微生物转化生产白藜芦醇的方法和布鲁塞尔德克酵母菌突变株的制作方法
微生物转化生产白藜芦醇的方法和布鲁塞尔德克酵母菌突变株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产白藜芦醇（resveratrol)的方法，特别是涉及一种以微生物 转化生产白藜芦醇的方法。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇（resveratrol)为一种植物多酚，主要为植物受到环境逆境时如：外 力伤害、UV过度照射、昆虫及微生物入侵感染时所生成的抵御机制，为一种植物抗菌 素(phytoalexins)(Anastasiadi et al. , 2012 ；Burns et al. , 2002 ；Fremont, 2000 ； Potrebko and Resurreccion, 2009)。白黎芦醇化学名称为三羟基二苯乙稀 (3,5,4'-trihydrozystibene)(Abbott et al·)，最早于 1940 年，学者高网（Takaoka)由 白藜芦（white hellebore ;Veratrum grandiflorum 0· Loes)的根部分离出鉴定，随后于 1963年由中国传统中药材-虎杖（Polygonum cuspidatum)的根莖部中也被分离出有白藜 芦醇成分。白藜芦醇除了于上述植物中被发现，其也存在一些特定的植物中，如葡萄、蓝莓 等某些莓果类，或是花生及石槽等（Burns et al·，2002 ;Counet et al·，2006;Jerkovic et al·，2010 ;Manach et al·，2004 ;Tome-Carneiro et al·，2012 ;Wang, 2012)，然而这 些的植物所含的白藜芦醇含量差异很大，同时，在某些植物中白藜芦醇会以糖苷（piceid; polydatin)的形式存在于体内。
[0003] 目前已知白藜芦醇，具有抗老化、降低糖尿病、肝病、心脏病、癌症及其他代谢症候 群相关疾病的罹患机率，然而因其于植物中含量稀少且萃取不易，使其售价及应用上均受 限制。
[0004] 白藜芦醇化合物有两种异构物分别为顺式（Cis)与反式（trans)结构，反式结 构才有生理活性，反式结构经UV照射后会变为顺式结构而失去生理活性（Potrebko and Resurreccion, 2009)，于植物中白藜芦醇会与糖结合形成较稳定的糖苷形式，糖苷形式有 接单糖于不同位置（Counet et al.，2006 ;Jerkovic et al.，2010 ;Sun et al.，2010 ;Wang et al.，2007;Zhang et al.，2007)的形式，也有同时接两个单糖的形式，但在虎杖中主要 以单糖接于3'-位置上的羟基形式居多数（Sun et al.，2010;Wang et al.,2007;吴佳 颖，2007)，这些不同的接糖形式主要为稳定白藜芦醇于生物体内，于适当时机时生物体可 直接转化生成白藜芦醇应用。
[0005] 目前生产白藜芦醇的方法，有植物萃取法、化学合成法、植物转化法以及微生物基 因工程等，然而植物中白藜芦醇主要经由酪胺酸与苯丙氨酸途径合成，其中主要关键步骤 为合成二苯乙烯合成酶（stilbene synthase) (Donnez et al·，2009)，目前文献所列以微 生物基因工程生产白藜芦醇的方式，可分为酵母菌与细菌两部分（Donnez et al.，2009)。
[0006] 文献研究指出：目前萃取虎杖中白藜芦醇方法主要有五种，分别以碱萃取法 (Alkaline extraction)、溶剂萃取法（Solvent extraction)、超音波辅助法（Ultrasonic extraction)、索式回流萃取（Soxhlet extraction)以及CO2超临界流萃取法（SFE-C02) (Benova et al.，2010 ;Cho et al.，2006 ;Du et al.，2007 ;Lei et al.，2007 ;吴佳 颖，2007)。所有的萃取方法均有其优缺点，然而就单纯以萃取效果而言，超音波辅助法萃取 效果最佳（Lei et al.，2007)。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种以微生物转化生产白藜芦醇（resveratrol)的方法，包括：(a)提 供一德克酵母属（Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质，其中该基质包括白藜芦醇前驱 物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质；(b)将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基 质加入至一培养基中以形成一混合物；以及（c)对该混合物进行发酵，以使于该混合物中 存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。
[0008] 本发明也提供一种新颖的布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)突变株， 其是于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编 号为BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌，并且是于2013年7月11日保藏于德国微生物 菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)， 保藏编号为DSM 27483的布鲁塞尔德克酵母菌。
【附图说明】
[0009] 图IA是显示初步选择的各菌株使用虎杖为基质的转化生成白藜芦醇的实验结 果。
[0010] 图IB是显示初步选择的各菌株使用石榴皮为基质的转化生成白藜芦醇的实验结 果。
[0011] 图2是显示不同的布鲁塞尔德克酵母菌使用虎杖为基质的转化生成白藜芦醇的 实验结果。
[0012] 图3是显示所挑选的12株突变株于不同培养时间点产生的β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase)量。
[0013] 图4Α是显示利用5公升发酵槽并以虎杖为植物基质且以水、醋酸缓冲溶液或福格 尔最小盐类培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)来培养编号72号的突变株进行 白藜芦醇转化生成的结果。
[0014] 图4B是显示利用20公升发酵槽并以虎杖为植物基质且以醋酸缓冲溶液来培养编 号72号的突变株进行白藜芦醇转化生成的结果。
【具体实施方式】
[0015] 在本发明一实施方式中，本发明提供一种以上微生物转化生产白藜芦醇 (resveratrol)的方法。本发明的以微生物转化生产白藜芦醇方法可包括下述步骤，但不限 于此。
[0016] 首先，提供一德克酵母属（Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质。上述基质可 包括，但不限于，白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质。
[0017] 上述德克酵母属的酵母菌或其突变株可包括一布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)或其突变株，但不限于此。上述布鲁塞尔德克酵母菌或其突变株的例子，可 包括，布鲁塞尔德克酵母菌BCRC 21440或其突变株等，但不限于此。又，布鲁塞尔德克酵母 菌BCRC 21440的突变株的例子则可包括，但不限于，于2013年1月9日保藏于台湾食品工 业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌 (此菌也于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏编号为 DSM27483)等。
[0018] 在一实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中所使用的德克酵 母属的酵母菌或其突变株可为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC 21440。在另一实施例中，于本发 明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中所使用的德克酵母属的酵母菌或其突变株可为， 于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为 BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌（此菌也于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种 保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏 编号为 DSM 27483)。
[0019] 于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，上述白藜芦醇前驱物可包括白 藜芦醇糖苷等，但不限于此，而白藜芦醇糖苷的例子可包括，但不限于虎杖糖苷等。又，于 本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，上述含有白藜芦醇前驱物的该植物基质的 例子可包括，但不限于，虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、蓝莓、桑葚、蔓越莓 或、波萝蜜等。在一实施例中，上述含有白藜芦醇前驱物的植物基质可为虎杖，而含于虎杖 的白藜芦醇糖苷为虎杖糖 苷。
[0020] 在一特定实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，所述基质 为含有白藜芦醇前驱物的植物基质。又，于此实施例中含有白藜芦醇前驱物的植物基质的 例子可为虎杖。
[0021] 接着，在提供一德克酵母属的酵母菌或其突变株与一基质之后，将上述德克酵母 属的酵母菌或其突变株与上述基质加入至一培养基中以形成一混合物。
[0022] 上述德克酵母属的酵母菌或其突变株的添加量为培养基体积的1-65%。在一实 施例中，上述德克酵母属的酵母菌或其突变株的添加量为培养基体积的1-40%。又，上述 基质的添加量为培养基体积的1-65%。在一实施例中，上述基质的添加量为培养基体积的 1-40%。
[0023] 又，适用于本发明的培养基的例子，可包括，水、醋酸缓冲溶液与福格尔最小盐类 培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)等，但不限于此。
[0024] 然后，将上述德克酵母属的酵母菌或其突变株与上述基质加入至一培养基中以形 成一混合物之后，对混合物进行发酵，以使于混合物中存在的白藜芦醇前驱物被上述德克 酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。
[0025] 上述发酵所进行的时间可为约12-72小时。在一实施例中，上述发酵所进行的时 间可为约18-48小时。又，上述发酵可于约20-35°C的温度进行。在一实施例中，上述发酵 可于约23_30°C的温度进行。
[0026] 另外，上述发酵可于一摇瓶或发酵槽中进行。
[0027] 在一实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，发酵于一发酵 槽中进行，且该德克酵母属的酵母菌的添加量为培养基体积的1-65%，而该基质的添加量 为培养基体积的1-65%。又于此实施例中，上述发酵所进行的时间可为约18-48小时，而上 述发酵可于约23-30°C的温度进行。又，于此实施例中，基质为含有白藜芦醇前驱物的该植 物基质，而植物基质可为虎杖或石榴皮等。
[0028] 再者，在另一实施例中，本发明以微生物转化生产白藜芦醇的方法，于上述对混合 物进行发酵，以使于混合物中存在的白藜芦醇前驱物被上述德克酵母属的酵母菌或其突变 株生物转化而产生白藜芦醇的步骤之后，还可更包括一从该混合物中萃取白藜芦醇的步 骤。
[0029] 而上述从该混合物中萃取白藜芦醇的步骤，可包括下列步骤，但不限于此。
[0030] 先将酒精加入于上述发酵后混合物中并进行超音波震荡以形成一萃取液。上述酒 精可包括1-80%的酒精，在一实施例中，上述酒精为80%酒精。另外，所使用的酒精与上述 混合物的体积比为1:5-1:20。在一实施例中，所使用酒精与上述混合物的体积比为1:10。
[0031] 接着，在形成上述萃取液之后将上述萃取液进行干燥，然后再加入水及乙醚以形 成一水层与一乙醚层。所使用的水与上述经干燥的萃取液的重量比为1:5-1:20。在一实施 例中，所使用的水与上述经干燥的萃取液的重量比为1:10。又，所使用的乙醚与上述经干燥 的萃取液的重量比为1:5-1:20。在一实施例中，所使用的乙醚与上述经干燥的萃取液的重 量比为1:10。
[0032] 然后，收集上述乙醚层并将上述乙醚层干燥以获得白藜芦醇产物。
[0033] 另外，在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种新颖的布鲁塞尔德克酵母 菌突变株，其于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究 中心，保藏编号为BCRC920084的布鲁塞尔德克酵母菌（此菌也于2013年7月11日保 藏于德国微生物菌种保藏中心 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏编号为 DSM27483)。
[0034] 实施例
[0035] A.材料与方法
[0036] ⑷材料
[0037] L标准品：
[0038] 白藜芦醇及糖苷为购自Aldrich公司。
[0039] 2.试剂及培养基：
[0040] 酵母提取物蛋白腺葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium, YPD)、乙酸（acetic acid)、醋酸钠 （sodium acetate)、乙醇（ethanol)、氯仿 (chloroform)、乙酸乙酯（ethyl acetate)、苯（benzene)、乙醚（ethyl ether)、甲苯 (toluene、正己烧（hexane)、乙臆（acetonitrile)、pNP、pNPG、NaCl、NH 4C1、Na2C03、葡萄糖 (glucose)、麦芽糖（maltose)、乳糖（lactose)、KN0 3、NH4N03、（NH4) 2S04、酵母提取物（yeast extract)、蛋白胨（peptone)、MgS0 4、KCl、吐温（Tween) 80 等为购自 Merck 公司。
[0041] 3.仪器
[0042] 各种温度的培养箱、电磁加热搅拌器、高效液相层析（high-performance liquid chromatography, HPLC)、分光亮度计、5公升发酵槽、20公升发酵槽、冷冻干燥机、回旋浓缩 机、大型蒸汽式浓缩机、版框压滤机、直立式压滤机等。
[0043] ⑶方法
[0044] 1.摇瓶培养：
[0045] 将菌接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基，并以150rpm，25°C进行培养形成菌 液。当菌液的00_值达到10，于一培养基（例如，醋酸缓冲液（说~5禮，？!14.5~6.5)) 中，加入上述菌液（添加量为培养基体积的5%)与白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物 的一植物基质（添加量为培养基体积的5% )，并于150rpm，25°C进行发酵24小时。之后将 培养液进行冻干、80 %酒精萃取后，以高效液相层析来分析糖苷及白藜芦醇含量。
[0046] 2.菌株的β-葡萄糖苷酶的活性测定
[0047] (1)将ρΝΡ以IM Na2CO3配成不同浓度，并以分光亮度计测各浓度的ρΝΡ于0D405nm 的吸光值以作为检量线。
[0048] (2)将待测菌株进行培养，并于不同时间取样分析。
[0049] (3)将菌液分成两部分。一部分以KKTC加热5分钟使于其中的酶失去活性后，将 其冷却离心并取上清液ImL至透明玻璃管中作为空白对照组；而另一部分则为将其离心并 取上清液ImL至透明玻璃管作为实验组。
[0050] (4)将对照组及实验组分别加入IOmM的pNPG (溶于20mM醋酸缓冲液，pH5) lmL，接 着于50°C加热并搅拌30分钟以进行反应以形成一反应溶液。之后于反应溶液中加入2mL 冰IM Na2CO3以终止反应。然后，将反应溶液混合均匀后，取一部分测定其0D405nm的吸光 值。若所测得吸光值超过检量线的范围，则以对照组作稀释后测，并依检量线推其酶活性。
[0051] 3.甲基硝基亚硝基狐（N-methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)突变
[0052] 根据先前试验得知，以IOOppm的甲基硝基亚硝基胍处理菌株5分钟来产生突变具 有较佳结果，于是将布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)BCRC21440先以不同浓 度的甲基硝基亚硝基胍处理5分钟以产生突变。结果显示，经IOOppm的甲基硝基亚硝基胍 处理5分钟的布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440其致死率为约58%。于是重新将布鲁塞尔 德克酵母菌BCRC21440以IOOppm的甲基硝基亚硝基胍进行不同时间长度的处理。结果显 示，随甲基硝基亚硝基胍处理时间增加，菌株致死率增加。于处理20分钟后，菌株的致死率 达70%，但之后随着处理时间的延长，致死率则呈趋缓。另外，重新配置不同浓度的甲基硝 基亚硝基胍，并布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440分别以不同浓度的甲基硝基亚硝基胍处理 5分钟以进行突变。结果显示，随甲基硝基亚硝基胍浓度增加，菌株的致死率提升。当甲基 硝基亚硝基胍浓度为300ppm时，菌株的致死率达70%，但之后随着处理浓度的增加，致死 率则呈趋缓。
[0053] 甲基硝基亚硝基胍突变的实验方法如下所述：
[0054] ( i )将菌株活化；
[0055] ( ii )将经活化的菌株转移至培养液；
[0056] ( iii )培养16-24小时之后，以8000rpm将培养液离心5分钟以收菌；
[0057] ( iv )去除上清液，将沉淀物以等量PBS缓冲溶液回溶清洗3次；
[005 8] ( V )将菌液浓度调整为106CFU/mL左右；
[0059] ( Vi )将菌液与甲基硝基亚硝基胍混合（不同浓度的甲基硝基亚硝基胍或不同的 处理时间）；
[0060] ( Vii)将菌液离心以去除上清液，之后将沉淀物以等量PBS缓冲溶液清洗3次；
[0061] ( € )将菌液进行适量的稀释，并涂布于平板培养基上以进行培养；
[0062] (ix )挑选菌株以进行其β -葡萄糖苷酶的活性测定；
[0063] ( x )将β -葡萄糖苷酶的活性较佳的菌株再进行突变或进行稳定性分析。
[0064] 将经挑选的甲基硝基亚硝基胍处理突变株调整菌体浓度后，接种至96孔ELISA盘 中，培养24小时。之后取出上清液加入pNPG及Na 2CO3呈色，以ELISA读取仪判读其0D405nm 的值，并将此值与原始菌株相较，以选择β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase)产量较好的菌 株。将所选择的β-葡萄糖苷酶产量较好的菌株以ELISA读取仪进行β-葡萄糖苷酶的稳 定性分析，若同个样本经多次测量，ELISA的读值稳定，显示菌株突变后分泌β-葡萄糖苷 酶性状稳定。
[0065] 4.植物基质的制备、白藜芦醇的微生物转化生产及转化率的计算
[0066] (1)将虎杖、石榴皮等植物基质以果汁机搅碎备用。
[0067] (2)将菌株以酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基进行培养基活化。之后将菌株加入 含植物基质培养基中以使基质进行转化，并不同时间点进行收集样品。
[0068] (3)样品进行冻干，之后加入50%乙醇并于70°C以超音波辅助萃取30分钟。将所 萃取的萃取液冷却后以〇. 22um滤膜过滤。
[0069] (4)然后以高效液相层析来分析滤液的虎杖糖苷（piceid)与白藜芦醇 (resverotrol)含量，并计算虎杖糖苷转化为白藜芦醇的转化率。
[0070] 转化率为：基质转化率（％)=
[0072] M:摩尔数
[0073] 5.白藜芦醇的萃取：
[0074] (1)将经冻干的含转化后植物基质的培养基加入1:10的80%酒精（w/w)并进行 30分钟超音波（40kHz)震荡。以此步骤进行两次萃取；
[0075] (2)合并萃取液并进行干燥。以1 :10进行覆水（w/w)形成溶液，再以1 :1的比例 将乙醚加入此溶液中，之后收集乙醚层，以此步骤进行两次萃取；
[0076] (3)将乙醚层进行干燥得白藜芦醇产物。
[0077] 6.糖苷与白藜芦醇的分析：
[0078] (1)分别取糖苷与白藜芦醇标准品，以50%酒精将其分别配制成0· 5、5、25、75、 100、150与175mg/L浓度并以HPLC分析，以获得其分别的检量线；
[0079] (2)将萃取后样品稀释至检量线浓度内，以0. 22μπι滤膜过滤后，以HPLC分析白藜 芦醇及糖苷含量；
[0080] (3)HPLC分析以C18管柱4. 6x250nm，5 μ m(Waters ODS II)作为分离管柱进行分 析；
[0081] (4)移动相为A :0.1 %乙酸；B :乙腈。初始以95% A与5% B，25. 3分钟后转为 55 %的A与45 %的B，31分钟转为100 %的B，33分钟后调回初始值95 %的A与5 %的B，维 持至45分钟；
[0082] (5)移动相流速为I. 5mL/分钟，样品注射量为20 μ L。
[0083] Β·实验与结果
[0084] 1.菌株的转化基质生成白藜芦醇的能力的分析
[0085] (1)菌株的初步筛选
[0086] 首先由生资中心微生物资源库进行初步筛选，初步筛选出如表1所示的细菌、酵 母菌及丝状真菌，并将其分别进行培养与β -葡萄糖苷酶的活性测试。表1由生资中心微 生物资源库进行初步筛选出的菌株
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 于测定各菌株的β_葡萄糖苷酶表现后，筛选出表现β_葡萄糖苷酶较高的 微生物菌株，其分别为2株酵母菌，为布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis) BCRC21440 与啤酒酿母菌（Saccharomyces cerevisiae)BCRC20855，以及 9 株真菌，为黑 霉菌（Aspergillus niger)BCRC32734 与 BCRC30883、百脉根轮纹菌（Stemphylium loti) BCRC31890、抚抱漆斑霉（Myrothecium verrucaria)BCRC31545、米曲菌（Aspergillus oryzae)BCRC30230 与 BCRC32271 以及嗜热侧抱霉菌（Sporotrichum thermophile) BCRC31852
[0093] 2.菌株的转化基质生成白藜芦醇的能力的分析
[0094] 对于所筛选出的各菌株进行下述的实验。将作为植物基质的虎杖或石榴皮的粉末 以及一菌株加入水中，并进行发酵。于发酵之后将培养液加入80%乙醇以进行萃取。将所 获得的萃取液以HPLC分析白藜芦醇及糖苷的含量。使用虎杖为基质的各菌株的实验结果 如图IA所示，而使用石榴皮为基质的各菌株的实验结果如图IB所示。
[0095] 根据图IA与IB的结果，可以清楚得知，相同的菌株对于不同的植物基质的白藜芦 醇及糖苷含量的增加或减少能力不同，且不同的菌株对于相同的植物基质的白藜芦醇及糖 苷含量的增减情况也不相同。而根据整个实验结果初步看来，以酵母菌的布鲁塞尔德克酵 母菌（Dekkera bruxellensis) BCRC21440对于白藜芦醇的生成具有较佳转化基质生成白 藜芦醇的效果。
[0096] 3.不同的布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)菌株的转化基质生成白 藜芦醇的能力的分析
[0097] 由上述菌株转化测试结果显示，酵母菌的布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440对于白 藜芦醇的生成具有较佳转化基质生成白藜芦醇的效果，因此尝试搜集不同布鲁塞尔德克酵 母菌的菌株，其分别为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440、布鲁塞尔德克酵母菌BCRC20932、 布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21518、布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21519与布鲁塞尔德克酵母菌 BCRC21517,并将所搜集到的菌株以虎杖作为植物基质进行转化生成白藜芦醇的试验。转化 结果如图2所示。
[0098] 根据图2可知，所搜集的布鲁塞尔德克酵母菌对于虎杖基质皆具有良好转化基质 生成白藜芦醇的能力，而后续以布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440菌株进行进一步突变以提 升其转化基质生成白藜芦醇的能力。
[0099] 虎杖中糖苷含量约为白藜芦醇2-4倍，较其他植物基质高很多，故利用虎杖作为 菌株转化的植物基质，可得到较佳的白藜芦醇产量，且有助于后续纯化回收白藜芦醇。
[0100] 4.布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440的甲基硝基亚硝基胍（N-methylW -nitro-N -nitrosoguanidine, NTG)突变
[0101] 将布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440经由一连串系列NTG突变后，共挑选226株 突变株进行分析，结果以其中12株结果较佳，其分别为编号11、16、34、39、41、53、58、61、 63、67、70与72的突变株，于是进一步分别分析此12株突变株于不同培养时间点所产生的 β_葡萄糖苷酶（β-glucosidase)的量。结果如图3所示。
[0102] 根据图3所示可知，上述的12株突变株的β -葡萄糖苷酶产量均较原始菌株佳， 其中又以编号11、53、61及72的突变株较佳。
[0103] 之后，将上述编号11、53、61及72的突变株所产生的β-葡萄糖苷酶进行稳定性 分析。将每株挑选23个菌落并调整至相同OD值后，培养48小时。之后测定所培养的菌 的OD 4tl5吸光值，分析其稳定性。结果显示4株菌产β-葡萄糖苷酶能力差异不大，而编号 11的突变株产β-葡萄糖苷酶能力的变异性较大（>10% )，其他3株都在10%以下，此外， 由于编号72号的突变株的β -葡萄糖苷酶产量略高，因此将其作为后续培养基探讨的菌 株，并将其命名为布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)NTG-72,且于2013年1月 9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC 920084， 并于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sa mmlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，保藏编号为 DSM 27483。
[0104] 连续培养的菌株的转化基质生成白藜芦醇的能力的分析
[0105] 经由一连串筛选与突变筛选，以上述编号72号的突变株进行后续实验。以YH)培 养基进行种菌活化，之后将经活化种菌接种并培养，当其以OD 6tltl测定值达到10,再进行后 续转化试验。
[0106] (1)5公升的发酵槽连续培养
[0107] 利用5公升发酵槽并以虎杖为植物基质来培养编号72号的突变株进行生产白藜 芦醇，而培养条件为：25°C、100~200rpm、通气量为lvvm、5%接菌量（相对于培养基的体 基）。分别以福格尔最小盐类培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)、20mM醋酸缓冲 液pH5. 0与水作为生产的培养基，添加2%虎杖（相对于培养基的体基）作为转化白藜芦醇 的植物基质来培养编号72号的突变株，结果如图4A所示。
[0108] 图4A中显示以醋酸缓冲液作为培养基具有最高的白藜芦醇产量。最高的白藜芦 醇的含量为7455. 6 μ g/g，之后随时间的增加而缓慢降低，而此时的虎杖糖苷含量只剩下 198. 6 μ g/g，而其次为水作为培养基，最差的为福格尔最小盐类培养基。
[0109] (2)20公升的发酵槽连续培养
[0110] 利用20公升发酵槽与并以虎杖为植物基质来培养编号72号的突变株进行生产白 藜芦醇，以100-200rpm、0. 2vvm的条件进行培养。以20mM醋酸缓冲液pH5. 0作为培养基， 并添加2%虎杖（相对于培养基的体基）作为基质，结果如图4B所示。
[0111] 图4B中显示，白藜芦醇含量随时间而增加，直到40小时趋于平缓，从2177. 6ug/g 增加到最高值为7266. 4ug/g，而虎杖糖苷的趋势则相反。另外，计算虎杖糖苷转化成白藜芦 醇的转化率，结果转化率可以达到95%以上。
[0112] 综合前述结果可知，将β_葡萄糖苷酶高产量的酵母菌（编号72号的突变株） 以虎杖为植物基质进行发酵，以转化虎杖糖苷生成白藜芦醇。从摇瓶初步测试转化率、5公 升发酵槽测试转速及通气量参数、20公升发酵槽测试放大制程的转化率均可行后，共进行 多次发酵（包括5公升、20公升、250公升和2000公升，均进行三次以上）。结果显示，在所 有发酵体积的实验中，在培养第30-72小时期间，糖苷含量降至0. 5mg/g或以下，而白藜芦 醇从30小时后则渐趋于稳定，大约含量为8-12mg/g，其转化率更可达95%以上。
[0113] 关于生物材料的保藏
[0114] 2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏 编号为 BCRC 920084。
[0115] 2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，保藏编号为 DSM27483。保藏中心地址为：英 豪丰大街7B，D-38124布伦瑞克。
【主权项】
1. 一种通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其特征在于，其包括： 提供一德克酵母属的酵母菌或其突变株与一基质，该基质包括白藜芦醇前驱物或含有 白藜芦醇前驱物的一植物基质； 将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基质加入至一培养基中以形成一混合物；以 及 对该混合物进行发酵，以使于该混合物中存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的 酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。2. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株包括一布鲁塞尔德克酵母菌或其突变株。3. 如权利要求2所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述布鲁塞尔德 克酵母菌或其突变株包括布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440或其突变株。4. 如权利要求3所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述布鲁塞尔德 克酵母菌的突变株包括于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ的保藏 编号为DSM27483的布鲁塞尔德克酵母菌。5. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440。6. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株为于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ的保藏 编号为DSM27483的布鲁塞尔德克酵母菌。7. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述白藜芦醇前 驱物包括白藜芦醇糖苷。8. 如权利要求7所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述白藜芦醇糖 苷包括虎杖糖苷。9. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，含有白藜芦醇前 驱物的该植物基质包括虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、蓝莓、桑葚、蔓越莓 或波萝蜜。10. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述含有白藜芦 醇前驱物的该植物基质为虎杖。11. 如权利要求10所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，含于所述虎杖 的该白藜芦醇前驱物为虎杖糖苷。12. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述基质为含有 白藜芦醇前驱物的该植物基质。13. 如权利要求12所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述植物基质 为虎杖。14. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株的添加量为培养基体积的1-65%。15. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述基质的添加 量为培养基体积的1-65%。16. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述培养基包括 水、醋酸缓冲溶液或福格尔最小盐类培养基。17. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵时间为 约12-72小时。18. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵温度为 约 20-35 °C。19. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵于一摇 瓶或发酵槽中进行。20. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵于一发 酵槽中进行，且该德克酵母属的酵母菌添加量为培养基体积的1-65%，而该基质的添加量 为培养基体积的1-65%。21. 如权利要求20所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵时间 为约18-48小时。22. 如权利要求20所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵温度 为约 23-30 °C。23. 如权利要求20所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述基质为含 有白藜芦醇前驱物的该植物基质。24. 如权利要求23所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述植物基质 为虎杖或石榴皮。25. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，在该步骤（c)之 后，还包括（d)从该混合物中萃取该白藜芦醇。26. 如权利要求25所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，在该步骤（d)中 包括： 于经发酵的该混合物中加入酒精并进行超音波震荡以形成一萃取液； 将该萃取液进行干燥后再加入水及乙醚以形成一水层与一乙醚层；以及 收集该乙醚层并将该乙醚层干燥以获得白藜芦醇产物。27. -种新布鲁塞尔德克酵母菌突变株，其是于2013年7月11日保藏于德国微生物菌 种保藏中心DSMZ的保藏编号为DSM27483的布鲁塞尔德克酵母菌。
【专利摘要】本发明提供一种以微生物转化生产白藜芦醇(resveratrol)的方法，其包括：(a)提供一德克酵母属(Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质，其中该基质包括白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质；(b)将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基质加入至一培养基中以形成一混合物；以及(c)对该混合物进行发酵，以使于该混合物中存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。DSM 2748320130711
【IPC分类】C12N1/16, C12R1/645, C12P7/22
【公开号】CN104894172
【申请号】CN201410185938
【发明人】黄学聪, 郭晓萍, 赖进此
【申请人】财团法人食品工业发展研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年5月5日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产白藜芦醇（resveratrol)的方法，特别是涉及一种以微生物 转化生产白藜芦醇的方法。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇（resveratrol)为一种植物多酚，主要为植物受到环境逆境时如：外 力伤害、UV过度照射、昆虫及微生物入侵感染时所生成的抵御机制，为一种植物抗菌 素(phytoalexins)(Anastasiadi et al. , 2012 ；Burns et al. , 2002 ；Fremont, 2000 ； Potrebko and Resurreccion, 2009)。白黎芦醇化学名称为三羟基二苯乙稀 (3,5,4'-trihydrozystibene)(Abbott et al·)，最早于 1940 年，学者高网（Takaoka)由 白藜芦（white hellebore ;Veratrum grandiflorum 0· Loes)的根部分离出鉴定，随后于 1963年由中国传统中药材-虎杖（Polygonum cuspidatum)的根莖部中也被分离出有白藜 芦醇成分。白藜芦醇除了于上述植物中被发现，其也存在一些特定的植物中，如葡萄、蓝莓 等某些莓果类，或是花生及石槽等（Burns et al·，2002 ;Counet et al·，2006;Jerkovic et al·，2010 ;Manach et al·，2004 ;Tome-Carneiro et al·，2012 ;Wang, 2012)，然而这 些的植物所含的白藜芦醇含量差异很大，同时，在某些植物中白藜芦醇会以糖苷（piceid; polydatin)的形式存在于体内。
[0003] 目前已知白藜芦醇，具有抗老化、降低糖尿病、肝病、心脏病、癌症及其他代谢症候 群相关疾病的罹患机率，然而因其于植物中含量稀少且萃取不易，使其售价及应用上均受 限制。
[0004] 白藜芦醇化合物有两种异构物分别为顺式（Cis)与反式（trans)结构，反式结 构才有生理活性，反式结构经UV照射后会变为顺式结构而失去生理活性（Potrebko and Resurreccion, 2009)，于植物中白藜芦醇会与糖结合形成较稳定的糖苷形式，糖苷形式有 接单糖于不同位置（Counet et al.，2006 ;Jerkovic et al.，2010 ;Sun et al.，2010 ;Wang et al.，2007;Zhang et al.，2007)的形式，也有同时接两个单糖的形式，但在虎杖中主要 以单糖接于3'-位置上的羟基形式居多数（Sun et al.，2010;Wang et al.,2007;吴佳 颖，2007)，这些不同的接糖形式主要为稳定白藜芦醇于生物体内，于适当时机时生物体可 直接转化生成白藜芦醇应用。
[0005] 目前生产白藜芦醇的方法，有植物萃取法、化学合成法、植物转化法以及微生物基 因工程等，然而植物中白藜芦醇主要经由酪胺酸与苯丙氨酸途径合成，其中主要关键步骤 为合成二苯乙烯合成酶（stilbene synthase) (Donnez et al·，2009)，目前文献所列以微 生物基因工程生产白藜芦醇的方式，可分为酵母菌与细菌两部分（Donnez et al.，2009)。
[0006] 文献研究指出：目前萃取虎杖中白藜芦醇方法主要有五种，分别以碱萃取法 (Alkaline extraction)、溶剂萃取法（Solvent extraction)、超音波辅助法（Ultrasonic extraction)、索式回流萃取（Soxhlet extraction)以及CO2超临界流萃取法（SFE-C02) (Benova et al.，2010 ;Cho et al.，2006 ;Du et al.，2007 ;Lei et al.，2007 ;吴佳 颖，2007)。所有的萃取方法均有其优缺点，然而就单纯以萃取效果而言，超音波辅助法萃取 效果最佳（Lei et al.，2007)。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种以微生物转化生产白藜芦醇（resveratrol)的方法，包括：(a)提 供一德克酵母属（Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质，其中该基质包括白藜芦醇前驱 物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质；(b)将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基 质加入至一培养基中以形成一混合物；以及（c)对该混合物进行发酵，以使于该混合物中 存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。
[0008] 本发明也提供一种新颖的布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)突变株， 其是于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编 号为BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌，并且是于2013年7月11日保藏于德国微生物 菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)， 保藏编号为DSM 27483的布鲁塞尔德克酵母菌。
【附图说明】
[0009] 图IA是显示初步选择的各菌株使用虎杖为基质的转化生成白藜芦醇的实验结 果。
[0010] 图IB是显示初步选择的各菌株使用石榴皮为基质的转化生成白藜芦醇的实验结 果。
[0011] 图2是显示不同的布鲁塞尔德克酵母菌使用虎杖为基质的转化生成白藜芦醇的 实验结果。
[0012] 图3是显示所挑选的12株突变株于不同培养时间点产生的β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase)量。
[0013] 图4Α是显示利用5公升发酵槽并以虎杖为植物基质且以水、醋酸缓冲溶液或福格 尔最小盐类培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)来培养编号72号的突变株进行 白藜芦醇转化生成的结果。
[0014] 图4B是显示利用20公升发酵槽并以虎杖为植物基质且以醋酸缓冲溶液来培养编 号72号的突变株进行白藜芦醇转化生成的结果。
【具体实施方式】
[0015] 在本发明一实施方式中，本发明提供一种以上微生物转化生产白藜芦醇 (resveratrol)的方法。本发明的以微生物转化生产白藜芦醇方法可包括下述步骤，但不限 于此。
[0016] 首先，提供一德克酵母属（Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质。上述基质可 包括，但不限于，白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质。
[0017] 上述德克酵母属的酵母菌或其突变株可包括一布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)或其突变株，但不限于此。上述布鲁塞尔德克酵母菌或其突变株的例子，可 包括，布鲁塞尔德克酵母菌BCRC 21440或其突变株等，但不限于此。又，布鲁塞尔德克酵母 菌BCRC 21440的突变株的例子则可包括，但不限于，于2013年1月9日保藏于台湾食品工 业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌 (此菌也于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏编号为 DSM27483)等。
[0018] 在一实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中所使用的德克酵 母属的酵母菌或其突变株可为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC 21440。在另一实施例中，于本发 明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中所使用的德克酵母属的酵母菌或其突变株可为， 于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为 BCRC 920084的布鲁塞尔德克酵母菌（此菌也于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种 保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏 编号为 DSM 27483)。
[0019] 于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，上述白藜芦醇前驱物可包括白 藜芦醇糖苷等，但不限于此，而白藜芦醇糖苷的例子可包括，但不限于虎杖糖苷等。又，于 本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，上述含有白藜芦醇前驱物的该植物基质的 例子可包括，但不限于，虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、蓝莓、桑葚、蔓越莓 或、波萝蜜等。在一实施例中，上述含有白藜芦醇前驱物的植物基质可为虎杖，而含于虎杖 的白藜芦醇糖苷为虎杖糖 苷。
[0020] 在一特定实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，所述基质 为含有白藜芦醇前驱物的植物基质。又，于此实施例中含有白藜芦醇前驱物的植物基质的 例子可为虎杖。
[0021] 接着，在提供一德克酵母属的酵母菌或其突变株与一基质之后，将上述德克酵母 属的酵母菌或其突变株与上述基质加入至一培养基中以形成一混合物。
[0022] 上述德克酵母属的酵母菌或其突变株的添加量为培养基体积的1-65%。在一实 施例中，上述德克酵母属的酵母菌或其突变株的添加量为培养基体积的1-40%。又，上述 基质的添加量为培养基体积的1-65%。在一实施例中，上述基质的添加量为培养基体积的 1-40%。
[0023] 又，适用于本发明的培养基的例子，可包括，水、醋酸缓冲溶液与福格尔最小盐类 培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)等，但不限于此。
[0024] 然后，将上述德克酵母属的酵母菌或其突变株与上述基质加入至一培养基中以形 成一混合物之后，对混合物进行发酵，以使于混合物中存在的白藜芦醇前驱物被上述德克 酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。
[0025] 上述发酵所进行的时间可为约12-72小时。在一实施例中，上述发酵所进行的时 间可为约18-48小时。又，上述发酵可于约20-35°C的温度进行。在一实施例中，上述发酵 可于约23_30°C的温度进行。
[0026] 另外，上述发酵可于一摇瓶或发酵槽中进行。
[0027] 在一实施例中，于本发明的以微生物转化生产白藜芦醇的方法中，发酵于一发酵 槽中进行，且该德克酵母属的酵母菌的添加量为培养基体积的1-65%，而该基质的添加量 为培养基体积的1-65%。又于此实施例中，上述发酵所进行的时间可为约18-48小时，而上 述发酵可于约23-30°C的温度进行。又，于此实施例中，基质为含有白藜芦醇前驱物的该植 物基质，而植物基质可为虎杖或石榴皮等。
[0028] 再者，在另一实施例中，本发明以微生物转化生产白藜芦醇的方法，于上述对混合 物进行发酵，以使于混合物中存在的白藜芦醇前驱物被上述德克酵母属的酵母菌或其突变 株生物转化而产生白藜芦醇的步骤之后，还可更包括一从该混合物中萃取白藜芦醇的步 骤。
[0029] 而上述从该混合物中萃取白藜芦醇的步骤，可包括下列步骤，但不限于此。
[0030] 先将酒精加入于上述发酵后混合物中并进行超音波震荡以形成一萃取液。上述酒 精可包括1-80%的酒精，在一实施例中，上述酒精为80%酒精。另外，所使用的酒精与上述 混合物的体积比为1:5-1:20。在一实施例中，所使用酒精与上述混合物的体积比为1:10。
[0031] 接着，在形成上述萃取液之后将上述萃取液进行干燥，然后再加入水及乙醚以形 成一水层与一乙醚层。所使用的水与上述经干燥的萃取液的重量比为1:5-1:20。在一实施 例中，所使用的水与上述经干燥的萃取液的重量比为1:10。又，所使用的乙醚与上述经干燥 的萃取液的重量比为1:5-1:20。在一实施例中，所使用的乙醚与上述经干燥的萃取液的重 量比为1:10。
[0032] 然后，收集上述乙醚层并将上述乙醚层干燥以获得白藜芦醇产物。
[0033] 另外，在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种新颖的布鲁塞尔德克酵母 菌突变株，其于2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究 中心，保藏编号为BCRC920084的布鲁塞尔德克酵母菌（此菌也于2013年7月11日保 藏于德国微生物菌种保藏中心 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏编号为 DSM27483)。
[0034] 实施例
[0035] A.材料与方法
[0036] ⑷材料
[0037] L标准品：
[0038] 白藜芦醇及糖苷为购自Aldrich公司。
[0039] 2.试剂及培养基：
[0040] 酵母提取物蛋白腺葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium, YPD)、乙酸（acetic acid)、醋酸钠 （sodium acetate)、乙醇（ethanol)、氯仿 (chloroform)、乙酸乙酯（ethyl acetate)、苯（benzene)、乙醚（ethyl ether)、甲苯 (toluene、正己烧（hexane)、乙臆（acetonitrile)、pNP、pNPG、NaCl、NH 4C1、Na2C03、葡萄糖 (glucose)、麦芽糖（maltose)、乳糖（lactose)、KN0 3、NH4N03、（NH4) 2S04、酵母提取物（yeast extract)、蛋白胨（peptone)、MgS0 4、KCl、吐温（Tween) 80 等为购自 Merck 公司。
[0041] 3.仪器
[0042] 各种温度的培养箱、电磁加热搅拌器、高效液相层析（high-performance liquid chromatography, HPLC)、分光亮度计、5公升发酵槽、20公升发酵槽、冷冻干燥机、回旋浓缩 机、大型蒸汽式浓缩机、版框压滤机、直立式压滤机等。
[0043] ⑶方法
[0044] 1.摇瓶培养：
[0045] 将菌接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基，并以150rpm，25°C进行培养形成菌 液。当菌液的00_值达到10，于一培养基（例如，醋酸缓冲液（说~5禮，？!14.5~6.5)) 中，加入上述菌液（添加量为培养基体积的5%)与白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物 的一植物基质（添加量为培养基体积的5% )，并于150rpm，25°C进行发酵24小时。之后将 培养液进行冻干、80 %酒精萃取后，以高效液相层析来分析糖苷及白藜芦醇含量。
[0046] 2.菌株的β-葡萄糖苷酶的活性测定
[0047] (1)将ρΝΡ以IM Na2CO3配成不同浓度，并以分光亮度计测各浓度的ρΝΡ于0D405nm 的吸光值以作为检量线。
[0048] (2)将待测菌株进行培养，并于不同时间取样分析。
[0049] (3)将菌液分成两部分。一部分以KKTC加热5分钟使于其中的酶失去活性后，将 其冷却离心并取上清液ImL至透明玻璃管中作为空白对照组；而另一部分则为将其离心并 取上清液ImL至透明玻璃管作为实验组。
[0050] (4)将对照组及实验组分别加入IOmM的pNPG (溶于20mM醋酸缓冲液，pH5) lmL，接 着于50°C加热并搅拌30分钟以进行反应以形成一反应溶液。之后于反应溶液中加入2mL 冰IM Na2CO3以终止反应。然后，将反应溶液混合均匀后，取一部分测定其0D405nm的吸光 值。若所测得吸光值超过检量线的范围，则以对照组作稀释后测，并依检量线推其酶活性。
[0051] 3.甲基硝基亚硝基狐（N-methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)突变
[0052] 根据先前试验得知，以IOOppm的甲基硝基亚硝基胍处理菌株5分钟来产生突变具 有较佳结果，于是将布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)BCRC21440先以不同浓 度的甲基硝基亚硝基胍处理5分钟以产生突变。结果显示，经IOOppm的甲基硝基亚硝基胍 处理5分钟的布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440其致死率为约58%。于是重新将布鲁塞尔 德克酵母菌BCRC21440以IOOppm的甲基硝基亚硝基胍进行不同时间长度的处理。结果显 示，随甲基硝基亚硝基胍处理时间增加，菌株致死率增加。于处理20分钟后，菌株的致死率 达70%，但之后随着处理时间的延长，致死率则呈趋缓。另外，重新配置不同浓度的甲基硝 基亚硝基胍，并布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440分别以不同浓度的甲基硝基亚硝基胍处理 5分钟以进行突变。结果显示，随甲基硝基亚硝基胍浓度增加，菌株的致死率提升。当甲基 硝基亚硝基胍浓度为300ppm时，菌株的致死率达70%，但之后随着处理浓度的增加，致死 率则呈趋缓。
[0053] 甲基硝基亚硝基胍突变的实验方法如下所述：
[0054] ( i )将菌株活化；
[0055] ( ii )将经活化的菌株转移至培养液；
[0056] ( iii )培养16-24小时之后，以8000rpm将培养液离心5分钟以收菌；
[0057] ( iv )去除上清液，将沉淀物以等量PBS缓冲溶液回溶清洗3次；
[005 8] ( V )将菌液浓度调整为106CFU/mL左右；
[0059] ( Vi )将菌液与甲基硝基亚硝基胍混合（不同浓度的甲基硝基亚硝基胍或不同的 处理时间）；
[0060] ( Vii)将菌液离心以去除上清液，之后将沉淀物以等量PBS缓冲溶液清洗3次；
[0061] ( € )将菌液进行适量的稀释，并涂布于平板培养基上以进行培养；
[0062] (ix )挑选菌株以进行其β -葡萄糖苷酶的活性测定；
[0063] ( x )将β -葡萄糖苷酶的活性较佳的菌株再进行突变或进行稳定性分析。
[0064] 将经挑选的甲基硝基亚硝基胍处理突变株调整菌体浓度后，接种至96孔ELISA盘 中，培养24小时。之后取出上清液加入pNPG及Na 2CO3呈色，以ELISA读取仪判读其0D405nm 的值，并将此值与原始菌株相较，以选择β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase)产量较好的菌 株。将所选择的β-葡萄糖苷酶产量较好的菌株以ELISA读取仪进行β-葡萄糖苷酶的稳 定性分析，若同个样本经多次测量，ELISA的读值稳定，显示菌株突变后分泌β-葡萄糖苷 酶性状稳定。
[0065] 4.植物基质的制备、白藜芦醇的微生物转化生产及转化率的计算
[0066] (1)将虎杖、石榴皮等植物基质以果汁机搅碎备用。
[0067] (2)将菌株以酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基进行培养基活化。之后将菌株加入 含植物基质培养基中以使基质进行转化，并不同时间点进行收集样品。
[0068] (3)样品进行冻干，之后加入50%乙醇并于70°C以超音波辅助萃取30分钟。将所 萃取的萃取液冷却后以〇. 22um滤膜过滤。
[0069] (4)然后以高效液相层析来分析滤液的虎杖糖苷（piceid)与白藜芦醇 (resverotrol)含量，并计算虎杖糖苷转化为白藜芦醇的转化率。
[0070] 转化率为：基质转化率（％)=
[0072] M:摩尔数
[0073] 5.白藜芦醇的萃取：
[0074] (1)将经冻干的含转化后植物基质的培养基加入1:10的80%酒精（w/w)并进行 30分钟超音波（40kHz)震荡。以此步骤进行两次萃取；
[0075] (2)合并萃取液并进行干燥。以1 :10进行覆水（w/w)形成溶液，再以1 :1的比例 将乙醚加入此溶液中，之后收集乙醚层，以此步骤进行两次萃取；
[0076] (3)将乙醚层进行干燥得白藜芦醇产物。
[0077] 6.糖苷与白藜芦醇的分析：
[0078] (1)分别取糖苷与白藜芦醇标准品，以50%酒精将其分别配制成0· 5、5、25、75、 100、150与175mg/L浓度并以HPLC分析，以获得其分别的检量线；
[0079] (2)将萃取后样品稀释至检量线浓度内，以0. 22μπι滤膜过滤后，以HPLC分析白藜 芦醇及糖苷含量；
[0080] (3)HPLC分析以C18管柱4. 6x250nm，5 μ m(Waters ODS II)作为分离管柱进行分 析；
[0081] (4)移动相为A :0.1 %乙酸；B :乙腈。初始以95% A与5% B，25. 3分钟后转为 55 %的A与45 %的B，31分钟转为100 %的B，33分钟后调回初始值95 %的A与5 %的B，维 持至45分钟；
[0082] (5)移动相流速为I. 5mL/分钟，样品注射量为20 μ L。
[0083] Β·实验与结果
[0084] 1.菌株的转化基质生成白藜芦醇的能力的分析
[0085] (1)菌株的初步筛选
[0086] 首先由生资中心微生物资源库进行初步筛选，初步筛选出如表1所示的细菌、酵 母菌及丝状真菌，并将其分别进行培养与β -葡萄糖苷酶的活性测试。表1由生资中心微 生物资源库进行初步筛选出的菌株
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 于测定各菌株的β_葡萄糖苷酶表现后，筛选出表现β_葡萄糖苷酶较高的 微生物菌株，其分别为2株酵母菌，为布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis) BCRC21440 与啤酒酿母菌（Saccharomyces cerevisiae)BCRC20855，以及 9 株真菌，为黑 霉菌（Aspergillus niger)BCRC32734 与 BCRC30883、百脉根轮纹菌（Stemphylium loti) BCRC31890、抚抱漆斑霉（Myrothecium verrucaria)BCRC31545、米曲菌（Aspergillus oryzae)BCRC30230 与 BCRC32271 以及嗜热侧抱霉菌（Sporotrichum thermophile) BCRC31852
[0093] 2.菌株的转化基质生成白藜芦醇的能力的分析
[0094] 对于所筛选出的各菌株进行下述的实验。将作为植物基质的虎杖或石榴皮的粉末 以及一菌株加入水中，并进行发酵。于发酵之后将培养液加入80%乙醇以进行萃取。将所 获得的萃取液以HPLC分析白藜芦醇及糖苷的含量。使用虎杖为基质的各菌株的实验结果 如图IA所示，而使用石榴皮为基质的各菌株的实验结果如图IB所示。
[0095] 根据图IA与IB的结果，可以清楚得知，相同的菌株对于不同的植物基质的白藜芦 醇及糖苷含量的增加或减少能力不同，且不同的菌株对于相同的植物基质的白藜芦醇及糖 苷含量的增减情况也不相同。而根据整个实验结果初步看来，以酵母菌的布鲁塞尔德克酵 母菌（Dekkera bruxellensis) BCRC21440对于白藜芦醇的生成具有较佳转化基质生成白 藜芦醇的效果。
[0096] 3.不同的布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)菌株的转化基质生成白 藜芦醇的能力的分析
[0097] 由上述菌株转化测试结果显示，酵母菌的布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440对于白 藜芦醇的生成具有较佳转化基质生成白藜芦醇的效果，因此尝试搜集不同布鲁塞尔德克酵 母菌的菌株，其分别为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440、布鲁塞尔德克酵母菌BCRC20932、 布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21518、布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21519与布鲁塞尔德克酵母菌 BCRC21517,并将所搜集到的菌株以虎杖作为植物基质进行转化生成白藜芦醇的试验。转化 结果如图2所示。
[0098] 根据图2可知，所搜集的布鲁塞尔德克酵母菌对于虎杖基质皆具有良好转化基质 生成白藜芦醇的能力，而后续以布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440菌株进行进一步突变以提 升其转化基质生成白藜芦醇的能力。
[0099] 虎杖中糖苷含量约为白藜芦醇2-4倍，较其他植物基质高很多，故利用虎杖作为 菌株转化的植物基质，可得到较佳的白藜芦醇产量，且有助于后续纯化回收白藜芦醇。
[0100] 4.布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440的甲基硝基亚硝基胍（N-methylW -nitro-N -nitrosoguanidine, NTG)突变
[0101] 将布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440经由一连串系列NTG突变后，共挑选226株 突变株进行分析，结果以其中12株结果较佳，其分别为编号11、16、34、39、41、53、58、61、 63、67、70与72的突变株，于是进一步分别分析此12株突变株于不同培养时间点所产生的 β_葡萄糖苷酶（β-glucosidase)的量。结果如图3所示。
[0102] 根据图3所示可知，上述的12株突变株的β -葡萄糖苷酶产量均较原始菌株佳， 其中又以编号11、53、61及72的突变株较佳。
[0103] 之后，将上述编号11、53、61及72的突变株所产生的β-葡萄糖苷酶进行稳定性 分析。将每株挑选23个菌落并调整至相同OD值后，培养48小时。之后测定所培养的菌 的OD 4tl5吸光值，分析其稳定性。结果显示4株菌产β-葡萄糖苷酶能力差异不大，而编号 11的突变株产β-葡萄糖苷酶能力的变异性较大（>10% )，其他3株都在10%以下，此外， 由于编号72号的突变株的β -葡萄糖苷酶产量略高，因此将其作为后续培养基探讨的菌 株，并将其命名为布鲁塞尔德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)NTG-72,且于2013年1月 9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏编号为BCRC 920084， 并于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sa mmlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，保藏编号为 DSM 27483。
[0104] 连续培养的菌株的转化基质生成白藜芦醇的能力的分析
[0105] 经由一连串筛选与突变筛选，以上述编号72号的突变株进行后续实验。以YH)培 养基进行种菌活化，之后将经活化种菌接种并培养，当其以OD 6tltl测定值达到10,再进行后 续转化试验。
[0106] (1)5公升的发酵槽连续培养
[0107] 利用5公升发酵槽并以虎杖为植物基质来培养编号72号的突变株进行生产白藜 芦醇，而培养条件为：25°C、100~200rpm、通气量为lvvm、5%接菌量（相对于培养基的体 基）。分别以福格尔最小盐类培养基（Vogel minimal salts medium, VMSM)、20mM醋酸缓冲 液pH5. 0与水作为生产的培养基，添加2%虎杖（相对于培养基的体基）作为转化白藜芦醇 的植物基质来培养编号72号的突变株，结果如图4A所示。
[0108] 图4A中显示以醋酸缓冲液作为培养基具有最高的白藜芦醇产量。最高的白藜芦 醇的含量为7455. 6 μ g/g，之后随时间的增加而缓慢降低，而此时的虎杖糖苷含量只剩下 198. 6 μ g/g，而其次为水作为培养基，最差的为福格尔最小盐类培养基。
[0109] (2)20公升的发酵槽连续培养
[0110] 利用20公升发酵槽与并以虎杖为植物基质来培养编号72号的突变株进行生产白 藜芦醇，以100-200rpm、0. 2vvm的条件进行培养。以20mM醋酸缓冲液pH5. 0作为培养基， 并添加2%虎杖（相对于培养基的体基）作为基质，结果如图4B所示。
[0111] 图4B中显示，白藜芦醇含量随时间而增加，直到40小时趋于平缓，从2177. 6ug/g 增加到最高值为7266. 4ug/g，而虎杖糖苷的趋势则相反。另外，计算虎杖糖苷转化成白藜芦 醇的转化率，结果转化率可以达到95%以上。
[0112] 综合前述结果可知，将β_葡萄糖苷酶高产量的酵母菌（编号72号的突变株） 以虎杖为植物基质进行发酵，以转化虎杖糖苷生成白藜芦醇。从摇瓶初步测试转化率、5公 升发酵槽测试转速及通气量参数、20公升发酵槽测试放大制程的转化率均可行后，共进行 多次发酵（包括5公升、20公升、250公升和2000公升，均进行三次以上）。结果显示，在所 有发酵体积的实验中，在培养第30-72小时期间，糖苷含量降至0. 5mg/g或以下，而白藜芦 醇从30小时后则渐趋于稳定，大约含量为8-12mg/g，其转化率更可达95%以上。
[0113] 关于生物材料的保藏
[0114] 2013年1月9日保藏于台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心，保藏 编号为 BCRC 920084。
[0115] 2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，保藏编号为 DSM27483。保藏中心地址为：英 豪丰大街7B，D-38124布伦瑞克。
【主权项】
1. 一种通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其特征在于，其包括： 提供一德克酵母属的酵母菌或其突变株与一基质，该基质包括白藜芦醇前驱物或含有 白藜芦醇前驱物的一植物基质； 将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基质加入至一培养基中以形成一混合物；以 及 对该混合物进行发酵，以使于该混合物中存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的 酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。2. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株包括一布鲁塞尔德克酵母菌或其突变株。3. 如权利要求2所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述布鲁塞尔德 克酵母菌或其突变株包括布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440或其突变株。4. 如权利要求3所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述布鲁塞尔德 克酵母菌的突变株包括于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ的保藏 编号为DSM27483的布鲁塞尔德克酵母菌。5. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株为布鲁塞尔德克酵母菌BCRC21440。6. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株为于2013年7月11日保藏于德国微生物菌种保藏中心DSMZ的保藏 编号为DSM27483的布鲁塞尔德克酵母菌。7. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述白藜芦醇前 驱物包括白藜芦醇糖苷。8. 如权利要求7所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述白藜芦醇糖 苷包括虎杖糖苷。9. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，含有白藜芦醇前 驱物的该植物基质包括虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、蓝莓、桑葚、蔓越莓 或波萝蜜。10. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述含有白藜芦 醇前驱物的该植物基质为虎杖。11. 如权利要求10所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，含于所述虎杖 的该白藜芦醇前驱物为虎杖糖苷。12. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述基质为含有 白藜芦醇前驱物的该植物基质。13. 如权利要求12所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述植物基质 为虎杖。14. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述德克酵母属 的酵母菌或其突变株的添加量为培养基体积的1-65%。15. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述基质的添加 量为培养基体积的1-65%。16. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述培养基包括 水、醋酸缓冲溶液或福格尔最小盐类培养基。17. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵时间为 约12-72小时。18. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵温度为 约 20-35 °C。19. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵于一摇 瓶或发酵槽中进行。20. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵于一发 酵槽中进行，且该德克酵母属的酵母菌添加量为培养基体积的1-65%，而该基质的添加量 为培养基体积的1-65%。21. 如权利要求20所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵时间 为约18-48小时。22. 如权利要求20所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述发酵温度 为约 23-30 °C。23. 如权利要求20所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述基质为含 有白藜芦醇前驱物的该植物基质。24. 如权利要求23所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，所述植物基质 为虎杖或石榴皮。25. 如权利要求1所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，在该步骤（c)之 后，还包括（d)从该混合物中萃取该白藜芦醇。26. 如权利要求25所述的通过微生物转化生产白藜芦醇的方法，其中，在该步骤（d)中 包括： 于经发酵的该混合物中加入酒精并进行超音波震荡以形成一萃取液； 将该萃取液进行干燥后再加入水及乙醚以形成一水层与一乙醚层；以及 收集该乙醚层并将该乙醚层干燥以获得白藜芦醇产物。27. -种新布鲁塞尔德克酵母菌突变株，其是于2013年7月11日保藏于德国微生物菌 种保藏中心DSMZ的保藏编号为DSM27483的布鲁塞尔德克酵母菌。
【专利摘要】本发明提供一种以微生物转化生产白藜芦醇(resveratrol)的方法，其包括：(a)提供一德克酵母属(Dekkera)的酵母菌或其突变株与一基质，其中该基质包括白藜芦醇前驱物或含有白藜芦醇前驱物的一植物基质；(b)将该德克酵母属的酵母菌或其突变株与该基质加入至一培养基中以形成一混合物；以及(c)对该混合物进行发酵，以使于该混合物中存在的该白藜芦醇前驱物被该德克酵母属的酵母菌或其突变株生物转化而产生白藜芦醇。DSM 2748320130711
【IPC分类】C12N1/16, C12R1/645, C12P7/22
【公开号】CN104894172
【申请号】CN201410185938
【发明人】黄学聪, 郭晓萍, 赖进此
【申请人】财团法人食品工业发展研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年5月5日
最新回复(0)