3-丁二醇中，显示出了非常好 的工业应用前景。应该理解的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变 换，例如，所述的菌株除了多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365之外，还可以 是多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa其它菌株，或者其它能够利用豆柏粉产生高纯 度（R，R)-2, 3- 丁二醇的微生物，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的 保护范围。
【主权项】
1. 一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)-2, 3-丁二醇的方法，其特征在于，包括如 下步骤： 将类芽孢杆菌（Paenibacillussp.)接种到以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养 基中进行发酵培养，发酵培养温度为37-40°C，发酵时间26小时，所得发酵液中即含有 (R，R)-2, 3- 丁二醇；所述豆柏粉在所述发酵培养基中的终浓度为10-80g/L;所述类芽孢杆 菌（Paenibacillussp.)为多粘类芽抱杆菌（Paenibacilluspolymyxa)。2. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R) _2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基包括豆柏粉及其水解液。3. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)_2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基还含有中性蛋白酶。4. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)_2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基还含有乙酸钠。5. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)_2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基还含有Tween-80。
【专利摘要】一种利用豆粕粉同步酶解发酵制备(R,R)-2,3-丁二醇的方法，包括如下步骤：将类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）接种到以豆粕粉作为有机氮源的发酵培养基中进行发酵培养，所得发酵液中即含有(R,R)-2,3-丁二醇；所述豆粕粉在所述发酵培养基中的终浓度为10-80g/L；所述类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。在分批补料发酵中，发酵液中(R,R)-2,3-丁二醇的浓度达到92.5g/L，光学纯度达到98%。采用本发明能够减少了酵母粉用量，且酶解与发酵同步进行，简化了操作步骤，降低了高纯度(R,R)-2,3-丁二醇生产成本。
【IPC分类】C12P7/18, C12R1/01
【公开号】CN104894170
【申请号】CN201410080322
【发明人】谢能中, 黄日波, 郭铃, 李检秀, 李亿, 黄艳燕
【申请人】广西科学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体是一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备 (R，R)-2, 3-丁二醇的方法。
【背景技术】
[0002] 2, 3- 丁二醇（2, 3-butanediol)作为一种大宗的化学产品具有广 泛的应用价值，尤其在化工、食品、燃料及航空航天等领域（Appl Microbiol Biotechnol，2001，55 (1) : 10-18)。同时，通过特定的化学反应，2, 3-丁二醇可以衍生出多种 重要的化学品如3-羟基丁酮、甲乙酮及1，3- 丁二烯。因此，它被视作一种极具潜力的平台 化合物。
[0003] 2, 3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，因此存在三种旋光异构体，分别是 (1?，1?)-2,3-丁二醇、（3,3)-2,3-丁二醇和11168〇-2,3-丁二醇。其中（1?，1?)-2,3-丁二醇不 仅具有混旋型2, 3- 丁二醇的一般功能，还是优良的抗冻剂，也是合成手性试剂和手性配体 的重要中间体，在手性药物的合成中也有潜在的重要应用（催化学报，2013, 34:351-360)。
[0004] 目前，（R，R)-2, 3- 丁二醇的生产主要采用化学合成法，以1- 丁醇经过多步反应得 到2, 3- 丁二醇的外消旋混合物，最后通过外消旋体的拆分得到（R，R) -2, 3- 丁二醇(化学进 展，2010, 22:2450-2461)。化学合成法过程繁琐，而且手性拆分成本高，难以实现大规模生 产。因此，实现单一立体构型2, 3- 丁二醇的研究很有必要。
[0005] 在制备化学品的方法中，微生物制造方法与化学合成法相比，其原料丰富而且 可再生、条件温和、工艺简单、环境友好，因此越来越成为国内外研究开发的热点。具 有良好生产潜力的2, 3-丁二醇合成菌株主要集中于克雷伯氏菌属（Klebsiella)、肠 杆菌属（Enterobacter)、类芽抱杆菌属（Panebacillus)、芽抱杆菌属（Bacillus)及 沙雷氏菌属（S e rr a t i a )。大多数报道的微生物产生的均为混旋型2，3 - 丁二醇，而类 芽孢杆菌属的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)则能够产生光学纯度大 于 98% 的（R，R)-2, 3- 丁二醇（Appl Environ Microbiol, 2011，77:4230-4233;Biore source Techno 1,2012, 124:237-244)。此外，也有利用代谢工程技术构建Bacillus licheniformis、Escherichia coli等重组菌株合成（R，R)_2, 3-丁二醇的报道，但产量比 较低。目前报道的（R，R)-2,3-丁二醇产量最高的是lllg/L，但其发酵培养基中需要加入高 浓度价格昂贵的酵母粉（60g/L)。当酵母粉浓度降低至5g/L的时候，（R，R)-2,3-丁二醇产 量仅为 60g/L (Bioresource Technol, 2012, 124:237-244)。
[0006] 微生物发酵产生（R，R)_2, 3- 丁二醇的同时需要富含氨基酸、维生素、无机盐以及 微量元素的氮源来维持菌体正常生长代谢。由于酵母粉、蛋白胨等氮源由于富含多种上 述营养成分，有利于菌体的生长和发酵。目前对微生物法制备（R，R)_2, 3-丁二醇的文献 报道大多使用这些高价的有机氮源（Bioresource Technol, 2012, 124:237-244; J Biosci Bioeng, 2000, 90:661-664;Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97:585-597)，从而限制了 其工业化生产。微生物发酵的培养基成分对生产成本影响很大，例如乳酸发酵中酵母粉等 氮源的成本占总发酵成本的30%左右（Enzyme Microb Technol, 2000, 26:209-215)。因此 寻找一种既廉价又有效的氮源来替代高价氮源是推进发酵产业化生产（R，R)-2, 3- 丁二醇 的必经之路。
[0007] 此外，通过检索发现与（R，R)-2, 3- 丁二醇制备相关的专利公开文献如下：
[0008] 1、产（R，R)_2, 3- 丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用（【申请号】 201210505523. 2)，公开了一株高产高纯度的（R，R)-2, 3- 丁二醇的基因工程菌及其构建方 法和应用。该发明所述的发酵培养基使用高价的蛋白胨和酵母膏为氮源，未使用豆柏粉为 氮源。
[0009] 2、一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯R，R型2, 3- 丁二醇的方法（【申请号】 200910026807. 1)，公开了一种多粘类芽孢杆菌及制备的方法。该发明的发酵培养基所使用 的有机氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉。其中使用豆饼粉为有机 氮源时（R，R)-2, 3- 丁二醇产量仅为18. 2g/L。该发明未使用豆柏粉为氮源。
[0010] 豆饼粉和豆柏粉是大豆提取豆油之后的剩余物，但成分有所区别。采用压榨法提 取油之后的剩余物为豆饼粉，豆油的残留量较高；而采用有机溶剂提取豆油之后剩余物为 豆柏粉，豆油的残留量低，价格低廉(过程工程学报，2007, 7:149-151 )。
[0011] 由此可见，目前（R，R)_2, 3-丁二醇的发酵生产主要以高价的酵母粉、蛋白胨、牛 肉膏等为有机氮源，成本较高，大规模生产时原料来源将受到限制。
[0012] 通过检索，未见有关采用廉价的豆柏粉作为有机氮源生产（R，R)-2, 3-丁二醇的 方法报道。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)-2, 3- 丁二醇的方 法，它能够采用廉价的豆柏粉替代或减少酵母粉等高价氮源的用量，降低（R，R)-2, 3- 丁二 醇的生产成本。
[0014] 本发明的技术方案为：一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)-2, 3-丁二醇的 方法，包括如下步骤：
[0015] 将类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.)接种到以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养 基中进行发酵培养，发酵培养温度为37-40°C，发酵时间26小时，所述发酵培养基于121°C 下高压灭菌20min，所得发酵液中即含有（R，R) -2, 3- 丁二醇；所述豆柏粉在所述发酵培 养基中的终浓度为10_80g/L ;所述类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.)为多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)。
[0016] 所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养包括豆柏粉及其水解液。
[0017] 所述发酵培养基还含有中性蛋白酶，所述中性蛋白酶在所述发酵培养基中的 终浓度可为0. 1-0. 8g/L。由于酶解与发酵同步进行，简化了操作步骤，降低了高纯度 (R，R) -2, 3- 丁二醇的生产成本。
[0018] 所述发酵培养基还含有乙酸钠以提高（R，R)-2, 3- 丁二醇的产量。
[0019] 所述发酵培养基还含有Tween-80以提高（R，R)-2, 3- 丁二醇的产量。
[0020] 本发明突出的实质性特点和显著进步在于：
[0021] 本发明选择廉价氮源豆柏粉代替现有技术的（R，R)-2, 3- 丁二醇发酵常规培养基 中的高价氮源，从而减少了酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等高价氮源的用量，更加适合用于大规 模工业化生产（R，R)-2, 3-丁二醇。发酵液中添加了中性蛋白酶，使得豆柏粉的酶解与发酵 同步进行，能够有效简化操作步骤，进一步降低高纯度（R，R)-2, 3-丁二醇的生产成本。此 外，发酵培养基中添加了乙酸钠和Tween-80,也能够有效提高（R，R) -2, 3- 丁二醇的产量。
[0022] 本发明所述廉价氮源还可以是上述豆柏粉及其水解液，或者豆柏粉及其水解液与 酵母粉等联用的氮源；即当单独使用豆柏粉及其水解液时（R，R)-2, 3-丁二醇生产能力达 到极限，可以选择与酵母粉、蛋白胨等氮源联合使用，使得（R，R)_2, 3-丁二醇生产能力进 一步提商。
【具体实施方式】
[0023] 本发明使用的菌种可以从菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集、基因工程改 造或者其他途径获得。涉及的专业术语是本领域中常见的专业术语，实施例是说明性的，而 不是限定性的，不能被解释为限定本发明的保护范围。
[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例为锥形瓶振荡法利用豆柏粉为有机氮源在37°C条件下发酵制备 (R，R)-2, 3- 丁二醇的方法，包括如下步骤：
[0028] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacillus polymyxa DSM365,该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
[0029] 种子培养基：蔗糖 100g/L，酵母粉 30g/L，（NH4) 2S043g/L，MgSO4 · 7H200. 3g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min。
[0030] 发酵培养基：蔗糖 l〇〇g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0031] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paeniba cillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0032] 将种子液按体积分数10%的接种量转接到60mL发酵培养基中进行震荡培养，发酵 温度分别为37 °C，摇床转速280rpm。发酵26小时后取发酵液离心测定（R，R)-2, 3- 丁二 醇、（S, S) -2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇的浓度，并计算糖醇转化率和（R, R) -2, 3- 丁二 醇光学纯度。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 结果如表1所示。
[0033] 表1以豆柏粉为有机氮源在37°C条件下的发酵结果
[0034]
[0035] 实施例2
[0036] 本实施例为锥形瓶振荡法利用豆柏粉为有机氮源在38. 5°C条件下发酵制备 (R，R)-2, 3-丁二醇的方法，包括如下步骤：
[0037] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacilluspolymyxa DSM365,该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
[0038] 种子培养基：蔗糖 100g/L，酵母粉 30g/L，（NH4) 2S043g/L，MgSO4 · 7H200. 3g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min。
[0039] 发酵培养基：蔗糖 100g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0040] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0041] 将种子液按体积分数10%的接种量转接到60mL发酵培养基中进行震荡培养，发酵 温度分别为38. 5°C，摇床转速280rpm。发酵26小时后取发酵液离心测定（R，R) -2, 3- 丁二 醇、（S, S) -2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇的浓度，并计算糖醇转化率和（R, R) -2, 3- 丁二 醇光学纯度。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 结果如表2所示。
[0042] 表2以豆柏粉为有机氮源在38. 5°C条件下的发酵结果
[0043]
[0044] 实施例3
[0045] 本实施例为锥形瓶振荡法利用豆柏粉为有机氮源在40°C条件下发酵制备 (R，R)-2, 3- 丁二醇的方法，包括如下步骤：
[0046] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacilluspolymyxa DSM365,该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
[0047] 种子培养基：蔗糖 100g/L，酵母粉 30g/L，（NH4) 2S043g/L，MgSO4 · 7H200. 3g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min。
[0048] 发酵培养基：蔗糖 100g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0049] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0050] 将种子液按体积分数10%的接种量转接到60mL发酵培养基中进行震荡培养，发酵 温度分别为40°C，摇床转速280rpm。发酵26小时后取发酵液离心测定（R，R)-2,3-丁二 醇、（S, S) -2, 3- 丁二醇和mes〇-2, 3- 丁二醇的浓度，并计算糖醇转化率和（R, R) -2, 3- 丁二 醇光学纯度。将本实施例发酵培养基和常规发酵培养基在上述相同条件下进行发酵实验， 结果如表3所不。
[0051] 表3以豆柏粉为有机氮源在40°C条件下的发酵结果
[0052]
[0053]
[0054] 实施例4
[0055] 分批补料发酵模式利用豆柏粉为有机氮源高效生产（R，R) -2, 3- 丁二醇
[0056] 发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)为多粘类芽孢杆菌 Paenibacilluspolymyxa DSM365〇
[0057] 种子培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：蔗糖100g/L，酵母粉30g/L， (NH 4) 2S043g/L，MgSO4 · 7Η200· 3g/L，Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，pH 为 6.0。121°C 高压灭菌 20min。
[0058] 发酵培养基：蔗糖 80g/L，豆柏蛋白 42g/L，（NH4) 2S042g/L，MgSO4 · 7Η200· 4g/L， Na2HPO4 · 12H204g/L，KH2P049g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠 8g/L，pH 为 6· 0。121°C 高压灭菌 20min，冷却到常温后加入过滤除菌的0. 8g/L中性蛋白酶。此时培养基中总氮含量相当于 常规培养基中30g/L酵母粉的总氮含量。
[0059] 将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365接到种 子培养基中，37°C震荡培养20小时，得到种子液。
[0060] 上海保兴BI0TECH3升发酵罐中加入1. 5升发酵培养基，将种子液按体积分数10% 的接种量转接到发酵培养基中进行培养，发酵温度40°C，搅拌速度为500rpm。发酵10小时 后补加5%浓度的蔗糖，之后每隔8h补加5%浓度的蔗糖。通过5次补料，在发酵72h结束 时，（R，R) -2, 3- 丁二醇浓度为92. 5g/L，光学纯度为98. 3%。
[0061] 这一结果表明本发明具有重要的经济效益，多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365在以豆柏粉为唯一氮源发酵生产（R，R)-2,3-丁二醇中，显示出了非常好 的工业应用前景。应该理解的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变 换，例如，所述的菌株除了多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa DSM365之外，还可以 是多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa其它菌株，或者其它能够利用豆柏粉产生高纯 度（R，R)-2, 3- 丁二醇的微生物，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的 保护范围。
【主权项】
1. 一种利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)-2, 3-丁二醇的方法，其特征在于，包括如 下步骤： 将类芽孢杆菌（Paenibacillussp.)接种到以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养 基中进行发酵培养，发酵培养温度为37-40°C，发酵时间26小时，所得发酵液中即含有 (R，R)-2, 3- 丁二醇；所述豆柏粉在所述发酵培养基中的终浓度为10-80g/L;所述类芽孢杆 菌（Paenibacillussp.)为多粘类芽抱杆菌（Paenibacilluspolymyxa)。2. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R) _2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基包括豆柏粉及其水解液。3. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)_2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基还含有中性蛋白酶。4. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)_2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基还含有乙酸钠。5. 根据权利要求1所述的利用豆柏粉同步酶解发酵制备（R，R)_2, 3-丁二醇的方法，其 特征在于：所述以豆柏粉作为有机氮源的发酵培养基还含有Tween-80。
【专利摘要】一种利用豆粕粉同步酶解发酵制备(R,R)-2,3-丁二醇的方法，包括如下步骤：将类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）接种到以豆粕粉作为有机氮源的发酵培养基中进行发酵培养，所得发酵液中即含有(R,R)-2,3-丁二醇；所述豆粕粉在所述发酵培养基中的终浓度为10-80g/L；所述类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。在分批补料发酵中，发酵液中(R,R)-2,3-丁二醇的浓度达到92.5g/L，光学纯度达到98%。采用本发明能够减少了酵母粉用量，且酶解与发酵同步进行，简化了操作步骤，降低了高纯度(R,R)-2,3-丁二醇生产成本。
【IPC分类】C12P7/18, C12R1/01
【公开号】CN104894170
【申请号】CN201410080322
【发明人】谢能中, 黄日波, 郭铃, 李检秀, 李亿, 黄艳燕
【申请人】广西科学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
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