一种don及乙酰化don毒素的培养制备及提取方法
一种don及乙酰化don毒素的培养制备及提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种DON毒素及乙酰化DON毒素的培养制备及提取纯化方法，特别是涉及一种简便有效培养禾谷镰刀菌大型分生孢子的方法，以及从接种培养物中同时分离提取纯化DON毒素及其乙酰化衍生物的方法。
【背景技术】
[0002]由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight)是危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦等多种禾谷类作物的一种重要病害，广泛分布于北美、欧洲和亚洲等温暖潮湿地区，近年来随着全球气候变暖呈逐步蔓延之势。农作物在生长或储备过程中均可感染镰刀菌，不但造成作物产量下降，更重要的是产生的镰刀菌毒素直接留存累积在禾谷类籽粒中，严重威胁人畜健康。
[0003]在我国，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是赤霉病的主要病原菌。禾谷镰刀菌产生B族单端孢霉烯族毒素,其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名呕吐毒素(vomitoxin, VT)为主。DON依靠其半職烯结构作用于真核细胞蛋白质翻译过程的不同阶段，抑制蛋白质合成，破坏人畜的免疫系统，使中毒者出现腹泻、呕吐和头晕等症状，是最主要的导致食物中毒的真菌毒素之一。目前，各国针对谷物及其制品中DON的含量制定了严格的限量标准，我国谷物中DON的限量标准为1.0mg/kg(lppm)。
[0004]DON毒素具有两种乙酰化产物，分别为3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Acetyldeoxynivalenol, 3-AcD0N)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyldeoxynivalenol, 15-AcDON)。一般认为，乙酸化 DON 的毒性与 DON 相当。亦有研究报道，产生3-AcDON的镰刀菌具有更强的产孢率和生长速度，对麦类作物的危害更为严重，并且正在取代产生其他毒素的镰刀菌，表现出更强的适应性(Ward TJ et al，An adaptive evolut1nary shift in Fusarium head blight pathogen populat1nsis driving the rapid spread of more toxigenic Fusarium graminearum in NorthAmerica.Fungal Genet.B1l.2008,45:473-484)。因此，需重视 DON 乙酰化产物的相关研究。
[0005]鉴于真菌毒素DON和乙酰化DON在小麦等谷物中普遍存在，继而对人类和动物的安全造成严重威胁的现实，近年来，针对DON及DON相关毒素的分析检测、体内外毒性研究及安全性评价等己引起广泛关注，这亦对于保证我国食品卫生安全具有重要意义。
[0006]但是由于国内DON标准品、参考品的制备尚属空白，而且目前欧美多国遵循禁止向非澳大利亚公约组织国家出售毒素及其代谢物标准品的禁运规定，给国内有关此类毒素的相关研究设置了较大障碍。因此，亟需研发一种简便的、可有效制备获得大量DON及乙酰化DON化合物的方法。
[0007]DON属于倍半萜烯类化合物，具有较为复杂的化学结构，迄今为止尚未实现DON的化学全合成。一般而言，DON毒素系从菌株培养提取后制备纯化而得。其中关键步骤之一为种子液的获得，即通过培养获得足够数量的大型分生孢子以作接种扩大培养之用。但采用传统震荡式培养时，菌丝的抱团生长会对孢子的产生造成极大限制，极其影响其后的接种效率。此外，DON适用的接种培养基分为固体(米饭或者麦粒)培养基和液体培养基。一般认为，固体培养基产生DON的效率要优于液体培养基，因此在DON毒素的制备纯化过程中，固体培养基仍是首选。但是，采用固体培养基培养时，由于小麦和大米中含有较丰富的蛋白质和糖类等组分，导致DON毒素粗提液中往往存在较多的杂质，进而导致了制备纯化步骤较为繁琐耗力，效率较低；而且，上述制备纯化步骤是否适用于粗提物中的乙酰化DON等相关毒素，尚未有相关报道述及。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于:针对目前DON毒素存在接种效率较低、制备纯化步骤繁琐以及效率低的实际问题，提供一种简便高效的DON及其乙酰化产物的大量培养制备及纯化方法。
[0009]本发明的目的通过下述步骤实现:一种DON毒素及乙酰化产物的大量培养制备及纯化方法，是利用禾谷镰刀菌产生DON毒素及乙酰化DON毒素，其特征之一在于:采用以液体培养基生成孢子，以固体培养基接种产毒；其特征之二在于:放置种子培养基的培养瓶中加入玻璃珠，再行震荡培养可限制菌丝的生长，优先生成大型分生孢子；其特征之三在于:从毒素粗提液中，仅需通过硅胶柱一步分离洗脱，即可获得纯DON毒素，并采取一步结晶法进行结晶；其特征之四在于:从毒素粗提液中，采用硅胶柱层析法同时纯化乙酰化DON毒素。具体的实施步骤是:
[0010]a)将禾谷镰刀菌经活化，接种于种子培养基中，培养瓶中放置有适当数目及合适粒径的玻璃珠，于25°C，200-250rpm摇床震荡培养3_5天，获得种子液；
[0011]所述“种子培养基”，是指能促进禾谷镰刀菌分生孢子生成的液体培养基，譬如本发明实施例中采用的4%绿豆水培养基。
[0012]所述玻璃珠“适当数目及合适粒径”是指在震荡培养中足以产生足够大的剪切力，从而有效抑制菌丝抱团生长的玻璃珠的选择条件，可依据培养瓶底面积及培养基体积进行调整。
[0013]b)种子液经六层纱布过滤除去菌丝，用血球计数器对过滤液中的大型分生孢子进行计数；
[0014]c)接种合适数量的孢子至无菌米饭培养基中，20?25°C静置培养，每天拍打瓶子底部防止培养基结块，适宜天数后获得固体培养物；
[0015]所述“合适数量的孢子”是指接种于米饭培养基中能产生最大产毒效率的孢子数目，可依据菌株不同进行相应优化，例如本发明实施例中比较每10g米饭培养基接种16?17孢子，最优选16孢子数。
[0016]所述“适宜天数”是指根据培养时间-浓度曲线所选择的培养时间，例如本发明实施例中的10?60天,最优选30?40天。
[0017]d)毒素粗提液制备。分别采用70%甲醇和纯甲醇溶液浸泡、超声固体培养物，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入1/3体积的饱和氯化钠水溶液，静置Ih后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取二次，将萃取所得的乙酸乙酯浓缩，得毒素的粗提取液；
[0018]e)湿法制备适宜规格的硅胶柱(20cmX2.5cm 1.d.)，将d)制备的毒素粗提液上样，以二氯甲烷和四氢呋喃体积比为10: 3的混合洗脱液一步洗脱；
[0019]所述“适宜规格”是指硅胶柱的硅胶粒径一般选择100?300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要选择。
[0020]f)收集第30?80mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有乙酰化DON毒素的情况，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩至获得棕红色油状物；
[0021]g)另干法制备适宜规格的硅胶柱(25cmX 1.0em 1.d.)，将f)中制备的棕红色油状物上样，以正己烷和乙酸乙酯体积比为1:1的混合液常压洗脱，保持流速大约为ImL/min,收集第适宜段流份，旋蒸至干，获得产物呈淡黄色油状物；
[0022]所述“适宜规格”是指硅胶柱的硅胶粒径一般选择100-300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要选择，
[0023]所述“适宜段流份”，是指需要通过TLC方法鉴别后，判断收集何段的流份洗脱液。
[0024]h)上步g)中获得的产物在乙酸乙酯和正己烷混合体系中结晶，抽滤后得白色晶体，即为纯化的乙酰化DON;
[0025]i)经e)步骤收集适宜段流份洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON毒素的情况；
[0026]所述“适宜段流份”，是指需要通过TLC方法鉴别后，判断收集何段的流份洗脱液。
[0027]j)合并含有DON毒素的收集管并旋转蒸干，溶解于少量的正己烷和乙醚体系中，进行结晶，获得纯化的DON毒素。
[0028]本发明的优点在于:通过种子培养基中玻璃珠的引入，大大提高分生孢子的产生效率；
[0029]本发明的优点还在于:改变常规多步骤分离洗脱的繁琐方法，采用一步洗脱分段收集及简单结晶法从毒素粗提取液中分别制备获得DON毒素及乙酰化DON毒素，由此提供了一种切实有效的、大量制备纯化DON相关毒素的简便方法。
【附图说明】
[0030]图1.DON及乙酰化DON毒素的培养制备及提取纯化流程图
[0031]图2.禾谷镰刀菌ACCC31058粗毒的液相色谱-质谱鉴定总离子流图
[0032]a.DON和3’ Ac-DON的混合标准品
[0033]b.DON和15’ Ac-DON的混合标准品
[0034]c.禾谷镰刀菌ACCC31058粗毒提取液
[0035]峰1:D0N 峰 2:3，Ac-DON 峰 3:15’ Ac-DON
[0036]图3.DON的质谱鉴定图谱(电喷雾MS及MS/MS图)
[0037]Mw296.1 ；m/z355.1 [M+CH3C00H-H] ^ ；m/z295.1 [Μ-ΗΓ ；m/z265.1 [M-CH2O-H] ^ ；
[0038]m/z247.1 [M-CH2O-H2O-H] ^ ；m/z217.1 [M-2CH20-H20_H] ^
[0039]图4.DON 的 1H-NMR 图谱
[0040]H2, 3.66 ;Η3，4.63 ;Η4，2.20 ;Η7，4.95 ；Η10, 6.79 ；Η11, 4.50 ；H13a, 3.14 ；13b,
3.25 ；Η14, 1.15 ；
[0041]H15a，3.66 ；H15b,3.98 ；Η16,1.92ppm
[0042]图5.3’ Ac-DON的质谱鉴定图谱(电喷雾MS及MS/MS图)
[0043]Mw338.1 ；m/z397.1 [M+CH3C00H-H]_ ；m/z383.1 [M+HCOOH-H] —；
[0044]m/z3 37.1 [M_H] ^ ；m/z307.1 [M-CH2O-H] ^ ；m/z247.1 [M-CH2O-CH2CO-H2O-H] ^ ；
[0045]m/z217.1 [M-2CH20-CH2C0-H20-H] ^
[0046]图6.3，Ac-DON 的 1H-NMR 图谱
[0047]H2, 3.91 ；H3, 5.23 ；H4b,2.18 ；H4a, 2.36 ；H7, 4.68 ；H10, 6.62 ；H11,4.84 ；H13a,
3.13 ；H13b,3.19 ；
[0048]H14,1.17 ；H15a, 3.80 ；H15b, 3.87 ；H16, 2.15ppm
[0049]图7.DON及3’ Ac-DON的培养时间-浓度曲线
【具体实施方式】
[0050]实施例1
[0051]禾谷镰刀菌ACCC31058(中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC)
[0052]实施步骤按流程图1进行。
[0053]将禾谷镰刀菌菌株从冷藏斜面转接到马铃薯葡萄糖培养基平板上活化，25°C培养3-5天，挑取少量的菌丝接种到4%绿豆水培养基中，其瓶底预先铺满约1/2底表面积的直径约4-5mm的玻璃珠，于25°C，200-250rpm摇床震荡培养3_5天，获得种子液。
[0054]种子液经纱布过滤除去菌丝，在显微镜下用血球计数器对过滤液中的大型分生孢子进行观察和计数。
[0055]在500mL三角烧瓶或克氏瓶中，加入87.5g大米后加入37.5mL蒸懼水,高压制备无菌米饭培养基。
[0056]接种I X 16孢子至上述米饭培养基中，20_25°C静置培养，每日拍打瓶子底部防止培养基结块，40天后收获固体培养物。
[0057]固体培养物分别采用70%甲醇和纯甲醇溶液浸泡过夜及超声，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入1/3体积的饱和氯化钠水溶液，静置Ih后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取2次，将萃取所得的乙酸乙酯合并浓缩，得到毒素的粗提取液。
[0058]将毒素粗提取液进行液相色谱-质谱分析，其总离子流质谱图见图2。从图2c可以看出，采用此方法培养禾谷镰刀菌ACCC31058产生的DON及3’ Ac-DON所占百分比较高，其他杂质较少，证明由该法制备的毒素粗提取液中，其DON及其乙酰化产物含量高，其他干扰物质含量较低。
[0059]毒素粗提液过制备型硅胶柱(300目，20cmX2.5cm 1.d.)，以二氯甲烷和四氢呋喃体积比为10: 3的混合洗脱液一步洗脱，保持流速约为lmL/min。
[0060]首先收集第30?SOmL流份，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩获得棕红色油状物。将此棕红色油状物过干法制备的硅胶柱(300目，25cmX1.0cm 1.d.)，以正己烷和乙酸乙酯体积比为1:1的混合液常压洗脱，保持流速约为lmL/min，收集第60?10mL流份，旋蒸至干，获得产物呈淡黄色油状物。将获得的产物在乙酸乙酯和正己烷混合体系中结晶，抽滤后得白色晶体，即为纯化的乙酰化DON ;
[0061]另收集第200?330mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON的情况，合并含有DON的收集管并旋转蒸干，溶解于少量的正己烷和乙醚体系中进行结晶，抽滤后得白色晶体，即为纯化的DON。
[0062]纯化的DON及乙酰化DON分别采用质谱法(电喷雾电离)及核磁共振法(1H-NMR)进行鉴定，结果见图3-6。
[0063]实施例2
[0064]禾谷镰刀菌ACCC31058 (中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC)
[0065]菌株培养及制备过程与实施例1的方法相同，在孢子接种米饭培养基后，进行培养天数和DON及乙酰化DON产量的时间-浓度曲线考察，结果见图7。图7表明随着培养时间的延长，乙酰化DON的产量呈下降趋势，而DON毒素在约40天培养时间处产量最高，随后亦下降。
[0066]实施例3
[0067]禾谷镰刀菌ACCC31057 (中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC)
[0068]菌株培养及制备过程与实施例1的方法相同，其区别仅在于，禾谷镰刀菌来源存在差异。
[0069]尽管本实施例采用的禾谷镰刀菌与实施例2的来源不同，完全采用实施例1方法同样顺利获得纯化DON毒素及乙酰化DON毒素，说明此方法具有很好的适应性。
[0070]对于本领域的技术人员而言，本权利要求中所述的制备纯化方法，完全能够想到将其应用于工业生产流程中，例如大规模发酵生产等，即使不提供任何实施例，这种用途和产品也完全可以预想得到。
【主权项】
1.一种同时制备DON毒素及其乙酰化衍生物的方法，其特征在于培养禾谷镰刀菌产生DON毒素及乙酰化DON毒素，培养中使用的种子培养基中加入玻璃珠；并且采用硅胶柱一步洗脱分段收集的方法，从毒素粗提液中可同时分别制备DON毒素和乙酰化DON毒素。2.根据权利要求1所述的同时制备DON毒素及其乙酰化衍生物的方法，具体制备纯化方法是: a)将禾谷镰刀菌活化，接种于种子培养基中培养获得种子液，培养基中预先放置玻璃珠; b)收集种子液，过滤，离心，重悬，获得分生孢子液； c)接种分生孢子于培养基中，静置培养后获得产毒培养物； d)使用溶剂对培养物进行提取，获得毒素粗提液，其中溶剂自由选自以下组成的组中:甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯或其混合物； e)使用硅胶柱精制毒素粗提液，使用薄层色谱(TLC)方法跟踪检测，分别收集含有乙酰化DON毒素和DON毒素的流份，旋转蒸干，结晶获得纯化的乙酰化DON毒素和DON毒素。3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:遵循先应用步骤a生成孢子再应用步骤c接种产毒的途径。4.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤a中种子培养基为能促进禾谷镰刀菌分生孢子生成的液体培养基。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述液体培养基为3%?4%绿豆水。6.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤a)中玻璃珠是指在震荡培养中足以产生足够大的剪切力，从而有效抑制菌丝抱团生长的玻璃珠，可依据培养瓶底面积及培养基体积调整其数目和粒径。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述玻璃珠的粒径为1-lOmm，数量为足够铺满培养瓶底面积的1/2。8.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤c)中的分生孢子的数量为接种于米饭培养基中能产生最大产毒效率的孢子数目，可依据菌株不同进行相应优化。9.根据权利要求8中所述的方法，其特征在于步骤c中接种大型分生孢子的数量为16?17单位至每10g含水量为30?40%的米饭培养基中。10.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤c)中静置培养的时间是指根据培养时间-浓度曲线所选择的培养时间。11.根据权利要求10中所述的方法，其特征在于静置培养的时间为30?40天。12.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤a)和c)中培养的温度，利于分生孢子以及毒素的产生，温度范围为4°C?50°C。13.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤d)使用溶剂对培养物进行提取的具体步骤为:分别采用70%甲醇和纯甲醇溶液浸泡、超声培养物，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入饱和氯化钠水溶液，静置后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取二次，将萃取所得的乙酸乙酯合并浓缩，得毒素的粗提取液。14.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤e)中所述硅胶柱是指硅胶柱的硅胶粒径选择100-300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要作相应调整，含有乙酰化DON毒素和DON毒素的流份是指收集流份的起始点和终止点需重新通过薄层色谱(TLC)鉴定方法加以确定。15.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤e)中所述使用硅胶柱精制毒素粗提液采用两次硅胶柱净化的方式，分段提取得到纯度较高的目标产物。16.根据权利要求1-15中所述的方法，其特征在于步骤e)中所述使用硅胶柱精制毒素粗提液的具体步骤为 1)湿法制备硅胶柱，将毒素粗提液上样，以混合洗脱液一步洗脱，保持流速约ImL/min ； 2)收集第30?80mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有乙酰化DON毒素的情况，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩至获得棕红色油状物； 3)另干法制备硅胶柱，将2)中制备的棕红色油状物上样，以正己烷和乙酸乙酯混合液常压洗脱，收集第60?10mL流份，旋蒸至干，获得淡黄色油状物，将该产物进行结晶，获得纯化的乙酰化DON; 4)经I)步骤收集第200?330mL流份洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON毒素的情况；合并含有DON毒素的收集管并旋转蒸干，进行结晶，获得纯化的DON毒素。17.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于:所述洗脱液自由选自以下组成的组中:二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、乙酸乙酯或其混合物。18.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于:所述结晶所使用的溶剂自由选自以下组成的组中:乙醚、正己烷、乙酸乙酯或其混合物。
【专利摘要】本发明涉及一种DON毒素及其乙酰化衍生物的制备纯化方法。在本发明中，通过种子培养基中玻璃珠的引入，能简便有效的抑制禾谷镰刀菌菌丝的产生，从而保证诱导主要生成大型分生孢子，有效获得种子液。本发明采用硅胶柱分离毒素粗提液，通过一步洗脱分离、分段收集不同流份可分别获得乙酰化DON毒素和DON毒素，并采用一步结晶法制备毒素纯品，其中乙酰化DON毒素结晶体系为乙酸乙酯和正己烷混合体系，DON毒素结晶体系为正己烷和乙醚混合体系。本发明改变常规多步骤分离洗脱的繁琐方法，采用一步洗脱分段收集及简单结晶法从毒素粗提取液中同时制备了两种毒素，从而提供一种切实有效的、大量制备纯化DON及乙酰化DON毒素的简便方法。
【IPC分类】C12R1/77, C12P17/18
【公开号】CN104894181
【申请号】CN201410078404
【发明人】谢剑炜, 徐华, 吴弼东, 郭磊, 陈佳, 林妮妮
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种DON毒素及乙酰化DON毒素的培养制备及提取纯化方法，特别是涉及一种简便有效培养禾谷镰刀菌大型分生孢子的方法，以及从接种培养物中同时分离提取纯化DON毒素及其乙酰化衍生物的方法。
【背景技术】
[0002]由镰刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight)是危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦等多种禾谷类作物的一种重要病害，广泛分布于北美、欧洲和亚洲等温暖潮湿地区，近年来随着全球气候变暖呈逐步蔓延之势。农作物在生长或储备过程中均可感染镰刀菌，不但造成作物产量下降，更重要的是产生的镰刀菌毒素直接留存累积在禾谷类籽粒中，严重威胁人畜健康。
[0003]在我国，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是赤霉病的主要病原菌。禾谷镰刀菌产生B族单端孢霉烯族毒素,其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名呕吐毒素(vomitoxin, VT)为主。DON依靠其半職烯结构作用于真核细胞蛋白质翻译过程的不同阶段，抑制蛋白质合成，破坏人畜的免疫系统，使中毒者出现腹泻、呕吐和头晕等症状，是最主要的导致食物中毒的真菌毒素之一。目前，各国针对谷物及其制品中DON的含量制定了严格的限量标准，我国谷物中DON的限量标准为1.0mg/kg(lppm)。
[0004]DON毒素具有两种乙酰化产物，分别为3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Acetyldeoxynivalenol, 3-AcD0N)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyldeoxynivalenol, 15-AcDON)。一般认为，乙酸化 DON 的毒性与 DON 相当。亦有研究报道，产生3-AcDON的镰刀菌具有更强的产孢率和生长速度，对麦类作物的危害更为严重，并且正在取代产生其他毒素的镰刀菌，表现出更强的适应性(Ward TJ et al，An adaptive evolut1nary shift in Fusarium head blight pathogen populat1nsis driving the rapid spread of more toxigenic Fusarium graminearum in NorthAmerica.Fungal Genet.B1l.2008,45:473-484)。因此，需重视 DON 乙酰化产物的相关研究。
[0005]鉴于真菌毒素DON和乙酰化DON在小麦等谷物中普遍存在，继而对人类和动物的安全造成严重威胁的现实，近年来，针对DON及DON相关毒素的分析检测、体内外毒性研究及安全性评价等己引起广泛关注，这亦对于保证我国食品卫生安全具有重要意义。
[0006]但是由于国内DON标准品、参考品的制备尚属空白，而且目前欧美多国遵循禁止向非澳大利亚公约组织国家出售毒素及其代谢物标准品的禁运规定，给国内有关此类毒素的相关研究设置了较大障碍。因此，亟需研发一种简便的、可有效制备获得大量DON及乙酰化DON化合物的方法。
[0007]DON属于倍半萜烯类化合物，具有较为复杂的化学结构，迄今为止尚未实现DON的化学全合成。一般而言，DON毒素系从菌株培养提取后制备纯化而得。其中关键步骤之一为种子液的获得，即通过培养获得足够数量的大型分生孢子以作接种扩大培养之用。但采用传统震荡式培养时，菌丝的抱团生长会对孢子的产生造成极大限制，极其影响其后的接种效率。此外，DON适用的接种培养基分为固体(米饭或者麦粒)培养基和液体培养基。一般认为，固体培养基产生DON的效率要优于液体培养基，因此在DON毒素的制备纯化过程中，固体培养基仍是首选。但是，采用固体培养基培养时，由于小麦和大米中含有较丰富的蛋白质和糖类等组分，导致DON毒素粗提液中往往存在较多的杂质，进而导致了制备纯化步骤较为繁琐耗力，效率较低；而且，上述制备纯化步骤是否适用于粗提物中的乙酰化DON等相关毒素，尚未有相关报道述及。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于:针对目前DON毒素存在接种效率较低、制备纯化步骤繁琐以及效率低的实际问题，提供一种简便高效的DON及其乙酰化产物的大量培养制备及纯化方法。
[0009]本发明的目的通过下述步骤实现:一种DON毒素及乙酰化产物的大量培养制备及纯化方法，是利用禾谷镰刀菌产生DON毒素及乙酰化DON毒素，其特征之一在于:采用以液体培养基生成孢子，以固体培养基接种产毒；其特征之二在于:放置种子培养基的培养瓶中加入玻璃珠，再行震荡培养可限制菌丝的生长，优先生成大型分生孢子；其特征之三在于:从毒素粗提液中，仅需通过硅胶柱一步分离洗脱，即可获得纯DON毒素，并采取一步结晶法进行结晶；其特征之四在于:从毒素粗提液中，采用硅胶柱层析法同时纯化乙酰化DON毒素。具体的实施步骤是:
[0010]a)将禾谷镰刀菌经活化，接种于种子培养基中，培养瓶中放置有适当数目及合适粒径的玻璃珠，于25°C，200-250rpm摇床震荡培养3_5天，获得种子液；
[0011]所述“种子培养基”，是指能促进禾谷镰刀菌分生孢子生成的液体培养基，譬如本发明实施例中采用的4%绿豆水培养基。
[0012]所述玻璃珠“适当数目及合适粒径”是指在震荡培养中足以产生足够大的剪切力，从而有效抑制菌丝抱团生长的玻璃珠的选择条件，可依据培养瓶底面积及培养基体积进行调整。
[0013]b)种子液经六层纱布过滤除去菌丝，用血球计数器对过滤液中的大型分生孢子进行计数；
[0014]c)接种合适数量的孢子至无菌米饭培养基中，20?25°C静置培养，每天拍打瓶子底部防止培养基结块，适宜天数后获得固体培养物；
[0015]所述“合适数量的孢子”是指接种于米饭培养基中能产生最大产毒效率的孢子数目，可依据菌株不同进行相应优化，例如本发明实施例中比较每10g米饭培养基接种16?17孢子，最优选16孢子数。
[0016]所述“适宜天数”是指根据培养时间-浓度曲线所选择的培养时间，例如本发明实施例中的10?60天,最优选30?40天。
[0017]d)毒素粗提液制备。分别采用70%甲醇和纯甲醇溶液浸泡、超声固体培养物，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入1/3体积的饱和氯化钠水溶液，静置Ih后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取二次，将萃取所得的乙酸乙酯浓缩，得毒素的粗提取液；
[0018]e)湿法制备适宜规格的硅胶柱(20cmX2.5cm 1.d.)，将d)制备的毒素粗提液上样，以二氯甲烷和四氢呋喃体积比为10: 3的混合洗脱液一步洗脱；
[0019]所述“适宜规格”是指硅胶柱的硅胶粒径一般选择100?300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要选择。
[0020]f)收集第30?80mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有乙酰化DON毒素的情况，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩至获得棕红色油状物；
[0021]g)另干法制备适宜规格的硅胶柱(25cmX 1.0em 1.d.)，将f)中制备的棕红色油状物上样，以正己烷和乙酸乙酯体积比为1:1的混合液常压洗脱，保持流速大约为ImL/min,收集第适宜段流份，旋蒸至干，获得产物呈淡黄色油状物；
[0022]所述“适宜规格”是指硅胶柱的硅胶粒径一般选择100-300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要选择，
[0023]所述“适宜段流份”，是指需要通过TLC方法鉴别后，判断收集何段的流份洗脱液。
[0024]h)上步g)中获得的产物在乙酸乙酯和正己烷混合体系中结晶，抽滤后得白色晶体，即为纯化的乙酰化DON;
[0025]i)经e)步骤收集适宜段流份洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON毒素的情况；
[0026]所述“适宜段流份”，是指需要通过TLC方法鉴别后，判断收集何段的流份洗脱液。
[0027]j)合并含有DON毒素的收集管并旋转蒸干，溶解于少量的正己烷和乙醚体系中，进行结晶，获得纯化的DON毒素。
[0028]本发明的优点在于:通过种子培养基中玻璃珠的引入，大大提高分生孢子的产生效率；
[0029]本发明的优点还在于:改变常规多步骤分离洗脱的繁琐方法，采用一步洗脱分段收集及简单结晶法从毒素粗提取液中分别制备获得DON毒素及乙酰化DON毒素，由此提供了一种切实有效的、大量制备纯化DON相关毒素的简便方法。
【附图说明】
[0030]图1.DON及乙酰化DON毒素的培养制备及提取纯化流程图
[0031]图2.禾谷镰刀菌ACCC31058粗毒的液相色谱-质谱鉴定总离子流图
[0032]a.DON和3’ Ac-DON的混合标准品
[0033]b.DON和15’ Ac-DON的混合标准品
[0034]c.禾谷镰刀菌ACCC31058粗毒提取液
[0035]峰1:D0N 峰 2:3，Ac-DON 峰 3:15’ Ac-DON
[0036]图3.DON的质谱鉴定图谱(电喷雾MS及MS/MS图)
[0037]Mw296.1 ；m/z355.1 [M+CH3C00H-H] ^ ；m/z295.1 [Μ-ΗΓ ；m/z265.1 [M-CH2O-H] ^ ；
[0038]m/z247.1 [M-CH2O-H2O-H] ^ ；m/z217.1 [M-2CH20-H20_H] ^
[0039]图4.DON 的 1H-NMR 图谱
[0040]H2, 3.66 ;Η3，4.63 ;Η4，2.20 ;Η7，4.95 ；Η10, 6.79 ；Η11, 4.50 ；H13a, 3.14 ；13b,
3.25 ；Η14, 1.15 ；
[0041]H15a，3.66 ；H15b,3.98 ；Η16,1.92ppm
[0042]图5.3’ Ac-DON的质谱鉴定图谱(电喷雾MS及MS/MS图)
[0043]Mw338.1 ；m/z397.1 [M+CH3C00H-H]_ ；m/z383.1 [M+HCOOH-H] —；
[0044]m/z3 37.1 [M_H] ^ ；m/z307.1 [M-CH2O-H] ^ ；m/z247.1 [M-CH2O-CH2CO-H2O-H] ^ ；
[0045]m/z217.1 [M-2CH20-CH2C0-H20-H] ^
[0046]图6.3，Ac-DON 的 1H-NMR 图谱
[0047]H2, 3.91 ；H3, 5.23 ；H4b,2.18 ；H4a, 2.36 ；H7, 4.68 ；H10, 6.62 ；H11,4.84 ；H13a,
3.13 ；H13b,3.19 ；
[0048]H14,1.17 ；H15a, 3.80 ；H15b, 3.87 ；H16, 2.15ppm
[0049]图7.DON及3’ Ac-DON的培养时间-浓度曲线
【具体实施方式】
[0050]实施例1
[0051]禾谷镰刀菌ACCC31058(中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC)
[0052]实施步骤按流程图1进行。
[0053]将禾谷镰刀菌菌株从冷藏斜面转接到马铃薯葡萄糖培养基平板上活化，25°C培养3-5天，挑取少量的菌丝接种到4%绿豆水培养基中，其瓶底预先铺满约1/2底表面积的直径约4-5mm的玻璃珠，于25°C，200-250rpm摇床震荡培养3_5天，获得种子液。
[0054]种子液经纱布过滤除去菌丝，在显微镜下用血球计数器对过滤液中的大型分生孢子进行观察和计数。
[0055]在500mL三角烧瓶或克氏瓶中，加入87.5g大米后加入37.5mL蒸懼水,高压制备无菌米饭培养基。
[0056]接种I X 16孢子至上述米饭培养基中，20_25°C静置培养，每日拍打瓶子底部防止培养基结块，40天后收获固体培养物。
[0057]固体培养物分别采用70%甲醇和纯甲醇溶液浸泡过夜及超声，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入1/3体积的饱和氯化钠水溶液，静置Ih后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取2次，将萃取所得的乙酸乙酯合并浓缩，得到毒素的粗提取液。
[0058]将毒素粗提取液进行液相色谱-质谱分析，其总离子流质谱图见图2。从图2c可以看出，采用此方法培养禾谷镰刀菌ACCC31058产生的DON及3’ Ac-DON所占百分比较高，其他杂质较少，证明由该法制备的毒素粗提取液中，其DON及其乙酰化产物含量高，其他干扰物质含量较低。
[0059]毒素粗提液过制备型硅胶柱(300目，20cmX2.5cm 1.d.)，以二氯甲烷和四氢呋喃体积比为10: 3的混合洗脱液一步洗脱，保持流速约为lmL/min。
[0060]首先收集第30?SOmL流份，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩获得棕红色油状物。将此棕红色油状物过干法制备的硅胶柱(300目，25cmX1.0cm 1.d.)，以正己烷和乙酸乙酯体积比为1:1的混合液常压洗脱，保持流速约为lmL/min，收集第60?10mL流份，旋蒸至干，获得产物呈淡黄色油状物。将获得的产物在乙酸乙酯和正己烷混合体系中结晶，抽滤后得白色晶体，即为纯化的乙酰化DON ;
[0061]另收集第200?330mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON的情况，合并含有DON的收集管并旋转蒸干，溶解于少量的正己烷和乙醚体系中进行结晶，抽滤后得白色晶体，即为纯化的DON。
[0062]纯化的DON及乙酰化DON分别采用质谱法(电喷雾电离)及核磁共振法(1H-NMR)进行鉴定，结果见图3-6。
[0063]实施例2
[0064]禾谷镰刀菌ACCC31058 (中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC)
[0065]菌株培养及制备过程与实施例1的方法相同，在孢子接种米饭培养基后，进行培养天数和DON及乙酰化DON产量的时间-浓度曲线考察，结果见图7。图7表明随着培养时间的延长，乙酰化DON的产量呈下降趋势，而DON毒素在约40天培养时间处产量最高，随后亦下降。
[0066]实施例3
[0067]禾谷镰刀菌ACCC31057 (中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC)
[0068]菌株培养及制备过程与实施例1的方法相同，其区别仅在于，禾谷镰刀菌来源存在差异。
[0069]尽管本实施例采用的禾谷镰刀菌与实施例2的来源不同，完全采用实施例1方法同样顺利获得纯化DON毒素及乙酰化DON毒素，说明此方法具有很好的适应性。
[0070]对于本领域的技术人员而言，本权利要求中所述的制备纯化方法，完全能够想到将其应用于工业生产流程中，例如大规模发酵生产等，即使不提供任何实施例，这种用途和产品也完全可以预想得到。
【主权项】
1.一种同时制备DON毒素及其乙酰化衍生物的方法，其特征在于培养禾谷镰刀菌产生DON毒素及乙酰化DON毒素，培养中使用的种子培养基中加入玻璃珠；并且采用硅胶柱一步洗脱分段收集的方法，从毒素粗提液中可同时分别制备DON毒素和乙酰化DON毒素。2.根据权利要求1所述的同时制备DON毒素及其乙酰化衍生物的方法，具体制备纯化方法是: a)将禾谷镰刀菌活化，接种于种子培养基中培养获得种子液，培养基中预先放置玻璃珠; b)收集种子液，过滤，离心，重悬，获得分生孢子液； c)接种分生孢子于培养基中，静置培养后获得产毒培养物； d)使用溶剂对培养物进行提取，获得毒素粗提液，其中溶剂自由选自以下组成的组中:甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯或其混合物； e)使用硅胶柱精制毒素粗提液，使用薄层色谱(TLC)方法跟踪检测，分别收集含有乙酰化DON毒素和DON毒素的流份，旋转蒸干，结晶获得纯化的乙酰化DON毒素和DON毒素。3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:遵循先应用步骤a生成孢子再应用步骤c接种产毒的途径。4.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤a中种子培养基为能促进禾谷镰刀菌分生孢子生成的液体培养基。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述液体培养基为3%?4%绿豆水。6.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤a)中玻璃珠是指在震荡培养中足以产生足够大的剪切力，从而有效抑制菌丝抱团生长的玻璃珠，可依据培养瓶底面积及培养基体积调整其数目和粒径。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述玻璃珠的粒径为1-lOmm，数量为足够铺满培养瓶底面积的1/2。8.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤c)中的分生孢子的数量为接种于米饭培养基中能产生最大产毒效率的孢子数目，可依据菌株不同进行相应优化。9.根据权利要求8中所述的方法，其特征在于步骤c中接种大型分生孢子的数量为16?17单位至每10g含水量为30?40%的米饭培养基中。10.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤c)中静置培养的时间是指根据培养时间-浓度曲线所选择的培养时间。11.根据权利要求10中所述的方法，其特征在于静置培养的时间为30?40天。12.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤a)和c)中培养的温度，利于分生孢子以及毒素的产生，温度范围为4°C?50°C。13.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤d)使用溶剂对培养物进行提取的具体步骤为:分别采用70%甲醇和纯甲醇溶液浸泡、超声培养物，合并提取液，减压蒸去甲醇，加入饱和氯化钠水溶液，静置后去除沉淀，用乙酸乙酯萃取二次，将萃取所得的乙酸乙酯合并浓缩，得毒素的粗提取液。14.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤e)中所述硅胶柱是指硅胶柱的硅胶粒径选择100-300目，硅胶柱装填的规格可以依据实验需要作相应调整，含有乙酰化DON毒素和DON毒素的流份是指收集流份的起始点和终止点需重新通过薄层色谱(TLC)鉴定方法加以确定。15.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于:步骤e)中所述使用硅胶柱精制毒素粗提液采用两次硅胶柱净化的方式，分段提取得到纯度较高的目标产物。16.根据权利要求1-15中所述的方法，其特征在于步骤e)中所述使用硅胶柱精制毒素粗提液的具体步骤为 1)湿法制备硅胶柱，将毒素粗提液上样，以混合洗脱液一步洗脱，保持流速约ImL/min ； 2)收集第30?80mL流份，用TLC方法检测每管洗脱液中含有乙酰化DON毒素的情况，将目标流份合并蒸干后用正己烷提取3次，弃去正己烷相，剩余溶液浓缩至获得棕红色油状物； 3)另干法制备硅胶柱，将2)中制备的棕红色油状物上样，以正己烷和乙酸乙酯混合液常压洗脱，收集第60?10mL流份，旋蒸至干，获得淡黄色油状物，将该产物进行结晶，获得纯化的乙酰化DON; 4)经I)步骤收集第200?330mL流份洗脱液，用TLC方法检测每管洗脱液中含有DON毒素的情况；合并含有DON毒素的收集管并旋转蒸干，进行结晶，获得纯化的DON毒素。17.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于:所述洗脱液自由选自以下组成的组中:二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、乙酸乙酯或其混合物。18.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于:所述结晶所使用的溶剂自由选自以下组成的组中:乙醚、正己烷、乙酸乙酯或其混合物。
【专利摘要】本发明涉及一种DON毒素及其乙酰化衍生物的制备纯化方法。在本发明中，通过种子培养基中玻璃珠的引入，能简便有效的抑制禾谷镰刀菌菌丝的产生，从而保证诱导主要生成大型分生孢子，有效获得种子液。本发明采用硅胶柱分离毒素粗提液，通过一步洗脱分离、分段收集不同流份可分别获得乙酰化DON毒素和DON毒素，并采用一步结晶法制备毒素纯品，其中乙酰化DON毒素结晶体系为乙酸乙酯和正己烷混合体系，DON毒素结晶体系为正己烷和乙醚混合体系。本发明改变常规多步骤分离洗脱的繁琐方法，采用一步洗脱分段收集及简单结晶法从毒素粗提取液中同时制备了两种毒素，从而提供一种切实有效的、大量制备纯化DON及乙酰化DON毒素的简便方法。
【IPC分类】C12R1/77, C12P17/18
【公开号】CN104894181
【申请号】CN201410078404
【发明人】谢剑炜, 徐华, 吴弼东, 郭磊, 陈佳, 林妮妮
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
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