一种用珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素p-3的方法
一种用珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素p-3的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 p-3的方法，属于生物发酵
技术领域。
【背景技术】
[0002] 安丝菌素（Ansamitocin)是从放线菌如珍贵橙色束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum)产生的高细胞毒性的化合物。安丝菌素的作用机理是抑制微管蛋白的组装，从 而抑制细胞分裂。安丝菌素的细胞毒性非常强，是传统化疗药物长春花碱、甲氨蝶呤和柔红 霉素的100-1000倍。
[0003] 安丝菌素属于大环内酯类化合物，其结构与美登醇相似。珍贵橙色束丝放线菌表 达的安丝菌素主要包括6种同系物，包括Ρ-1、Ρ-2、Ρ-3、Ρ-3'、P-4和P-4'，其中P-3为其主 要产物，安丝菌素同系物的结构如下式所示。
[0004]
[0005] 安丝菌素具有高效的抗B-16黑色素瘤、恶性毒瘤180及P185肥大细胞瘤等活 性。经过化学转变能合成含硫醇的美登素，虽然美登素类化合物因其极强的细胞毒性而在 肿瘤治疗领域受到关注，但是在美国的II期临床研宄表明其具有剂量限制毒性而被排除 临床应用，然而美登素可作为合成抗体偶联药物的"弹头"，具有令人满意的疗效和较低的 毒副作用，例如，罗氏公司的以DMl作为药物"弹头"的trastuzumab emtansine (T-DM1， Kadcyla?)已经于2013年2月22日被美国PDA批准上市，用于治疗乳腺癌。
[0006] 美登素最初是从卫矛科、鼠李科、大戟科及苔藓等高等植物分离得到，但是其在植 物中含量极低，提取的成本高、效率低，同时由于其复杂的结构，化学全合成也有成本高、收 率低的缺点。因此，通过微生物发酵获得其前体安丝菌素再转化成美登素成为一种经济高 效的方式。珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素中安丝菌素 p-3的含量最高，由于其活性 高、结构稳定、疏水性强已于萃取，成为合成美登素的最佳前体。因此通过放线菌发酵选择 性地高表达安丝菌素 P-3,对于其在抗肿瘤药物中的应用具有非常重要的意义。
[0007] 现有技术报道的安丝菌素的制备工艺中，安丝菌素 P-3最高产量是使用基因突 变株 Actinosynnema pretiosum PF4_4(ATCC PTA-3921)在 900L 发酵罐规模中 304mg/L， 20mL/250mL 摇床中 435mg/L(CN101103120A，TO03/064610A2)。其他现有技术 US4162940、 US4450234、US4228239、US4331598 以及 US4356265,安丝菌素的产量一般在 12 ~100mg/L， 安丝菌素 P-3所占比例低于70%，并且其中混有不少不希望产生的安丝菌素成分，如N-脱 甲基、20-0-脱甲基和19-脱氯处被修饰的产物，在还原性脱酰作用下这些产物不能合成美 登醇。
[0008] 目前，放线菌发酵安丝菌素的产量较低，生产成本高，安丝菌素 P-3所占比例低， 并且纯化工艺繁琐，涉及多种剧毒材料的处理，进行大规模生产非常困难。此外，在各个工 艺步骤中还必须确保操作人员的安全。因此，筛选高表达安丝菌素的菌株或通过发酵工艺 优化提高选择性地高表达安丝菌素 P-3,对于安丝菌素的规模化生产和促进其在抗肿瘤药 物中的应用具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术的不足，提供一种从珍贵橙色束丝放线菌发酵生产安丝菌素 P-3的方法。
[0010] 本发明的主要技术方案是选用高表达安丝菌素的珍贵橙色束丝放线菌，通过优化 发酵培养基配方、发酵条件和补料工艺实现安丝菌素的高产量，并使其中安丝菌素 P-3所 占比例提尚。
[0011] 本发明的技术方案如下：
[0012] 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 p-3的方法，步骤如下：
[0013] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿 划线培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子；
[0014] (2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养 30~50h，获得种子液；
[0015] (3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养， 溶氧控制20%以上，发酵持续时间350~450h ;
[0016] 步骤⑴中所述束丝放线菌优选的为珍贵橙色束丝放线菌 ATCC31565(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；
[0017] 步骤（1)中所述固体培养基组分如下，均为重量百分比：
[0018] 酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨0.3~1.0%、麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油 0.5~L 5%，琼脂粉L 5~2. 2%，自然pH;
[0019] 优选地，所述步骤（1)中的孢子是在培养温度为27~29°C条件下，于固体培养基 培养皿倒置培养4~8天后制得的；所述培养皿直径90mm，所装培养基15~20mL ;
[0020] 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分如下，均为重量百分比：
[0021] 玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆蛋白胨0.5~2%，pH为7.0~8.0 ;
[0022] 优选地，所述步骤（2)中培养温度为27. 5~28. 5°C，培养时间为30~40h，优选 34 ~38h ;
[0023] 步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
[0024] 玉米淀粉4~7%，玉米浆干粉1. 5~2. 5%，热榨豆饼粉1~3%，葡萄糖0. 1~ 1%，Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 02 ~0· 03%，MgS04 ·7Η20 0· 1 ~l%，CaC030. 3 ~0· 7%，CaC120. 05 ~ 0· 2 %，异丁醇 0· 2 ~0· 5 %，CoCl2 · 6H20 0· 0002 ~0· 001 %，FeSO4 · 7H20 0· 0001 ~ 0.0003%，pH 为 6. 8 ~7.5 ;
[0025] 优选地，所述步骤（3)中的液体发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
[0026] 玉米淀粉5%，玉米浆干粉2%，葡萄糖0.5%，热榨豆饼粉2%，K2HPO 4 · 3H20 0· 025 %，MgSO4 · 7H20 0· 3 %，CaCO3O. 4 %，CaCl2O. 1 %，异丁醇 0· 3 %，CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，FeSO4 · 7H20 0· 0002 %，pH 为 7· 2 ;
[0027] 步骤（3)中所述的种子液按8~12 %的接种量接种到液体发酵培养基进行发酵培 养；发酵培养温度为28°C，溶氧控制30%以上，发酵持续时间400~432h ;
[0028] 具体地，步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20~25% 的葡萄糖溶液，流速0. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后补加含有20~30 %的葡萄糖和 5~15%热榨豆饼粉，流速0. 8~I. 2mL/L/h，同时，开始添加异丁醇，添加方式为每24h每 升发酵液一次性添加1. 5~2. 5mL，直至发酵结束；
[0029] 优选地，发酵至48~72h后补加的葡萄糖浓度为23~27%，热榨豆饼粉浓度为 8~12 %，异丁醇添加方式为每24h每升发酵液一次性添加1. 8~2mL，直至发酵结束。
[0030] 本发明技术方案的关键点在于：
[0031] (1)在发酵培养基和补加的成分中添加热榨豆饼粉，热榨豆饼粉的主要成分为不 溶性蛋白，作为长效氮源可以延长发酵周期并大幅提高发酵后期发酵液中菌丝的浓度，从 而提高安丝菌素 P-3的产量；
[0032] (2)在补料发酵培养时，现有技术中异丁醇的添加方式为流加方式或在某个特定 时间一次添加；本发明改进异丁醇的添加方式为每24h每升发酵液一次性添加1. 8~2mL， 直至发酵结束；通过改进异丁醇补加方式，安丝菌素 P-3产量可提高40%以上。
[0033] 本发明的优选技术方案之一为：
[0034] 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 P-3的方法，步骤如下：
[0035] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿 划线培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子；
[0036] (2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养 30~50h，获得种子液；
[0037] (3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养， 溶氧控制20%以上，发酵持续时间350~450h ;
[0038] 步骤（1)中所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565 (Actinosynnema pretiosum ATCC31565);所述的固体培养基的组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、 麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，均为重量百 分比，自然pH ;
[0039] 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0. 5~2%， 大豆蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比，pH为7. 0~8. 0 ;
[0040] 步骤（3)中所述的液体发酵培养基的组分为玉米淀粉4~7%，玉米浆干粉1.5~ 2. 5%，热榨豆饼粉 1 ~3%，葡萄糖 0· 1 ~1%，K2HPO4 · 3H20 0· 02 ~0· 03%，MgSO4 · 7H20 0· 1 ~1 %，CaCO3O. 3 ~0· 7 %，CaC120. 05 ~0· 2 %，异丁醇 0· 2 ~0· 5 %，CoCl2 · 6H20 0· 0002 ~0· 001%，FeSO4 · 7Η200· OOOl ~0· 0003%，均为重量百分比，pH 为 6· 8 ~7· 5 ;
[0041] 步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20~25 %的葡萄糖 溶液，流速〇. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后补加含有20~30 %的葡萄糖和5~15 % 热榨豆饼粉的补料液，流速〇. 8~I. 2mL/L/h，同时，每24h每升发酵液一次性添加1. 8~ 2. OmL的异丁醇，直至发酵结束。
[0042] 本发明的另一优选技术方案为：
[0043] 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 P-3的方法，步骤如下：
[0044] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿 划线培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子；
[0045] (2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养 30~50h，获得种子液；
[0046] (3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养， 溶氧控制20%以上，发酵持续时间350~450h ;
[0047] 步骤（1)中所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565 (Actinosynnema pretiosum ATCC31565);所述的固体培养基的组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，均为重量百 分比，自然pH ;
[0048] 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0· 5~2%， 大豆蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比，pH为7. 0~8. 0 ;
[0049] 步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分为，玉米淀粉5 %，玉米浆干粉2 %，热榨豆 饼粉2%，葡萄糖0· 5%，Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 025%，MgS04 ·7Η20 0· 3%，CaC030 . 4%，CaCl20. 1%， 异丁醇 0.3%，CoCl2 ·6Η20 0.0005%，FeSO4 · 7H20 0.0002%，pH 为 7.2,均为重量百分比。
[0050] 本发明方法制备得到的安丝菌素 P-3用于合成美登素的应用。
[0051] 本发明的有益效果如下：
[0052] 1、通过本发明方法获得的珍贵橙色束丝放线菌发酵液中，安丝菌素 P-3的含量最 高可达1200mg/L以上，远高于目前现有技术的水平；
[0053] 2、通过本发明方法发酵得到的安丝菌素中安丝菌素 P-3的比例达到93%以上，节 省了生产成本，并非常有利于后期的纯化过程，适于工业化生产；
[0054] 3、通过本发明方法发酵得到的安丝菌素 P-3用于合成美登素生产成本低，收率 高，纯度高。
【附图说明】
[0055] 图1、实施例3发酵液中最终安丝菌素 P-3的HPLC检测图谱；
【具体实施方式】
[0056] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是，应当理解，这些实施例 和仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。
[0057] 实施例中所用菌种为珍贵橙色束丝放线菌Actinosynnema pretiosum ATCC31565,购自美国菌种保藏中心ATCC，所用酵母提取物购自英国Oxiod公司，麦芽浸 膏购自北京奥博星公司，玉米浆干粉购自江苏新沂恒惠淀粉糖有限公司，热榨豆饼粉购 自莒南北兴粮油有限公司，玉米淀粉购自内蒙古融成玉米开发有限公司，葡萄糖、甘油、 K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaC03、CaCl2、CoCl2 · 6H20、FeSO4 · 7H20 和异丁醇购自国药集团 化学试剂有限公司，其他试剂均为普通市售产品。
[0058] 实施例1 :50L罐分批补料发酵（发酵培养时未添加热榨豆饼粉，异丁醇的补加方 式为流加）
[0059] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的珍贵橙色束丝放线菌孢子在固体培养 基培养皿划线培养，28°C倒置培养6天；
[0060] 固体培养基配方：酵母提取物0. 3%，大豆蛋白胨0. 5%、麦芽浸膏0. 3%，甘油 1%，琼脂粉2%，自然pH;
[0061] (2)种子培养：在IOL发酵罐中加入6L液体种子培养基，121°C灭菌30min后，从 培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基；28°C进行培养，通气量0. 4vvm，以80rpm的转速 搅拌；培养过程通过调整通气量和增强搅拌使溶氧保持在30 %以上，最大通气量lvvm，最 大转速350rpm，在培养36h后获得种子液；
[0062] 液体种子培养基配方：玉米淀粉3%，酵母粉0. 7%，大豆蛋白胨1. 5%，初始pH为 7. 2 ；
[0063] (3)发酵培养：50L发酵罐中加入30L液体发酵培养基，取培养好的3L种子液接种 于液体发酵培养基；发酵罐保持28°C，初始搅拌转速80rpm，初始通气量0. 4vvm，培养20h 后，根据溶氧提高通气量和搅拌速度，最大通气lvvm，最大搅拌速度700rpm，发酵过程不控 制pH ;
[0064] 液体发酵培养基为：玉米淀粉5 %，玉米浆干粉2. 5 %，葡萄糖0. 5 %， K2HPO4 · 3Η200· 025 %，MgSO4 · 7H20 0· 3 %，CaCO3O. 4 %，CaCl2O. 1 %，异丁醇 0· 3 %， CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，FeSO4 · 7H20 0· 0002 %，初始 pH 7. 2 ;
[0065] 发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h的流速补加22. 5%的葡萄糖溶液，发酵60h后，以 lmL/L/h的速率补加含有25%葡萄糖、10%玉米浆干粉和10%异丁醇的补料液，发酵培养 至264h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到385mg/L ;
[0066] (4)样品处理及检测方法：取发酵液ImL加入4mL的无水甲醇，超声萃取20min，离 心取上清，用0. 22 μ m的滤膜过滤后用HPLC检测安丝菌素 P-3的含量。HPLC所用色谱柱为 C18 柱（Waters，150mmX4.6mm，5ym);流动相为甲醇：水=75:25，流速1.〇11117/111；[11，检测波 长 246nm，注温 30°C。
[0067] 实施例2 :50L罐分批补料发酵（发酵培养时添加热榨豆饼粉，异丁醇的补加方式 为流加）
[0068] (1)孢子培养：如实施例1 ;
[0069] ⑵种子培养：如实施例1 ;
[0070] (3)发酵培养：如实施例1，所不同的是液体发酵培养基为：玉米淀粉5%，玉米 浆干粉 2 %，热榨豆饼粉 2%，葡萄糖 0.5%，K2HPO4 · 3H20 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 3%， CaCO3O. 4 %，CaCl2O. I %，异丁醇 0· 3 %，CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，FeSO4 · 7H20 0· 0002 %，初 始 pH 7. 2 ;
[0071] 发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h的流速补加22. 5%的葡萄糖溶液，发酵60h后，以 lmL/L/h的速率补加含有25%葡萄糖、10%热榨豆饼粉和10%异丁醇的补料液，发酵培养 至412h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到863mg/L ;
[0072] (4)样品处理及检测方法：如实施例1。
[0073] 实施例3 :50L罐分批补料发酵
[0074] (1)孢子培养：如实施例1 ;
[0075] (2)种子培养：如实施例1 ;
[0076] (3)发酵培养：如实施例2,所不同的是补料工艺，发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h 的流速补加22. 5 %的葡萄糖溶液，发酵60h后，以lmL/L/h的速率补加含有25 %葡萄糖、 10%热榨豆饼粉的补料液，异丁醇补加采用每24h -次性添加55m L的方式；发酵培养至 408h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到1211mg/L(如图1所 示）；
[0077] (4)样品处理及检测方法如实施例1。
[0078] 实施例4 : IOt罐分批补料发酵
[0079] (1)孢子培养：如实施例1 ;
[0080] (2)种子培养：在500L发酵罐中加入300L液体种子培养基，120°C灭菌30min后， 从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基；28°C进行培养，通气量0. 4vvm，以80rpm的转 速搅拌，培养过程通过调整通气量和增强搅拌使溶氧保持在30 %以上，在培养36h后获得 种子液；
[0081] 液体种子培养基配方如实施例1 ;
[0082] (3)发酵培养：10t发酵罐中加入6t液体发酵培养基，培养基配方如实施例2。取 培养好的600L种子液接种于液体发酵培养基，发酵罐保持28°C，搅拌转速80rpm，初始通 气量〇. 4vvm，培养20h后，根据溶氧提高通气量和搅拌速度，最大通气lvvm，最大搅拌速度 180rpm ；
[0083] 发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h的流速补加22. 5%的葡萄糖溶液，发酵60h后，以 lmL/L/h的速率补加含有25 %葡萄糖、10%热榨豆饼粉的补料液，每24h -次性添加异丁 醇IlL ;发酵培养至432h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到 1124mg/L ；
[0084] (4)样品处理及检测方法如实施例1。
[0085] 由上述实施例可以看出，实施例1在发酵培养时未添加热榨豆饼粉，异丁醇的补 加方式为流加，安丝菌素 P-3的表达量只有385mg/L ;实施例2虽然添加了热炸豆饼粉，但 异丁醇的补加方式仍为流加，安丝菌素 P-3的表达量已提升到863mg/L ;实施例3、4在发酵 培养时既添加了热炸豆饼粉，异丁醇的补加方式改为每24h -次性添加，直至发酵结束，安 丝菌素 P-3的表达量可以达到1200mg/L左右甚至高于1200mg/L。
【主权项】
1. 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，步骤如下： (1) 孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线 培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子； (2) 种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养30~ 50h，获得种子液； (3) 发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养，溶氧 控制20%以上，发酵持续时间350~450h; 步骤（1)中所述束丝放线菌优选的为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565(Actinosynnema pretiosumATCC31565);所述固体培养基组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨0. 3~1. 〇%、麦芽浸膏〇. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，自然pH，均为重量 百分比； 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆 蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比； 步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分为玉米淀粉4~7 %，玉米浆干粉1. 5~2. 5 %， 热榨豆饼粉 1 ~3%，葡萄糖 0? 1 ~1 %，K2HPO4 ? 3H20 0? 02 ~0? 03%，MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ l%，CaC030. 3 ~0? 7%，CaC12 0? 05 ~0? 2%，异丁醇 0? 2 ~0? 5%，CoC12 .6H20 0? 0002~ 0? 001%，FeSO4 ? 7H200. 0001 ~0? 0003%，pH 为 6. 8 ~7. 5 ;均为重量百分比。2. -种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，步骤如下： (1) 孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线 培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子； (2) 种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养30~ 50h，获得种子液； (3) 发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养，溶氧 控制20%以上，发酵持续时间350~450h; 步骤（1)中所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565(Actinosynnema pretiosumATCC31565);所述的固体培养基的组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，均为重量百 分比，自然pH; 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆 蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比，pH为7. 0~8. 0 ; 步骤（3)中所述的液体发酵培养基的组分为玉米淀粉4~7%，玉米浆干粉1.5~ 2. 5%，热榨豆饼粉 1 ~3%，葡萄糖 0? 1 ~1%，K2HPO4 ? 3H20 0? 02 ~0? 03%，MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~1%，CaCO3O. 3 ~0? 7%，CaC12 0? 05 ~0? 2%，异丁醇 0? 2 ~0? 5%，CoCl2 ? 6H20 0? 0002 ~0? 001%，FeSO4 ? 7H200. 0001 ~0? 0003%，均为重量百分比，pH为 6. 8 ~7. 5 ; 步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20~25 %的葡萄糖溶液， 流速0. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后补加含有20~30%的葡萄糖和5~15 %热榨 豆饼粉的补料液，流速〇. 8~I. 2mL/L/h，同时，每24h每升发酵液一次性添加1. 8~2.OmL 的异丁醇，直至发酵结束。3. 根据权利要求1或2所述的方法，步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分为，玉米淀 粉5 %，玉米浆干粉2 %，热榨豆饼粉2 %，葡萄糖0? 5 %，K2HPO4 ? 3H20 0? 025 %，MgSO4 ? 7H20 0? 3 %，CaCO3 0? 4 %，CaCl2 0?I%，异丁醇 0? 3 %，CoCl2 ? 6H20 0? 0005 %，FeSO4 ? 7H20 0. 0002%，pH为7. 2,均为重量百分比。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的孢子是在培养温 度为27~29°C条件下，于固体培养基培养皿倒置培养4~8天后制得的；所述培养皿直径 90mm，所装培养基15~20mL〇5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)中的培养温度为27. 5~ 28. 5°C，培养时间为30~40h，优选34~38h。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的种子液按8~12 % 的接种量接种到液体发酵培养基进行发酵培养，发酵培养温度为28°C，溶氧控制在30%以 上，发酵时间为400~432h。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养 基后开始补加浓度为20~25 %的葡萄糖溶液，流速0. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后 补加含有20~30%的葡萄糖和5~15%热榨豆饼粉，流速0. 8~I. 2mL/L/h，同时，开始添 加异丁醇，添加方式为每24h每升发酵液一次性添加1. 5~2. 5mL，直至发酵结束。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：发酵至48~72h后补加的葡萄糖浓度为 23~27 %，热榨豆饼粉的浓度为8~12 %，异丁醇添加方式为每24h每升发酵液一次性添 加L8~2mL。9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：发酵至48~72h后补加的葡萄糖浓度为 23~27 %，热榨豆饼粉的浓度为8~12 %，异丁醇添加方式为每24h每升发酵液一次性添 加L8~2mL。10. 权利要求1或2所述的方法制备的安丝菌素P-3用于合成美登素的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，包括以下步骤：(1)孢子培养：将在20％甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线培养，25～30℃培养3～9天，至生长出丰富孢子；(2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25～30℃进行培养30～50h，获得种子液；(3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25～30℃发酵培养，溶氧控制20％以上，发酵350～450h。通过本发明方法制得的发酵液中安丝菌素产量高、安丝菌素P-3所占比例大，节省了生产成本，并有利于后期的纯化过程，适于工业化生产。
【IPC分类】C12R1/01, C12P17/18
【公开号】CN104894183
【申请号】CN201510358871
【发明人】刘升波, 孙丽霞, 张超, 江波, 王克波, 王德明, 肖娜, 樊乐, 艾丽静
【申请人】齐鲁制药有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 p-3的方法，属于生物发酵
技术领域。
【背景技术】
[0002] 安丝菌素（Ansamitocin)是从放线菌如珍贵橙色束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum)产生的高细胞毒性的化合物。安丝菌素的作用机理是抑制微管蛋白的组装，从 而抑制细胞分裂。安丝菌素的细胞毒性非常强，是传统化疗药物长春花碱、甲氨蝶呤和柔红 霉素的100-1000倍。
[0003] 安丝菌素属于大环内酯类化合物，其结构与美登醇相似。珍贵橙色束丝放线菌表 达的安丝菌素主要包括6种同系物，包括Ρ-1、Ρ-2、Ρ-3、Ρ-3'、P-4和P-4'，其中P-3为其主 要产物，安丝菌素同系物的结构如下式所示。
[0004]
[0005] 安丝菌素具有高效的抗B-16黑色素瘤、恶性毒瘤180及P185肥大细胞瘤等活 性。经过化学转变能合成含硫醇的美登素，虽然美登素类化合物因其极强的细胞毒性而在 肿瘤治疗领域受到关注，但是在美国的II期临床研宄表明其具有剂量限制毒性而被排除 临床应用，然而美登素可作为合成抗体偶联药物的"弹头"，具有令人满意的疗效和较低的 毒副作用，例如，罗氏公司的以DMl作为药物"弹头"的trastuzumab emtansine (T-DM1， Kadcyla?)已经于2013年2月22日被美国PDA批准上市，用于治疗乳腺癌。
[0006] 美登素最初是从卫矛科、鼠李科、大戟科及苔藓等高等植物分离得到，但是其在植 物中含量极低，提取的成本高、效率低，同时由于其复杂的结构，化学全合成也有成本高、收 率低的缺点。因此，通过微生物发酵获得其前体安丝菌素再转化成美登素成为一种经济高 效的方式。珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素中安丝菌素 p-3的含量最高，由于其活性 高、结构稳定、疏水性强已于萃取，成为合成美登素的最佳前体。因此通过放线菌发酵选择 性地高表达安丝菌素 P-3,对于其在抗肿瘤药物中的应用具有非常重要的意义。
[0007] 现有技术报道的安丝菌素的制备工艺中，安丝菌素 P-3最高产量是使用基因突 变株 Actinosynnema pretiosum PF4_4(ATCC PTA-3921)在 900L 发酵罐规模中 304mg/L， 20mL/250mL 摇床中 435mg/L(CN101103120A，TO03/064610A2)。其他现有技术 US4162940、 US4450234、US4228239、US4331598 以及 US4356265,安丝菌素的产量一般在 12 ~100mg/L， 安丝菌素 P-3所占比例低于70%，并且其中混有不少不希望产生的安丝菌素成分，如N-脱 甲基、20-0-脱甲基和19-脱氯处被修饰的产物，在还原性脱酰作用下这些产物不能合成美 登醇。
[0008] 目前，放线菌发酵安丝菌素的产量较低，生产成本高，安丝菌素 P-3所占比例低， 并且纯化工艺繁琐，涉及多种剧毒材料的处理，进行大规模生产非常困难。此外，在各个工 艺步骤中还必须确保操作人员的安全。因此，筛选高表达安丝菌素的菌株或通过发酵工艺 优化提高选择性地高表达安丝菌素 P-3,对于安丝菌素的规模化生产和促进其在抗肿瘤药 物中的应用具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0009] 本发明针对现有技术的不足，提供一种从珍贵橙色束丝放线菌发酵生产安丝菌素 P-3的方法。
[0010] 本发明的主要技术方案是选用高表达安丝菌素的珍贵橙色束丝放线菌，通过优化 发酵培养基配方、发酵条件和补料工艺实现安丝菌素的高产量，并使其中安丝菌素 P-3所 占比例提尚。
[0011] 本发明的技术方案如下：
[0012] 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 p-3的方法，步骤如下：
[0013] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿 划线培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子；
[0014] (2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养 30~50h，获得种子液；
[0015] (3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养， 溶氧控制20%以上，发酵持续时间350~450h ;
[0016] 步骤⑴中所述束丝放线菌优选的为珍贵橙色束丝放线菌 ATCC31565(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；
[0017] 步骤（1)中所述固体培养基组分如下，均为重量百分比：
[0018] 酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨0.3~1.0%、麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油 0.5~L 5%，琼脂粉L 5~2. 2%，自然pH;
[0019] 优选地，所述步骤（1)中的孢子是在培养温度为27~29°C条件下，于固体培养基 培养皿倒置培养4~8天后制得的；所述培养皿直径90mm，所装培养基15~20mL ;
[0020] 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分如下，均为重量百分比：
[0021] 玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆蛋白胨0.5~2%，pH为7.0~8.0 ;
[0022] 优选地，所述步骤（2)中培养温度为27. 5~28. 5°C，培养时间为30~40h，优选 34 ~38h ;
[0023] 步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
[0024] 玉米淀粉4~7%，玉米浆干粉1. 5~2. 5%，热榨豆饼粉1~3%，葡萄糖0. 1~ 1%，Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 02 ~0· 03%，MgS04 ·7Η20 0· 1 ~l%，CaC030. 3 ~0· 7%，CaC120. 05 ~ 0· 2 %，异丁醇 0· 2 ~0· 5 %，CoCl2 · 6H20 0· 0002 ~0· 001 %，FeSO4 · 7H20 0· 0001 ~ 0.0003%，pH 为 6. 8 ~7.5 ;
[0025] 优选地，所述步骤（3)中的液体发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
[0026] 玉米淀粉5%，玉米浆干粉2%，葡萄糖0.5%，热榨豆饼粉2%，K2HPO 4 · 3H20 0· 025 %，MgSO4 · 7H20 0· 3 %，CaCO3O. 4 %，CaCl2O. 1 %，异丁醇 0· 3 %，CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，FeSO4 · 7H20 0· 0002 %，pH 为 7· 2 ;
[0027] 步骤（3)中所述的种子液按8~12 %的接种量接种到液体发酵培养基进行发酵培 养；发酵培养温度为28°C，溶氧控制30%以上，发酵持续时间400~432h ;
[0028] 具体地，步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20~25% 的葡萄糖溶液，流速0. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后补加含有20~30 %的葡萄糖和 5~15%热榨豆饼粉，流速0. 8~I. 2mL/L/h，同时，开始添加异丁醇，添加方式为每24h每 升发酵液一次性添加1. 5~2. 5mL，直至发酵结束；
[0029] 优选地，发酵至48~72h后补加的葡萄糖浓度为23~27%，热榨豆饼粉浓度为 8~12 %，异丁醇添加方式为每24h每升发酵液一次性添加1. 8~2mL，直至发酵结束。
[0030] 本发明技术方案的关键点在于：
[0031] (1)在发酵培养基和补加的成分中添加热榨豆饼粉，热榨豆饼粉的主要成分为不 溶性蛋白，作为长效氮源可以延长发酵周期并大幅提高发酵后期发酵液中菌丝的浓度，从 而提高安丝菌素 P-3的产量；
[0032] (2)在补料发酵培养时，现有技术中异丁醇的添加方式为流加方式或在某个特定 时间一次添加；本发明改进异丁醇的添加方式为每24h每升发酵液一次性添加1. 8~2mL， 直至发酵结束；通过改进异丁醇补加方式，安丝菌素 P-3产量可提高40%以上。
[0033] 本发明的优选技术方案之一为：
[0034] 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 P-3的方法，步骤如下：
[0035] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿 划线培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子；
[0036] (2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养 30~50h，获得种子液；
[0037] (3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养， 溶氧控制20%以上，发酵持续时间350~450h ;
[0038] 步骤（1)中所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565 (Actinosynnema pretiosum ATCC31565);所述的固体培养基的组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、 麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，均为重量百 分比，自然pH ;
[0039] 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0. 5~2%， 大豆蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比，pH为7. 0~8. 0 ;
[0040] 步骤（3)中所述的液体发酵培养基的组分为玉米淀粉4~7%，玉米浆干粉1.5~ 2. 5%，热榨豆饼粉 1 ~3%，葡萄糖 0· 1 ~1%，K2HPO4 · 3H20 0· 02 ~0· 03%，MgSO4 · 7H20 0· 1 ~1 %，CaCO3O. 3 ~0· 7 %，CaC120. 05 ~0· 2 %，异丁醇 0· 2 ~0· 5 %，CoCl2 · 6H20 0· 0002 ~0· 001%，FeSO4 · 7Η200· OOOl ~0· 0003%，均为重量百分比，pH 为 6· 8 ~7· 5 ;
[0041] 步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20~25 %的葡萄糖 溶液，流速〇. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后补加含有20~30 %的葡萄糖和5~15 % 热榨豆饼粉的补料液，流速〇. 8~I. 2mL/L/h，同时，每24h每升发酵液一次性添加1. 8~ 2. OmL的异丁醇，直至发酵结束。
[0042] 本发明的另一优选技术方案为：
[0043] 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素 P-3的方法，步骤如下：
[0044] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿 划线培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子；
[0045] (2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养 30~50h，获得种子液；
[0046] (3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养， 溶氧控制20%以上，发酵持续时间350~450h ;
[0047] 步骤（1)中所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565 (Actinosynnema pretiosum ATCC31565);所述的固体培养基的组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，均为重量百 分比，自然pH ;
[0048] 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0· 5~2%， 大豆蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比，pH为7. 0~8. 0 ;
[0049] 步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分为，玉米淀粉5 %，玉米浆干粉2 %，热榨豆 饼粉2%，葡萄糖0· 5%，Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 025%，MgS04 ·7Η20 0· 3%，CaC030 . 4%，CaCl20. 1%， 异丁醇 0.3%，CoCl2 ·6Η20 0.0005%，FeSO4 · 7H20 0.0002%，pH 为 7.2,均为重量百分比。
[0050] 本发明方法制备得到的安丝菌素 P-3用于合成美登素的应用。
[0051] 本发明的有益效果如下：
[0052] 1、通过本发明方法获得的珍贵橙色束丝放线菌发酵液中，安丝菌素 P-3的含量最 高可达1200mg/L以上，远高于目前现有技术的水平；
[0053] 2、通过本发明方法发酵得到的安丝菌素中安丝菌素 P-3的比例达到93%以上，节 省了生产成本，并非常有利于后期的纯化过程，适于工业化生产；
[0054] 3、通过本发明方法发酵得到的安丝菌素 P-3用于合成美登素生产成本低，收率 高，纯度高。
【附图说明】
[0055] 图1、实施例3发酵液中最终安丝菌素 P-3的HPLC检测图谱；
【具体实施方式】
[0056] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是，应当理解，这些实施例 和仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。
[0057] 实施例中所用菌种为珍贵橙色束丝放线菌Actinosynnema pretiosum ATCC31565,购自美国菌种保藏中心ATCC，所用酵母提取物购自英国Oxiod公司，麦芽浸 膏购自北京奥博星公司，玉米浆干粉购自江苏新沂恒惠淀粉糖有限公司，热榨豆饼粉购 自莒南北兴粮油有限公司，玉米淀粉购自内蒙古融成玉米开发有限公司，葡萄糖、甘油、 K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaC03、CaCl2、CoCl2 · 6H20、FeSO4 · 7H20 和异丁醇购自国药集团 化学试剂有限公司，其他试剂均为普通市售产品。
[0058] 实施例1 :50L罐分批补料发酵（发酵培养时未添加热榨豆饼粉，异丁醇的补加方 式为流加）
[0059] (1)孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的珍贵橙色束丝放线菌孢子在固体培养 基培养皿划线培养，28°C倒置培养6天；
[0060] 固体培养基配方：酵母提取物0. 3%，大豆蛋白胨0. 5%、麦芽浸膏0. 3%，甘油 1%，琼脂粉2%，自然pH;
[0061] (2)种子培养：在IOL发酵罐中加入6L液体种子培养基，121°C灭菌30min后，从 培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基；28°C进行培养，通气量0. 4vvm，以80rpm的转速 搅拌；培养过程通过调整通气量和增强搅拌使溶氧保持在30 %以上，最大通气量lvvm，最 大转速350rpm，在培养36h后获得种子液；
[0062] 液体种子培养基配方：玉米淀粉3%，酵母粉0. 7%，大豆蛋白胨1. 5%，初始pH为 7. 2 ；
[0063] (3)发酵培养：50L发酵罐中加入30L液体发酵培养基，取培养好的3L种子液接种 于液体发酵培养基；发酵罐保持28°C，初始搅拌转速80rpm，初始通气量0. 4vvm，培养20h 后，根据溶氧提高通气量和搅拌速度，最大通气lvvm，最大搅拌速度700rpm，发酵过程不控 制pH ;
[0064] 液体发酵培养基为：玉米淀粉5 %，玉米浆干粉2. 5 %，葡萄糖0. 5 %， K2HPO4 · 3Η200· 025 %，MgSO4 · 7H20 0· 3 %，CaCO3O. 4 %，CaCl2O. 1 %，异丁醇 0· 3 %， CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，FeSO4 · 7H20 0· 0002 %，初始 pH 7. 2 ;
[0065] 发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h的流速补加22. 5%的葡萄糖溶液，发酵60h后，以 lmL/L/h的速率补加含有25%葡萄糖、10%玉米浆干粉和10%异丁醇的补料液，发酵培养 至264h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到385mg/L ;
[0066] (4)样品处理及检测方法：取发酵液ImL加入4mL的无水甲醇，超声萃取20min，离 心取上清，用0. 22 μ m的滤膜过滤后用HPLC检测安丝菌素 P-3的含量。HPLC所用色谱柱为 C18 柱（Waters，150mmX4.6mm，5ym);流动相为甲醇：水=75:25，流速1.〇11117/111；[11，检测波 长 246nm，注温 30°C。
[0067] 实施例2 :50L罐分批补料发酵（发酵培养时添加热榨豆饼粉，异丁醇的补加方式 为流加）
[0068] (1)孢子培养：如实施例1 ;
[0069] ⑵种子培养：如实施例1 ;
[0070] (3)发酵培养：如实施例1，所不同的是液体发酵培养基为：玉米淀粉5%，玉米 浆干粉 2 %，热榨豆饼粉 2%，葡萄糖 0.5%，K2HPO4 · 3H20 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 3%， CaCO3O. 4 %，CaCl2O. I %，异丁醇 0· 3 %，CoCl2 · 6H20 0· 0005 %，FeSO4 · 7H20 0· 0002 %，初 始 pH 7. 2 ;
[0071] 发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h的流速补加22. 5%的葡萄糖溶液，发酵60h后，以 lmL/L/h的速率补加含有25%葡萄糖、10%热榨豆饼粉和10%异丁醇的补料液，发酵培养 至412h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到863mg/L ;
[0072] (4)样品处理及检测方法：如实施例1。
[0073] 实施例3 :50L罐分批补料发酵
[0074] (1)孢子培养：如实施例1 ;
[0075] (2)种子培养：如实施例1 ;
[0076] (3)发酵培养：如实施例2,所不同的是补料工艺，发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h 的流速补加22. 5 %的葡萄糖溶液，发酵60h后，以lmL/L/h的速率补加含有25 %葡萄糖、 10%热榨豆饼粉的补料液，异丁醇补加采用每24h -次性添加55m L的方式；发酵培养至 408h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到1211mg/L(如图1所 示）；
[0077] (4)样品处理及检测方法如实施例1。
[0078] 实施例4 : IOt罐分批补料发酵
[0079] (1)孢子培养：如实施例1 ;
[0080] (2)种子培养：在500L发酵罐中加入300L液体种子培养基，120°C灭菌30min后， 从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基；28°C进行培养，通气量0. 4vvm，以80rpm的转 速搅拌，培养过程通过调整通气量和增强搅拌使溶氧保持在30 %以上，在培养36h后获得 种子液；
[0081] 液体种子培养基配方如实施例1 ;
[0082] (3)发酵培养：10t发酵罐中加入6t液体发酵培养基，培养基配方如实施例2。取 培养好的600L种子液接种于液体发酵培养基，发酵罐保持28°C，搅拌转速80rpm，初始通 气量〇. 4vvm，培养20h后，根据溶氧提高通气量和搅拌速度，最大通气lvvm，最大搅拌速度 180rpm ；
[0083] 发酵培养0_60h，以0. 5mL/L/h的流速补加22. 5%的葡萄糖溶液，发酵60h后，以 lmL/L/h的速率补加含有25 %葡萄糖、10%热榨豆饼粉的补料液，每24h -次性添加异丁 醇IlL ;发酵培养至432h，至安丝菌素 P-3的表达量不再增加，发酵已经结束，表达量达到 1124mg/L ；
[0084] (4)样品处理及检测方法如实施例1。
[0085] 由上述实施例可以看出，实施例1在发酵培养时未添加热榨豆饼粉，异丁醇的补 加方式为流加，安丝菌素 P-3的表达量只有385mg/L ;实施例2虽然添加了热炸豆饼粉，但 异丁醇的补加方式仍为流加，安丝菌素 P-3的表达量已提升到863mg/L ;实施例3、4在发酵 培养时既添加了热炸豆饼粉，异丁醇的补加方式改为每24h -次性添加，直至发酵结束，安 丝菌素 P-3的表达量可以达到1200mg/L左右甚至高于1200mg/L。
【主权项】
1. 一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，步骤如下： (1) 孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线 培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子； (2) 种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养30~ 50h，获得种子液； (3) 发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养，溶氧 控制20%以上，发酵持续时间350~450h; 步骤（1)中所述束丝放线菌优选的为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565(Actinosynnema pretiosumATCC31565);所述固体培养基组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨0. 3~1. 〇%、麦芽浸膏〇. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，自然pH，均为重量 百分比； 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆 蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比； 步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分为玉米淀粉4~7 %，玉米浆干粉1. 5~2. 5 %， 热榨豆饼粉 1 ~3%，葡萄糖 0? 1 ~1 %，K2HPO4 ? 3H20 0? 02 ~0? 03%，MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ l%，CaC030. 3 ~0? 7%，CaC12 0? 05 ~0? 2%，异丁醇 0? 2 ~0? 5%，CoC12 .6H20 0? 0002~ 0? 001%，FeSO4 ? 7H200. 0001 ~0? 0003%，pH 为 6. 8 ~7. 5 ;均为重量百分比。2. -种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，步骤如下： (1) 孢子培养：将在20%甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线 培养，25~30°C培养3~9天，至生长出丰富孢子； (2) 种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25~30°C进行培养30~ 50h，获得种子液； (3) 发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25~30°C发酵培养，溶氧 控制20%以上，发酵持续时间350~450h; 步骤（1)中所述的束丝放线菌为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565(Actinosynnema pretiosumATCC31565);所述的固体培养基的组分为酵母提取物0. 1~5%，大豆蛋白胨 0. 3~1.0%、麦芽浸膏0. 1~0.5%，甘油0.5~1.5%，琼脂粉1.5~2. 2%，均为重量百 分比，自然pH; 步骤（2)中所述的液体种子培养基组分为玉米淀粉1~5%，酵母粉0.5~2%，大豆 蛋白胨0. 5~2%，pH为7. 0~8. 0,均为重量百分比，pH为7. 0~8. 0 ; 步骤（3)中所述的液体发酵培养基的组分为玉米淀粉4~7%，玉米浆干粉1.5~ 2. 5%，热榨豆饼粉 1 ~3%，葡萄糖 0? 1 ~1%，K2HPO4 ? 3H20 0? 02 ~0? 03%，MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~1%，CaCO3O. 3 ~0? 7%，CaC12 0? 05 ~0? 2%，异丁醇 0? 2 ~0? 5%，CoCl2 ? 6H20 0? 0002 ~0? 001%，FeSO4 ? 7H200. 0001 ~0? 0003%，均为重量百分比，pH为 6. 8 ~7. 5 ; 步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养基后开始补加浓度为20~25 %的葡萄糖溶液， 流速0. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后补加含有20~30%的葡萄糖和5~15 %热榨 豆饼粉的补料液，流速〇. 8~I. 2mL/L/h，同时，每24h每升发酵液一次性添加1. 8~2.OmL 的异丁醇，直至发酵结束。3. 根据权利要求1或2所述的方法，步骤（3)中所述的液体发酵培养基组分为，玉米淀 粉5 %，玉米浆干粉2 %，热榨豆饼粉2 %，葡萄糖0? 5 %，K2HPO4 ? 3H20 0? 025 %，MgSO4 ? 7H20 0? 3 %，CaCO3 0? 4 %，CaCl2 0?I%，异丁醇 0? 3 %，CoCl2 ? 6H20 0? 0005 %，FeSO4 ? 7H20 0. 0002%，pH为7. 2,均为重量百分比。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的孢子是在培养温 度为27~29°C条件下，于固体培养基培养皿倒置培养4~8天后制得的；所述培养皿直径 90mm，所装培养基15~20mL〇5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)中的培养温度为27. 5~ 28. 5°C，培养时间为30~40h，优选34~38h。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的种子液按8~12 % 的接种量接种到液体发酵培养基进行发酵培养，发酵培养温度为28°C，溶氧控制在30%以 上，发酵时间为400~432h。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中当种子液接种液体发酵培养 基后开始补加浓度为20~25 %的葡萄糖溶液，流速0. 4~0. 5mL/L/h，发酵至48~72h后 补加含有20~30%的葡萄糖和5~15%热榨豆饼粉，流速0. 8~I. 2mL/L/h，同时，开始添 加异丁醇，添加方式为每24h每升发酵液一次性添加1. 5~2. 5mL，直至发酵结束。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：发酵至48~72h后补加的葡萄糖浓度为 23~27 %，热榨豆饼粉的浓度为8~12 %，异丁醇添加方式为每24h每升发酵液一次性添 加L8~2mL。9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：发酵至48~72h后补加的葡萄糖浓度为 23~27 %，热榨豆饼粉的浓度为8~12 %，异丁醇添加方式为每24h每升发酵液一次性添 加L8~2mL。10. 权利要求1或2所述的方法制备的安丝菌素P-3用于合成美登素的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，包括以下步骤：(1)孢子培养：将在20％甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线培养，25～30℃培养3～9天，至生长出丰富孢子；(2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25～30℃进行培养30～50h，获得种子液；(3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25～30℃发酵培养，溶氧控制20％以上，发酵350～450h。通过本发明方法制得的发酵液中安丝菌素产量高、安丝菌素P-3所占比例大，节省了生产成本，并有利于后期的纯化过程，适于工业化生产。
【IPC分类】C12R1/01, C12P17/18
【公开号】CN104894183
【申请号】CN201510358871
【发明人】刘升波, 孙丽霞, 张超, 江波, 王克波, 王德明, 肖娜, 樊乐, 艾丽静
【申请人】齐鲁制药有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日
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