一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备苷元的方法
一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备苷元的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备 苷元的方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex. Fr. ) Karst]隶属担子菌亚门 (Basidiomycetes)、层菌纲（Hymenomycetes)、多孔菌目（Polyparales)、多孔菌科 (Polyporaceae)、灵芝属（Ganoderma)，是一种药用价值很高的食用菌，在我国已有2000多 年的历史。《中国人民共和国药典》（2000版）将灵芝补录，明确指出灵芝具有"补气安神， 止咳平喘"的功效，其所具有的较重要的药理作用有抗肿瘤、抗放疗与抗化疗、抗心肌缺血、 调节血脂、免疫调节、抗缺氧、清除自由基及延缓衰老等，最近的研宄还显示灵芝具有抑制 艾滋病毒增殖的效果。
[0003] 灵芝主要的活性成分有多糖类、三萜类、核苷类、留醇类、生物碱类、呋喃衍生物、 氨基酸多肽类、微量元素、脂肪酸、有机锗等。其中，灵芝多糖和灵芝三萜是其主要的生物活 性成分。灵芝多糖主要的药理作用有：抗肿瘤、免疫调节、抗氧自由基、活化淤血、抗衰老等。 灵芝三萜的主要药理作用有：保肝、抗肿瘤、镇痛、抑制血小板聚集等。
[0004] 大豆异黄酮（Soybean Isoflavone)是一类从大豆中提取出的具有多酷结构混合 物的统称，是一类具有雌激素样作用的具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是 最主要的"异黄酮"类植物雌激素之一。其主要成分有3种，即染料木黄酮（Genistein)、大 豆苷元（Daidzein)和大豆黄素（Glycitein)。通常情况下，这三种异黄酮母核与葡萄糖以 β -糖苷键连接，以异黄酮葡萄糖苷形式存在于大豆中，分别称为染料木苷（Genistin)、大 豆苷（Daidzin)和6-甲氧基大豆苷（Glycitin)，含量占大豆异黄酮的97~98%。研宄发 现，大多数的结合型糖苷不能通过小肠壁，真正在体内被吸收而产生生理活性的是游离苷 元Gen和Den。大豆异黄酮除具有弱的雌激素活性外，还具有抗癌、抗氧化、抗溶血、抗真菌 等活性，同时能够有效抑制白血病、骨质增生、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等多种疾病的发 生。
[0005] 一般情况下，大豆异黄酮苷元主要通过以下方式获得：（1)碱水解，但水解得到的 大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解；（2)酸水解，一般所用的酸为盐酸，水解效率虽然很 高，但强酸条件不易实现工业化，同时会使产品色泽、口感及滋气味较差，影响产品品质； (3)酶水解，反应速度快，条件温和，工艺参数容易控制，但酶制品成本高，而利用微生物发 酵的方法直接生产大豆异黄酮苷元可大幅降低成本。
[0006] 微生物转化是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化 反应，具有反应条件温和、操作性强、无环境污染等特点，同时微生物培养具有繁殖迅速，生 长周期短，可以降低成本，易于工业化生产。由于大豆异黄酮分子中糖基的连接键是β-糖 苷键，所以可以利用可分泌β-葡萄糖苷酶的微生物发酵来实现大豆异黄酮苷元的制备。 目前，曲霉被普遍认为是产β-葡萄糖苷酶的优良菌种，尤以黑曲霉的效率最高，但仅限于 实验室研制阶段，黑曲霉β -葡萄糖苷酶的转化效率仍有待提高。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备苷元的方法，该方法获得的 β-葡萄糖苷酶的酶活高，产物大豆异黄酮糖苷元的转化率高。
[0008] 一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，包括：
[0009] (1)将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液；
[0010] (2)对发酵液进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液 中，获得粗酶液；
[0011] (3)将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。
[0012] 对发酵液进行匀浆处理，即可破碎发酵液中的菌丝体，释放β -葡萄糖苷酶；释放 后无需提取β-葡萄糖苷酶即可直接用于大豆异黄酮糖苷的转化，转化后得到的大豆异黄 酮苷元包含染料木素（Genistein)、大豆苷元（Daidzein)和黄豆黄素（Glycitein)，其中， 黄豆黄素的含量极低，可以忽略。
[0013] 作为优选，以重量百分比计，所述培养基包括麦芽汁4. 10%，酵母浸出粉1.8%， KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，ρΗ5. 40。其中，糖化后的麦芽汁使用糖度仪测定其 含糖量，试验中所涉及的麦芽汁的用量均以其溶液中的含糖量计，即4. 10%为麦芽汁的含 糖量。
[0014] 作为优选，所述发酵培养的条件为：25~30°C下培养6~8天。
[0015] 步骤（2)中，在0~5°C条件下进行匀浆处理，以避免β-葡萄糖苷酶酶活的降低。
[0016] 通过实验对粗酶液与大豆异黄酮糖苷的反应条件以及粗酶液中葡萄糖苷酶 与大豆异黄酮糖苷的用量关系进行优选
[0017] 作为优选，步骤（3)中，反应的温度为50°C~60°C ;更优选，60°C。
[0018] 步骤（3)中，反应的时间为6~60h;更优选，42h。步骤（3)中，反应液pH值为 4~6〇
[0019] 更优选，步骤（3)中，反应的温度为60°C，反应的时间为42h，反应液pH值为4~ 6〇
[0020] 作为优选，以Ig大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中β -葡萄糖苷酶的用量为10~30U。
[0021] 发酵培养前，将灵芝接入种子培养基中进行培养，培养条件为：28°C下培养8天。
[0022] 作为优选，以重量百分比计，所述种子培养基包括马铃薯1 %，葡萄糖2%，蛋白胨 1.8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，pH 5.5,121°C湿热灭菌 20min，VB1 过滤除 菌。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024] (1)本发明通过深度发酵灵芝获得大量β -葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮制备苷 元，获得的β -葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收 率，同时转化产物还富含灵芝胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发 及工业化生产奠定基础；
[0025] (2)灵芝液体深层发酵具有繁殖迅速，生长周期短等优点，可以降低成本，易于工 业化生产；
[0026] (3)采用灵芝的发酵产物转化大豆异黄酮糖苷，具有反应条件温和，工艺简单、操 作性强、无有机溶剂残留、无环境污染等特点。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明灵芝菌株液体发酵过程中β -葡萄糖苷酶酶活变化；
[0028] 图2为本发明大豆异黄酮添加量对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0029] 图3为本发明温度对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0030] 图4为本发明转化时间对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0031] 图5为本发明大豆异黄酮粗提物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物质含量的示意 图；
[0032] 图6为本发明转化产物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物质含量的示意图（转化 条件：大豆异黄酮5g，60°C，48h)。
【具体实施方式】
[0033] 1、灵芝菌株的液体发酵培养方法
[0034] 各菌株培养保存于斜面培养基中，取4-5块Icm2菌丝块接种到种子液培养基，于 28°C，180rpm培养8d后得灵芝液体种子液。然后按10% (v/v)接种量将各种子液接种到 发酵培养基中，28°C，180rpm培养7d。
[0035] 斜面培养基：马铃薯 1%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. ISKVB10.00 5%，琼脂 2%，121°C湿热灭菌20min，VB1过滤除菌。
[0036] 种子液培养基：马铃薯1%，葡萄糖2%，蛋白胨1.8%，KH2P040. 3%，MgS040. 15%， VB10.00 5%，pH 5· 5,121°C 湿热灭菌 20min，VB1 过滤除菌。
[0037] 液体发酵培养基：麦芽汁4. 10%，酵母浸出粉1. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%， VB10.00 5%, pH5. 40〇
[0038] 麦芽汁的制备：取啤酒制备所用小麦芽，按照European Brewery Cenvention(EBC)方法制备麦芽汁，利用手持糖度折光仪测定麦芽汁含糖量，后续实验均以 含糖量（％ )计。
[0039] 2、β -葡萄糖苷酶活力测定方法
[0040] 葡萄糖苷酶活力单位（U)定义为，在pH 5.0, 50°C反应条件下，一分钟时间内 底物被水解释放出1 μ mol的pNP所需要的酶量。
[0041] pH5. 0 的 P-C 缓冲液：称取 Na2HPO4 · 12H20 3. 689g、柠檬酸 1.0 lg 溶于 100mL 蒸馏 水中，调pH至5.0并定容。
[0042] 底物（pNPG)工作液：准确称取pNPG 150. 65mg，完全溶解于100ml pH5. 0的P-C缓 冲液中备用。
[0043] β -葡萄糖苷酶酶活测定：离心收集灵芝液体发酵菌丝，加入适量蒸馏水后超声 破碎，4°C下 1000 Og 离心 15min，取 100μΙ 上清与 200 μ1 5mM pNPG 混匀，50°C保温 30min， 加入2ml lmol/L Na2CO3*止反应并显色，于400nm下测定吸光值。
[0044] β -葡萄糖苷酶酶活（U/g) = (x X103X 2. 3 X KT3 X100)八0· IX 30 Xm);
[0045] X :测定吸光值对应的pNP含量；
[0046] m :用于破碎的灵芝菌丝干重。
[0047] 3、灵芝转化大豆异黄酮
[0048] 灵芝菌株液体发酵一定时间至菌丝和发酵液中β -葡萄糖苷酶酶活达到最高，取 发酵液和菌丝，将其匀浆至菌丝完全破碎，取适量大豆异黄酮粗提物与该匀浆液按一定比 例混合，调整pH至5,于恒温水浴中在一定温度下，反应一定时间，利用HPLC法测定其大豆 苷元及染料木素的转化率（上述过程的具体条件如下文所述）。
[0049] HPLC 检测转化率时，HPLC column 为 ZORBAX SB-C18(5ym，4.6*250mm;Agilent); 流动相包括：〇. 2 % (v/v)甲酸的水溶液（A)，乙腈（B) ;HPLC洗脱程序为：0-25min， 10% -63% (B)，柱温为30°C，流速为lml/min，进样量为10μ1，检测波长为254nm。
[0050] 大豆苷元转化率（％)=转化后大豆苷元含量八转化前大豆苷含量+转化前大豆 苷元含量）
[0051] 染料木素转化率（％)=转化后染料木素含量八转化前染料木苷含量+转化前染 料木素含量）
[0052] 4、统计分析
[0053] 实验结果采用SPSS 17. 0进行统计分析，结果用平均土 SD值表示，三次重复实验 的结果用ANOVA进行分析比较，p < 0. 05为差异显著，p < 0. 01为差异极显著，同时采用 Duncun' s多重比较进行显著性分析（取p < 0. 05)。
[0054] 5、灵芝菌丝液体发酵过程中发酵液β -葡萄糖苷酶酶活变化
[0055] 将灵芝菌株于28°C，ISOrpm下液体发酵培养7d，测定发酵l-8d时发酵液中β -葡 萄糖苷酶酶活，观察其在液体发酵过程中的变化（图1)。
[0056] 由图1可知，灵芝菌株在液体发酵过程中β-葡萄糖苷酶酶活趋势为先上 升后趋于稳定再缓慢降低，灵芝发酵液β-葡萄糖苷酶酶活于第6d达到最高，为 0. 787±0. 08U/ml，第7d时为0. 76±0. 06U/ml。而当发酵时间为6d时，菌丝生物量可达到 L 8776±0· 02g/100ml，第 7d 时为 L 9195±0· 01g/100ml，达到最高。
[0057] 采用将菌丝及发酵液匀浆，不仅可以收集胞内外β-葡萄糖苷酶，同时还可以富 集菌丝中所含的活性物质，考虑到β-葡萄糖苷酶在水解大豆异黄酮中的重要作用及实际 发酵时间选择发酵液酶活为〇. 787±0. 08U/ml (第6d)，并将该含有菌丝的发酵液匀浆至完 全破碎，测定β -葡萄糖苷酶酶活为I. 15±0. 06U/ml。考虑到实际操作的方便性，将匀浆液 稀释至酶活为I. 〇U/ml，并以此作为灵芝转化大豆异黄酮的实验所需酶活。
[0058] 6、灵芝转化大豆异黄酮工艺
[0059] 灵芝菌株于28°C，ISOrpm下液体发酵培养，定时检测菌丝和发酵液匀浆后β -葡 萄糖苷酶酶活，取酶活为1.0 U/ml的匀浆液100ml (pH = 5)用作后续转化实验。另一方面， 以大豆苷元和染料木素转化率为检测指标，研宄大豆异黄酮添加量、转化温度、转化时间对 灵芝转化大豆异黄酮的影响，以优化其转化工艺。
[0060] (1)大豆异黄酮添加量对灵芝转化大豆异黄酮影响
[0061] 选取5种不同的大豆异黄酮添加量（28,58，1(^，158,2(^)，将其添加到10〇1111灵芝 发酵匀浆液中，于50°C转化24h，测定大豆苷元和染料木素转化率（如图2所示）。
[0062] 由图2可知，随着大豆异黄酮添加量的增加，大豆苷元和染料木素的转化 率均呈现下降趋势，当大豆异黄酮添加2g时，大豆苷元和染料木素的转化率分别为 69. 13±2. 18%，69. 73± I. 56%;当大豆异黄酮添加5g时，大豆苷元和染料木素的转化率分 别为61. 51 ±1. 82%，63. 23±1. 98% ;而当大豆异黄酮添加量增至20g时，大豆苷元和染料 木素的转化率则降至23. 46±1. 89%，11. 65±2. 29%。主要是由于该实验选择的是β-葡 萄糖苷酶酶活为l.〇U/ml的匀浆液100ml，其中β-葡萄糖苷酶含量是一定的，大豆异黄酮 过多时糖苷则无法全部被水解。另一方面，考虑到灵芝转化大豆异黄酮的工业生产，合适的 底物浓度不仅能最大限度被水解，更能节省成本，因此，选择大豆异黄酮添加量为5g为最 佳。
[0063] (2)温度对灵芝转化大豆异黄酮影响
[0064] 将5g大豆异黄酮添加到100mL灵芝发酵匀浆液中，在5种不同的温度（室温（约 15°C )，30°C，40°C，50°C，60°C，70°C )下转化24h，测定大豆苷元和染料木素转化率（图3)。
[0065] 由图3可知，大豆苷元转化率与温度基本呈正相关，当温度为60°C时，其转化率 可达91.78±3. 47% ;而温度为70°C时，其值可达100. 3±3. 05%。而随着温度的升高，染 料木素转化率基本呈先上升后趋于稳定再下降的趋势，当温度为60°C时，其值达到最高，为 67. 66 ± 2. 75 %;当温度为70°C时，其值降至40. 84 ± 1. 23 %。综上，在其他条件一定的情况 下，选择灵芝转化大豆异黄酮的温度为60°C。
[0066] (3)转化时间对灵芝转化大豆异黄酮影响
[0067] 将5g大豆异黄酮添加到100mL灵芝发酵勾衆液中，于50°C转化不同时间（2h，6h， 18h，30h，42h，60h)，测定大豆苷元和染料木素转化率（图4)。
[0068] 由图4可知，随着转化时间的延长，β -葡萄糖苷酶可以最大程度水解大豆异黄 酮，进而提高苷元转化率。当转化2h时，大豆苷元转化率仅为36. 99 ±2. 56%，染料木素转 化率为17. 67±0. 89% ;当转化时间为42h时，大豆苷元和染料木素转化率均达到最高，分 别为：94. 42±2. 75%，82. 56±2. 12% ;而转化时间过长时，部分苷元被分解致转化率降低。 因此，选择转化时间为42h。
[0069] (4)灵芝转化大豆异黄酮的正交实验优化设计
[0070] 在单因素的基础上，以β -葡萄糖苷酶酶活为1.0 U/ml的灵芝匀浆液100ml (pH = 5)作为转化反应液，将大豆异黄酮添加量、温度、转化时间3因素设计正交实验，确立三因 素三水平表，进行优化实验。正交实验水平因素设计见表1，正交实验结果见2,各指标极差 分析见表3。
[0071] 表1 L9(33)正交实验水平因素设计
[0072]
[0073] 表2 L9 (33)正交实验结果
[0074]
[0075] 表3 L9 (33)正交实验极差分析
[0076]
[0077] 由表2, 3可知，大豆异黄酮添加量、转化温度、转化时间对大豆苷元和染料木素转 化率的影响依次减弱，综合分析各因素条件下各指标k值，可得最佳的转化条件为A2B2C3， 即以β -葡萄糖苷酶酶活为1.0 U/ml的灵芝匀浆液100ml (pH = 5)作为转化反应液，加入5g 大豆异黄酮粗提物，于60°C下转化48h，得到大豆苷元及染料木素转化率分别为96. 63%， 87.82%。转化前后大豆异黄酮HPLC图谱见图5、6。
【主权项】
1. 一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，包括： (1) 将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液； (2) 对发酵液及菌丝进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，e-葡萄糖苷酶释放到发酵液 中，获得粗酶匀浆液； (3) 将匀浆液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述培养基包括麦芽汁 4. 10%，酵母浸出粉 1. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB1O. 005%，pH5. 40。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：25~30°C下培养 6~8天。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述匀浆处理的温度为0~ 5。 。。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应的温度为50°C~60°C。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应的时间为6~60h。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应液pH值为4~6。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以Ig大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中0 _葡萄 糖苷酶的用量为10~30U。
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，该方法包括：将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液；对发酵液进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液中，获得粗酶匀浆液；将匀浆液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。本发明通过深度发酵灵芝获得大量β-葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮制备苷元，获得的β-葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收率，同时转化产物还富含灵芝胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发及工业化生产奠定基础。
【IPC分类】C12P17/06
【公开号】CN104894180
【申请号】CN201510270900
【发明人】何国庆, 崔美林, 袁岚, 杨浣漪
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备 苷元的方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex. Fr. ) Karst]隶属担子菌亚门 (Basidiomycetes)、层菌纲（Hymenomycetes)、多孔菌目（Polyparales)、多孔菌科 (Polyporaceae)、灵芝属（Ganoderma)，是一种药用价值很高的食用菌，在我国已有2000多 年的历史。《中国人民共和国药典》（2000版）将灵芝补录，明确指出灵芝具有"补气安神， 止咳平喘"的功效，其所具有的较重要的药理作用有抗肿瘤、抗放疗与抗化疗、抗心肌缺血、 调节血脂、免疫调节、抗缺氧、清除自由基及延缓衰老等，最近的研宄还显示灵芝具有抑制 艾滋病毒增殖的效果。
[0003] 灵芝主要的活性成分有多糖类、三萜类、核苷类、留醇类、生物碱类、呋喃衍生物、 氨基酸多肽类、微量元素、脂肪酸、有机锗等。其中，灵芝多糖和灵芝三萜是其主要的生物活 性成分。灵芝多糖主要的药理作用有：抗肿瘤、免疫调节、抗氧自由基、活化淤血、抗衰老等。 灵芝三萜的主要药理作用有：保肝、抗肿瘤、镇痛、抑制血小板聚集等。
[0004] 大豆异黄酮（Soybean Isoflavone)是一类从大豆中提取出的具有多酷结构混合 物的统称，是一类具有雌激素样作用的具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是 最主要的"异黄酮"类植物雌激素之一。其主要成分有3种，即染料木黄酮（Genistein)、大 豆苷元（Daidzein)和大豆黄素（Glycitein)。通常情况下，这三种异黄酮母核与葡萄糖以 β -糖苷键连接，以异黄酮葡萄糖苷形式存在于大豆中，分别称为染料木苷（Genistin)、大 豆苷（Daidzin)和6-甲氧基大豆苷（Glycitin)，含量占大豆异黄酮的97~98%。研宄发 现，大多数的结合型糖苷不能通过小肠壁，真正在体内被吸收而产生生理活性的是游离苷 元Gen和Den。大豆异黄酮除具有弱的雌激素活性外，还具有抗癌、抗氧化、抗溶血、抗真菌 等活性，同时能够有效抑制白血病、骨质增生、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等多种疾病的发 生。
[0005] 一般情况下，大豆异黄酮苷元主要通过以下方式获得：（1)碱水解，但水解得到的 大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解；（2)酸水解，一般所用的酸为盐酸，水解效率虽然很 高，但强酸条件不易实现工业化，同时会使产品色泽、口感及滋气味较差，影响产品品质； (3)酶水解，反应速度快，条件温和，工艺参数容易控制，但酶制品成本高，而利用微生物发 酵的方法直接生产大豆异黄酮苷元可大幅降低成本。
[0006] 微生物转化是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化 反应，具有反应条件温和、操作性强、无环境污染等特点，同时微生物培养具有繁殖迅速，生 长周期短，可以降低成本，易于工业化生产。由于大豆异黄酮分子中糖基的连接键是β-糖 苷键，所以可以利用可分泌β-葡萄糖苷酶的微生物发酵来实现大豆异黄酮苷元的制备。 目前，曲霉被普遍认为是产β-葡萄糖苷酶的优良菌种，尤以黑曲霉的效率最高，但仅限于 实验室研制阶段，黑曲霉β -葡萄糖苷酶的转化效率仍有待提高。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种灵芝发酵转化大豆异黄酮糖苷制备苷元的方法，该方法获得的 β-葡萄糖苷酶的酶活高，产物大豆异黄酮糖苷元的转化率高。
[0008] 一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，包括：
[0009] (1)将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液；
[0010] (2)对发酵液进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液 中，获得粗酶液；
[0011] (3)将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。
[0012] 对发酵液进行匀浆处理，即可破碎发酵液中的菌丝体，释放β -葡萄糖苷酶；释放 后无需提取β-葡萄糖苷酶即可直接用于大豆异黄酮糖苷的转化，转化后得到的大豆异黄 酮苷元包含染料木素（Genistein)、大豆苷元（Daidzein)和黄豆黄素（Glycitein)，其中， 黄豆黄素的含量极低，可以忽略。
[0013] 作为优选，以重量百分比计，所述培养基包括麦芽汁4. 10%，酵母浸出粉1.8%， KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，ρΗ5. 40。其中，糖化后的麦芽汁使用糖度仪测定其 含糖量，试验中所涉及的麦芽汁的用量均以其溶液中的含糖量计，即4. 10%为麦芽汁的含 糖量。
[0014] 作为优选，所述发酵培养的条件为：25~30°C下培养6~8天。
[0015] 步骤（2)中，在0~5°C条件下进行匀浆处理，以避免β-葡萄糖苷酶酶活的降低。
[0016] 通过实验对粗酶液与大豆异黄酮糖苷的反应条件以及粗酶液中葡萄糖苷酶 与大豆异黄酮糖苷的用量关系进行优选
[0017] 作为优选，步骤（3)中，反应的温度为50°C~60°C ;更优选，60°C。
[0018] 步骤（3)中，反应的时间为6~60h;更优选，42h。步骤（3)中，反应液pH值为 4~6〇
[0019] 更优选，步骤（3)中，反应的温度为60°C，反应的时间为42h，反应液pH值为4~ 6〇
[0020] 作为优选，以Ig大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中β -葡萄糖苷酶的用量为10~30U。
[0021] 发酵培养前，将灵芝接入种子培养基中进行培养，培养条件为：28°C下培养8天。
[0022] 作为优选，以重量百分比计，所述种子培养基包括马铃薯1 %，葡萄糖2%，蛋白胨 1.8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，pH 5.5,121°C湿热灭菌 20min，VB1 过滤除 菌。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024] (1)本发明通过深度发酵灵芝获得大量β -葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮制备苷 元，获得的β -葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收 率，同时转化产物还富含灵芝胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发 及工业化生产奠定基础；
[0025] (2)灵芝液体深层发酵具有繁殖迅速，生长周期短等优点，可以降低成本，易于工 业化生产；
[0026] (3)采用灵芝的发酵产物转化大豆异黄酮糖苷，具有反应条件温和，工艺简单、操 作性强、无有机溶剂残留、无环境污染等特点。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明灵芝菌株液体发酵过程中β -葡萄糖苷酶酶活变化；
[0028] 图2为本发明大豆异黄酮添加量对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0029] 图3为本发明温度对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0030] 图4为本发明转化时间对灵芝转化大豆异黄酮影响；
[0031] 图5为本发明大豆异黄酮粗提物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物质含量的示意 图；
[0032] 图6为本发明转化产物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物质含量的示意图（转化 条件：大豆异黄酮5g，60°C，48h)。
【具体实施方式】
[0033] 1、灵芝菌株的液体发酵培养方法
[0034] 各菌株培养保存于斜面培养基中，取4-5块Icm2菌丝块接种到种子液培养基，于 28°C，180rpm培养8d后得灵芝液体种子液。然后按10% (v/v)接种量将各种子液接种到 发酵培养基中，28°C，180rpm培养7d。
[0035] 斜面培养基：马铃薯 1%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. ISKVB10.00 5%，琼脂 2%，121°C湿热灭菌20min，VB1过滤除菌。
[0036] 种子液培养基：马铃薯1%，葡萄糖2%，蛋白胨1.8%，KH2P040. 3%，MgS040. 15%， VB10.00 5%，pH 5· 5,121°C 湿热灭菌 20min，VB1 过滤除菌。
[0037] 液体发酵培养基：麦芽汁4. 10%，酵母浸出粉1. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%， VB10.00 5%, pH5. 40〇
[0038] 麦芽汁的制备：取啤酒制备所用小麦芽，按照European Brewery Cenvention(EBC)方法制备麦芽汁，利用手持糖度折光仪测定麦芽汁含糖量，后续实验均以 含糖量（％ )计。
[0039] 2、β -葡萄糖苷酶活力测定方法
[0040] 葡萄糖苷酶活力单位（U)定义为，在pH 5.0, 50°C反应条件下，一分钟时间内 底物被水解释放出1 μ mol的pNP所需要的酶量。
[0041] pH5. 0 的 P-C 缓冲液：称取 Na2HPO4 · 12H20 3. 689g、柠檬酸 1.0 lg 溶于 100mL 蒸馏 水中，调pH至5.0并定容。
[0042] 底物（pNPG)工作液：准确称取pNPG 150. 65mg，完全溶解于100ml pH5. 0的P-C缓 冲液中备用。
[0043] β -葡萄糖苷酶酶活测定：离心收集灵芝液体发酵菌丝，加入适量蒸馏水后超声 破碎，4°C下 1000 Og 离心 15min，取 100μΙ 上清与 200 μ1 5mM pNPG 混匀，50°C保温 30min， 加入2ml lmol/L Na2CO3*止反应并显色，于400nm下测定吸光值。
[0044] β -葡萄糖苷酶酶活（U/g) = (x X103X 2. 3 X KT3 X100)八0· IX 30 Xm);
[0045] X :测定吸光值对应的pNP含量；
[0046] m :用于破碎的灵芝菌丝干重。
[0047] 3、灵芝转化大豆异黄酮
[0048] 灵芝菌株液体发酵一定时间至菌丝和发酵液中β -葡萄糖苷酶酶活达到最高，取 发酵液和菌丝，将其匀浆至菌丝完全破碎，取适量大豆异黄酮粗提物与该匀浆液按一定比 例混合，调整pH至5,于恒温水浴中在一定温度下，反应一定时间，利用HPLC法测定其大豆 苷元及染料木素的转化率（上述过程的具体条件如下文所述）。
[0049] HPLC 检测转化率时，HPLC column 为 ZORBAX SB-C18(5ym，4.6*250mm;Agilent); 流动相包括：〇. 2 % (v/v)甲酸的水溶液（A)，乙腈（B) ;HPLC洗脱程序为：0-25min， 10% -63% (B)，柱温为30°C，流速为lml/min，进样量为10μ1，检测波长为254nm。
[0050] 大豆苷元转化率（％)=转化后大豆苷元含量八转化前大豆苷含量+转化前大豆 苷元含量）
[0051] 染料木素转化率（％)=转化后染料木素含量八转化前染料木苷含量+转化前染 料木素含量）
[0052] 4、统计分析
[0053] 实验结果采用SPSS 17. 0进行统计分析，结果用平均土 SD值表示，三次重复实验 的结果用ANOVA进行分析比较，p < 0. 05为差异显著，p < 0. 01为差异极显著，同时采用 Duncun' s多重比较进行显著性分析（取p < 0. 05)。
[0054] 5、灵芝菌丝液体发酵过程中发酵液β -葡萄糖苷酶酶活变化
[0055] 将灵芝菌株于28°C，ISOrpm下液体发酵培养7d，测定发酵l-8d时发酵液中β -葡 萄糖苷酶酶活，观察其在液体发酵过程中的变化（图1)。
[0056] 由图1可知，灵芝菌株在液体发酵过程中β-葡萄糖苷酶酶活趋势为先上 升后趋于稳定再缓慢降低，灵芝发酵液β-葡萄糖苷酶酶活于第6d达到最高，为 0. 787±0. 08U/ml，第7d时为0. 76±0. 06U/ml。而当发酵时间为6d时，菌丝生物量可达到 L 8776±0· 02g/100ml，第 7d 时为 L 9195±0· 01g/100ml，达到最高。
[0057] 采用将菌丝及发酵液匀浆，不仅可以收集胞内外β-葡萄糖苷酶，同时还可以富 集菌丝中所含的活性物质，考虑到β-葡萄糖苷酶在水解大豆异黄酮中的重要作用及实际 发酵时间选择发酵液酶活为〇. 787±0. 08U/ml (第6d)，并将该含有菌丝的发酵液匀浆至完 全破碎，测定β -葡萄糖苷酶酶活为I. 15±0. 06U/ml。考虑到实际操作的方便性，将匀浆液 稀释至酶活为I. 〇U/ml，并以此作为灵芝转化大豆异黄酮的实验所需酶活。
[0058] 6、灵芝转化大豆异黄酮工艺
[0059] 灵芝菌株于28°C，ISOrpm下液体发酵培养，定时检测菌丝和发酵液匀浆后β -葡 萄糖苷酶酶活，取酶活为1.0 U/ml的匀浆液100ml (pH = 5)用作后续转化实验。另一方面， 以大豆苷元和染料木素转化率为检测指标，研宄大豆异黄酮添加量、转化温度、转化时间对 灵芝转化大豆异黄酮的影响，以优化其转化工艺。
[0060] (1)大豆异黄酮添加量对灵芝转化大豆异黄酮影响
[0061] 选取5种不同的大豆异黄酮添加量（28,58，1(^，158,2(^)，将其添加到10〇1111灵芝 发酵匀浆液中，于50°C转化24h，测定大豆苷元和染料木素转化率（如图2所示）。
[0062] 由图2可知，随着大豆异黄酮添加量的增加，大豆苷元和染料木素的转化 率均呈现下降趋势，当大豆异黄酮添加2g时，大豆苷元和染料木素的转化率分别为 69. 13±2. 18%，69. 73± I. 56%;当大豆异黄酮添加5g时，大豆苷元和染料木素的转化率分 别为61. 51 ±1. 82%，63. 23±1. 98% ;而当大豆异黄酮添加量增至20g时，大豆苷元和染料 木素的转化率则降至23. 46±1. 89%，11. 65±2. 29%。主要是由于该实验选择的是β-葡 萄糖苷酶酶活为l.〇U/ml的匀浆液100ml，其中β-葡萄糖苷酶含量是一定的，大豆异黄酮 过多时糖苷则无法全部被水解。另一方面，考虑到灵芝转化大豆异黄酮的工业生产，合适的 底物浓度不仅能最大限度被水解，更能节省成本，因此，选择大豆异黄酮添加量为5g为最 佳。
[0063] (2)温度对灵芝转化大豆异黄酮影响
[0064] 将5g大豆异黄酮添加到100mL灵芝发酵匀浆液中，在5种不同的温度（室温（约 15°C )，30°C，40°C，50°C，60°C，70°C )下转化24h，测定大豆苷元和染料木素转化率（图3)。
[0065] 由图3可知，大豆苷元转化率与温度基本呈正相关，当温度为60°C时，其转化率 可达91.78±3. 47% ;而温度为70°C时，其值可达100. 3±3. 05%。而随着温度的升高，染 料木素转化率基本呈先上升后趋于稳定再下降的趋势，当温度为60°C时，其值达到最高，为 67. 66 ± 2. 75 %;当温度为70°C时，其值降至40. 84 ± 1. 23 %。综上，在其他条件一定的情况 下，选择灵芝转化大豆异黄酮的温度为60°C。
[0066] (3)转化时间对灵芝转化大豆异黄酮影响
[0067] 将5g大豆异黄酮添加到100mL灵芝发酵勾衆液中，于50°C转化不同时间（2h，6h， 18h，30h，42h，60h)，测定大豆苷元和染料木素转化率（图4)。
[0068] 由图4可知，随着转化时间的延长，β -葡萄糖苷酶可以最大程度水解大豆异黄 酮，进而提高苷元转化率。当转化2h时，大豆苷元转化率仅为36. 99 ±2. 56%，染料木素转 化率为17. 67±0. 89% ;当转化时间为42h时，大豆苷元和染料木素转化率均达到最高，分 别为：94. 42±2. 75%，82. 56±2. 12% ;而转化时间过长时，部分苷元被分解致转化率降低。 因此，选择转化时间为42h。
[0069] (4)灵芝转化大豆异黄酮的正交实验优化设计
[0070] 在单因素的基础上，以β -葡萄糖苷酶酶活为1.0 U/ml的灵芝匀浆液100ml (pH = 5)作为转化反应液，将大豆异黄酮添加量、温度、转化时间3因素设计正交实验，确立三因 素三水平表，进行优化实验。正交实验水平因素设计见表1，正交实验结果见2,各指标极差 分析见表3。
[0071] 表1 L9(33)正交实验水平因素设计
[0072]
[0073] 表2 L9 (33)正交实验结果
[0074]
[0075] 表3 L9 (33)正交实验极差分析
[0076]
[0077] 由表2, 3可知，大豆异黄酮添加量、转化温度、转化时间对大豆苷元和染料木素转 化率的影响依次减弱，综合分析各因素条件下各指标k值，可得最佳的转化条件为A2B2C3， 即以β -葡萄糖苷酶酶活为1.0 U/ml的灵芝匀浆液100ml (pH = 5)作为转化反应液，加入5g 大豆异黄酮粗提物，于60°C下转化48h，得到大豆苷元及染料木素转化率分别为96. 63%， 87.82%。转化前后大豆异黄酮HPLC图谱见图5、6。
【主权项】
1. 一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，包括： (1) 将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液； (2) 对发酵液及菌丝进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，e-葡萄糖苷酶释放到发酵液 中，获得粗酶匀浆液； (3) 将匀浆液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述培养基包括麦芽汁 4. 10%，酵母浸出粉 1. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB1O. 005%，pH5. 40。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：25~30°C下培养 6~8天。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述匀浆处理的温度为0~ 5。 。。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应的温度为50°C~60°C。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应的时间为6~60h。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，反应液pH值为4~6。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以Ig大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中0 _葡萄 糖苷酶的用量为10~30U。
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝发酵转化大豆异黄酮制备苷元的方法，该方法包括：将灵芝接入培养基进行发酵培养，获得含灵芝菌丝体的发酵液；对发酵液进行匀浆处理，使灵芝菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液中，获得粗酶匀浆液；将匀浆液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。本发明通过深度发酵灵芝获得大量β-葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮制备苷元，获得的β-葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收率，同时转化产物还富含灵芝胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发及工业化生产奠定基础。
【IPC分类】C12P17/06
【公开号】CN104894180
【申请号】CN201510270900
【发明人】何国庆, 崔美林, 袁岚, 杨浣漪
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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