一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法
一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘蔗渣是一种重要的木质纤维类可再生原料，我国是世界上甘蔗种植量第三大的 国家，南方是中国主要种植甘蔗的地区，每年甘蔗总产量达到7000多万吨，同时会产生700 万吨的甘蔗渣。
[0003] 甘蔗渣中主要组分为纤维素、半纤维素和木质素。目前甘蔗渣的主要用途是燃烧 发电（轻工科技，2013,（11): 11-12·)、作为家畜饲料（中国专利申请号94113455. 5)、替 代传统的木材资源作为造纸和生产高密度材料（中国塑料，2008,（02) :57-61)、作为食用 菌的培养基（食用菌，1980,（02) : 12-16)、以及开发生产高附加值产品：如开发生产木糖醇 (科技通报，2004,（I) :37-41)、阿拉伯糖（氨基酸和生物资源，2009,（I) :8-12.)、糠醛（化 工科技市场，2001，（11) : 12-15)。中国专利CN 1060464C公布了用蔗渣碱木质素催化氧化 制备丁香醛和香兰素的方法。中国专利CN 103614435A公布了一种从甘蔗渣制备低聚木糖 的方法。
[0004] 丁二酸是工业上一种重要的C4平台化合物，在食品、医药、化学工业以及其他领 域都有着广泛的应用。目前文献报道的发酵生产丁二酸研宄所用的培养基碳源主要是葡萄 糖，开发价格低廉的碳源是降低发酵法生产丁二酸成本的途径之一。巴西Borge等报道用 稀硫酸酸解甘鹿澄，得到的糖液作为碳源，用A. succinogenes CIP 106512厌氧摇瓶发酵丁 二酸 24h，得到丁二酸的浓度最高为 22. 5g.L-1 (Industrial Microbiology and Biotechnol ogy，2011，38:1001-1011.)。徐蓉等用稀硫酸酸解甘蔗渣，再用纤维素酶水解预处理的残渣， 甘蔗渣水解液发酵丁二酸，得到20g. Γ1的丁二酸（化工进展，2013, 04:874-877.)。但用 这些方法发酵生产的丁二酸，产量较低，增加了后续提取的成本。本发明提供了一种甘蔗渣 高效水解和生产高浓度丁二酸的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用廉价甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法。
[0006] 所述发酵生产丁二酸的方法，是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、水解得到的水解糖液 作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后 的残渣（干重）作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批发酵生产丁二酸。
[0007] 所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本发明的一种实施方式中，是以榨糖工业废弃 物甘蔗渣为原料，将干的甘蔗渣粉碎，过20-40目筛，40-70°C烘干保存，用质量浓度为 0. 5-5 %的NaOH溶液，按固液比1:1-1:15 (w/v)，121 °C高温预处理甘蔗渣2-4h，过滤水洗得 甘蔗渣，45-70 °C烘干备用。
[0008] 所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本发明的一种实施方式中，稀碱预处理甘蔗渣后 的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯仿萃取，得到糠醛粗品。
[0009] 所述水解，在本发明的一种实施方式中，是将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为 3~10%的溶液，在纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶的协同作用下水解，水解温 度40-70°C，pH调至4. 0-6. 5,转速100-250r. mirT1，时间24-72h。水解后，经离心得水解糖 液，固体烘干即得甘蔗渣水解后的残渣。
[0010] 所述水解，在本发明的一种实施方式中，纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果胶 酶对每克底物的的添加量分别为：l〇-35FPU. g'SO-UOU. g'10-SOU· g-1和5-30U. g-1。
[0011] 所述甘蔗渣水解后的残渣，在本发明的一种实施方式中，添加量为8~18g. L'
[0012] 所述反复分批发酵或反复补料分批发酵，在本发明的一种实施方式中，是指采用 分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中甘蔗渣水 解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需 要接种，直接进行下一批次发酵。
[0013] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：（1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备 发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20~100g. Γ1; (2)在发酵培养基中添加 4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种，在温度35~40°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20~60h ; (3)发酵结束后静止，待发酵 液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发 酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0014] 所述步骤（1)的发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，包括：甘蔗渣水解液糖 浓度20~100g. L-1，玉米浆浓度10~30g. L-1，无水氯化钙浓度0. 05~0. 5g. L-1，磷酸氢二 钾浓度1~5g. Γ1，磷酸二氢钠浓度4~12g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 05~0. 5g. Γ1，硫化钠 浓度 0· 05 ~0· 5g. L 1O
[0015] 所述步骤（1)的发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，甘蔗渣水解液糖浓度 55g. L 1O
[0016] 所述步骤（2)的发酵，在本发明的一种实施方式中，通入C02/N2气体控制发酵过程 为厌氧条件，饱和似!10) 3控制发酵pH 5. 8~6. 5。
[0017] 所述步骤（2)的补料分批发酵，在本发明的一种实施方式中，是发酵培养基初始 糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g. Γ1时，开始补加甘蔗渣 水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. Γ1，发酵25-50h。
[0018] 所述步骤（2)的分批，在本发明的一种实施方式中，是发酵3-5个批次。
[0019] 所述琥泊酸放线杆菌，在本发明的一种实施方式中，是A. ssuccinogenes F3-21或 琥珀酸放线杆菌 CGMCC NO. 1593、CCTCC NO :M 2012036。
[0020] 所述步骤（3)中的发酵结束，在本发明的一种实施方式中，是指发酵液还原糖浓 度小于10g. I71或小于5g/L。
[0021] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：（1)甘蔗渣预处理：甘蔗渣粉碎 20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶液，按照固液比1:1~1:20 (w/ v)，121°C高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70°C烘干备用；（2) 甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加纤维素酶、木聚糖酶、 β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速100-250r. min-1的条 件下，水解24~72h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添 加量分别为：1〇~35FPU. g'50~120U. g'10~80U. g4和5~30U. g'离心，得甘蔗渣 水解糖液和甘蔗渣水解残渣；（3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培 养，发酵培养基组成为：甘蔗渣水解液糖浓度20-100g. Γ1，玉米浆浓度10-30g. Γ1，无水氯 化妈浓度0. 05-0. 5g. I71，磷酸氢二钾浓度l-5g. I71，磷酸二氢钠浓度4-12g. I71，六水氯化镁 浓度0.05-0.58.171，硫化钠浓度0.05-0.58.17 1;在发酵培养基中添加4~2(^丄_1的甘蔗渣 水解后的残渣（以干重计），然后按5~10%的接种量接种种子液，在温度35~40°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下，发酵20~60h ;发酵结束后静止，待发酵液中的甘蔗渣水解残渣 下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直 接进行下一批次发酵。
[0022] 本发明还要求保护根据所述方法得到的丁二酸及其在食品、化学和制备药物方面 的应用。
[0023] 本发明还提供了一种综合利用甘蔗渣的方法，所述方法包括：（1)甘蔗渣经粉碎、 稀碱预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液 中添加4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复 补料分批发酵生产丁二酸；（2)稀碱预处理甘蔗渣后的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯 仿萃取，得到糠醛粗品。具体可参见上述发酵生产丁二酸的方法。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] (1)实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，用4~20g. Γ1的甘蔗渣水解残渣作为菌 体附着载体循环发酵丁二酸，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵 效率。（常规发酵中，种子培养12_24h，种子培养基一般含10g. L 1以上的酵母霄，种子约占 原料成本的2-5% )。同时，反复批次发酵能够进行，3批次循环分批发酵的丁二酸浓度均 值 为35g. Γ1左右，平均生产强度为I. 65g. L 乂 1Γ1，平均糖酸转化率为0. 81g. g4，整个发酵系 统运行64h，没有下降的趋势。
[0026] (2)本发明的工艺，对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适 合工业化生产。
[0027] (3)采用了不与人争粮的廉价的榨糖工业废弃物甘蔗渣为发酵原料，多酶组合水 解甘蔗渣，达到了 90%的总纤维素水解率，与报道的酸处理法相比，用稀碱预处理、结合多 酶协同水解，提高了甘蔗渣的水解糖含量，提高了水解液发酵产丁二酸的浓度。同时通过补 料分批发酵，丁二酸的浓度达到71g. Γ1，丁二酸对甘蔗渣的产率为0. 46g. g'
[0028] (4)本发明对于降低丁二酸的生产成本，缓解丁二酸产品对石化原料的依赖，促进 农业废弃物资源的利用，保护环境，实现可持续循环经济发展有积极经济和社会意义。
【附图说明】
[0029] 图1 :甘蔗渣发酵丁二酸工艺路线；
[0030] 图2 :多酶协同水解预处理甘蔗渣时间曲线；
[0031] 图3 :甘蔗渣水解液作为碳源补料分批发酵丁二酸的过程曲线；
[0032] 图4 :带渣3L发酵罐反复分批发酵丁二酸。
【具体实施方式】
[0033] 残糖和有机酸测定：预处理甘蔗渣水解液中各种糖浓度（葡萄糖、木糖、纤维二 糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸等）的测定、及发酵液中的残糖和有机酸的浓度采用高效液相色谱 法测定，详见CN 101603059A专利。
[0034] 实施例1 :稀碱预处理甘蔗渣
[0035] 取20g粉碎后烘干的甘蔗澄，与质量浓度为1 %的NaOH溶液300mL混勾，在121 °C 高温预处理甘蔗渣2h，过滤水洗得甘蔗渣至中性，65°C烘干，得到13g预处理的甘蔗渣，重 量损失35%，总纤维素含量为87. 6%，其成分如表1。
[0036] 表1为NREL法测得碱预处理甘蔗渣的组分
[0037]
[0038] 实施例2 :多酶协同水解碱处理后的甘蔗渣
[0039] 称取其中3g碱预处理好的甘蔗渣，转入150mL的三角瓶中，加入纤维素酶25FPU. g4,木聚糖酶85U. g4, β -葡聚糖酶40U. g4,果胶酶25U. g4,加入pH5. 0的朽1檬酸酸缓冲液， 定容至40mL，在50°C下水浴摇床上进行水解40h，每隔4h小时取一次样。多酶协同水解时 间图2。水解40h结束，水解液中还原糖浓度为65. 6g. I71，甘蔗渣的总纤维素水解效率最高 达到90%，甘蔗渣水解液中葡萄糖的浓度为45. 06g. I71，木糖浓度为14. 92g. I71，葡糖醛酸 的浓度为5. 62g. I71，葡萄糖和木糖的浓度比接近3:1。多酶协同水解预处理甘蔗渣时间曲 线如图2所示。
[0040] 实施例3 :甘蔗渣水解液补料发酵生产丁二酸
[0041] 菌株：瑭泊酸放线杆菌（Actinobacillu ssuccinogenes F3-21)。培养基：甘鹿 渣水解液糖浓度55g. Γ1，玉米浆浓度25g. Γ1，无水氯化钙浓度0. 2g. Γ1，磷酸氢二钾浓度 2g. Γ1，磷酸二氢钠浓度9. 6g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 2g. Γ1，硫化钠浓度0. lg. Γ1，pH调至 6. 0,121°C 灭菌 20min。
[0042] 在3L搅拌发酵罐上，采用补料分批发酵，初始的甘蔗渣水解糖液的浓度为55g. ΙΛ当发酵液中残糖浓度降为20g. Γ1时，用蠕动泵流加总还原糖浓度为200g. L4的浓缩的 甘蔗渣水解糖液，使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. L'发酵20-26h时，生产强度可以 保持在I. 7g. ΙΛ h'发酵50小时，产丁二酸71g. Γ1，糖酸转化率为0. 82g. g'生产强度为 1.42g. ?ΛΙΓ1。结果如图3所示。
[0043] 实施例4 :甘蔗渣残渣（SBR)作为吸附载体循环发酵丁二酸
[0044] 发酵培养基同实施例3，且添加量10g. Γ1的SBR (干物质量，在80 °C烘干至恒重）。 发酵培养基121°C灭菌20min，接入5% (v/v)种子液，于37°C发酵，发酵罐的转速为150r. mirT1，用饱和NaHCO3控制pH为6. 2左右，当糖浓度降低到5mg/L以下时，结束本批发酵。每 批次发酵结束，将发酵液静置2-4h直至甘蔗渣自然沉降到发酵罐的底部，用蠕动泵将发酵 上清液泵出来，再将新鲜的培养基泵入发酵罐，每批次的发酵体系为1L，反复循环操作直至 发酵结束。
[0045] 3批次循环分批发酵，结果如表2和图4。丁二酸浓度均值为35g. Γ1左右，丁二酸 的平均生产强度为I. 65g. L'tT1，平均糖酸转化率为0. 81g. P，整个发酵系统运行64h，没 有下降的趋势。
[0046] 表2带渣循环分批发酵丁二酸的结果
[0047]
[0049] 实施例5 :甘蔗渣稀碱预处理液中糠醛含量
[0050] 按实施例1的方法，进行甘蔗渣预处理，将得到的预处理液用硫酸调节pH至3.0 左右。取50mL的预处理液与50mL的氯仿（体积比1:1)室温下进行摇晃混勾30min，静置 5h。取有机相，在276nm处测定糠醛的含量，计算得出100g甘蔗渣的处理液中，含有2. 6g 糠醛。
[0051] 实施例6 :甘蔗渣残渣（SBR)添加量对循环发酵丁二酸的影响
[0052] 按施例4的方法，配置发酵培养基，在IOOmL三角瓶中分别添加 SBR，用量依次为 0· lg、0. 15g、0. 20g、0. 25g、0. 3g、0. 35g、0. 40g、0. 45g、0. 50g，调节发酵液的 pH 至 6. 5,加水 定容至25mL，121°C灭菌20min，接入5% (v/v)种子液，37°C厌氧摇瓶发酵，静置分层，倒出 液体，测发酵液中丁二酸的浓度，并补加灭过菌的发酵培养基，反复分批发酵三次，结果如 表3〇
[0053] 表3不同SBR浓度对发酵丁二酸含量（g. Γ1)的影响
[0054]
[0055] 实施例7 :反复补料分批发酵生产丁二酸
[0056] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0057] (1)甘蔗预处理；甘蔗渣粉碎20-60目筛，70°C烘干，用质量浓度为5%的NaOH溶 液，按照固液比I: I (w/v)，高温预处理甘蔗渣lh，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45°C烘干 备用；预处理后总纤维素含量为86. 8% ;
[0058] (2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3 %的溶液，添加纤维素酶、木 聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40°C，pH调至6. 5,转速100-250r. mirT1的条件下， 水解72h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添加量分别为： 10FPU. g'50U. g'10U. g4和5U. g、离心，得甘蔗渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣；水解液 中还原糖浓度为60. 6g. L'
[0059] (3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培养，发酵培养基组成 为：甘蔗渣水解液糖浓度100g. Γ1，玉米浆浓度30g. Γ1，无水氯化钙浓度0. 05g. Γ1，磷酸氢 二钾浓度Ig. Γ1，磷酸二氢钠浓度12g. I71，六水氯化镁浓度0. 5g. I71，硫化钠浓度0. 05g. I^1;在发酵培养基中添加8g. LH的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5%的接种量接种琥珀酸放 线杆菌CGMCC NO. 1593种子液，在温度40°C、pH 6. 5的厌氧条件下发酵；当发酵液中还原糖 浓度低于20g. Γ1时，开始补加甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10-20g. L Λ 发酵40h ;发酵结束后静止I. 5h，发酵液中的甘蔗渣水解残渣下沉至发酵罐底部，然后转移 上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。反复 分批发酵5次。
[0060] 结果显示，反复分批发酵的丁二酸浓度均值为58g. Γ1左右，丁二酸的平均生产强 度为I. 61g. L'tT1，平均糖酸转化率为0. 80g. g'整个发酵系统运行过程中没有下降的趋 势。
[0061] 实施例8 :反复分批发酵生产丁二酸
[0062] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0063] (1)甘蔗渣预处理；甘蔗渣粉碎20-60目筛，40°C烘干，用质量浓度为0.5%的 NaOH溶液，按照固液比1:20 (w/v)，121°C高温预处理甘蔗渣4h，过滤水洗得到预处理的甘 蔗渣，70°C烘干备用；预处理后总纤维素含量为84.6% ;
[0064] (2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为10%的溶液，添加纤维素酶、木 聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度70°C，pH调至4. 0,转速100-250r. HiirT1的条件下， 水解24h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添加量分别为： 35FPU. g'UOU. g'SOU. g-1和30U. g-1;离心，得甘蔗渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣；水解 液中还原糖浓度为62. 8g. Γ1，甘蔗渣的总纤维素水解效率最高达到89%，甘蔗渣水解液中 葡萄糖的 浓度为42. 86g. Γ1，木糖浓度为14. 32g. Γ1，葡糖醛酸的浓度为5. 62g. Γ1，葡萄糖 和木糖的浓度比接近3:1。
[0065] (3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培养，发酵培养基组成 为：甘蔗渣水解液糖浓度20g. Γ1，玉米浆浓度10g. Γ1，无水氯化钙浓度0. 5g. Γ1，磷酸氢二 钾浓度5g. Γ1，磷酸二氢钠浓度4g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 05g. Γ1，硫化钠浓度0. 5g. L_S在 发酵培养基中添加4g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按10%的接种量接种琥珀酸放线杆 菌CCTCC NO :M 2012036种子液，在温度35°C、pH 5. 8的厌氧条件下发酵，当残糖浓度低于 5g/L时发酵结束，然后静止，待发酵液中的甘蔗渣水解残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清 液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。反复分批 发酵4次。
[0066] 结果显示，反复分批发酵3次，丁二酸浓度均值分别为35. 2、33. 2、30g. Γ1，平均为 32. 8g. Γ1左右，丁二酸的平均生产强度为I. 54g.厂1.1Γ1，平均糖酸转化率为0. 80g. g4,整个 发酵系统运行过程中没有下降的趋势。
[0067] 实施例9 :反复分批发酵生产丁二酸
[0068] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0069] (1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓 度50g. Γ1; (2)在发酵培养基中添加12g. LH的甘蔗渣水解后的残渣，然后按8%的接种量 接种，在温度38°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下发酵20h ; (3)发酵结束后静止，待发酵液中 甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培 养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0070] 3批次循环分批发酵结果显示，丁二酸浓度均值为32. 6g. Γ1左右，丁二酸的平均 生产强度为I. 64g. L'tT1，平均糖酸转化率为0. 82g. P，整个发酵系统运过程中没有下降 的趋势。
[0071] 实施例10 :反复分批发酵生产丁二酸
[0072] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0073] (1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓 度SOg.!/ 1; (2)在发酵培养基中添加20g. LH的甘蔗渣水解后的残渣，然后按8%的接种量 接种，在温度38°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g. Γ1 时，开始补加甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. Γ1，发酵60h ; (3)发酵 结束后静止，待发酵液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发 酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0074] 5批次循环分批发酵结果显示，丁二酸的平均生产强度为I. 58g. L'tT1，整个发酵 系统运过程中没有明显下降的趋势。
[0075] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、 水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4~ 20g?I71的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批 发酵生产丁二酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反复分批发酵或反复补料分批发酵， 是指采用分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中 甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜培养基， 不需要接种，直接进行下一批次发酵。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)以甘蔗渣水解糖液 为碳源，制备发酵培养基，培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20~100g吨4; (2)在发酵培养基 中添加4~20g?I71的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种，在温度35~ 40°C、pH5. 8~6. 5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20~60h; (3)发酵结束后静 止，待发酵液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加 入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)的补料分批发酵是发酵培养 基初始糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g吨4时，开始补加 甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g?L'发酵25-50h。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是：甘蔗渣水解液糖浓度 20~100g?L-1，玉米浆浓度10~30g?L-1，无水氯化钙浓度0. 05~0. 5g?L-1，磷酸氢二钾 浓度1~5g?I71，磷酸二氢钠浓度4~12g?I71，六水氯化镁浓度0. 05~0. 5g?I71，硫化 钠浓度〇? 05~0? 5g?L'6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解糖液和甘蔗渣水解后的残渣 的制备方法是：甘蔗渣粉碎20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶 液，按照固液比1:1~l:20(w/v)，高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘 蔗渣，45-70°C烘干备用；然后将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加 纤维素酶、木聚糖酶、0 -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速 100-250r?HiirT1的条件下，水解24~72h;其中纤维素酶、木聚糖酶、0 -葡聚糖酶和果胶 酶对每克甘蔗渣的添加量分别为：1〇~35FPU?g'50~120U?g'10~80U?glP5~ 30U?g、离心，得甘蔗渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)甘蔗渣预处理：甘 蔗渣粉碎20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶液，按照固液比1:1~ 1:20 (w/v)，高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70°C烘干备用； (2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加纤维素酶、木聚糖 酶、0 -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速100-250r.mirT1的 条件下，水解24~72h;其中纤维素酶、木聚糖酶、0 -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添 加量分别为：1〇~35FPU.g'SO~120U.g'lO~80U.g-1和5~30U.g-1;离心，得甘鹿 渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣；(3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵 培养，发酵培养基组成为：甘蔗渣水解液糖浓度20-100g吨'玉米浆浓度10-30g吨'无水 氯化1?浓度0. 05-0. 5g吨'磷酸氢二钾浓度l-5g吨'磷酸二氢钠浓度4-12g 六水氯 化镁浓度0. 05-0. 5g吨4，硫化钠浓度0. 05-0. 5g ;在发酵培养基中添加4~20g?L―1的 甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种种子液，在温度35~40°C、pH5. 8~ 6. 5的厌氧条件下，分批发酵或补料分批发酵20~60h;发酵结束后静止，待发酵液中的甘 蔗渣水解残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不 需要接种，直接进行下一批次发酵。8. 根据权利要求1-7任一所述方法得到的丁二酸。9. 权利要求8所述丁二酸在食品、化学和制备药物方面的应用。10. -种综合利用甘蔗渣的方法，其特征在于，所述方法包括：（1)甘蔗渣经粉碎、稀碱 预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添 加4~20g?I71的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补 料分批发酵生产丁二酸；（2)稀碱预处理甘蔗渣后的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯仿 萃取，得到糠醛粗品。
【专利摘要】本发明公开了一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法是以榨糖工业的主要副产物甘蔗渣为原料，经过粉碎，稀碱预处理，以及纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶的共同水解，得到水解糖液；利用琥珀酸放线杆菌发酵水解糖液生产丁二酸，同时在发酵液中添加甘蔗渣水解的残渣，使得发酵可以反复运行，节省种子培养，而且可以用有机溶剂萃取稀碱预处理后的残液中的糠醛。本发明方法，实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵效率，同时对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适合工业化生产。
【IPC分类】C12P7/46, C12R1/01, C07D307/50
【公开号】CN104894174
【申请号】CN201510387997
【发明人】郑璞, 淘声涛, 查鑫华
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月3日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 甘蔗渣是一种重要的木质纤维类可再生原料，我国是世界上甘蔗种植量第三大的 国家，南方是中国主要种植甘蔗的地区，每年甘蔗总产量达到7000多万吨，同时会产生700 万吨的甘蔗渣。
[0003] 甘蔗渣中主要组分为纤维素、半纤维素和木质素。目前甘蔗渣的主要用途是燃烧 发电（轻工科技，2013,（11): 11-12·)、作为家畜饲料（中国专利申请号94113455. 5)、替 代传统的木材资源作为造纸和生产高密度材料（中国塑料，2008,（02) :57-61)、作为食用 菌的培养基（食用菌，1980,（02) : 12-16)、以及开发生产高附加值产品：如开发生产木糖醇 (科技通报，2004,（I) :37-41)、阿拉伯糖（氨基酸和生物资源，2009,（I) :8-12.)、糠醛（化 工科技市场，2001，（11) : 12-15)。中国专利CN 1060464C公布了用蔗渣碱木质素催化氧化 制备丁香醛和香兰素的方法。中国专利CN 103614435A公布了一种从甘蔗渣制备低聚木糖 的方法。
[0004] 丁二酸是工业上一种重要的C4平台化合物，在食品、医药、化学工业以及其他领 域都有着广泛的应用。目前文献报道的发酵生产丁二酸研宄所用的培养基碳源主要是葡萄 糖，开发价格低廉的碳源是降低发酵法生产丁二酸成本的途径之一。巴西Borge等报道用 稀硫酸酸解甘鹿澄，得到的糖液作为碳源，用A. succinogenes CIP 106512厌氧摇瓶发酵丁 二酸 24h，得到丁二酸的浓度最高为 22. 5g.L-1 (Industrial Microbiology and Biotechnol ogy，2011，38:1001-1011.)。徐蓉等用稀硫酸酸解甘蔗渣，再用纤维素酶水解预处理的残渣， 甘蔗渣水解液发酵丁二酸，得到20g. Γ1的丁二酸（化工进展，2013, 04:874-877.)。但用 这些方法发酵生产的丁二酸，产量较低，增加了后续提取的成本。本发明提供了一种甘蔗渣 高效水解和生产高浓度丁二酸的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用廉价甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法。
[0006] 所述发酵生产丁二酸的方法，是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、水解得到的水解糖液 作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后 的残渣（干重）作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批发酵生产丁二酸。
[0007] 所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本发明的一种实施方式中，是以榨糖工业废弃 物甘蔗渣为原料，将干的甘蔗渣粉碎，过20-40目筛，40-70°C烘干保存，用质量浓度为 0. 5-5 %的NaOH溶液，按固液比1:1-1:15 (w/v)，121 °C高温预处理甘蔗渣2-4h，过滤水洗得 甘蔗渣，45-70 °C烘干备用。
[0008] 所述甘蔗渣粉碎、稀碱预处理，在本发明的一种实施方式中，稀碱预处理甘蔗渣后 的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯仿萃取，得到糠醛粗品。
[0009] 所述水解，在本发明的一种实施方式中，是将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为 3~10%的溶液，在纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶的协同作用下水解，水解温 度40-70°C，pH调至4. 0-6. 5,转速100-250r. mirT1，时间24-72h。水解后，经离心得水解糖 液，固体烘干即得甘蔗渣水解后的残渣。
[0010] 所述水解，在本发明的一种实施方式中，纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和果胶 酶对每克底物的的添加量分别为：l〇-35FPU. g'SO-UOU. g'10-SOU· g-1和5-30U. g-1。
[0011] 所述甘蔗渣水解后的残渣，在本发明的一种实施方式中，添加量为8~18g. L'
[0012] 所述反复分批发酵或反复补料分批发酵，在本发明的一种实施方式中，是指采用 分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中甘蔗渣水 解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需 要接种，直接进行下一批次发酵。
[0013] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：（1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备 发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20~100g. Γ1; (2)在发酵培养基中添加 4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种，在温度35~40°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20~60h ; (3)发酵结束后静止，待发酵 液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发 酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0014] 所述步骤（1)的发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，包括：甘蔗渣水解液糖 浓度20~100g. L-1，玉米浆浓度10~30g. L-1，无水氯化钙浓度0. 05~0. 5g. L-1，磷酸氢二 钾浓度1~5g. Γ1，磷酸二氢钠浓度4~12g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 05~0. 5g. Γ1，硫化钠 浓度 0· 05 ~0· 5g. L 1O
[0015] 所述步骤（1)的发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，甘蔗渣水解液糖浓度 55g. L 1O
[0016] 所述步骤（2)的发酵，在本发明的一种实施方式中，通入C02/N2气体控制发酵过程 为厌氧条件，饱和似!10) 3控制发酵pH 5. 8~6. 5。
[0017] 所述步骤（2)的补料分批发酵，在本发明的一种实施方式中，是发酵培养基初始 糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g. Γ1时，开始补加甘蔗渣 水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. Γ1，发酵25-50h。
[0018] 所述步骤（2)的分批，在本发明的一种实施方式中，是发酵3-5个批次。
[0019] 所述琥泊酸放线杆菌，在本发明的一种实施方式中，是A. ssuccinogenes F3-21或 琥珀酸放线杆菌 CGMCC NO. 1593、CCTCC NO :M 2012036。
[0020] 所述步骤（3)中的发酵结束，在本发明的一种实施方式中，是指发酵液还原糖浓 度小于10g. I71或小于5g/L。
[0021] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：（1)甘蔗渣预处理：甘蔗渣粉碎 20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶液，按照固液比1:1~1:20 (w/ v)，121°C高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70°C烘干备用；（2) 甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加纤维素酶、木聚糖酶、 β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速100-250r. min-1的条 件下，水解24~72h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添 加量分别为：1〇~35FPU. g'50~120U. g'10~80U. g4和5~30U. g'离心，得甘蔗渣 水解糖液和甘蔗渣水解残渣；（3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培 养，发酵培养基组成为：甘蔗渣水解液糖浓度20-100g. Γ1，玉米浆浓度10-30g. Γ1，无水氯 化妈浓度0. 05-0. 5g. I71，磷酸氢二钾浓度l-5g. I71，磷酸二氢钠浓度4-12g. I71，六水氯化镁 浓度0.05-0.58.171，硫化钠浓度0.05-0.58.17 1;在发酵培养基中添加4~2(^丄_1的甘蔗渣 水解后的残渣（以干重计），然后按5~10%的接种量接种种子液，在温度35~40°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下，发酵20~60h ;发酵结束后静止，待发酵液中的甘蔗渣水解残渣 下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直 接进行下一批次发酵。
[0022] 本发明还要求保护根据所述方法得到的丁二酸及其在食品、化学和制备药物方面 的应用。
[0023] 本发明还提供了一种综合利用甘蔗渣的方法，所述方法包括：（1)甘蔗渣经粉碎、 稀碱预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液 中添加4~20g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复 补料分批发酵生产丁二酸；（2)稀碱预处理甘蔗渣后的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯 仿萃取，得到糠醛粗品。具体可参见上述发酵生产丁二酸的方法。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] (1)实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，用4~20g. Γ1的甘蔗渣水解残渣作为菌 体附着载体循环发酵丁二酸，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵 效率。（常规发酵中，种子培养12_24h，种子培养基一般含10g. L 1以上的酵母霄，种子约占 原料成本的2-5% )。同时，反复批次发酵能够进行，3批次循环分批发酵的丁二酸浓度均 值 为35g. Γ1左右，平均生产强度为I. 65g. L 乂 1Γ1，平均糖酸转化率为0. 81g. g4，整个发酵系 统运行64h，没有下降的趋势。
[0026] (2)本发明的工艺，对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适 合工业化生产。
[0027] (3)采用了不与人争粮的廉价的榨糖工业废弃物甘蔗渣为发酵原料，多酶组合水 解甘蔗渣，达到了 90%的总纤维素水解率，与报道的酸处理法相比，用稀碱预处理、结合多 酶协同水解，提高了甘蔗渣的水解糖含量，提高了水解液发酵产丁二酸的浓度。同时通过补 料分批发酵，丁二酸的浓度达到71g. Γ1，丁二酸对甘蔗渣的产率为0. 46g. g'
[0028] (4)本发明对于降低丁二酸的生产成本，缓解丁二酸产品对石化原料的依赖，促进 农业废弃物资源的利用，保护环境，实现可持续循环经济发展有积极经济和社会意义。
【附图说明】
[0029] 图1 :甘蔗渣发酵丁二酸工艺路线；
[0030] 图2 :多酶协同水解预处理甘蔗渣时间曲线；
[0031] 图3 :甘蔗渣水解液作为碳源补料分批发酵丁二酸的过程曲线；
[0032] 图4 :带渣3L发酵罐反复分批发酵丁二酸。
【具体实施方式】
[0033] 残糖和有机酸测定：预处理甘蔗渣水解液中各种糖浓度（葡萄糖、木糖、纤维二 糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸等）的测定、及发酵液中的残糖和有机酸的浓度采用高效液相色谱 法测定，详见CN 101603059A专利。
[0034] 实施例1 :稀碱预处理甘蔗渣
[0035] 取20g粉碎后烘干的甘蔗澄，与质量浓度为1 %的NaOH溶液300mL混勾，在121 °C 高温预处理甘蔗渣2h，过滤水洗得甘蔗渣至中性，65°C烘干，得到13g预处理的甘蔗渣，重 量损失35%，总纤维素含量为87. 6%，其成分如表1。
[0036] 表1为NREL法测得碱预处理甘蔗渣的组分
[0037]
[0038] 实施例2 :多酶协同水解碱处理后的甘蔗渣
[0039] 称取其中3g碱预处理好的甘蔗渣，转入150mL的三角瓶中，加入纤维素酶25FPU. g4,木聚糖酶85U. g4, β -葡聚糖酶40U. g4,果胶酶25U. g4,加入pH5. 0的朽1檬酸酸缓冲液， 定容至40mL，在50°C下水浴摇床上进行水解40h，每隔4h小时取一次样。多酶协同水解时 间图2。水解40h结束，水解液中还原糖浓度为65. 6g. I71，甘蔗渣的总纤维素水解效率最高 达到90%，甘蔗渣水解液中葡萄糖的浓度为45. 06g. I71，木糖浓度为14. 92g. I71，葡糖醛酸 的浓度为5. 62g. I71，葡萄糖和木糖的浓度比接近3:1。多酶协同水解预处理甘蔗渣时间曲 线如图2所示。
[0040] 实施例3 :甘蔗渣水解液补料发酵生产丁二酸
[0041] 菌株：瑭泊酸放线杆菌（Actinobacillu ssuccinogenes F3-21)。培养基：甘鹿 渣水解液糖浓度55g. Γ1，玉米浆浓度25g. Γ1，无水氯化钙浓度0. 2g. Γ1，磷酸氢二钾浓度 2g. Γ1，磷酸二氢钠浓度9. 6g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 2g. Γ1，硫化钠浓度0. lg. Γ1，pH调至 6. 0,121°C 灭菌 20min。
[0042] 在3L搅拌发酵罐上，采用补料分批发酵，初始的甘蔗渣水解糖液的浓度为55g. ΙΛ当发酵液中残糖浓度降为20g. Γ1时，用蠕动泵流加总还原糖浓度为200g. L4的浓缩的 甘蔗渣水解糖液，使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. L'发酵20-26h时，生产强度可以 保持在I. 7g. ΙΛ h'发酵50小时，产丁二酸71g. Γ1，糖酸转化率为0. 82g. g'生产强度为 1.42g. ?ΛΙΓ1。结果如图3所示。
[0043] 实施例4 :甘蔗渣残渣（SBR)作为吸附载体循环发酵丁二酸
[0044] 发酵培养基同实施例3，且添加量10g. Γ1的SBR (干物质量，在80 °C烘干至恒重）。 发酵培养基121°C灭菌20min，接入5% (v/v)种子液，于37°C发酵，发酵罐的转速为150r. mirT1，用饱和NaHCO3控制pH为6. 2左右，当糖浓度降低到5mg/L以下时，结束本批发酵。每 批次发酵结束，将发酵液静置2-4h直至甘蔗渣自然沉降到发酵罐的底部，用蠕动泵将发酵 上清液泵出来，再将新鲜的培养基泵入发酵罐，每批次的发酵体系为1L，反复循环操作直至 发酵结束。
[0045] 3批次循环分批发酵，结果如表2和图4。丁二酸浓度均值为35g. Γ1左右，丁二酸 的平均生产强度为I. 65g. L'tT1，平均糖酸转化率为0. 81g. P，整个发酵系统运行64h，没 有下降的趋势。
[0046] 表2带渣循环分批发酵丁二酸的结果
[0047]
[0049] 实施例5 :甘蔗渣稀碱预处理液中糠醛含量
[0050] 按实施例1的方法，进行甘蔗渣预处理，将得到的预处理液用硫酸调节pH至3.0 左右。取50mL的预处理液与50mL的氯仿（体积比1:1)室温下进行摇晃混勾30min，静置 5h。取有机相，在276nm处测定糠醛的含量，计算得出100g甘蔗渣的处理液中，含有2. 6g 糠醛。
[0051] 实施例6 :甘蔗渣残渣（SBR)添加量对循环发酵丁二酸的影响
[0052] 按施例4的方法，配置发酵培养基，在IOOmL三角瓶中分别添加 SBR，用量依次为 0· lg、0. 15g、0. 20g、0. 25g、0. 3g、0. 35g、0. 40g、0. 45g、0. 50g，调节发酵液的 pH 至 6. 5,加水 定容至25mL，121°C灭菌20min，接入5% (v/v)种子液，37°C厌氧摇瓶发酵，静置分层，倒出 液体，测发酵液中丁二酸的浓度，并补加灭过菌的发酵培养基，反复分批发酵三次，结果如 表3〇
[0053] 表3不同SBR浓度对发酵丁二酸含量（g. Γ1)的影响
[0054]
[0055] 实施例7 :反复补料分批发酵生产丁二酸
[0056] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0057] (1)甘蔗预处理；甘蔗渣粉碎20-60目筛，70°C烘干，用质量浓度为5%的NaOH溶 液，按照固液比I: I (w/v)，高温预处理甘蔗渣lh，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45°C烘干 备用；预处理后总纤维素含量为86. 8% ;
[0058] (2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3 %的溶液，添加纤维素酶、木 聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40°C，pH调至6. 5,转速100-250r. mirT1的条件下， 水解72h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添加量分别为： 10FPU. g'50U. g'10U. g4和5U. g、离心，得甘蔗渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣；水解液 中还原糖浓度为60. 6g. L'
[0059] (3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培养，发酵培养基组成 为：甘蔗渣水解液糖浓度100g. Γ1，玉米浆浓度30g. Γ1，无水氯化钙浓度0. 05g. Γ1，磷酸氢 二钾浓度Ig. Γ1，磷酸二氢钠浓度12g. I71，六水氯化镁浓度0. 5g. I71，硫化钠浓度0. 05g. I^1;在发酵培养基中添加8g. LH的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5%的接种量接种琥珀酸放 线杆菌CGMCC NO. 1593种子液，在温度40°C、pH 6. 5的厌氧条件下发酵；当发酵液中还原糖 浓度低于20g. Γ1时，开始补加甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10-20g. L Λ 发酵40h ;发酵结束后静止I. 5h，发酵液中的甘蔗渣水解残渣下沉至发酵罐底部，然后转移 上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。反复 分批发酵5次。
[0060] 结果显示，反复分批发酵的丁二酸浓度均值为58g. Γ1左右，丁二酸的平均生产强 度为I. 61g. L'tT1，平均糖酸转化率为0. 80g. g'整个发酵系统运行过程中没有下降的趋 势。
[0061] 实施例8 :反复分批发酵生产丁二酸
[0062] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0063] (1)甘蔗渣预处理；甘蔗渣粉碎20-60目筛，40°C烘干，用质量浓度为0.5%的 NaOH溶液，按照固液比1:20 (w/v)，121°C高温预处理甘蔗渣4h，过滤水洗得到预处理的甘 蔗渣，70°C烘干备用；预处理后总纤维素含量为84.6% ;
[0064] (2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为10%的溶液，添加纤维素酶、木 聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶，在温度70°C，pH调至4. 0,转速100-250r. HiirT1的条件下， 水解24h ;其中纤维素酶、木聚糖酶、β -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添加量分别为： 35FPU. g'UOU. g'SOU. g-1和30U. g-1;离心，得甘蔗渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣；水解 液中还原糖浓度为62. 8g. Γ1，甘蔗渣的总纤维素水解效率最高达到89%，甘蔗渣水解液中 葡萄糖的 浓度为42. 86g. Γ1，木糖浓度为14. 32g. Γ1，葡糖醛酸的浓度为5. 62g. Γ1，葡萄糖 和木糖的浓度比接近3:1。
[0065] (3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵培养，发酵培养基组成 为：甘蔗渣水解液糖浓度20g. Γ1，玉米浆浓度10g. Γ1，无水氯化钙浓度0. 5g. Γ1，磷酸氢二 钾浓度5g. Γ1，磷酸二氢钠浓度4g. Γ1，六水氯化镁浓度0. 05g. Γ1，硫化钠浓度0. 5g. L_S在 发酵培养基中添加4g. Γ1的甘蔗渣水解后的残渣，然后按10%的接种量接种琥珀酸放线杆 菌CCTCC NO :M 2012036种子液，在温度35°C、pH 5. 8的厌氧条件下发酵，当残糖浓度低于 5g/L时发酵结束，然后静止，待发酵液中的甘蔗渣水解残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清 液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。反复分批 发酵4次。
[0066] 结果显示，反复分批发酵3次，丁二酸浓度均值分别为35. 2、33. 2、30g. Γ1，平均为 32. 8g. Γ1左右，丁二酸的平均生产强度为I. 54g.厂1.1Γ1，平均糖酸转化率为0. 80g. g4,整个 发酵系统运行过程中没有下降的趋势。
[0067] 实施例9 :反复分批发酵生产丁二酸
[0068] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0069] (1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓 度50g. Γ1; (2)在发酵培养基中添加12g. LH的甘蔗渣水解后的残渣，然后按8%的接种量 接种，在温度38°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下发酵20h ; (3)发酵结束后静止，待发酵液中 甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培 养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0070] 3批次循环分批发酵结果显示，丁二酸浓度均值为32. 6g. Γ1左右，丁二酸的平均 生产强度为I. 64g. L'tT1，平均糖酸转化率为0. 82g. P，整个发酵系统运过程中没有下降 的趋势。
[0071] 实施例10 :反复分批发酵生产丁二酸
[0072] 按以下方法发酵生产丁二酸：
[0073] (1)以甘蔗渣水解糖液为碳源，制备发酵培养基，其中培养基中甘蔗渣水解液糖浓 度SOg.!/ 1; (2)在发酵培养基中添加20g. LH的甘蔗渣水解后的残渣，然后按8%的接种量 接种，在温度38°C、pH 5. 8~6. 5的厌氧条件下发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g. Γ1 时，开始补加甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g. Γ1，发酵60h ; (3)发酵 结束后静止，待发酵液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发 酵罐中加入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。
[0074] 5批次循环分批发酵结果显示，丁二酸的平均生产强度为I. 58g. L'tT1，整个发酵 系统运过程中没有明显下降的趋势。
[0075] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法是将甘蔗渣粉碎、稀碱预处理、 水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添加4~ 20g?I71的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补料分批 发酵生产丁二酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反复分批发酵或反复补料分批发酵， 是指采用分批发酵或补料分批发酵的方式生产丁二酸，每一批次结束后，静止，待发酵液中 甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜培养基， 不需要接种，直接进行下一批次发酵。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)以甘蔗渣水解糖液 为碳源，制备发酵培养基，培养基中甘蔗渣水解液糖浓度20~100g吨4; (2)在发酵培养基 中添加4~20g?I71的甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种，在温度35~ 40°C、pH5. 8~6. 5的厌氧条件下分批发酵或补料分批发酵20~60h; (3)发酵结束后静 止，待发酵液中甘蔗渣水解后的残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加 入新鲜发酵培养基，不需要接种，直接进行下一批次发酵。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)的补料分批发酵是发酵培养 基初始糖浓度为50g/L以上的补料发酵，当发酵液中还原糖浓度低于20g吨4时，开始补加 甘蔗渣水解糖液以使发酵液中的糖浓度控制在10_20g?L'发酵25-50h。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是：甘蔗渣水解液糖浓度 20~100g?L-1，玉米浆浓度10~30g?L-1，无水氯化钙浓度0. 05~0. 5g?L-1，磷酸氢二钾 浓度1~5g?I71，磷酸二氢钠浓度4~12g?I71，六水氯化镁浓度0. 05~0. 5g?I71，硫化 钠浓度〇? 05~0? 5g?L'6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解糖液和甘蔗渣水解后的残渣 的制备方法是：甘蔗渣粉碎20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶 液，按照固液比1:1~l:20(w/v)，高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘 蔗渣，45-70°C烘干备用；然后将预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加 纤维素酶、木聚糖酶、0 -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速 100-250r?HiirT1的条件下，水解24~72h;其中纤维素酶、木聚糖酶、0 -葡聚糖酶和果胶 酶对每克甘蔗渣的添加量分别为：1〇~35FPU?g'50~120U?g'10~80U?glP5~ 30U?g、离心，得甘蔗渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)甘蔗渣预处理：甘 蔗渣粉碎20-60目筛，40-70°C烘干，用质量浓度为0. 5-5%的NaOH溶液，按照固液比1:1~ 1:20 (w/v)，高温预处理甘蔗渣1~4h，过滤水洗得到预处理的甘蔗渣，45-70°C烘干备用； (2)甘蔗渣水解：预处理的甘蔗渣配成质量浓度为3~10%的溶液，添加纤维素酶、木聚糖 酶、0 -葡聚糖酶和果胶酶，在温度40~70°C，pH调至4. 0~6. 5,转速100-250r.mirT1的 条件下，水解24~72h;其中纤维素酶、木聚糖酶、0 -葡聚糖酶和果胶酶对每克甘蔗渣的添 加量分别为：1〇~35FPU.g'SO~120U.g'lO~80U.g-1和5~30U.g-1;离心，得甘鹿 渣水解糖液和甘蔗渣水解残渣；(3)发酵生产丁二酸：调节甘蔗渣水解糖液浓度，配置发酵 培养，发酵培养基组成为：甘蔗渣水解液糖浓度20-100g吨'玉米浆浓度10-30g吨'无水 氯化1?浓度0. 05-0. 5g吨'磷酸氢二钾浓度l-5g吨'磷酸二氢钠浓度4-12g 六水氯 化镁浓度0. 05-0. 5g吨4，硫化钠浓度0. 05-0. 5g ;在发酵培养基中添加4~20g?L―1的 甘蔗渣水解后的残渣，然后按5~10%的接种量接种种子液，在温度35~40°C、pH5. 8~ 6. 5的厌氧条件下，分批发酵或补料分批发酵20~60h;发酵结束后静止，待发酵液中的甘 蔗渣水解残渣下沉至发酵罐底部后，转移上清液，然后往发酵罐中加入新鲜发酵培养基，不 需要接种，直接进行下一批次发酵。8. 根据权利要求1-7任一所述方法得到的丁二酸。9. 权利要求8所述丁二酸在食品、化学和制备药物方面的应用。10. -种综合利用甘蔗渣的方法，其特征在于，所述方法包括：（1)甘蔗渣经粉碎、稀碱 预处理、水解得到的水解糖液作为琥珀酸放线杆菌厌氧发酵丁二酸的碳源，在发酵液中添 加4~20g?I71的甘蔗渣水解后的残渣作为菌体细胞的附着载体，反复分批发酵或反复补 料分批发酵生产丁二酸；（2)稀碱预处理甘蔗渣后的残液，用体积比为1:0. 5~1:1的氯仿 萃取，得到糠醛粗品。
【专利摘要】本发明公开了一种以甘蔗渣原料发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法是以榨糖工业的主要副产物甘蔗渣为原料，经过粉碎，稀碱预处理，以及纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶的共同水解，得到水解糖液；利用琥珀酸放线杆菌发酵水解糖液生产丁二酸，同时在发酵液中添加甘蔗渣水解的残渣，使得发酵可以反复运行，节省种子培养，而且可以用有机溶剂萃取稀碱预处理后的残液中的糠醛。本发明方法，实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵效率，同时对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适合工业化生产。
【IPC分类】C12P7/46, C12R1/01, C07D307/50
【公开号】CN104894174
【申请号】CN201510387997
【发明人】郑璞, 淘声涛, 查鑫华
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年7月3日
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