一种姜黄素衍生物的制备方法
一种姜黄素衍生物的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种姜黄素衍生物的制备方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 姜黄素的化学结构式为：
[0003]
[0004] 姜黄素（curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一 种天然有效成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗HIV、抗高血压、抗胆固醇、抗凝血等生物活 性，且其分子量小、毒性低，具有良好的临床应用潜力。但因姜黄素在机体内药效不持久、 选择性低、被机体吸收的能力差、易被降解、生物利用度低等缺点，制约了其在保健食品 和医药领域中的应用。因此，在保留姜黄素原有药效基础上，通过化学或生物法制备性 能更好的姜黄素衍生物成为近年来研宄的热点。Zhang Xing等采用在华根霉（Rhizopus chinensis) IFFI03043培养液中直接加入底物姜黄素的生长培养转化法制得两种主要的姜 黄素衍生物一4' -0- β -D-葡萄糖苷姜黄素（产率为57 % )和六氢姜黄素（产率为6. 2 % ) (Biocatalysis and Biotransformation, 2010, 28(5-6):380-386)〇
[0005] 申请人在先专利申请201110025986. 4 (公开号CN102161978B)提供了一株新菌种 红球菌ZJPH1003以及利用该菌种催化不对称水解制备S-(+)-2, 2-二甲基环丙烷甲酸的方 法。本发明提出了利用红球菌ZJPH1003菌株生物转化姜黄素制备两种姜黄素衍生物的新 方法。本发明利用红球菌ZJPH1003静息细胞为催化剂转化姜黄素制备其衍生物，不仅可消 除培养基成分对姜黄素生物转化的影响，有效控制转化液的组成，提高转化率，而且更利于 姜黄素转化产物的后续分离与提纯。本发明采用的菌种易培养，含酶源细胞的制备成本低， 并且催化转化姜黄素的底物浓度高，转化产率高。采用微生物转化法对天然产物进行结构 修饰具有区域选择性和立体选择性高，反应条件温和、操作简单、成本低廉，环境友好等优 点，且生物体系可产生多种性质与功能各异的酶，从而可催化姜黄素底物转化生成具有不 同取代方式的系列衍生物，有望从中找到活性更好或具有新结构的姜黄素衍生物，并且对 姜黄素"构效关系"研宄具有重要的意义。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种姜黄素衍生物的制备方法，特别是利用红球菌ZJPH1003 生物转化制备六氢姜黄素和八氢姜黄素，利用红球菌ZJPH1003静息细胞转化姜黄素制备 其衍生物，不仅可消除培养基成分对生物转化过程的影响，有效控制转化液的组成，提高转 化率，而且更利于姜黄素转化产物的后续分离与提纯，菌种易培养，含酶源细胞的制备成本 低，并且催化转化姜黄素的底物浓度高，转化产率高。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种姜黄素衍生物的制备方法，所述的方法为：以红球菌 (Rhodococcus sp.) ZJPH1003经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值 5. 4~8. 0的磷酸缓冲液中构成转化体系，在25~35°C、150~250rpm条件下（优选30°C、 200rpm)进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行后处理，获得姜黄素衍生物；所述 湿菌体的用量以菌体干重计为14. 4~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓度为 10~250mg/L转化体系。
[0009] 本发明所述红球菌（Rhodococcus sp. ) ZJPH1003保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072,保藏编号为CCTCC NO. M2010371，保藏日期 2010年12月29日，该菌株已在先前的专利申请（申请号为2011100259864,申请日2011 年1月25日）中公开。
[0010] 进一步，所述转化反应液的后处理方法为：反应结束后，将转化液离心，取上清液 用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去乙酸乙酯，取浓缩物进行硅胶柱层析，TLC法跟踪 检测，分别收集Rf值为〇. 329和0. 505时的洗脱液，蒸除溶剂，分别获得八氢姜黄素和六氢 姜黄素。
[0011] 进一步，优选所述湿菌体的用量以菌体干重计为21. 6~50. 5g/L转化体系，所述 姜黄素底物的初始浓度为50~250mg/L转化体系。
[0012] 进一步，所述用于制备八氢姜黄素的酶源按如下方法制备：
[0013] (1)斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜 面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~ 6g/L、（NH 4)2S043 ~8g/L、KH2PO4O. 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1 ~ 1. 0g/L、NaCl 0· 1~I. 0g/L、琼脂20~40g/L，pH 5~8,溶剂为水；优选斜面培养基终浓 度组成为：葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4)2SO4 4. 0g/L，KH2PO4L 0g/L， K2HPO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，琼脂 30g/L，溶剂为水，pH 7· 0 ;
[0014] (2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30°C、200rpm培养 24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵 母膏 1 ~6g/L、（NH4)2S043 ~8g/L、KH2P040. 2 ~I. 5g/L、K2HP040. 2 ~I. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 1 ~I. 0g/L、NaCl 0· 1 ~I. 0g/L，pH 5 ~8,溶剂为水；
[0015] (3)发酵培养：以体积浓度5~15%接种量将种子液接种到发酵培养基中，30°C、 200rpm发酵培养56h，将发酵培养液离心，收集湿菌体，即获得所述酶源；所述发酵培养基 终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、酵母膏5~50g/L、Li 2SO4O. 1~0· 5g/L、KH2PO4O. 5~ 3. 0g/L、K2HPO4O. 5 ~3. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0· 2 ~I. 0g/L、NaCl 0· 2 ~I. 0g/L，pH 5 ~8， 溶剂为水；
[0016] 本发明所述酶源制备过程中用于高产八氢姜黄素的发酵培养的培养基优选为：葡 萄糖 35 ~45g/L、酵母膏 15 ~25g/L、Li2S040. 1 ~0· 3g/L、KH2P04l. 0 ~2. 0g/L、K2HP04l. 0 ~ 2. 0g/L、MgS04 · 7H20 0· 4 ~0· 8g/L、NaCl 0· 4 ~0· 8g/L，pH 5 ~8,溶剂为水，最优选为葡 萄糖 40g/L、酵母膏 20g/L、Li2SO4O. 2g/L、KH2PO4L 5g/L、K2HPO4L 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 6g/ L、NaCl 0· 6g/L，pH 7. 0,溶剂为水。
[0017] 本发明所述用于制备六氢姜黄素的酶源按如下方法制备：
[0018] (1)斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜 面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~ 6g/L、（NH 4)2S043 ~8g/L、KH2PO4O. 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1 ~ 1.0 g/L、NaCl 0· 1 ~1.0 g/L、琼脂 20 ~40g/L，pH 5 ~8,溶剂为水；
[0019] (2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，在30°C、200rpm培 养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、 酵母膏 1 ~6g/L、（NH4)2S043 ~8g/L、KH2P040. 2 ~I. 5g/L、K2HP040. 2 ~I. 5g/L、MgS04 ·7Η20 0. 1~1.0 g/L、NaCl 0. 1~1.0 g/L，pH 5~8,溶剂为水；优选种子培养基终浓度组成为： 葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4) 2S044. 0g/L，KH2PO4L 0g/L，K2HPO4L Og/ L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，溶剂为水，pH 7· 0 ;
[0020] (3)发酵培养：以体积浓度10%接种量将种子液接种到装有IOOmL发酵培养基的 250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体即获得所述酶源；所述 发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、蛋白胨5~50g/L、（NH 4)2SO4O. 5~3. 0g/L、 K2HPO4L 0 ~4. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0· 2 ~I. 0g/L、NaCl 0· 2 ~I. 0g/L，pH 5 ~8,溶剂为 水；
[0021] 本发明所述酶源制备过程中用于高产六氢姜黄素的发酵培养的培养基优选为： 葡萄糖 30 ~40g/L、蛋白胨 15 ~25g/L、（NH4)2SO4O. 5 ~I. 5g/L、Κ2ΗΡ042· 5 ~3. 5g/L、 MgS04.7H20 0.4~0.8g/L、NaCl 0.4~0.8g/L，pH 5~8,溶剂为水，最优选为葡萄糖 35g/L，蛋白胨 20g/L，（NH4)2SO4L 0g/L，Κ2ΗΡ043· 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0· 6g/L， pH 7.0,溶剂为水。
[0022] 进一步，所述红球菌ZJPH1003在生物转化制备姜黄素衍生物中应用，具体为转化 制备八氢姜黄素的应用按如下步骤进行：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜 黄素置于PH值为5. 4~8. 0磷酸缓冲液中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化 反应36h，反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1 的正己烷、二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集R f值为0. 329时的洗脱 液，将洗脱液于50°C下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即八氢姜黄素；所述红球菌 ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 9~50. 5g/L转化体系，所述姜 黄素底物的初始浓度为50~200mg/L转化体系。
[0023] 进一步，所述红球菌ZJPH1003在生物转化制备姜黄素衍生物中应用，具体为转化 制备六氢姜黄素的应用按如下步骤进行：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜 黄素置于PH值为5. 8~7. 4磷酸缓冲液 中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化 反应24h，反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1 的正己烷、二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集R f值为0. 505时的洗脱 液，将洗脱液于50°C下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即六氢姜黄素；所述红球菌 ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 9~50. 5g/L转化体系，所述姜 黄素底物的初始浓度为50~200mg/L转化体系。
[0024] 本发明所述经红球菌ZJPH1003湿菌体生物转化后获得的转化反应液（实验组）， 首先进行TLC法分析，与姜黄素标准品、对照组1 (转化反应体系中只加入底物，不加入酶 源）和对照组2 (转化反应体系中不加入底物，只加入酶源，用缓冲液补充体积）进行对 照，确定实验组的转化液中是否产生新斑点，如果产生新的斑点，则将转化液离心，取上清 液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至干，取旋蒸后所得浓缩物用色谱甲醇重新溶解、微 滤（0.45 μπι)处理后进行HPLC分析，确定是否出现新的特征峰（与姜黄素标准品、对照组 1和对照组2相比）。如果出现新的特征峰，将生物转化后获得的转化液离心，取上清液用 乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩后进行硅胶柱层析，收集R f值为0. 329的流出液，除去洗 脱剂，获得所述姜黄素衍生物之一；收集Rf值为〇. 505的流出液，除去洗脱剂，获得所述姜 黄素衍生物之二。分别采用高效液相色谱法分析其纯度。取纯度在95%以上的组分进行高 效液相色谱和质谱联用检测（LC-MS)， 1H-NMR和13C-NMR检测，鉴定其结构。
[0025] 本发明有益效果主要体现在：本发明利用红球菌ZJPH1003菌株静息细胞为催化 剂的生物转化方法对姜黄素进行结构修饰，由此获得相应的衍生物。姜黄素结构修饰物的 药理或生物活性较修饰前的姜黄素底物有不同程度的改善，有利于药物新制剂的开发；本 发明采用生物转化方法获得姜黄素衍生物的工艺过程较简单，环境友好，生物催化剂为微 生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉。与已报道的转化菌株相比，本发明菌种 催化转化姜黄素的底物浓度高，制备姜黄素衍生物的产率高。 (四）
【附图说明】
[0026] 图1本发明利用红球菌ZJPH1003微生物转化制备姜黄素衍生物的流程图。
[0027] 图2实施例1姜黄素转化产物的TLC图谱示意图，A为B的示意图，B为TLC图谱； 其中，1为实验组样品，2为姜黄素标准品，3为对照组1样品，4为对照组2样品；a，b为红 球菌ZJPH1003制备的姜黄素转化产物产生的斑点；c为姜黄素标准品产生的斑点；d为对 照组1样品产生的斑点。
[0028] 图3实施例1姜黄素转化产物的HPLC图谱：a为实验组样品；b为姜黄素标准品； c为对照组1样品；d为对照组2样品；峰1-峰7对应的出峰时间分别为A1= 12. 3min，12 =23. 0min? t3= 25. 6min? 14= 26. 4min? 15= 28. 6min? 16= 29. 9min? 17= 32. 7min? t ^ 龍=49. Omin
[0029] 图4实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的一级质谱图（MS)。
[0030] 图5实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的三级质谱图（MS3)。
[0031] 图6实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的核磁氢谱图（1H-NMR)。
[0032] 图7实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的核磁碳谱图（13C-NMR)。
[0033] 图8实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的一级质谱图（MS)。
[0034] 图9实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的三级质谱图（MS3)。
[0035] 图10实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的核磁氢谱图（1H-NMR)。
[0036] 图11实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的核磁碳谱图（13C-NMR)。 (五）
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0038] 实施例1 :姜黄素转化产物的制备
[0039] (1)斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，即得到 斜面菌种；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖l〇g/L，蛋白胨5. Og/L，酵母膏3. Og/L， (NH4) 2S044. Og/L，KH2PO4L Og/L，K2HPO4L Og/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，琼月旨 30g/ L，溶剂为水，pH 7. 0,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面；
[0040] (2)种子培养：从步骤（1)斜面菌体挑取一环菌体接种至装有IOOmL种子培养基 的250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养24h，制备得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为： 葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4) 2S044. 0g/L，KH2PO4L 0g/L，K2HPO4L Og/ L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，溶剂为水，ρΗ7· 0,121°C灭菌 20 分钟，灭菌后冷却；
[0041] (3)用于制备姜黄素衍生物酶源的初始发酵培养：以体积浓度10%接种量将种子 液（步骤⑵制备）接种到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养56h， 得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度为：葡萄糖5g/L、蛋白胨25g/L、酵 母膏 3g/L、甘油 2g/L、（NH4)2S043g/L、KH2P0 4l. 0g/L、K2HP042. 0g/L、MgS04 ·7Η20 0· 5g/L、NaCl 1.75g/L，pH 7.0,溶剂为水，pH 7.0，121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却。
[0042] (4)优化步骤（3)培养基成分，得到高产八氢姜黄素的酶源的发酵培养：以体积浓 度10%接种量将种子液（步骤⑵制备）接种到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中， 30°C、20〇rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度为：葡萄糖 40g/L，酵母膏 20g/L，Li2SO4O. 2g/L，KH2PO4L 5g/L，K2HPO4L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0. 6g/L，溶剂为水，pH 7. 0,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却。
[0043] (5)优化步骤（3)培养基成分，得到高产六氢姜黄素的酶源的发酵培养：以体积 浓度10%接种量将种子液（步骤（2)制备）接种到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶 中，30°C、200rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度为：葡萄 糖 35g/L，蛋白胨 20g/L，（NH4)2SO4L 0g/L，Κ2ΗΡ043· 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0· 6g/ L，溶剂为水，pH 7. 0,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却。
[0044] (6)姜黄素的生物转化：
[0045] 实验组：将步骤（3)获得的湿菌体用0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液洗涤后，将湿菌 体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始 浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加量以菌体干重计为28. 9g/L转化体系。
[0046] 设置对照组1 (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0047] 设置对照组2 (不添加底物）：将步骤（3)获得的湿菌体加入到0. 1M，pH 6. 6的磷 酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体干重计为28. 9g/L反应体系。
[0048] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应36h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，待检测。
[0049] (7)分析检测
[0050] ①薄层层析检测（TLC):用毛细点样管分别吸取一定量的实验组样品、姜黄素标 准品（0.1 g姜黄素标准品用IOOrnl色谱甲醇溶解）、对照组1样品和对照组2样品，分别点样 于预活化的硅胶薄层板上，展层剂为正己烧：二氯甲烧：甲醇=2:18:1(￥八八），于254]1111 紫外灯下将实验组样品与对照组样品和标准品相比较，采用碘蒸气显色后观察是否产生新 的斑点。
[0051] ②高效液相色谱检测（HPLC):所有样品进样检测前先用0.45 μ m微孔滤膜过滤， 将实验组样品谱图与姜黄素标准品、对照组1样品和对照组2样品进行比对，观察是否出现 新的物质峰。
[0052] 色谱柱为 shim-pack VP-ODS (250 X Φ 4. 6mm, SHIMADZU)，检测波长：280nm，流速： 0. 5mL/min，进样量：10 μ L，流动相：乙腈-水，梯度洗脱条件如表1所示。
[0053] 表1 HPLC梯度洗脱条件
[0054]
[0055] 实验组样品经TLC检测出现两个新的斑点（见图2,点a (Rf值为0. 329)和点b (R f 值为0. 505)所示），HPLC法检测得到7个微生物转化产物（图3中的峰1-峰7所示），其 中HPLC图谱显示产物4 (t = 26. 4min，即TLC检测时Rf值为0. 329时出现的斑点）和产物 6 (t = 29. 9min，即TLC检测时Rf值为0. 505时出现的斑点）的峰面积较高，含量较多，为 红球菌ZJPH1003菌株的两个主要的姜黄素转化产物。
[0056] (8)转化产物的分离纯化：
[0057] 利用硅胶柱层析对上述两个主要的姜黄素转化产物（即转化液经离心、萃取、减 压浓缩后的浓缩物）进行分离。洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇（2:18:1 (v/v/v))梯度 洗脱，硅胶粒径为100~200目，硅胶型号为粗孔ZCX II ;采用湿法装柱，称取60g硅胶装于 直径2cm的层析柱中，流速控制在2mL/min ;洗脱液用TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 329 时的洗脱液，用HPLC法检测纯度（检测条件同步骤（5))，经过分离纯化，得到产物4(t = 26. 4min);收集Rf值为0. 505时的洗脱液，用HPLC法检测纯度（检测条件同步骤（5))，经 过分离纯化，得到产物6 (t = 2 9. 9min)，分别进行LC-MS^H-NMR和13C-NMR检测，并对其进 行结构鉴定。
[0058] 高效液相色谱和质谱联用检测（LC-MS):鞘气流速（arb) : 20 ;辅助气流速 (arb) :20 ;喷雾电压（kv) :3· 5 ;毛细管温度（°C ) :275。
[0059] 经鉴定，推断该转化产物4 (t = 26. 4min)为八氢姜黄素，其结构式为：
[0060]
[0061] 该化合物具有以下理化性质：白色粉末，推断其分子式为C21H28O 6。通过高分辨率 的EI-MS得到[M+H]+为377, [M-H] _为375,因此，可推断出其分子量为376,在（+)EI-MS 中，还出现两个个主要的分子离子峰，[M+Na]+为399, [Μ+Η-Η20]+为359。将m/z 359的 分子离子峰断裂，得到三级质谱（MS3)，其m/z分别为217,177,163,137。如图4和5所示。 1H-NMR 结果为=1H-NMR (3000MHz，CDCl3) : δ = 1. 41 (2H, m, H-4) ; δ = 1. 49 (4H, m, H-2, 6); δ = 2. 49 (2Η, m, H-l, 7) ； δ = 2. 50 (2Η, m, Η-1, 7) ； δ = 3. 31 (2Η, s, Η-〇Η) ； δ =3.72 (6H，m, H-OCH3) ;δ = 4.55 (2H，m，H-3, 5) ;δ = 6.56 (2H，d，H-2'）；δ = 6· 65 (2Η，dd，Η-6'）； δ = 6· 71 (2Η，dd，Η-5'）； δ = 8· 59 (2Η，s，H-ArOH)，如图 6 所示。 13C-NMR 结果为：6 31.4(〇1，(：-7)，40.0((：-2，(：-6)，43.3((：-4)，55.9(3，，3"0厘6)，72.4((：-3, C-5)，111. I (C-2，，C-2〃），114.4(05,，C-5" )，120.9(06,，C-6" )，133.8(01，，C-1")， 143.8(C-4'，C-4" )，146.5(C-3'，C-3")，如图 7 所示。
[0062] 经鉴定，推断转化产物6 (t = 29. 9min)为六氢姜黄素，其结构式为：
[0063]
[0064] 该化合物具有以下理化性质：白色结晶，推断其分子式为C21H26O6。通过高分辨率 的EI-MS得到[M+H]+为375, [M-H] _为373,因此，可推断出其分子量为374,在（+)EI-MS 中，还出现一个主要的分子离子峰，[Μ+Η-Η20]+为357。将m/z 357的分子离子峰断裂，得 到三级质谱（MS3)，其m/z分别为357, 339,177,163。如图8和9所示。1H-NMR结果为： 1H-NMR(MeOD) : δ =1.71 (2Η, m, H-2) ； δ = 2. 60 (4H, m, H-l, 7) ； δ = 2. 78 (4Η, m, Η-4, 6)； δ = 3.83 (3H，s, H-OCH3) ;δ = 3.84 (3H，s, H-OCH3) ;δ = 4.02 (Η, m，H-3) ;δ = 6· 62 (2Η，d，Η-6'）； δ = 6· 70 (2Η，dd，Η-5'）； δ = 6· 77 (2Η，s，Η-2'），如图 10 所示。 13C-NMR 结果为：δ 29. 3 (C-I)，31. 4 (C-7)，38. 3 (C-6)，45. 4 (C-2)，55. 9 (3,，3 " OMe)，66 ? 9(C-5)，llLl(C-2，，2" ),111. 3(C-2，，2" ),114. 4(C-5,/5" ),120. 7(C-6，，6" ),120.9 (C-6，，6" ),132. 5(C-1，，I" )，133.7(01，，I" ),143. 7 (C-4，，4" )，144.0(04,，4" ),146 ? 4(C-3'，3" ),146. 5(C-3'，3" ),211. 3(C-3)，如图 11 所示。
[0065] 据报道，八氢姜黄素和六氢姜黄素的生物活性和药理活性较底物姜黄素都得 到了较大的改善，稳定性也有所提高。例如=PfeifTer等人将六氢姜黄素和姜黄素同时 置于37°C，0.1 M pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，放置24h后用HPLC检测两者的降解率，研 宄发现，姜黄素在Ih内降解率已达90%，而六氢姜黄素在24h之内都没有明显的降解 (Pfeiffer E，Hoehle S I,Walch S G，et al. Curcuminoids from reactive glucuronides in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007,55:538-544.)〇 八 氢姜黄素的抗氧化能力（AAPH法）高于姜黄素，且较姜黄素可更有效地抑制红细胞 膜脂质的过氧化。此外，八氢姜黄素和六氢姜黄素的抗氧化活性均高于姜黄素，其抗 氧化活性顺序依次为八氢姜黄素〉六氢姜黄素〉姜黄素 （Somparn P，Phisalaphong C，Nakornchai Sj et al. Comparative antioxidant activities of curcumin and its demethoxy and hydrogenated derivatives. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2007,30(I):74-8. Feng JY，Liu ZQ. Phenolic and enolic hydroxyl groups in curcumin:which plays the major role in scavenging radicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57:11041-11046. Srimuangwong K，Tocharus C，Chintana P Y，et al.Hexahydrocurcumin enhances inhibitory effect of 5-fluorouracil on HT-29human colon cancer cells. World Journal of Gastroenterol ogy，2012, 18 (19) : 2383-2389.)。
[0066] 实施例2~7菌体浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0067] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体以 菌体干重计分别为 14. 4g/L、21. 6g/L、28. 9g/L、36. lg/L、43. 3g/L、50. 5g/L)(表2所示），底 物姜黄素终浓度为50mg/L，分别于30°C，200rpm转化36h。反应结束后，将转化液离心除去 菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸后所 得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面积归 一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表2。
[0068] 表2不同菌体浓度对转化产物4(t = 26. 4min)得率的影响
[0069]
[0070] 结论：从表2可知，较佳的菌体浓度为43. 3g/L。在此条件下姜黄素转化产物4的 得率为58. 90%，转化产物6的得率为19. 15%。
[0071 ] 实施例8~14转化液pH值对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0072] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH分别为5. 4~8. 0磷酸缓冲液（表3所示）的 50mL三角瓶中（湿菌体终浓度为43. 3g/L)，底物姜黄素浓度为50mg/L，于30°C，200rpm转 化36h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测 方法同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表3。
[0073] 表3不同转化液pH值对转化产物4 (t = 26. 4min)得率的影响
[0074]
[0075] 结论：从表3可知，较佳的转化液pH值为6. 6,在此条件下姜黄素转化产物4的得 率为58. 87 %，转化产物6的得率为23. 02 %。
[0076] 实施例15~20底物浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0077] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体 以菌体干重计为43. 3g/L)，底物姜黄素终浓度分别为10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、 200mg/L、250mg/L (表4所示），分别于30°C，200rpm转化36h。反应结束后，将转化液离心 除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸 后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面 积归一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表4。
[0078] 表4不同底物浓度对转化产物4 (t = 26. 4min)得率的影响
[0079]
[0080]
[0081] 结论：由表4可知，较佳的底物质量浓度为150mg/L。在此条件下姜黄素转化产物 4的得率为52. 18%，转化产物6的得率为15. 38%。
[0082] 实施例21~29转化时间对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0083] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体终 浓度为43. 3g/L)，底物姜黄素浓度为150mg/L，于30°C，200rpm转化6~54h (表5所示）。 反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩 至干，除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0.75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法 同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表5。
[0084] 表5不同转化时间对转化产物4(t = 26. 4min)得率的影响 [0085]
[0086] 结论：由" 5可知，较佳的"化时间为36h。*此条件下姜黄-转化产物4的得率 为59. 47 %，转化产物6的得率为16. 11 %。
[0087] 实施例30 :用于制备姜黄素转化产物6的发酵培养基组分的正交优化
[0088] 表6发酵培养基正交因素水平表
[0089]
[0091] 利用红球菌ZJPH1003菌株，按实施例1的方法进行斜面培养和种子培养后，按表 6设计的实验方案优化实施例1步骤（3)发酵培养基中蛋白胨、葡萄糖、（NH4)2SOjP K2HPO4 的浓度。将发酵后的湿菌体加入装有IOmL 0.1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿 菌体加入量以菌体干重计为28. 9g/L)，底物姜黄素终浓度为50mg/L，于30°C，200rpm转化 24h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于 50°C减压蒸馏除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，根 据面积归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的产率，结果见表7和表8。
[0092] 表7发酵培养基正交试验L9 (34)结果
[0093]
[0094] 注：ITi=KiAi
[0095] 表8发酵培养基正交试验方差分析
[0096]
[0098] 根据方差分析，蛋白胨浓度和葡萄糖浓度是影响产物6 (t = 29. 9min)得率非常显 著的因素，硫酸铵浓度是显著的因素，根据表7所示，四个因素的最佳配比为A2B 2C1D3，即蛋 白胨浓度20g/L，葡萄糖浓度35g/L，硫酸铵浓度1.0 g/L，磷酸氢二钾浓度3. Og/L。当采用 此配比的发酵培养基进行培养时，所收获的菌体按照实施例1中实验组的转化条件进行姜 黄素转化，转化为产物6的得率可达75. 21 %，转化为产物4的得率为8. 75%。
[0099] 实施例31~35转化液pH值对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0100] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH分别为5. 8~7. 4磷酸缓冲液（表9所示）的 50mL三角瓶中（湿菌体终浓度为28. 9g/L)，底物姜黄素浓度为50mg/L，于30°C，200rpm转 化24h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测 方法同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的得率，结果见表9。 [0101] 表9不同转化液pH值对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0102]
[0103] 结论:从表9可以看出，较佳的转化液pH值为6. 6。在此条件下姜黄素转化产物6 的得率为73. 10 %，转化产物4的得率为9. 11 %。
[0104] 实施例36~41菌体浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0105] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体以 菌体干重计分别为 14. 4g/L、21. 6g/L、28. 9g/L、36. lg/L、43. 3g/L、50. 5g/L)(表 10 所示）， 底物姜黄素终浓度为50mg/L，分别于30°C，200rpm转化24h。反应结束后，将转化液离心除 去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸后 所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面积 归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的得率，结果见表10。
[0106] 表10不同菌体浓度对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0107]
[0108] 结论：λ表10可知，较佳的^体浓度为28. 9g/i。在此条件下姜^素转化产物6的 得率为74. 06 %，转化产物4的得率为7. 33 %。
[0109] 实施例42~46底物浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0110] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体 以菌体干重计为28. 9g/L)，底物姜黄素终浓度分别为10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、 200mg/L (表11所示），分别于30°C，200rpm转化24h。反应结束后，将转化液离心除去菌 体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸后所得 残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面积归一 法计算产物6(t = 29. 9min)的得率，结果见表11。
[0111] 表11不同底物浓度对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0112]
[0113」
[0114] 结论：由表11可知，较佳的底物质量浓度为l〇〇mg/L。在此条件下姜黄素转化产 物6的得率为73. 20 %，转化产物4的得率为8. 93 %。
[0115] 实施例47~52转化时间对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0116] 利用红球菌（Rhodococcus sp. ) ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发酵 培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体终浓 度为28. 9g/L)，底物姜黄素浓度为100mg/L，于30°C，200rpm转化12~42h (表12所示）。 反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩 至干，除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0.75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法 同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的得率，结果见表12。
[0117] 表12不同转化时间对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0118]
[0119] 结论：由表12可知，较佳的转化时间为24h。在此条件下姜黄素转化产物6的得 率为74. 48 %，转化产物4的得率为8. 09 %。
[0120] 实施例53 :约翰逊锁掷抱酵母（Sporidiobolus. johnsonii) AS 2. 1063对姜黄素 生物转化活性的考察
[0121] (1)约翰逊锁掷孢酵母（Sporidiobolus. johnsonii) AS 2. 1063购自中国科学院 微生物研宄所。
[0122] (2)斜面培养：将约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063接种至斜面培养基，30°C培养2~ 3天，获得斜面菌体；斜面培养基为麦芽汁培养基，每IL麦芽汁中添加琼脂20g，pH自然。
[0123] (3)种子培养：取斜面菌体接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液；种子培 养基组成：葡萄糖 30g/L，酵母膏 2. 0g/L，NH4Cl 6. 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，KH2PO4L Og/ L，K2HPO4L 0g/L，pH自然，溶剂为水。
[0124] (4)发酵培养：取种子液以体积浓度10%的接种量接种至装有IOOmL发酵培养基 的250mL摇瓶中，30°C培养24h，获得湿菌体；发酵培养基同种子培养基配方。
[0125] (5)姜黄素的生物转化：
[0126] 实验组：将约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063湿菌体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲 液中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加 量以菌体湿重计为200g/L转化体系。
[0127] 设置对照组I (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0128] 设置对照组2(不添加底物）：将约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063湿菌体加入到 0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为200g/L反应 体系。
[0129] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1中的HPLC 法进行检测，未检测到八氢姜黄素和六氢姜黄素产物。
[0130] 结论：约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和八氢 姜黄素。
[0131] 实施例54 :热带假丝酵母（Candida tropicalis) IFFI 01254对姜黄素生物转化 活性的考察
[0132] (1)热带假丝酵母（Candida tropicalis) IFFI 01254购自轻工部食品与发酵工 业研宄所。
[0133] (2)斜面培养：将热带假丝酵母IFFI 01254接种至斜面培养基，30°C培养2~3 天，获得斜面菌体；斜面培养基为麦芽汁培养基，每IL麦芽汁中添加琼脂20g，pH自然。
[0134] (3)种子培养：取斜面菌体接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液；种子培 养基组成：葡萄糖 30g/L，酵母膏 2. Og/L，NH4Cl 6. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，KH2PO4L Og/ L，K2HPO4L Og/L，pH自然，溶剂为水。
[0135] (4)发酵培养：取种子液以体积浓度10%的接种量接种至装有IOOmL发酵培养基 的250mL摇瓶中，30°C培养24h，获得湿菌体；发酵培养基同种子培养基配方。
[0136] (5)姜黄素的生物转化：
[0137] 实验组：将热带假丝酵母IFFI 01254湿菌体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液 中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加量 以菌体湿重计为200g/L转化体系。
[0138] 设置对照组1 (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0139] 设置对照组2 (不添加底物）：将热带假丝酵母IFFI 01254湿菌体加入到0. 1M ， pH6. 6的磷酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为200g/L反应体系。
[0140] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1中的HPLC 法进行检测，未检测到八氢姜黄素和六氢姜黄素产物。
[0141] 结论：热带假丝酵母IFFI 01254不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和八氢姜 黄素。
[0142] 实施例55 :细菌耐酪氨酸冢村氏菌E105对姜黄素生物转化活性的考察
[0143] (1)耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens) El〇5 保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072,保藏编号为CCTCC NO. M209306,保藏日期2009年12月16日，该菌株已在先前的专利申请（申请号为 200910155776. X，申请日2009年12月25日）中公开。
[0144] (2)斜面培养：将耐酪氨酸冢村氏菌E105接种至斜面培养基，30°C培养2~ 3天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：葡萄糖10g/L，蛋白胨5. Og/L，酵母膏2. Og/L， (NH4) 2S042. 0g/L，K2HP042. Og/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，琼月旨 20g/ L，pH 7.0,溶剂为水。
[0145] (3)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液；种子培 养基组成：葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 2. 0g/L，（NH4)2S042. 0g/L，K2HP042. 0g/L， KH2PO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，pH 7. 0,溶剂为水。
[0146] (4)发酵培养：取种子液以体积浓度4%的接种量接种至装有80mL发酵培养基的 250mL摇瓶中，30°C培养36h，获得湿菌体；发酵培养基组成：葡萄糖15g/L，酵母膏12. Ig/ L，NH4Cl 9. 5g/L，Κ2ΗΡ042· 0g/L，KH2PO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 6g/L，pH 7. 0， 溶剂为水。
[0147] (5)姜黄素的生物转化：
[0148] 实验组：将耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中， 同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加量以菌 体湿重计为200g/L转化体系。
[0149] 设置对照组1 (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0150] 设置对照组2 (不添加底物）：将耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为200g/L反应体系。
[0151] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1中的HPLC 法进行检测，未检测到八氢姜黄素和六氢姜黄素产物。
[0152] 结论：细菌耐酪氨酸冢村氏菌E105不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和八氢 姜黄素。
【主权项】
1. 一种姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述的方法为：以红球菌ZJPH1003经发 酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值5. 4~8.O的磷酸缓冲液中构成转 化体系，在25~35°C、150~250rpm条件下进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行 后处理，获得姜黄素衍生物；所述湿菌体的用量以菌体干重计为14. 4~50. 5g/L转化体系， 所述姜黄素底物的初始浓度为10~250mg/L转化体系。2. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述转化反应液的后处理 方法为：反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去乙 酸乙酯，取浓缩物进行硅胶柱层析，TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 329和0. 505的洗脱液， 蒸除溶剂，分别获得八氢姜黄素和六氢姜黄素。3. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述湿菌体的用量以菌体 干重计为21. 6~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓度为50~250mg/L转化体 系。4. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述姜黄素衍生物的制备 方法为：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜黄素置于pH值为5. 4~8. 0磷酸 缓冲液中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化反应36h，反应结束后，将转化液 离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，将萃取液减压浓缩至干，除去乙酸 乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1的正己烷、二氯甲烷 和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 329时的洗脱液，将洗脱液于50°C 下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即八氢姜黄素；所述红球菌ZJPH1003发酵培养 获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 8~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓 度为50~200mg/L转化体系。5. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述姜黄素衍生物的制备 方法为：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜黄素置于pH值为5. 8~7. 4磷酸 缓冲液中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，将萃取液减压浓缩至干，除去乙酸 乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1的正己烷、二氯甲烷 和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 505时的洗脱液，将洗脱液于50°C 下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即六氢姜黄素；所述红球菌ZJPH1003发酵培养 获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 8~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓 度为50~200mg/L转化体系。6. 如权利要求4所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述酶源按如下方法制 备： (1) 斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜面菌 体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~6g/ L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4 0? 2 ~I. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ I.Og/L、NaCl0? 1 ~I.Og/L、琼脂 20 ~40g/L，pH5 ~8,溶剂为水； (2) 种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，在30°C、200rpm培 养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~IOg/ L、酵母膏 1 ~6g/L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、 MgSO4 ? 7H200. 1 ~I.Og/L、NaCl0? 1 ~I.Og/L，pH5 ~8,溶剂为水； (3)发酵培养：以体积浓度5~15 %接种量将种子液接种到发酵培养基中，30 °C、 200rpm发酵培养56h，将发酵培养液离心，收集湿菌体，即获得所述酶源；所述发酵培养基 终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、酵母膏5~50g/L、Li2S040. 1~0? 5、KH2P040. 5~3.Og/ L、K2HPO4 0? 5 ~3.Og/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2 ~I.Og/L、NaCl0? 2 ~I.Og/L，pH5 ~8,溶剂 为水。7.如权利要求5所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述酶源按如下方法制 备： (1) 斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜面菌 体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~6g/ L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4 0? 2 ~I. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ I. 0g/L、NaCl0? 1 ~I. 0g/L、琼脂 20 ~40g/L，pH5 ~8,溶剂为水； (2) 种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，在30°C、200rpm培养 24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵 母膏 1 ~6g/L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2P04 0? 2 ~I. 5g/L、K2HP04 0? 2 ~I. 5g/L、MgS04.7H20 0? 1 ~I. 0g/L、NaCl0? 1 ~I. 0g/L，pH5 ~8,溶剂为水； (3) 发酵培养：以体积浓度10%接种量将种子液接种到装有IOOmL发酵培养基的 250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体即获得所述酶源；所述 发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、蛋白胨5~50g/L、（NH4)2SO4 0? 5~3. 0g/L、 K2HPO4 1. 0 ~4. 0g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2 ~I. 0g/L、NaCl0? 2 ~I. 0g/L，pH5 ~8,溶剂为 水。
【专利摘要】本发明公开了一种姜黄素衍生物的制备方法，所述的方法为：以红球菌ZJPH1003经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值5.4～8.0的磷酸缓冲液中，在25～35℃、150～250rpm条件下进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行后处理，获得姜黄素衍生物；本发明利用红球菌ZJPH1003菌株静息细胞转化方法对姜黄素进行结构修饰，由此获得相应的衍生物。姜黄素结构修饰物的药理或生物活性较修饰前的姜黄素底物有不同程度的改善，有利于药物新制剂的开发；本发明采用微生物转化方法获得姜黄素衍生物的工艺过程较简单，环境友好，生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉。
【IPC分类】C12R1/01, C12P7/22, C12P7/26
【公开号】CN104894173
【申请号】CN201410795155
【发明人】王普, 黄金, 罗杨春
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年12月18日
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种姜黄素衍生物的制备方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 姜黄素的化学结构式为：
[0003]
[0004] 姜黄素（curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一 种天然有效成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗HIV、抗高血压、抗胆固醇、抗凝血等生物活 性，且其分子量小、毒性低，具有良好的临床应用潜力。但因姜黄素在机体内药效不持久、 选择性低、被机体吸收的能力差、易被降解、生物利用度低等缺点，制约了其在保健食品 和医药领域中的应用。因此，在保留姜黄素原有药效基础上，通过化学或生物法制备性 能更好的姜黄素衍生物成为近年来研宄的热点。Zhang Xing等采用在华根霉（Rhizopus chinensis) IFFI03043培养液中直接加入底物姜黄素的生长培养转化法制得两种主要的姜 黄素衍生物一4' -0- β -D-葡萄糖苷姜黄素（产率为57 % )和六氢姜黄素（产率为6. 2 % ) (Biocatalysis and Biotransformation, 2010, 28(5-6):380-386)〇
[0005] 申请人在先专利申请201110025986. 4 (公开号CN102161978B)提供了一株新菌种 红球菌ZJPH1003以及利用该菌种催化不对称水解制备S-(+)-2, 2-二甲基环丙烷甲酸的方 法。本发明提出了利用红球菌ZJPH1003菌株生物转化姜黄素制备两种姜黄素衍生物的新 方法。本发明利用红球菌ZJPH1003静息细胞为催化剂转化姜黄素制备其衍生物，不仅可消 除培养基成分对姜黄素生物转化的影响，有效控制转化液的组成，提高转化率，而且更利于 姜黄素转化产物的后续分离与提纯。本发明采用的菌种易培养，含酶源细胞的制备成本低， 并且催化转化姜黄素的底物浓度高，转化产率高。采用微生物转化法对天然产物进行结构 修饰具有区域选择性和立体选择性高，反应条件温和、操作简单、成本低廉，环境友好等优 点，且生物体系可产生多种性质与功能各异的酶，从而可催化姜黄素底物转化生成具有不 同取代方式的系列衍生物，有望从中找到活性更好或具有新结构的姜黄素衍生物，并且对 姜黄素"构效关系"研宄具有重要的意义。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种姜黄素衍生物的制备方法，特别是利用红球菌ZJPH1003 生物转化制备六氢姜黄素和八氢姜黄素，利用红球菌ZJPH1003静息细胞转化姜黄素制备 其衍生物，不仅可消除培养基成分对生物转化过程的影响，有效控制转化液的组成，提高转 化率，而且更利于姜黄素转化产物的后续分离与提纯，菌种易培养，含酶源细胞的制备成本 低，并且催化转化姜黄素的底物浓度高，转化产率高。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种姜黄素衍生物的制备方法，所述的方法为：以红球菌 (Rhodococcus sp.) ZJPH1003经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值 5. 4~8. 0的磷酸缓冲液中构成转化体系，在25~35°C、150~250rpm条件下（优选30°C、 200rpm)进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行后处理，获得姜黄素衍生物；所述 湿菌体的用量以菌体干重计为14. 4~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓度为 10~250mg/L转化体系。
[0009] 本发明所述红球菌（Rhodococcus sp. ) ZJPH1003保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072,保藏编号为CCTCC NO. M2010371，保藏日期 2010年12月29日，该菌株已在先前的专利申请（申请号为2011100259864,申请日2011 年1月25日）中公开。
[0010] 进一步，所述转化反应液的后处理方法为：反应结束后，将转化液离心，取上清液 用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去乙酸乙酯，取浓缩物进行硅胶柱层析，TLC法跟踪 检测，分别收集Rf值为〇. 329和0. 505时的洗脱液，蒸除溶剂，分别获得八氢姜黄素和六氢 姜黄素。
[0011] 进一步，优选所述湿菌体的用量以菌体干重计为21. 6~50. 5g/L转化体系，所述 姜黄素底物的初始浓度为50~250mg/L转化体系。
[0012] 进一步，所述用于制备八氢姜黄素的酶源按如下方法制备：
[0013] (1)斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜 面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~ 6g/L、（NH 4)2S043 ~8g/L、KH2PO4O. 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1 ~ 1. 0g/L、NaCl 0· 1~I. 0g/L、琼脂20~40g/L，pH 5~8,溶剂为水；优选斜面培养基终浓 度组成为：葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4)2SO4 4. 0g/L，KH2PO4L 0g/L， K2HPO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，琼脂 30g/L，溶剂为水，pH 7· 0 ;
[0014] (2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30°C、200rpm培养 24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵 母膏 1 ~6g/L、（NH4)2S043 ~8g/L、KH2P040. 2 ~I. 5g/L、K2HP040. 2 ~I. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 1 ~I. 0g/L、NaCl 0· 1 ~I. 0g/L，pH 5 ~8,溶剂为水；
[0015] (3)发酵培养：以体积浓度5~15%接种量将种子液接种到发酵培养基中，30°C、 200rpm发酵培养56h，将发酵培养液离心，收集湿菌体，即获得所述酶源；所述发酵培养基 终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、酵母膏5~50g/L、Li 2SO4O. 1~0· 5g/L、KH2PO4O. 5~ 3. 0g/L、K2HPO4O. 5 ~3. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0· 2 ~I. 0g/L、NaCl 0· 2 ~I. 0g/L，pH 5 ~8， 溶剂为水；
[0016] 本发明所述酶源制备过程中用于高产八氢姜黄素的发酵培养的培养基优选为：葡 萄糖 35 ~45g/L、酵母膏 15 ~25g/L、Li2S040. 1 ~0· 3g/L、KH2P04l. 0 ~2. 0g/L、K2HP04l. 0 ~ 2. 0g/L、MgS04 · 7H20 0· 4 ~0· 8g/L、NaCl 0· 4 ~0· 8g/L，pH 5 ~8,溶剂为水，最优选为葡 萄糖 40g/L、酵母膏 20g/L、Li2SO4O. 2g/L、KH2PO4L 5g/L、K2HPO4L 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 6g/ L、NaCl 0· 6g/L，pH 7. 0,溶剂为水。
[0017] 本发明所述用于制备六氢姜黄素的酶源按如下方法制备：
[0018] (1)斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜 面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~ 6g/L、（NH 4)2S043 ~8g/L、KH2PO4O. 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1 ~ 1.0 g/L、NaCl 0· 1 ~1.0 g/L、琼脂 20 ~40g/L，pH 5 ~8,溶剂为水；
[0019] (2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，在30°C、200rpm培 养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、 酵母膏 1 ~6g/L、（NH4)2S043 ~8g/L、KH2P040. 2 ~I. 5g/L、K2HP040. 2 ~I. 5g/L、MgS04 ·7Η20 0. 1~1.0 g/L、NaCl 0. 1~1.0 g/L，pH 5~8,溶剂为水；优选种子培养基终浓度组成为： 葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4) 2S044. 0g/L，KH2PO4L 0g/L，K2HPO4L Og/ L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，溶剂为水，pH 7· 0 ;
[0020] (3)发酵培养：以体积浓度10%接种量将种子液接种到装有IOOmL发酵培养基的 250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体即获得所述酶源；所述 发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、蛋白胨5~50g/L、（NH 4)2SO4O. 5~3. 0g/L、 K2HPO4L 0 ~4. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0· 2 ~I. 0g/L、NaCl 0· 2 ~I. 0g/L，pH 5 ~8,溶剂为 水；
[0021] 本发明所述酶源制备过程中用于高产六氢姜黄素的发酵培养的培养基优选为： 葡萄糖 30 ~40g/L、蛋白胨 15 ~25g/L、（NH4)2SO4O. 5 ~I. 5g/L、Κ2ΗΡ042· 5 ~3. 5g/L、 MgS04.7H20 0.4~0.8g/L、NaCl 0.4~0.8g/L，pH 5~8,溶剂为水，最优选为葡萄糖 35g/L，蛋白胨 20g/L，（NH4)2SO4L 0g/L，Κ2ΗΡ043· 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0· 6g/L， pH 7.0,溶剂为水。
[0022] 进一步，所述红球菌ZJPH1003在生物转化制备姜黄素衍生物中应用，具体为转化 制备八氢姜黄素的应用按如下步骤进行：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜 黄素置于PH值为5. 4~8. 0磷酸缓冲液中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化 反应36h，反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1 的正己烷、二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集R f值为0. 329时的洗脱 液，将洗脱液于50°C下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即八氢姜黄素；所述红球菌 ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 9~50. 5g/L转化体系，所述姜 黄素底物的初始浓度为50~200mg/L转化体系。
[0023] 进一步，所述红球菌ZJPH1003在生物转化制备姜黄素衍生物中应用，具体为转化 制备六氢姜黄素的应用按如下步骤进行：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜 黄素置于PH值为5. 8~7. 4磷酸缓冲液 中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化 反应24h，反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1 的正己烷、二氯甲烷和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集R f值为0. 505时的洗脱 液，将洗脱液于50°C下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即六氢姜黄素；所述红球菌 ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 9~50. 5g/L转化体系，所述姜 黄素底物的初始浓度为50~200mg/L转化体系。
[0024] 本发明所述经红球菌ZJPH1003湿菌体生物转化后获得的转化反应液（实验组）， 首先进行TLC法分析，与姜黄素标准品、对照组1 (转化反应体系中只加入底物，不加入酶 源）和对照组2 (转化反应体系中不加入底物，只加入酶源，用缓冲液补充体积）进行对 照，确定实验组的转化液中是否产生新斑点，如果产生新的斑点，则将转化液离心，取上清 液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至干，取旋蒸后所得浓缩物用色谱甲醇重新溶解、微 滤（0.45 μπι)处理后进行HPLC分析，确定是否出现新的特征峰（与姜黄素标准品、对照组 1和对照组2相比）。如果出现新的特征峰，将生物转化后获得的转化液离心，取上清液用 乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩后进行硅胶柱层析，收集R f值为0. 329的流出液，除去洗 脱剂，获得所述姜黄素衍生物之一；收集Rf值为〇. 505的流出液，除去洗脱剂，获得所述姜 黄素衍生物之二。分别采用高效液相色谱法分析其纯度。取纯度在95%以上的组分进行高 效液相色谱和质谱联用检测（LC-MS)， 1H-NMR和13C-NMR检测，鉴定其结构。
[0025] 本发明有益效果主要体现在：本发明利用红球菌ZJPH1003菌株静息细胞为催化 剂的生物转化方法对姜黄素进行结构修饰，由此获得相应的衍生物。姜黄素结构修饰物的 药理或生物活性较修饰前的姜黄素底物有不同程度的改善，有利于药物新制剂的开发；本 发明采用生物转化方法获得姜黄素衍生物的工艺过程较简单，环境友好，生物催化剂为微 生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉。与已报道的转化菌株相比，本发明菌种 催化转化姜黄素的底物浓度高，制备姜黄素衍生物的产率高。 (四）
【附图说明】
[0026] 图1本发明利用红球菌ZJPH1003微生物转化制备姜黄素衍生物的流程图。
[0027] 图2实施例1姜黄素转化产物的TLC图谱示意图，A为B的示意图，B为TLC图谱； 其中，1为实验组样品，2为姜黄素标准品，3为对照组1样品，4为对照组2样品；a，b为红 球菌ZJPH1003制备的姜黄素转化产物产生的斑点；c为姜黄素标准品产生的斑点；d为对 照组1样品产生的斑点。
[0028] 图3实施例1姜黄素转化产物的HPLC图谱：a为实验组样品；b为姜黄素标准品； c为对照组1样品；d为对照组2样品；峰1-峰7对应的出峰时间分别为A1= 12. 3min，12 =23. 0min? t3= 25. 6min? 14= 26. 4min? 15= 28. 6min? 16= 29. 9min? 17= 32. 7min? t ^ 龍=49. Omin
[0029] 图4实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的一级质谱图（MS)。
[0030] 图5实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的三级质谱图（MS3)。
[0031] 图6实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的核磁氢谱图（1H-NMR)。
[0032] 图7实施例1姜黄素转化产物4 (t = 26. 4min)的核磁碳谱图（13C-NMR)。
[0033] 图8实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的一级质谱图（MS)。
[0034] 图9实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的三级质谱图（MS3)。
[0035] 图10实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的核磁氢谱图（1H-NMR)。
[0036] 图11实施例1姜黄素转化产物6 (t = 29. 9min)的核磁碳谱图（13C-NMR)。 (五）
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0038] 实施例1 :姜黄素转化产物的制备
[0039] (1)斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，即得到 斜面菌种；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖l〇g/L，蛋白胨5. Og/L，酵母膏3. Og/L， (NH4) 2S044. Og/L，KH2PO4L Og/L，K2HPO4L Og/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，琼月旨 30g/ L，溶剂为水，pH 7. 0,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面；
[0040] (2)种子培养：从步骤（1)斜面菌体挑取一环菌体接种至装有IOOmL种子培养基 的250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养24h，制备得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为： 葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4) 2S044. 0g/L，KH2PO4L 0g/L，K2HPO4L Og/ L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，溶剂为水，ρΗ7· 0,121°C灭菌 20 分钟，灭菌后冷却；
[0041] (3)用于制备姜黄素衍生物酶源的初始发酵培养：以体积浓度10%接种量将种子 液（步骤⑵制备）接种到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养56h， 得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度为：葡萄糖5g/L、蛋白胨25g/L、酵 母膏 3g/L、甘油 2g/L、（NH4)2S043g/L、KH2P0 4l. 0g/L、K2HP042. 0g/L、MgS04 ·7Η20 0· 5g/L、NaCl 1.75g/L，pH 7.0,溶剂为水，pH 7.0，121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却。
[0042] (4)优化步骤（3)培养基成分，得到高产八氢姜黄素的酶源的发酵培养：以体积浓 度10%接种量将种子液（步骤⑵制备）接种到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中， 30°C、20〇rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度为：葡萄糖 40g/L，酵母膏 20g/L，Li2SO4O. 2g/L，KH2PO4L 5g/L，K2HPO4L 5g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0. 6g/L，溶剂为水，pH 7. 0,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却。
[0043] (5)优化步骤（3)培养基成分，得到高产六氢姜黄素的酶源的发酵培养：以体积 浓度10%接种量将种子液（步骤（2)制备）接种到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶 中，30°C、200rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度为：葡萄 糖 35g/L，蛋白胨 20g/L，（NH4)2SO4L 0g/L，Κ2ΗΡ043· 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0· 6g/ L，溶剂为水，pH 7. 0,121°C灭菌20分钟，灭菌后冷却。
[0044] (6)姜黄素的生物转化：
[0045] 实验组：将步骤（3)获得的湿菌体用0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液洗涤后，将湿菌 体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始 浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加量以菌体干重计为28. 9g/L转化体系。
[0046] 设置对照组1 (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0047] 设置对照组2 (不添加底物）：将步骤（3)获得的湿菌体加入到0. 1M，pH 6. 6的磷 酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体干重计为28. 9g/L反应体系。
[0048] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应36h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，待检测。
[0049] (7)分析检测
[0050] ①薄层层析检测（TLC):用毛细点样管分别吸取一定量的实验组样品、姜黄素标 准品（0.1 g姜黄素标准品用IOOrnl色谱甲醇溶解）、对照组1样品和对照组2样品，分别点样 于预活化的硅胶薄层板上，展层剂为正己烧：二氯甲烧：甲醇=2:18:1(￥八八），于254]1111 紫外灯下将实验组样品与对照组样品和标准品相比较，采用碘蒸气显色后观察是否产生新 的斑点。
[0051] ②高效液相色谱检测（HPLC):所有样品进样检测前先用0.45 μ m微孔滤膜过滤， 将实验组样品谱图与姜黄素标准品、对照组1样品和对照组2样品进行比对，观察是否出现 新的物质峰。
[0052] 色谱柱为 shim-pack VP-ODS (250 X Φ 4. 6mm, SHIMADZU)，检测波长：280nm，流速： 0. 5mL/min，进样量：10 μ L，流动相：乙腈-水，梯度洗脱条件如表1所示。
[0053] 表1 HPLC梯度洗脱条件
[0054]
[0055] 实验组样品经TLC检测出现两个新的斑点（见图2,点a (Rf值为0. 329)和点b (R f 值为0. 505)所示），HPLC法检测得到7个微生物转化产物（图3中的峰1-峰7所示），其 中HPLC图谱显示产物4 (t = 26. 4min，即TLC检测时Rf值为0. 329时出现的斑点）和产物 6 (t = 29. 9min，即TLC检测时Rf值为0. 505时出现的斑点）的峰面积较高，含量较多，为 红球菌ZJPH1003菌株的两个主要的姜黄素转化产物。
[0056] (8)转化产物的分离纯化：
[0057] 利用硅胶柱层析对上述两个主要的姜黄素转化产物（即转化液经离心、萃取、减 压浓缩后的浓缩物）进行分离。洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇（2:18:1 (v/v/v))梯度 洗脱，硅胶粒径为100~200目，硅胶型号为粗孔ZCX II ;采用湿法装柱，称取60g硅胶装于 直径2cm的层析柱中，流速控制在2mL/min ;洗脱液用TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 329 时的洗脱液，用HPLC法检测纯度（检测条件同步骤（5))，经过分离纯化，得到产物4(t = 26. 4min);收集Rf值为0. 505时的洗脱液，用HPLC法检测纯度（检测条件同步骤（5))，经 过分离纯化，得到产物6 (t = 2 9. 9min)，分别进行LC-MS^H-NMR和13C-NMR检测，并对其进 行结构鉴定。
[0058] 高效液相色谱和质谱联用检测（LC-MS):鞘气流速（arb) : 20 ;辅助气流速 (arb) :20 ;喷雾电压（kv) :3· 5 ;毛细管温度（°C ) :275。
[0059] 经鉴定，推断该转化产物4 (t = 26. 4min)为八氢姜黄素，其结构式为：
[0060]
[0061] 该化合物具有以下理化性质：白色粉末，推断其分子式为C21H28O 6。通过高分辨率 的EI-MS得到[M+H]+为377, [M-H] _为375,因此，可推断出其分子量为376,在（+)EI-MS 中，还出现两个个主要的分子离子峰，[M+Na]+为399, [Μ+Η-Η20]+为359。将m/z 359的 分子离子峰断裂，得到三级质谱（MS3)，其m/z分别为217,177,163,137。如图4和5所示。 1H-NMR 结果为=1H-NMR (3000MHz，CDCl3) : δ = 1. 41 (2H, m, H-4) ; δ = 1. 49 (4H, m, H-2, 6); δ = 2. 49 (2Η, m, H-l, 7) ； δ = 2. 50 (2Η, m, Η-1, 7) ； δ = 3. 31 (2Η, s, Η-〇Η) ； δ =3.72 (6H，m, H-OCH3) ;δ = 4.55 (2H，m，H-3, 5) ;δ = 6.56 (2H，d，H-2'）；δ = 6· 65 (2Η，dd，Η-6'）； δ = 6· 71 (2Η，dd，Η-5'）； δ = 8· 59 (2Η，s，H-ArOH)，如图 6 所示。 13C-NMR 结果为：6 31.4(〇1，(：-7)，40.0((：-2，(：-6)，43.3((：-4)，55.9(3，，3"0厘6)，72.4((：-3, C-5)，111. I (C-2，，C-2〃），114.4(05,，C-5" )，120.9(06,，C-6" )，133.8(01，，C-1")， 143.8(C-4'，C-4" )，146.5(C-3'，C-3")，如图 7 所示。
[0062] 经鉴定，推断转化产物6 (t = 29. 9min)为六氢姜黄素，其结构式为：
[0063]
[0064] 该化合物具有以下理化性质：白色结晶，推断其分子式为C21H26O6。通过高分辨率 的EI-MS得到[M+H]+为375, [M-H] _为373,因此，可推断出其分子量为374,在（+)EI-MS 中，还出现一个主要的分子离子峰，[Μ+Η-Η20]+为357。将m/z 357的分子离子峰断裂，得 到三级质谱（MS3)，其m/z分别为357, 339,177,163。如图8和9所示。1H-NMR结果为： 1H-NMR(MeOD) : δ =1.71 (2Η, m, H-2) ； δ = 2. 60 (4H, m, H-l, 7) ； δ = 2. 78 (4Η, m, Η-4, 6)； δ = 3.83 (3H，s, H-OCH3) ;δ = 3.84 (3H，s, H-OCH3) ;δ = 4.02 (Η, m，H-3) ;δ = 6· 62 (2Η，d，Η-6'）； δ = 6· 70 (2Η，dd，Η-5'）； δ = 6· 77 (2Η，s，Η-2'），如图 10 所示。 13C-NMR 结果为：δ 29. 3 (C-I)，31. 4 (C-7)，38. 3 (C-6)，45. 4 (C-2)，55. 9 (3,，3 " OMe)，66 ? 9(C-5)，llLl(C-2，，2" ),111. 3(C-2，，2" ),114. 4(C-5,/5" ),120. 7(C-6，，6" ),120.9 (C-6，，6" ),132. 5(C-1，，I" )，133.7(01，，I" ),143. 7 (C-4，，4" )，144.0(04,，4" ),146 ? 4(C-3'，3" ),146. 5(C-3'，3" ),211. 3(C-3)，如图 11 所示。
[0065] 据报道，八氢姜黄素和六氢姜黄素的生物活性和药理活性较底物姜黄素都得 到了较大的改善，稳定性也有所提高。例如=PfeifTer等人将六氢姜黄素和姜黄素同时 置于37°C，0.1 M pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中，放置24h后用HPLC检测两者的降解率，研 宄发现，姜黄素在Ih内降解率已达90%，而六氢姜黄素在24h之内都没有明显的降解 (Pfeiffer E，Hoehle S I,Walch S G，et al. Curcuminoids from reactive glucuronides in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007,55:538-544.)〇 八 氢姜黄素的抗氧化能力（AAPH法）高于姜黄素，且较姜黄素可更有效地抑制红细胞 膜脂质的过氧化。此外，八氢姜黄素和六氢姜黄素的抗氧化活性均高于姜黄素，其抗 氧化活性顺序依次为八氢姜黄素〉六氢姜黄素〉姜黄素 （Somparn P，Phisalaphong C，Nakornchai Sj et al. Comparative antioxidant activities of curcumin and its demethoxy and hydrogenated derivatives. Biological and Pharmaceutical Bulletin，2007,30(I):74-8. Feng JY，Liu ZQ. Phenolic and enolic hydroxyl groups in curcumin:which plays the major role in scavenging radicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57:11041-11046. Srimuangwong K，Tocharus C，Chintana P Y，et al.Hexahydrocurcumin enhances inhibitory effect of 5-fluorouracil on HT-29human colon cancer cells. World Journal of Gastroenterol ogy，2012, 18 (19) : 2383-2389.)。
[0066] 实施例2~7菌体浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0067] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体以 菌体干重计分别为 14. 4g/L、21. 6g/L、28. 9g/L、36. lg/L、43. 3g/L、50. 5g/L)(表2所示），底 物姜黄素终浓度为50mg/L，分别于30°C，200rpm转化36h。反应结束后，将转化液离心除去 菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸后所 得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面积归 一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表2。
[0068] 表2不同菌体浓度对转化产物4(t = 26. 4min)得率的影响
[0069]
[0070] 结论：从表2可知，较佳的菌体浓度为43. 3g/L。在此条件下姜黄素转化产物4的 得率为58. 90%，转化产物6的得率为19. 15%。
[0071 ] 实施例8~14转化液pH值对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0072] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH分别为5. 4~8. 0磷酸缓冲液（表3所示）的 50mL三角瓶中（湿菌体终浓度为43. 3g/L)，底物姜黄素浓度为50mg/L，于30°C，200rpm转 化36h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测 方法同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表3。
[0073] 表3不同转化液pH值对转化产物4 (t = 26. 4min)得率的影响
[0074]
[0075] 结论：从表3可知，较佳的转化液pH值为6. 6,在此条件下姜黄素转化产物4的得 率为58. 87 %，转化产物6的得率为23. 02 %。
[0076] 实施例15~20底物浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0077] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体 以菌体干重计为43. 3g/L)，底物姜黄素终浓度分别为10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、 200mg/L、250mg/L (表4所示），分别于30°C，200rpm转化36h。反应结束后，将转化液离心 除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸 后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面 积归一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表4。
[0078] 表4不同底物浓度对转化产物4 (t = 26. 4min)得率的影响
[0079]
[0080]
[0081] 结论：由表4可知，较佳的底物质量浓度为150mg/L。在此条件下姜黄素转化产物 4的得率为52. 18%，转化产物6的得率为15. 38%。
[0082] 实施例21~29转化时间对红球菌ZJPH1003转化制备产物4的影响
[0083] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（4)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体终 浓度为43. 3g/L)，底物姜黄素浓度为150mg/L，于30°C，200rpm转化6~54h (表5所示）。 反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩 至干，除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0.75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法 同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物4 (t = 26. 4min)的得率，结果见表5。
[0084] 表5不同转化时间对转化产物4(t = 26. 4min)得率的影响 [0085]
[0086] 结论：由" 5可知，较佳的"化时间为36h。*此条件下姜黄-转化产物4的得率 为59. 47 %，转化产物6的得率为16. 11 %。
[0087] 实施例30 :用于制备姜黄素转化产物6的发酵培养基组分的正交优化
[0088] 表6发酵培养基正交因素水平表
[0089]
[0091] 利用红球菌ZJPH1003菌株，按实施例1的方法进行斜面培养和种子培养后，按表 6设计的实验方案优化实施例1步骤（3)发酵培养基中蛋白胨、葡萄糖、（NH4)2SOjP K2HPO4 的浓度。将发酵后的湿菌体加入装有IOmL 0.1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿 菌体加入量以菌体干重计为28. 9g/L)，底物姜黄素终浓度为50mg/L，于30°C，200rpm转化 24h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于 50°C减压蒸馏除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，根 据面积归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的产率，结果见表7和表8。
[0092] 表7发酵培养基正交试验L9 (34)结果
[0093]
[0094] 注：ITi=KiAi
[0095] 表8发酵培养基正交试验方差分析
[0096]
[0098] 根据方差分析，蛋白胨浓度和葡萄糖浓度是影响产物6 (t = 29. 9min)得率非常显 著的因素，硫酸铵浓度是显著的因素，根据表7所示，四个因素的最佳配比为A2B 2C1D3，即蛋 白胨浓度20g/L，葡萄糖浓度35g/L，硫酸铵浓度1.0 g/L，磷酸氢二钾浓度3. Og/L。当采用 此配比的发酵培养基进行培养时，所收获的菌体按照实施例1中实验组的转化条件进行姜 黄素转化，转化为产物6的得率可达75. 21 %，转化为产物4的得率为8. 75%。
[0099] 实施例31~35转化液pH值对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0100] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH分别为5. 8~7. 4磷酸缓冲液（表9所示）的 50mL三角瓶中（湿菌体终浓度为28. 9g/L)，底物姜黄素浓度为50mg/L，于30°C，200rpm转 化24h。反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减 压浓缩至干除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测 方法同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的得率，结果见表9。 [0101] 表9不同转化液pH值对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0102]
[0103] 结论:从表9可以看出，较佳的转化液pH值为6. 6。在此条件下姜黄素转化产物6 的得率为73. 10 %，转化产物4的得率为9. 11 %。
[0104] 实施例36~41菌体浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0105] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体以 菌体干重计分别为 14. 4g/L、21. 6g/L、28. 9g/L、36. lg/L、43. 3g/L、50. 5g/L)(表 10 所示）， 底物姜黄素终浓度为50mg/L，分别于30°C，200rpm转化24h。反应结束后，将转化液离心除 去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸后 所得残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面积 归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的得率，结果见表10。
[0106] 表10不同菌体浓度对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0107]
[0108] 结论：λ表10可知，较佳的^体浓度为28. 9g/i。在此条件下姜^素转化产物6的 得率为74. 06 %，转化产物4的得率为7. 33 %。
[0109] 实施例42~46底物浓度对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0110] 利用红球菌（Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发 酵培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体 以菌体干重计为28. 9g/L)，底物姜黄素终浓度分别为10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、 200mg/L (表11所示），分别于30°C，200rpm转化24h。反应结束后，将转化液离心除去菌 体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干，旋蒸后所得 残留物再用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法同实施例1步骤（7)，根据面积归一 法计算产物6(t = 29. 9min)的得率，结果见表11。
[0111] 表11不同底物浓度对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0112]
[0113」
[0114] 结论：由表11可知，较佳的底物质量浓度为l〇〇mg/L。在此条件下姜黄素转化产 物6的得率为73. 20 %，转化产物4的得率为8. 93 %。
[0115] 实施例47~52转化时间对红球菌ZJPH1003转化制备产物6的影响
[0116] 利用红球菌（Rhodococcus sp. ) ZJPH1003菌株，按实施例1步骤（5)的方法经发酵 培养后，将湿菌体加入装有IOmL 0. 1M，pH 6. 6磷酸缓冲液的50mL三角瓶中（湿菌体终浓 度为28. 9g/L)，底物姜黄素浓度为100mg/L，于30°C，200rpm转化12~42h (表12所示）。 反应结束后，离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩 至干，除去乙酸乙酯，旋蒸后所得残留物再用0.75ml色谱甲醇重新溶解后检测，检测方法 同实施例1步骤（7)，根据面积归一法计算产物6 (t = 29. 9min)的得率，结果见表12。
[0117] 表12不同转化时间对转化产物6 (t = 29. 9min)得率的影响
[0118]
[0119] 结论：由表12可知，较佳的转化时间为24h。在此条件下姜黄素转化产物6的得 率为74. 48 %，转化产物4的得率为8. 09 %。
[0120] 实施例53 :约翰逊锁掷抱酵母（Sporidiobolus. johnsonii) AS 2. 1063对姜黄素 生物转化活性的考察
[0121] (1)约翰逊锁掷孢酵母（Sporidiobolus. johnsonii) AS 2. 1063购自中国科学院 微生物研宄所。
[0122] (2)斜面培养：将约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063接种至斜面培养基，30°C培养2~ 3天，获得斜面菌体；斜面培养基为麦芽汁培养基，每IL麦芽汁中添加琼脂20g，pH自然。
[0123] (3)种子培养：取斜面菌体接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液；种子培 养基组成：葡萄糖 30g/L，酵母膏 2. 0g/L，NH4Cl 6. 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，KH2PO4L Og/ L，K2HPO4L 0g/L，pH自然，溶剂为水。
[0124] (4)发酵培养：取种子液以体积浓度10%的接种量接种至装有IOOmL发酵培养基 的250mL摇瓶中，30°C培养24h，获得湿菌体；发酵培养基同种子培养基配方。
[0125] (5)姜黄素的生物转化：
[0126] 实验组：将约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063湿菌体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲 液中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加 量以菌体湿重计为200g/L转化体系。
[0127] 设置对照组I (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0128] 设置对照组2(不添加底物）：将约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063湿菌体加入到 0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为200g/L反应 体系。
[0129] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1中的HPLC 法进行检测，未检测到八氢姜黄素和六氢姜黄素产物。
[0130] 结论：约翰逊锁掷孢酵母AS 2. 1063不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和八氢 姜黄素。
[0131] 实施例54 :热带假丝酵母（Candida tropicalis) IFFI 01254对姜黄素生物转化 活性的考察
[0132] (1)热带假丝酵母（Candida tropicalis) IFFI 01254购自轻工部食品与发酵工 业研宄所。
[0133] (2)斜面培养：将热带假丝酵母IFFI 01254接种至斜面培养基，30°C培养2~3 天，获得斜面菌体；斜面培养基为麦芽汁培养基，每IL麦芽汁中添加琼脂20g，pH自然。
[0134] (3)种子培养：取斜面菌体接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液；种子培 养基组成：葡萄糖 30g/L，酵母膏 2. Og/L，NH4Cl 6. Og/L，MgSO4 · 7H20 0· 4g/L，KH2PO4L Og/ L，K2HPO4L Og/L，pH自然，溶剂为水。
[0135] (4)发酵培养：取种子液以体积浓度10%的接种量接种至装有IOOmL发酵培养基 的250mL摇瓶中，30°C培养24h，获得湿菌体；发酵培养基同种子培养基配方。
[0136] (5)姜黄素的生物转化：
[0137] 实验组：将热带假丝酵母IFFI 01254湿菌体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液 中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加量 以菌体湿重计为200g/L转化体系。
[0138] 设置对照组1 (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0139] 设置对照组2 (不添加底物）：将热带假丝酵母IFFI 01254湿菌体加入到0. 1M ， pH6. 6的磷酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为200g/L反应体系。
[0140] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1中的HPLC 法进行检测，未检测到八氢姜黄素和六氢姜黄素产物。
[0141] 结论：热带假丝酵母IFFI 01254不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和八氢姜 黄素。
[0142] 实施例55 :细菌耐酪氨酸冢村氏菌E105对姜黄素生物转化活性的考察
[0143] (1)耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens) El〇5 保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072,保藏编号为CCTCC NO. M209306,保藏日期2009年12月16日，该菌株已在先前的专利申请（申请号为 200910155776. X，申请日2009年12月25日）中公开。
[0144] (2)斜面培养：将耐酪氨酸冢村氏菌E105接种至斜面培养基，30°C培养2~ 3天，获得斜面菌体；斜面培养基组成：葡萄糖10g/L，蛋白胨5. Og/L，酵母膏2. Og/L， (NH4) 2S042. 0g/L，K2HP042. Og/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，琼月旨 20g/ L，pH 7.0,溶剂为水。
[0145] (3)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，30°C培养24h，获得种子液；种子培 养基组成：葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 2. 0g/L，（NH4)2S042. 0g/L，K2HP042. 0g/L， KH2PO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，pH 7. 0,溶剂为水。
[0146] (4)发酵培养：取种子液以体积浓度4%的接种量接种至装有80mL发酵培养基的 250mL摇瓶中，30°C培养36h，获得湿菌体；发酵培养基组成：葡萄糖15g/L，酵母膏12. Ig/ L，NH4Cl 9. 5g/L，Κ2ΗΡ042· 0g/L，KH2PO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 6g/L，pH 7. 0， 溶剂为水。
[0147] (5)姜黄素的生物转化：
[0148] 实验组：将耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中， 同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/L转化体系，湿菌体加量以菌 体湿重计为200g/L转化体系。
[0149] 设置对照组1 (不添加湿菌体）：将姜黄素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中 构成反应体系，使其终浓度为50mg/L反应体系。
[0150] 设置对照组2 (不添加底物）：将耐酪氨酸冢村氏菌E105湿菌体加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸盐缓冲液中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为200g/L反应体系。
[0151] 将各组实验反应体系在30°C、200rpm条件下转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C减压浓缩至干除去乙酸乙 酯，各组旋蒸后所得浓缩物用0. 75ml色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1中的HPLC 法进行检测，未检测到八氢姜黄素和六氢姜黄素产物。
[0152] 结论：细菌耐酪氨酸冢村氏菌E105不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和八氢 姜黄素。
【主权项】
1. 一种姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述的方法为：以红球菌ZJPH1003经发 酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值5. 4~8.O的磷酸缓冲液中构成转 化体系，在25~35°C、150~250rpm条件下进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行 后处理，获得姜黄素衍生物；所述湿菌体的用量以菌体干重计为14. 4~50. 5g/L转化体系， 所述姜黄素底物的初始浓度为10~250mg/L转化体系。2. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述转化反应液的后处理 方法为：反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去乙 酸乙酯，取浓缩物进行硅胶柱层析，TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 329和0. 505的洗脱液， 蒸除溶剂，分别获得八氢姜黄素和六氢姜黄素。3. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述湿菌体的用量以菌体 干重计为21. 6~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓度为50~250mg/L转化体 系。4. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述姜黄素衍生物的制备 方法为：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜黄素置于pH值为5. 4~8. 0磷酸 缓冲液中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化反应36h，反应结束后，将转化液 离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，将萃取液减压浓缩至干，除去乙酸 乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1的正己烷、二氯甲烷 和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 329时的洗脱液，将洗脱液于50°C 下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即八氢姜黄素；所述红球菌ZJPH1003发酵培养 获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 8~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓 度为50~200mg/L转化体系。5. 如权利要求1所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述姜黄素衍生物的制备 方法为：将红球菌ZJPH1003发酵培养获得的湿菌体和姜黄素置于pH值为5. 8~7. 4磷酸 缓冲液中构成转化体系，在30°C、200rpm条件下进行转化反应24h，反应结束后，将转化液 离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，将萃取液减压浓缩至干，除去乙酸 乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行硅胶柱层析，以体积比2:18:1的正己烷、二氯甲烷 和甲醇混合液为洗脱剂，TLC法跟踪检测，收集Rf值为0. 505时的洗脱液，将洗脱液于50°C 下水浴蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物，即六氢姜黄素；所述红球菌ZJPH1003发酵培养 获得的湿菌体的用量以菌体干重计为28. 8~50. 5g/L转化体系，所述姜黄素底物的初始浓 度为50~200mg/L转化体系。6. 如权利要求4所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述酶源按如下方法制 备： (1) 斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜面菌 体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~6g/ L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4 0? 2 ~I. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ I.Og/L、NaCl0? 1 ~I.Og/L、琼脂 20 ~40g/L，pH5 ~8,溶剂为水； (2) 种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，在30°C、200rpm培 养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~IOg/ L、酵母膏 1 ~6g/L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、 MgSO4 ? 7H200. 1 ~I.Og/L、NaCl0? 1 ~I.Og/L，pH5 ~8,溶剂为水； (3)发酵培养：以体积浓度5~15 %接种量将种子液接种到发酵培养基中，30 °C、 200rpm发酵培养56h，将发酵培养液离心，收集湿菌体，即获得所述酶源；所述发酵培养基 终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、酵母膏5~50g/L、Li2S040. 1~0? 5、KH2P040. 5~3.Og/ L、K2HPO4 0? 5 ~3.Og/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2 ~I.Og/L、NaCl0? 2 ~I.Og/L，pH5 ~8,溶剂 为水。7.如权利要求5所述姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于所述酶源按如下方法制 备： (1) 斜面培养：将红球菌ZJPH1003接种至斜面培养基，30°C培养3~4天，获得斜面菌 体，所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~6g/ L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4 0? 2 ~I. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ I. 0g/L、NaCl0? 1 ~I. 0g/L、琼脂 20 ~40g/L，pH5 ~8,溶剂为水； (2) 种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，在30°C、200rpm培养 24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵 母膏 1 ~6g/L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2P04 0? 2 ~I. 5g/L、K2HP04 0? 2 ~I. 5g/L、MgS04.7H20 0? 1 ~I. 0g/L、NaCl0? 1 ~I. 0g/L，pH5 ~8,溶剂为水； (3) 发酵培养：以体积浓度10%接种量将种子液接种到装有IOOmL发酵培养基的 250mL摇瓶中，30°C、200rpm培养56h，得到发酵液，离心，收集湿菌体即获得所述酶源；所述 发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5~50g/L、蛋白胨5~50g/L、（NH4)2SO4 0? 5~3. 0g/L、 K2HPO4 1. 0 ~4. 0g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2 ~I. 0g/L、NaCl0? 2 ~I. 0g/L，pH5 ~8,溶剂为 水。
【专利摘要】本发明公开了一种姜黄素衍生物的制备方法，所述的方法为：以红球菌ZJPH1003经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以姜黄素为底物，于pH值5.4～8.0的磷酸缓冲液中，在25～35℃、150～250rpm条件下进行转化反应，反应结束后将转化反应液进行后处理，获得姜黄素衍生物；本发明利用红球菌ZJPH1003菌株静息细胞转化方法对姜黄素进行结构修饰，由此获得相应的衍生物。姜黄素结构修饰物的药理或生物活性较修饰前的姜黄素底物有不同程度的改善，有利于药物新制剂的开发；本发明采用微生物转化方法获得姜黄素衍生物的工艺过程较简单，环境友好，生物催化剂为微生物菌体，可以自行发酵生产，质量稳定，成本低廉。
【IPC分类】C12R1/01, C12P7/22, C12P7/26
【公开号】CN104894173
【申请号】CN201410795155
【发明人】王普, 黄金, 罗杨春
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年12月18日
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