一种皮肤长寿因子肽及其制备工艺的制作方法
一种皮肤长寿因子肽及其制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有多种生理活性的皮肤长寿因子肽及其制备工艺，尤其是，一 种天然的促进皮肤健康长寿的新型肽类产品及其制备工艺。
【背景技术】
[0002] "爱美之心，人皆有之"，这句话放诸四海而皆准，可见人类对美的不懈追求。而皮 肤的健康，则是外表美丽的基础。皮肤覆盖于身体的最外层，是人体最大的器官，它承担着 保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学 性和病原微生物性的侵袭。皮肤直接接触外界的各种物质，包括阳光、空气、灰尘、雾霾、细 菌、化妆品等。这些物质有些对皮肤有益，有些也会对皮肤机能造成一定危害。例如，紫外 线UVA及UVB在渗入皮肤后，会产生有害的自由基，造成胶原和弹性纤维的松弛和脆裂，表 皮细胞新生减缓；细胞核受到自由基伤害，无法分裂出健康的皮肤细胞；细胞间的脂质被 自由基破坏，会变得无法维持住肌肤中的水分。除了紫外线之外，生活中还有许多其它因素 也会加速细胞氧化，导致体内自由基的产生，例如：电脑辐射，抽烟饮酒，紧张压力，垃圾食 品等等，这些因素都会导致皮肤的加速老化。所以我们需要通过补充抗氧化物质来帮助减 少自由基的产生，加速自由基的清除，减缓皮肤的衰老过程。另一个导致皮肤衰老的原因则 是皮肤失水。皮肤过于干燥，会造成角质产生缝隙并松动，抵御外界刺激的功能减退，毛孔 油脂分泌过度，脱皮、假性皱纹等现象。皮肤保湿性差会加速其衰老过程。
[0003] 为了保持皮肤的健康长寿，人们一直从各种不断改进的化妆品成分中寻求灵丹妙 药。蛋白质因是皮肤组成成分，所以备受瞩目。目前，国际市场销售的蛋白质类化妆品原料 近50种。作为化妆品原料，一种含有53个氨基酸的肽类物质一一表皮生长因子备受推崇。 然而它目前主要采用基因工程手段合成，100 μ g约为100美金，价格昂贵，极大地限制了它 的应用。目前，作为皮肤抗衰老产品原料的多肽物质，多以基因工程方法制备，生产成本过 尚。
[0004] 专利200910061718. 0和201210047402. 8均公开过一种制备皮肤长寿因子肽的工 艺，两法均以水解鱼汁浸膏（PST多肽）作为培养基，通过酵母发酵制备皮肤长寿因子肽。而 本发明公开的制备工艺的优点在于：1.旧法的水解鱼汁浸膏为鱼酶解获得的蛋白多肽粉 溶水制得（见图2)，而本法则是将此过程中止于酶灭活之前，直接衔接发酵培养基的灭菌 过程，同时达到酶灭活的目的；将酶解液整体作为培养基，最大程度利用其中的营养物质及 无机盐，减少与终产品无关物质的添加，且富氮培养基有利于发酵产物的积累；2.本法本 着化妆品允许添加、制得成品中无残留或残留对品质无影响等原则，在培养基中添加清蛋 白多肽，作为酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽（GSH)的前体；在培养过程中添加 H2O2，对酵母菌 种形成氧胁迫，刺激酿酒酵母产生GSH ;在培养过程中添加水杨酸作为外源刺激，提高胞内 GSH产量（未见报道，机理尚待研宄）；3.酵母发酵过程利用或吸附培养基中的苦味肽和三 甲胺、醛、酮类腥味物质，达到终产品去腥脱苦的目的，取得与传统方法中活性炭吸附类似 的效果，更省时节能；4.微波破壁的同时，其产生的热力效应，及两次过滤和浓缩、喷雾干 燥过程，对添加的低浓度H2O2及水杨酸的去除起到积极作用，终产品中两物质均未检出。本 法有助于降低生产成本，加速实现产业化。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有多种生理活性的皮肤长寿因子肽及其 制备工艺。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的皮肤长寿因子肽的制备工艺具体步骤如下：
[0008] (1)生产用种子菌的准备：
[0009] 活化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)种子液18~30小时，菌体增殖浓度 达到 85gDCW/L ~175gDCW/L ;
[0010] (2)生产用富氮培养基的制备：
[0011] 将鱼皮碱泡、酸泡并用流水冲洗至中性后，加10倍蒸馏水匀衆，用45°C热水恒温 提取12h，获得含鱼胶原蛋白的水提液；在45°C下，调pH至7. 0,中性蛋白酶添加量2000U/ g，不断搅拌酶解4h，获得含鱼胶原蛋白肽的酶解液；将酶解液与蒸馏水按体积比1:0. 5~ 1:2混勾，加入清蛋白多肽1.0~4.0% (w/w)，葡萄糖1.0~3.0% (w/w);将配制好的发 酵培养基0. lMPa、121°C灭菌、灭酶20min ;
[0012] (3)超氧诱导发酵：
[0013] 培养基灭菌后降温至15~40°C，按接种量5%~15% (v/v)接入步骤（1)活化好 的种子液，培养〇~30小时后向发酵液中添加3mmol/L~300mmol/L H2O2或0. lmmol/L~ 10mmol/L水杨酸（SA)，15~40°C间歇搅拌培养1~3天后停止发酵；
[0014] (4)后处理：
[0015] 发酵液300~700W微波破壁20~60min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品。
[0016] 步骤（1)中，所述的酿酒酵母购置于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为 CCTCC AY 92025,活化种子液24小时，菌体浓度达到160gDCW/L。
[0017] 步骤（2)中，将鱼皮酶解液作为发酵培养基，培养基灭菌与灭酶同时进行，培养基 组成如下：酶解液与蒸馏水按体积比1:1混匀，加入清蛋白多肽2. 0 % (w/w)，葡萄糖2. 0 % (w/w)，其碳氮比为10:3。
[0018] 步骤（3)中，培养基灭菌后降温至30°C，按接种量12% (v/v)接入步骤（1)活化 好的种子液，间歇搅拌培养12小时后向发酵液中添加30mmol/L H2O2或间歇搅拌培养15小 时后向发酵液中添加 lmmol/L水杨酸（SA)，30°C间歇搅拌培养2天后停止发酵。培养基因 酿酒酵母的培养发酵达到去腥脱苦的目的。
[0019] 步骤（4)中，发酵液600W微波破壁40min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤月吴精滤。
[0020] 步骤⑷中，制备获得的皮肤长寿因子肽，其具体属性如下：淡黄色粉末，溶液澄 清透明；多肽含量多93. 0%、羟脯氨酸多7. 6%、谷胱甘肽（GSH)含量多2. 2%、多糖含量 彡0· 6% ;分子量范围为：200~900Da。
[0021] 本发明的积极效果如下：
[0022] 相对于现有技术，本发明涉及的皮肤长寿因子肽制造工艺，利用酶解获得含多肽 的培养基，利用酵母对含多肽的培养基进行超氧诱导发酵，通过发酵过程中产生的GSH，有 效地提高了胶原肽的抗氧化能力，使得皮肤长寿因子肽在具有优异保湿效果的同时也拥有 了良好的抗氧化能力。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明的皮肤长寿因子肽的制备工艺流程图。
[0024] 图2是传统酶解法制备鱼胶原蛋白肽的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0025] 下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0026] 蛋白质类化妆品原料中，最早被广泛应用的是胶原蛋白，这类产品性能温和、功能 多样、使用安全，符合当代化妆品的潮流，成为了高档化妆品的重要原料。如，美国CTFA化 妆品原料手册录用的天然物质和日本《功能性化妆品原料》中选用的天然物质中都有胶原 蛋白或其水解产物（羟脯氨酸、脯氨酸、丝氨酸）。
[0027] 随着生物酶工程技术的发展，人们对由胶原蛋白降解得到的小分子肽有了更深入 地认识。因蛋白肽分子量相对较小，更易被吸收利用，人们逐渐热衷于开发含有小分子肽的 口服及外用化妆品。化妆品原料市场中有些胶原肽即是从深海鱼皮、鱼鳞、鱼骨中提取的， 且国内很多知名的化妆品厂商，在其生产的高档化妆品中都添加了水产胶原肽作为功效因 子。
[0028] 酵母是世界上研宄最多的微生物之一，是当今生物技术产品研宄开发的热点，是 现代生物技术发展、基因组研宄的模式系统。由于酵母已应用于传统的食品工业中的面包 制作和酿造领域，因此有着天然、良好的标签形象。在国外，酵母抽提物的应用非常广泛，市 场也比较成熟，年产销量超过10万吨。欧洲和日本的酵母抽提物产品有一定的差别。欧洲 的产品除了普通的纯酵母抽提物外，还有一些特殊的风味型产品，是采用酵母抽提物加上 合适的香精制成，往往具有肉类、烟熏味等特有的风味特征。在应用上，欧洲通常将酵母抽 提物作为酸水解植物蛋白和味精的替代品。日本的产品一般颜色较浅、溶解性很好，并且在 营养上作了强化，例如高谷胱甘肽含量的酵母抽提物。在国内，高纯度的谷胱甘肽主要用来 做药品，国家的食品添加剂目录中并未明确将其列入，只称其为一种功效因子。然而，高谷 胱甘肽含量的酵母抽提物已列入国家允许使用的食品添加剂目录。这些都为皮肤长寿因子 肽的应用铺平了道路。
[0029] 水杨酸（Salicylic Acid)又名柳酸，可从柳树皮中提取，化学名为邻羟基苯甲酸， 白色针状晶体或毛状结晶性粉末，是重要的精细化工原料。在医药工业中，水杨酸是一种用 途极广的消毒防腐剂。作为医药中间体，水杨酸的衍生物很多，其中之一就是医学上常用的 阿司匹林。化妆品中添加水杨酸，常宣称具有"祛痘"功效，原理是水杨酸溶解了角质间的 构成性物质，能去除积聚过厚的角质层，达到疏通毛孔的作用。在生物科学研宄中，水杨酸 是一种重要的内源信号分子，能够激活一系列植物的抗性防卫反应，也常用来诱导动植物 细胞蛋白的差异性表达。但关于水杨酸刺激酵母细胞高产谷胱甘肽的研宄尚未见报道。本 法本着化妆品允许添加、制得成品中无残留或残留对品质无影响等原则，筛选水杨酸作为 酿酒酵母发酵培养的外源刺激，达到菌株高产GSH的效果，其反应机理尚不清楚。
[0030] 本发明利用酵母对 酶解生成的含多肽的培养基进行发酵来制备皮肤长寿因子肽。 以下涉及的各实施实例均是根据图1所示的流程完成。而通过下述实施实例将有助于理解 本发明，但不限制本发明的内容。
[0031] 实施实例1 :
[0032] 500mL培养基（鱼皮酶解液250mL，蒸馏水250mL，2. 0%清蛋白多肽，2. 0%葡萄 糖）分装到17个300mL三角瓶中（约30mL/瓶），灭菌降温后接入出发菌酿酒酵母，30°C摇 床培养活化24小时制备种子液，菌体浓度160gDCW/L ;
[0033] I. 8L鱼皮酶解液、72g清蛋白多肽、72g葡萄糖、I. 8L蒸馏水配制优化培养基，转入 发酵罐121°C灭菌20分钟后降温至30°C左右，按12%的接种量接入活化24小时的种子液， 间歇搅拌发酵12小时后加入30mmol/L H2O2或间歇搅拌发酵15小时后加入lmmol/L水杨 酸；
[0034] 培养2天后，发酵液600W微波破壁40分钟，经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品192. 7g。
[0035] 不同外源刺激下所制备的皮肤长寿因子肽产品指标如表1所示：
[0036] 表1实施实例1制备的皮肤长寿因子肽指标
[0037]
[0038] 实施实例2 :
[0039] 500mL培养基（鱼皮酶解液330mL，蒸馏水170mL，3. 0%清蛋白多肽，3. 0%葡萄 糖）分装到17个300mL三角瓶中（约30mL/瓶），灭菌降温后接入出发菌酿酒酵母，30°C摇 床培养活化28小时制备种子液，菌体浓度170gDCW/L ;
[0040] 2. 4L鱼皮酶解液、108g清蛋白多肽、108g葡萄糖、I. 2L蒸馏水配制优化培养基，转 入发酵罐121°C灭菌20分钟后降温至30°C左右，按15%的接种量接入活化28小时的种子 液，并加入3mmol/L H2O2或0. lmmol/L水杨酸，间歇搅拌发酵；
[0041] 培养3天后，发酵液700W微波破壁50分钟，经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品189. 6g。
[0042] 不同外源刺激下所制备的皮肤长寿因子肽产品指标如表2所示：
[0043] 表2实施实例2制备的皮肤长寿因子肽指标
[0044]
[0045] 实施实例3 :
[0046] 5001^培养基（鱼皮酶解液1701^，蒸馏水33011^，1.0%清蛋白多肽，1.0%葡萄 糖）分装到17个300mL三角瓶中（约30mL/瓶），灭菌降温后接入出发菌酿酒酵母，30°C摇 床培养活化20小时制备种子液，菌体浓度90gDCW/L ;
[0047] I. 2L鱼皮酶解液、36g清蛋白多肽、36g葡萄糖、2. 4L蒸馏水配制优化培养基，转入 发酵罐121°C灭菌20分钟后降温至30°C左右，按8%的接种量接入活化20小时的种子液， 间歇搅拌发酵28小时后加入300mmol/L H2O2或间歇搅拌发酵30小时后加入lOmmol/L水 杨酸；
[0048] 培养60小时后，发酵液500W微波破壁30分钟，经板框过滤器初滤，再经中空纤维 超滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品188. 2g。
[0049] 不同外源刺激下所制备的皮肤长寿因子肽产品指标如表3所示：
[0050] 表3实施实例3制备的皮肤长寿因子肽指标
[0051]
[0052」 对比例，篸照专利201210047402. 8的万沄：
[0053] 500mL培养基（3. 0%PTS多肽，3. 0%葡萄糖），分装到17个300mL三角瓶中 (约30mL/瓶）灭菌降温后接入活化出发酵母菌种子液，30°C摇床培养活化24小时制备 140gDCW/L 种子液；
[0054] 135gPTS多肽、135g葡萄糖、3. 5L水配制优化培养基，转入发酵罐121°C灭菌30分 钟后降温至30°C左右，接入活化24小时的种子液，间歇搅拌发酵3天；
[0055] 3天后发酵罐夹套通入蒸汽升温至100摄氏度左右，维持20分钟后取出发酵液 5410mL，离心收集上清液浓缩干燥，得产物165. 9g。
[0056] 对比例所制备的皮肤长寿因子肽指标如表4所示：
[0057] 表4对比例制备的皮肤长寿因子肽指标
[0058]
[0059] 为评估本发明涉及的皮肤长寿因子肽的制备工艺获得的皮肤长寿因子肽产品的 性能，将实施例1和对比例制备的多肽进行了以下实验：
[0060] 1.体表保湿功能实验
[0061] 按照1 :4的料液比配制受试物溶液；通过SK-II水分测定仪测定其体表保湿效 果。结果证明皮肤长寿因子肽的体表保湿效果远强于市售多肽产品。
[0062] 2.体外保湿功能实验
[0063] 按照1 :4的料液比配制受试物溶液；通过干燥器模拟恒温恒湿环境；用3M胶布模 拟人体皮肤，涂抹受试物溶液；单位时间测量失水量，折算失水率。结果证明皮肤长寿因子 肽的体外失水率远低于市售多肽产品，有良好的保湿效果。
[0064] 3.清除自由基DPPH能力的测定
[0065] 相同浓度皮肤长寿因子肽和GSH的DPPH自由基清除率见下表：
[0066] 表5皮肤长寿因子肽DPPH自由基清除率（X±s, η = 6)
[0067]
[0068] 由表5可见，本发明的方法制备的皮肤长寿因子肽具有与GSH相当的DPPH自由 基清除率。相对于对比例，本发明制备的皮肤长寿因子肽，其多肽含量、羟脯氨酸含量、GSH 含量均明显提高，相应的抗氧化能力也有所提高；且制备工艺更省时节能，适应于工业化生 产。
[0069] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换 和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺的具体步骤如下： (1) 生产用种子菌的准备： 活化酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)种子液18~30小时，菌体增殖浓度达到 85gDCW/L~175gDCW/L; (2) 生产用富氮培养基的制备： 将鱼皮碱泡、酸泡并用流水冲洗至中性后，加10倍蒸馏水匀浆，用45°C热水恒温提取 12h，获得含鱼胶原蛋白的水提液；在45°C下，调pH至7. 0,中性蛋白酶添加量2000U/g，不 断搅拌酶解4h，获得含鱼胶原蛋白肽的酶解液；将酶解液与蒸馏水按体积比1:0. 5~1:2 混勾，加入清蛋白多肽1.0~4.0 % (w/w)，葡萄糖1.0~3.0 % (w/w);将配制好的发酵培 养基 0?IMPa、121°C灭菌、灭酶 20min; (3) 超氧诱导发酵： 培养基灭菌后降温至15~40°C，按接种量5%~15% (v/v)接入步骤（1)活化好的 种子液，培养〇~30小时后向发酵液中添加3mmol/L~300mmol/LH2O2或0.lmmol/L~ 10mmol/L水杨酸（SA)，15~40°C间歇搅拌培养1~3天后停止发酵； (4) 后处理： 发酵液300~700W微波破壁20~60min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超滤膜 精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品。2. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（1)中，所述的 酿酒酵母购置于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCCAY92025,活化种子液 24小时，菌体浓度达到160gDCW/L。3. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（2)中，将鱼皮 酶解液作为发酵培养基，培养基灭菌与灭酶同时进行，培养基组成如下：酶解液与蒸馏水按 体积比1:1混勾，加入清蛋白多肽2.0% (w/w)，葡萄糖2.0% (w/w)，其碳氮比为10:3。4. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（3)中，培养基 灭菌后降温至30°C，按接种量12% (v/v)接入步骤（1)活化好的种子液，间歇搅拌培养12 小时后向发酵液中添加30mmol/LH2O2或间歇搅拌培养15小时后向发酵液中添加lmmol/L 水杨酸（SA)，30°C间歇搅拌培养2天后停止发酵。培养基因酿酒酵母的培养发酵达到去腥 脱苦的目的。5. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（4)中，发酵液 600W微波破壁40min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超滤膜精滤。6. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（4)中，制备 获得的皮肤长寿因子肽，其多肽含量多93.0%、羟脯氨酸多7.6%、谷胱甘肽（GSH)含量 彡2. 2%、多糖含量彡0. 6%。7. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（4)中，制备获 得的皮肤长寿因子肽，其中分子量范围为：200~900Da。
【专利摘要】本发明公开了一种皮肤长寿因子肽及其制备工艺，步骤如下：(1)生产用种子菌的准备；(2)生产用富氮培养基的制备；(3)接种；(4)超氧诱导发酵；(5)发酵液微波破壁(7)过滤精制得到皮肤长寿因子肽。本发明通过酶联超氧诱导发酵法制备得到一种具有抗氧化、保湿等延缓皮肤衰老效果的新型多肽原料。本法有助于降低生产成本，加速实现产业化。
【IPC分类】C12R1/865, C12P21/02
【公开号】CN104894197
【申请号】CN201510363029
【发明人】陈栋梁
【申请人】梦工坊技术（武汉）有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有多种生理活性的皮肤长寿因子肽及其制备工艺，尤其是，一 种天然的促进皮肤健康长寿的新型肽类产品及其制备工艺。
【背景技术】
[0002] "爱美之心，人皆有之"，这句话放诸四海而皆准，可见人类对美的不懈追求。而皮 肤的健康，则是外表美丽的基础。皮肤覆盖于身体的最外层，是人体最大的器官，它承担着 保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学 性和病原微生物性的侵袭。皮肤直接接触外界的各种物质，包括阳光、空气、灰尘、雾霾、细 菌、化妆品等。这些物质有些对皮肤有益，有些也会对皮肤机能造成一定危害。例如，紫外 线UVA及UVB在渗入皮肤后，会产生有害的自由基，造成胶原和弹性纤维的松弛和脆裂，表 皮细胞新生减缓；细胞核受到自由基伤害，无法分裂出健康的皮肤细胞；细胞间的脂质被 自由基破坏，会变得无法维持住肌肤中的水分。除了紫外线之外，生活中还有许多其它因素 也会加速细胞氧化，导致体内自由基的产生，例如：电脑辐射，抽烟饮酒，紧张压力，垃圾食 品等等，这些因素都会导致皮肤的加速老化。所以我们需要通过补充抗氧化物质来帮助减 少自由基的产生，加速自由基的清除，减缓皮肤的衰老过程。另一个导致皮肤衰老的原因则 是皮肤失水。皮肤过于干燥，会造成角质产生缝隙并松动，抵御外界刺激的功能减退，毛孔 油脂分泌过度，脱皮、假性皱纹等现象。皮肤保湿性差会加速其衰老过程。
[0003] 为了保持皮肤的健康长寿，人们一直从各种不断改进的化妆品成分中寻求灵丹妙 药。蛋白质因是皮肤组成成分，所以备受瞩目。目前，国际市场销售的蛋白质类化妆品原料 近50种。作为化妆品原料，一种含有53个氨基酸的肽类物质一一表皮生长因子备受推崇。 然而它目前主要采用基因工程手段合成，100 μ g约为100美金，价格昂贵，极大地限制了它 的应用。目前，作为皮肤抗衰老产品原料的多肽物质，多以基因工程方法制备，生产成本过 尚。
[0004] 专利200910061718. 0和201210047402. 8均公开过一种制备皮肤长寿因子肽的工 艺，两法均以水解鱼汁浸膏（PST多肽）作为培养基，通过酵母发酵制备皮肤长寿因子肽。而 本发明公开的制备工艺的优点在于：1.旧法的水解鱼汁浸膏为鱼酶解获得的蛋白多肽粉 溶水制得（见图2)，而本法则是将此过程中止于酶灭活之前，直接衔接发酵培养基的灭菌 过程，同时达到酶灭活的目的；将酶解液整体作为培养基，最大程度利用其中的营养物质及 无机盐，减少与终产品无关物质的添加，且富氮培养基有利于发酵产物的积累；2.本法本 着化妆品允许添加、制得成品中无残留或残留对品质无影响等原则，在培养基中添加清蛋 白多肽，作为酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽（GSH)的前体；在培养过程中添加 H2O2，对酵母菌 种形成氧胁迫，刺激酿酒酵母产生GSH ;在培养过程中添加水杨酸作为外源刺激，提高胞内 GSH产量（未见报道，机理尚待研宄）；3.酵母发酵过程利用或吸附培养基中的苦味肽和三 甲胺、醛、酮类腥味物质，达到终产品去腥脱苦的目的，取得与传统方法中活性炭吸附类似 的效果，更省时节能；4.微波破壁的同时，其产生的热力效应，及两次过滤和浓缩、喷雾干 燥过程，对添加的低浓度H2O2及水杨酸的去除起到积极作用，终产品中两物质均未检出。本 法有助于降低生产成本，加速实现产业化。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有多种生理活性的皮肤长寿因子肽及其 制备工艺。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的皮肤长寿因子肽的制备工艺具体步骤如下：
[0008] (1)生产用种子菌的准备：
[0009] 活化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)种子液18~30小时，菌体增殖浓度 达到 85gDCW/L ~175gDCW/L ;
[0010] (2)生产用富氮培养基的制备：
[0011] 将鱼皮碱泡、酸泡并用流水冲洗至中性后，加10倍蒸馏水匀衆，用45°C热水恒温 提取12h，获得含鱼胶原蛋白的水提液；在45°C下，调pH至7. 0,中性蛋白酶添加量2000U/ g，不断搅拌酶解4h，获得含鱼胶原蛋白肽的酶解液；将酶解液与蒸馏水按体积比1:0. 5~ 1:2混勾，加入清蛋白多肽1.0~4.0% (w/w)，葡萄糖1.0~3.0% (w/w);将配制好的发 酵培养基0. lMPa、121°C灭菌、灭酶20min ;
[0012] (3)超氧诱导发酵：
[0013] 培养基灭菌后降温至15~40°C，按接种量5%~15% (v/v)接入步骤（1)活化好 的种子液，培养〇~30小时后向发酵液中添加3mmol/L~300mmol/L H2O2或0. lmmol/L~ 10mmol/L水杨酸（SA)，15~40°C间歇搅拌培养1~3天后停止发酵；
[0014] (4)后处理：
[0015] 发酵液300~700W微波破壁20~60min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品。
[0016] 步骤（1)中，所述的酿酒酵母购置于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为 CCTCC AY 92025,活化种子液24小时，菌体浓度达到160gDCW/L。
[0017] 步骤（2)中，将鱼皮酶解液作为发酵培养基，培养基灭菌与灭酶同时进行，培养基 组成如下：酶解液与蒸馏水按体积比1:1混匀，加入清蛋白多肽2. 0 % (w/w)，葡萄糖2. 0 % (w/w)，其碳氮比为10:3。
[0018] 步骤（3)中，培养基灭菌后降温至30°C，按接种量12% (v/v)接入步骤（1)活化 好的种子液，间歇搅拌培养12小时后向发酵液中添加30mmol/L H2O2或间歇搅拌培养15小 时后向发酵液中添加 lmmol/L水杨酸（SA)，30°C间歇搅拌培养2天后停止发酵。培养基因 酿酒酵母的培养发酵达到去腥脱苦的目的。
[0019] 步骤（4)中，发酵液600W微波破壁40min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤月吴精滤。
[0020] 步骤⑷中，制备获得的皮肤长寿因子肽，其具体属性如下：淡黄色粉末，溶液澄 清透明；多肽含量多93. 0%、羟脯氨酸多7. 6%、谷胱甘肽（GSH)含量多2. 2%、多糖含量 彡0· 6% ;分子量范围为：200~900Da。
[0021] 本发明的积极效果如下：
[0022] 相对于现有技术，本发明涉及的皮肤长寿因子肽制造工艺，利用酶解获得含多肽 的培养基，利用酵母对含多肽的培养基进行超氧诱导发酵，通过发酵过程中产生的GSH，有 效地提高了胶原肽的抗氧化能力，使得皮肤长寿因子肽在具有优异保湿效果的同时也拥有 了良好的抗氧化能力。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明的皮肤长寿因子肽的制备工艺流程图。
[0024] 图2是传统酶解法制备鱼胶原蛋白肽的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0025] 下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0026] 蛋白质类化妆品原料中，最早被广泛应用的是胶原蛋白，这类产品性能温和、功能 多样、使用安全，符合当代化妆品的潮流，成为了高档化妆品的重要原料。如，美国CTFA化 妆品原料手册录用的天然物质和日本《功能性化妆品原料》中选用的天然物质中都有胶原 蛋白或其水解产物（羟脯氨酸、脯氨酸、丝氨酸）。
[0027] 随着生物酶工程技术的发展，人们对由胶原蛋白降解得到的小分子肽有了更深入 地认识。因蛋白肽分子量相对较小，更易被吸收利用，人们逐渐热衷于开发含有小分子肽的 口服及外用化妆品。化妆品原料市场中有些胶原肽即是从深海鱼皮、鱼鳞、鱼骨中提取的， 且国内很多知名的化妆品厂商，在其生产的高档化妆品中都添加了水产胶原肽作为功效因 子。
[0028] 酵母是世界上研宄最多的微生物之一，是当今生物技术产品研宄开发的热点，是 现代生物技术发展、基因组研宄的模式系统。由于酵母已应用于传统的食品工业中的面包 制作和酿造领域，因此有着天然、良好的标签形象。在国外，酵母抽提物的应用非常广泛，市 场也比较成熟，年产销量超过10万吨。欧洲和日本的酵母抽提物产品有一定的差别。欧洲 的产品除了普通的纯酵母抽提物外，还有一些特殊的风味型产品，是采用酵母抽提物加上 合适的香精制成，往往具有肉类、烟熏味等特有的风味特征。在应用上，欧洲通常将酵母抽 提物作为酸水解植物蛋白和味精的替代品。日本的产品一般颜色较浅、溶解性很好，并且在 营养上作了强化，例如高谷胱甘肽含量的酵母抽提物。在国内，高纯度的谷胱甘肽主要用来 做药品，国家的食品添加剂目录中并未明确将其列入，只称其为一种功效因子。然而，高谷 胱甘肽含量的酵母抽提物已列入国家允许使用的食品添加剂目录。这些都为皮肤长寿因子 肽的应用铺平了道路。
[0029] 水杨酸（Salicylic Acid)又名柳酸，可从柳树皮中提取，化学名为邻羟基苯甲酸， 白色针状晶体或毛状结晶性粉末，是重要的精细化工原料。在医药工业中，水杨酸是一种用 途极广的消毒防腐剂。作为医药中间体，水杨酸的衍生物很多，其中之一就是医学上常用的 阿司匹林。化妆品中添加水杨酸，常宣称具有"祛痘"功效，原理是水杨酸溶解了角质间的 构成性物质，能去除积聚过厚的角质层，达到疏通毛孔的作用。在生物科学研宄中，水杨酸 是一种重要的内源信号分子，能够激活一系列植物的抗性防卫反应，也常用来诱导动植物 细胞蛋白的差异性表达。但关于水杨酸刺激酵母细胞高产谷胱甘肽的研宄尚未见报道。本 法本着化妆品允许添加、制得成品中无残留或残留对品质无影响等原则，筛选水杨酸作为 酿酒酵母发酵培养的外源刺激，达到菌株高产GSH的效果，其反应机理尚不清楚。
[0030] 本发明利用酵母对 酶解生成的含多肽的培养基进行发酵来制备皮肤长寿因子肽。 以下涉及的各实施实例均是根据图1所示的流程完成。而通过下述实施实例将有助于理解 本发明，但不限制本发明的内容。
[0031] 实施实例1 :
[0032] 500mL培养基（鱼皮酶解液250mL，蒸馏水250mL，2. 0%清蛋白多肽，2. 0%葡萄 糖）分装到17个300mL三角瓶中（约30mL/瓶），灭菌降温后接入出发菌酿酒酵母，30°C摇 床培养活化24小时制备种子液，菌体浓度160gDCW/L ;
[0033] I. 8L鱼皮酶解液、72g清蛋白多肽、72g葡萄糖、I. 8L蒸馏水配制优化培养基，转入 发酵罐121°C灭菌20分钟后降温至30°C左右，按12%的接种量接入活化24小时的种子液， 间歇搅拌发酵12小时后加入30mmol/L H2O2或间歇搅拌发酵15小时后加入lmmol/L水杨 酸；
[0034] 培养2天后，发酵液600W微波破壁40分钟，经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品192. 7g。
[0035] 不同外源刺激下所制备的皮肤长寿因子肽产品指标如表1所示：
[0036] 表1实施实例1制备的皮肤长寿因子肽指标
[0037]
[0038] 实施实例2 :
[0039] 500mL培养基（鱼皮酶解液330mL，蒸馏水170mL，3. 0%清蛋白多肽，3. 0%葡萄 糖）分装到17个300mL三角瓶中（约30mL/瓶），灭菌降温后接入出发菌酿酒酵母，30°C摇 床培养活化28小时制备种子液，菌体浓度170gDCW/L ;
[0040] 2. 4L鱼皮酶解液、108g清蛋白多肽、108g葡萄糖、I. 2L蒸馏水配制优化培养基，转 入发酵罐121°C灭菌20分钟后降温至30°C左右，按15%的接种量接入活化28小时的种子 液，并加入3mmol/L H2O2或0. lmmol/L水杨酸，间歇搅拌发酵；
[0041] 培养3天后，发酵液700W微波破壁50分钟，经板框过滤器初滤，再经中空纤维超 滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品189. 6g。
[0042] 不同外源刺激下所制备的皮肤长寿因子肽产品指标如表2所示：
[0043] 表2实施实例2制备的皮肤长寿因子肽指标
[0044]
[0045] 实施实例3 :
[0046] 5001^培养基（鱼皮酶解液1701^，蒸馏水33011^，1.0%清蛋白多肽，1.0%葡萄 糖）分装到17个300mL三角瓶中（约30mL/瓶），灭菌降温后接入出发菌酿酒酵母，30°C摇 床培养活化20小时制备种子液，菌体浓度90gDCW/L ;
[0047] I. 2L鱼皮酶解液、36g清蛋白多肽、36g葡萄糖、2. 4L蒸馏水配制优化培养基，转入 发酵罐121°C灭菌20分钟后降温至30°C左右，按8%的接种量接入活化20小时的种子液， 间歇搅拌发酵28小时后加入300mmol/L H2O2或间歇搅拌发酵30小时后加入lOmmol/L水 杨酸；
[0048] 培养60小时后，发酵液500W微波破壁30分钟，经板框过滤器初滤，再经中空纤维 超滤膜精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品188. 2g。
[0049] 不同外源刺激下所制备的皮肤长寿因子肽产品指标如表3所示：
[0050] 表3实施实例3制备的皮肤长寿因子肽指标
[0051]
[0052」 对比例，篸照专利201210047402. 8的万沄：
[0053] 500mL培养基（3. 0%PTS多肽，3. 0%葡萄糖），分装到17个300mL三角瓶中 (约30mL/瓶）灭菌降温后接入活化出发酵母菌种子液，30°C摇床培养活化24小时制备 140gDCW/L 种子液；
[0054] 135gPTS多肽、135g葡萄糖、3. 5L水配制优化培养基，转入发酵罐121°C灭菌30分 钟后降温至30°C左右，接入活化24小时的种子液，间歇搅拌发酵3天；
[0055] 3天后发酵罐夹套通入蒸汽升温至100摄氏度左右，维持20分钟后取出发酵液 5410mL，离心收集上清液浓缩干燥，得产物165. 9g。
[0056] 对比例所制备的皮肤长寿因子肽指标如表4所示：
[0057] 表4对比例制备的皮肤长寿因子肽指标
[0058]
[0059] 为评估本发明涉及的皮肤长寿因子肽的制备工艺获得的皮肤长寿因子肽产品的 性能，将实施例1和对比例制备的多肽进行了以下实验：
[0060] 1.体表保湿功能实验
[0061] 按照1 :4的料液比配制受试物溶液；通过SK-II水分测定仪测定其体表保湿效 果。结果证明皮肤长寿因子肽的体表保湿效果远强于市售多肽产品。
[0062] 2.体外保湿功能实验
[0063] 按照1 :4的料液比配制受试物溶液；通过干燥器模拟恒温恒湿环境；用3M胶布模 拟人体皮肤，涂抹受试物溶液；单位时间测量失水量，折算失水率。结果证明皮肤长寿因子 肽的体外失水率远低于市售多肽产品，有良好的保湿效果。
[0064] 3.清除自由基DPPH能力的测定
[0065] 相同浓度皮肤长寿因子肽和GSH的DPPH自由基清除率见下表：
[0066] 表5皮肤长寿因子肽DPPH自由基清除率（X±s, η = 6)
[0067]
[0068] 由表5可见，本发明的方法制备的皮肤长寿因子肽具有与GSH相当的DPPH自由 基清除率。相对于对比例，本发明制备的皮肤长寿因子肽，其多肽含量、羟脯氨酸含量、GSH 含量均明显提高，相应的抗氧化能力也有所提高；且制备工艺更省时节能，适应于工业化生 产。
[0069] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换 和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺的具体步骤如下： (1) 生产用种子菌的准备： 活化酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)种子液18~30小时，菌体增殖浓度达到 85gDCW/L~175gDCW/L; (2) 生产用富氮培养基的制备： 将鱼皮碱泡、酸泡并用流水冲洗至中性后，加10倍蒸馏水匀浆，用45°C热水恒温提取 12h，获得含鱼胶原蛋白的水提液；在45°C下，调pH至7. 0,中性蛋白酶添加量2000U/g，不 断搅拌酶解4h，获得含鱼胶原蛋白肽的酶解液；将酶解液与蒸馏水按体积比1:0. 5~1:2 混勾，加入清蛋白多肽1.0~4.0 % (w/w)，葡萄糖1.0~3.0 % (w/w);将配制好的发酵培 养基 0?IMPa、121°C灭菌、灭酶 20min; (3) 超氧诱导发酵： 培养基灭菌后降温至15~40°C，按接种量5%~15% (v/v)接入步骤（1)活化好的 种子液，培养〇~30小时后向发酵液中添加3mmol/L~300mmol/LH2O2或0.lmmol/L~ 10mmol/L水杨酸（SA)，15~40°C间歇搅拌培养1~3天后停止发酵； (4) 后处理： 发酵液300~700W微波破壁20~60min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超滤膜 精滤，将滤液浓缩、喷雾干燥后制得成品。2. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（1)中，所述的 酿酒酵母购置于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCCAY92025,活化种子液 24小时，菌体浓度达到160gDCW/L。3. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（2)中，将鱼皮 酶解液作为发酵培养基，培养基灭菌与灭酶同时进行，培养基组成如下：酶解液与蒸馏水按 体积比1:1混勾，加入清蛋白多肽2.0% (w/w)，葡萄糖2.0% (w/w)，其碳氮比为10:3。4. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（3)中，培养基 灭菌后降温至30°C，按接种量12% (v/v)接入步骤（1)活化好的种子液，间歇搅拌培养12 小时后向发酵液中添加30mmol/LH2O2或间歇搅拌培养15小时后向发酵液中添加lmmol/L 水杨酸（SA)，30°C间歇搅拌培养2天后停止发酵。培养基因酿酒酵母的培养发酵达到去腥 脱苦的目的。5. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（4)中，发酵液 600W微波破壁40min后经板框过滤器初滤，再经中空纤维超滤膜精滤。6. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（4)中，制备 获得的皮肤长寿因子肽，其多肽含量多93.0%、羟脯氨酸多7.6%、谷胱甘肽（GSH)含量 彡2. 2%、多糖含量彡0. 6%。7. 如权利要求1所述的皮肤长寿因子肽的制备工艺，其特征在于：步骤（4)中，制备获 得的皮肤长寿因子肽，其中分子量范围为：200~900Da。
【专利摘要】本发明公开了一种皮肤长寿因子肽及其制备工艺，步骤如下：(1)生产用种子菌的准备；(2)生产用富氮培养基的制备；(3)接种；(4)超氧诱导发酵；(5)发酵液微波破壁(7)过滤精制得到皮肤长寿因子肽。本发明通过酶联超氧诱导发酵法制备得到一种具有抗氧化、保湿等延缓皮肤衰老效果的新型多肽原料。本法有助于降低生产成本，加速实现产业化。
【IPC分类】C12R1/865, C12P21/02
【公开号】CN104894197
【申请号】CN201510363029
【发明人】陈栋梁
【申请人】梦工坊技术（武汉）有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
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