路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法
路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法
【专利说明】
[0001] 路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法
技术领域
[0002] 本发明涉及一种从水生生物的血管抑制因子的制备方法，尤其涉及一种路氏双髻 鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法。
[0003]
【背景技术】
[0004] 血管生成是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和慢性炎症等血管增生性疾 病的重要病理特征之一。而以抗血管生成为主的肿瘤生物治疗研宄成为近十多年来抗肿瘤 药物的研宄热点。
[0005] 与以直接杀伤肿瘤细胞为目的的化学治疗相比，肿瘤血管生成抑制剂（Tumor angiogenesis inhibitor，TAI)具有以下独特优点：（1) TAI直接作用于血管内皮细胞，而 抗癌药物经组织扩散时受到组织纤维化、坏死等的影响，经常在组织内达不到有效药物浓 度；（2)相对于基因型不稳定肿瘤细胞，血管内皮细胞属正常细胞，基因型稳定，不易产生 耐药性；（3)原发肿瘤和继发肿瘤的血管内皮细胞相同，而原发灶与继发灶中肿瘤细胞的 生物学特性差异较大，化疗反应亦不同；（4)肿瘤血管内皮细胞的增殖速度比正常组织快 许多倍，TAI对正常组织的影响轻微。基于以上原因，抗血管生成的肿瘤治疗策略将在今后 肿瘤治疗中发挥重要的作用。
[0006] 申请人研宄发现，以路氏双髻鲨软骨为原料，制备血管生成抑制因子的研宄处于 空白阶段，而路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中 的应用更是未见报道。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的尚在于提供一种操作方便、最终产品纯度高的路氏双髻鲨软骨血管 生成抑制因子的制备方法。
[0009] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种路氏双髻鲨软骨血管生成 抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比I g: 8~10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提32~36 h后，于4 °C、10 000 r/min离心15~20 min，取上清液装入截留分子量为I kDa的透析袋中，利用Tris-HCKpH 7. 6)缓冲液于4°C以下透析22~24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋 白粗提液置于4 °C，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0. 5~I h后， 于4 °C以下10 000 r/min离心15~25 min，取上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓 度达60%，静置0· 5~I h后，4 °C以下、10 000 r/min离心15~25 min，取沉淀置于截留 分子量为I kDa的透析袋内用双蒸水于4 °C以下透析22~24 h，透析液冷冻干燥，得路氏 双髻鲨软骨活性蛋白组分。
[0010] 2)路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液 比I g : 20~25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9~10)，得混合液；将混合 液温度升至45~55 °C预热5~10 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1. 5~ 2. 5%加入碱性蛋白酶(酶活力彡2. OXlO5 U/g)，酶解温度为45~55 °C，酶解5~6 h后， 将溶液升温至90~95°C，并于此温度保持10~15 min后，10 OOOg离心20~25 min，取 上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物； 3)路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采 用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依 次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC)纯化，得到路氏双髻鲨软骨 血管生成抑制因子。
[0011] 作为优选，所述步骤1)中的路氏双髻藍为路氏双髻藍作为改 进，所述步骤3)中的凝胶过滤层析、细胞膜色谱和RP-HPLC纯化的具体过程为： 凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6. 5~7. 5磷酸盐缓冲液配成15~25 mg/mL 的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2. 6 X 80 cm)分离，用pH 6. 5~7. 5磷酸盐缓冲 液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血 管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物。
[0012] 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40~50 μ g/mL的溶液， 加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒 毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。
[0013] RP-HPLC纯化:将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80~100 μ g/mL的 溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用得1个高活 性多肽 Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys (PDYKFK)，ESI-MS 检测分子量为 796. 90 Da。
[0014] 优选，所述细胞膜色谱条件为：进样量5~10 μ L ;细胞膜色谱柱（150 mm X 4. 6mm，5 μπι);柱温为37 °C ;流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm ;流速：0· 2 mL/min。
[0015] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 mm X 4. 6 mm，5 μπι);流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm〇
[0016] 再优选，所述细胞膜色谱柱中采用的细胞膜为人脐静脉血管内皮细胞株ECV304 的细胞膜。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于：提取、纯化工艺较先进，制得的血管生成抑 制因子活性显著，可用于肿瘤疾病的防治。
[0018]
【附图说明】
[0019]图1是本发明的超滤酶解液(< I kDa组分）的葡聚糖凝胶G-15柱层析色谱图； 图2是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物（Fr. C)的细胞膜色谱图； 图3是本发明的细胞膜色谱纯化酶解物（Fr. C-II)的RP-HPLC色谱图； 图4是本发明制备步骤流程图。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022] 实施例： 一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：路氏双髻鲨软骨一组 织破碎一盐酸胍抽提一丙酮分级沉淀一凝胶过滤层析纯化一细胞膜色谱纯化一高效液相 色谱纯化一血管生成抑制因子。
[0023] 1)路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨 软骨按固液比I g:10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提36 h 后，于4 °C、10 000 r/min离心20 min，取上清液装入截留分子量为I kDa的透析袋中，利 用Tris-HCl (pH 7. 6)缓冲液于4°C以下透析24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双 髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 °C，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置I h 后，于4 °C以下10 000 r/min离心25 min，取上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度 达60%，静置I h后，4 °C以下、10 000 r/min离心25 min，取沉淀置于截留分子量为I kDa 的透析袋内用双蒸水于4 °C以下透析24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白 组分 2) 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9~10)，得混合液；将混合液温度升至 45~55 °C预热5 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1. 8%加入碱性蛋白酶(酶 活力彡2.0X105 U/g)，酶解温度为50 °C，酶解5 h后，将溶液升温至95°C，并于此温度保 持12 min后，10 OOOg离心25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物； 3) 路氏双髻鲨软骨血 管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采 用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依 次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC)纯化，得到路氏双髻鲨软骨 血管生成抑制因子。
[0024] ①凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 7. 0磷酸盐缓冲液配成25 mg/mL的溶 液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2.6 X 80 cm)分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱， 根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制 作用最强组分为凝胶层析酶解物Fr. C (图1)。
[0025] ②细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物Fr. C用三蒸水配成50 μ g/mL的溶 液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化(条件：进样量50 μ L ;人脐静脉血管内皮细胞株ECV304 的细胞膜柱（150 mm X 4. 6mm，5 μ m);柱温为37 °C;流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm ;流速：0. 2 mL/min)，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用最强组分为细胞 膜色谱纯化酶解物Fr. C-II (图2)。
[0026] ③RP-HPLC纯化:将上述细胞膜色谱纯化酶解物Fr. C-II用三蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件：进样量15 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm)，根据对鸡胚绒毛尿 囊膜（CAM)血管生成抑制作用得1个高活性多肽。
[0027] ④结构检测:收集对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用最强的多肽，经检 测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys (PDYKFK)，ESI-MS 检测分子量为 796. 90 Da。
[0028] 将制得的Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys (PDYKFK)进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血 管生成抑制活性测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等"改进的鸡胚绒毛尿囊膜技 术一无气室孵育法"（记载于《中山大学学报（自然科学版)》，2003年第2册(第42卷）：第 126-128页)。结果表明，路氏双髻鲨血管生成抑制因子TOYKFK显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管生成并呈剂量依赖关系(表1)。
[0029] 表1路氏双髻鲨血管生成抑制因子对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成的抑制作 用
将制得的roYKFK进行促血管生成因子表达影响的测定，测定方法参考孙晓佳、张月 英、贾青等"蝎毒多肽提取物联合化疗抑制Lewis肺癌血管生成实验研宄"（记载于《中国中 药杂志》，2011年第12期(第36卷）：第1644-1649页)。给荷Lewis肺癌小鼠腹腔注射路 氏双髻鲨血管生成抑制因子I 3DYKFK (20.0 mg/kg · dX 14)，取肺癌组织进行免疫组化检查， 检测结果表明：路氏双髻鲨血管生成抑制因子I3DYKFK对血管内皮细胞生长因子（VEGF)、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和血小板衍生生长因子（PDGF)等三种促血管生成因子 的表达有明显的抑制作用（表2)。
[0030] 表2路氏双髻鲨血管生成抑制因子对促血管生成因子表达的抑制作用
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术 人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同 等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比Ig: 8~10mL加入到1.0mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提32~36h后，于4 °C、10OOO r/min离心15~20min，取上清液装入截留分子量为IkDa的透析袋中，利用pH7. 6的 Tris-HCl缓冲液于4°C以下透析22~24h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软 骨蛋白粗提液置于4 °C，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0. 5~Ih 后，于4 °C以下10 000r/min离心15~25min，取上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙 酮浓度达60%，静置0? 5~Ih后，4 °C以下、10 000r/min离心15~25min，取沉淀置于 截留分子量为IkDa的透析袋内用双蒸水于4 °C以下透析22~24h，透析液冷冻干燥，得 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分； 2) 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g: 20~25mL加入浓度0. 05mol/L、pH9~10的Gly-NaOH缓冲液，得混合液；将混合 液温度升至45~55 °C预热5~10min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1. 5~ 2. 5%加入酶活力彡2.OXIO5U/g的碱性蛋白酶，酶解温度为45~55 °C，酶解5~6h后， 将溶液升温至90~95°C，并于此温度保持10~15min后，10OOOg离心20~25min，取 上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物； 3) 路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采 用IkDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于IkDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依 次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成 抑制因子。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中的路氏双髻鲨为路氏双 SphyrnaIewini03. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的凝胶过滤层析、细胞膜 色谱和反相高效液相色谱纯化的具体过程为： 凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH6. 5~7. 5磷酸盐缓冲液配成15~25mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用pH6. 5~7. 5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据 215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最强组 分为凝胶层析酶解物； 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40~50yg/mL的溶液，加入 到细胞膜色谱柱进行纯化，根据215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿 囊膜（CAM)血管生成抑制作用最强组分为细胞膜色谱纯化酶解物； RP-HPLC纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80~100yg/mL的溶 液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用得1个高活性多肽 Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys，ESI-MS检测分子量为 796. 90Da04. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱条件为：进样量5~ 10UL;细胞膜色谱柱规格为150mmX4. 6mm，5ym;柱温为37 °C;流动相：三蒸水；紫 外检测波长215nm;流速：0? 2mL/min〇5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 UL;色谱柱是规格为250mmX4. 6mm、5ym的ZorbaxC18;流动相为20 %乙腈；紫外
【专利摘要】本发明涉及一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法。制备时经过路氏双髻鲨软骨匀浆，盐酸胍抽提，丙酮沉淀分级、酶解、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和高效液相色谱纯化，得Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys。该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，对荷Lewis 肺癌小鼠肺癌组织的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/16, C12P21/06
【公开号】CN104894200
【申请号】CN201510238524
【发明人】王斌, 迟长凤, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【专利说明】
[0001] 路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法
技术领域
[0002] 本发明涉及一种从水生生物的血管抑制因子的制备方法，尤其涉及一种路氏双髻 鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法。
[0003]
【背景技术】
[0004] 血管生成是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和慢性炎症等血管增生性疾 病的重要病理特征之一。而以抗血管生成为主的肿瘤生物治疗研宄成为近十多年来抗肿瘤 药物的研宄热点。
[0005] 与以直接杀伤肿瘤细胞为目的的化学治疗相比，肿瘤血管生成抑制剂（Tumor angiogenesis inhibitor，TAI)具有以下独特优点：（1) TAI直接作用于血管内皮细胞，而 抗癌药物经组织扩散时受到组织纤维化、坏死等的影响，经常在组织内达不到有效药物浓 度；（2)相对于基因型不稳定肿瘤细胞，血管内皮细胞属正常细胞，基因型稳定，不易产生 耐药性；（3)原发肿瘤和继发肿瘤的血管内皮细胞相同，而原发灶与继发灶中肿瘤细胞的 生物学特性差异较大，化疗反应亦不同；（4)肿瘤血管内皮细胞的增殖速度比正常组织快 许多倍，TAI对正常组织的影响轻微。基于以上原因，抗血管生成的肿瘤治疗策略将在今后 肿瘤治疗中发挥重要的作用。
[0006] 申请人研宄发现，以路氏双髻鲨软骨为原料，制备血管生成抑制因子的研宄处于 空白阶段，而路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中 的应用更是未见报道。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的尚在于提供一种操作方便、最终产品纯度高的路氏双髻鲨软骨血管 生成抑制因子的制备方法。
[0009] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种路氏双髻鲨软骨血管生成 抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比I g: 8~10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提32~36 h后，于4 °C、10 000 r/min离心15~20 min，取上清液装入截留分子量为I kDa的透析袋中，利用Tris-HCKpH 7. 6)缓冲液于4°C以下透析22~24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋 白粗提液置于4 °C，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0. 5~I h后， 于4 °C以下10 000 r/min离心15~25 min，取上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓 度达60%，静置0· 5~I h后，4 °C以下、10 000 r/min离心15~25 min，取沉淀置于截留 分子量为I kDa的透析袋内用双蒸水于4 °C以下透析22~24 h，透析液冷冻干燥，得路氏 双髻鲨软骨活性蛋白组分。
[0010] 2)路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液 比I g : 20~25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9~10)，得混合液；将混合 液温度升至45~55 °C预热5~10 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1. 5~ 2. 5%加入碱性蛋白酶(酶活力彡2. OXlO5 U/g)，酶解温度为45~55 °C，酶解5~6 h后， 将溶液升温至90~95°C，并于此温度保持10~15 min后，10 OOOg离心20~25 min，取 上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物； 3)路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采 用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依 次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC)纯化，得到路氏双髻鲨软骨 血管生成抑制因子。
[0011] 作为优选，所述步骤1)中的路氏双髻藍为路氏双髻藍作为改 进，所述步骤3)中的凝胶过滤层析、细胞膜色谱和RP-HPLC纯化的具体过程为： 凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6. 5~7. 5磷酸盐缓冲液配成15~25 mg/mL 的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2. 6 X 80 cm)分离，用pH 6. 5~7. 5磷酸盐缓冲 液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血 管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物。
[0012] 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40~50 μ g/mL的溶液， 加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒 毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。
[0013] RP-HPLC纯化:将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80~100 μ g/mL的 溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用得1个高活 性多肽 Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys (PDYKFK)，ESI-MS 检测分子量为 796. 90 Da。
[0014] 优选，所述细胞膜色谱条件为：进样量5~10 μ L ;细胞膜色谱柱（150 mm X 4. 6mm，5 μπι);柱温为37 °C ;流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm ;流速：0· 2 mL/min。
[0015] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 mm X 4. 6 mm，5 μπι);流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm〇
[0016] 再优选，所述细胞膜色谱柱中采用的细胞膜为人脐静脉血管内皮细胞株ECV304 的细胞膜。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于：提取、纯化工艺较先进，制得的血管生成抑 制因子活性显著，可用于肿瘤疾病的防治。
[0018]
【附图说明】
[0019]图1是本发明的超滤酶解液(< I kDa组分）的葡聚糖凝胶G-15柱层析色谱图； 图2是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物（Fr. C)的细胞膜色谱图； 图3是本发明的细胞膜色谱纯化酶解物（Fr. C-II)的RP-HPLC色谱图； 图4是本发明制备步骤流程图。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022] 实施例： 一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，制备流程如下：路氏双髻鲨软骨一组 织破碎一盐酸胍抽提一丙酮分级沉淀一凝胶过滤层析纯化一细胞膜色谱纯化一高效液相 色谱纯化一血管生成抑制因子。
[0023] 1)路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨 软骨按固液比I g:10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提36 h 后，于4 °C、10 000 r/min离心20 min，取上清液装入截留分子量为I kDa的透析袋中，利 用Tris-HCl (pH 7. 6)缓冲液于4°C以下透析24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双 髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 °C，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置I h 后，于4 °C以下10 000 r/min离心25 min，取上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度 达60%，静置I h后，4 °C以下、10 000 r/min离心25 min，取沉淀置于截留分子量为I kDa 的透析袋内用双蒸水于4 °C以下透析24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白 组分 2) 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9~10)，得混合液；将混合液温度升至 45~55 °C预热5 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1. 8%加入碱性蛋白酶(酶 活力彡2.0X105 U/g)，酶解温度为50 °C，酶解5 h后，将溶液升温至95°C，并于此温度保 持12 min后，10 OOOg离心25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物； 3) 路氏双髻鲨软骨血 管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采 用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依 次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC)纯化，得到路氏双髻鲨软骨 血管生成抑制因子。
[0024] ①凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 7. 0磷酸盐缓冲液配成25 mg/mL的溶 液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析（2.6 X 80 cm)分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱， 根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制 作用最强组分为凝胶层析酶解物Fr. C (图1)。
[0025] ②细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物Fr. C用三蒸水配成50 μ g/mL的溶 液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化(条件：进样量50 μ L ;人脐静脉血管内皮细胞株ECV304 的细胞膜柱（150 mm X 4. 6mm，5 μ m);柱温为37 °C;流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm ;流速：0. 2 mL/min)，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用最强组分为细胞 膜色谱纯化酶解物Fr. C-II (图2)。
[0026] ③RP-HPLC纯化:将上述细胞膜色谱纯化酶解物Fr. C-II用三蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件：进样量15 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm)，根据对鸡胚绒毛尿 囊膜（CAM)血管生成抑制作用得1个高活性多肽。
[0027] ④结构检测:收集对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用最强的多肽，经检 测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys (PDYKFK)，ESI-MS 检测分子量为 796. 90 Da。
[0028] 将制得的Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys (PDYKFK)进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血 管生成抑制活性测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等"改进的鸡胚绒毛尿囊膜技 术一无气室孵育法"（记载于《中山大学学报（自然科学版)》，2003年第2册(第42卷）：第 126-128页)。结果表明，路氏双髻鲨血管生成抑制因子TOYKFK显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管生成并呈剂量依赖关系(表1)。
[0029] 表1路氏双髻鲨血管生成抑制因子对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM)血管生成的抑制作 用
将制得的roYKFK进行促血管生成因子表达影响的测定，测定方法参考孙晓佳、张月 英、贾青等"蝎毒多肽提取物联合化疗抑制Lewis肺癌血管生成实验研宄"（记载于《中国中 药杂志》，2011年第12期(第36卷）：第1644-1649页)。给荷Lewis肺癌小鼠腹腔注射路 氏双髻鲨血管生成抑制因子I 3DYKFK (20.0 mg/kg · dX 14)，取肺癌组织进行免疫组化检查， 检测结果表明：路氏双髻鲨血管生成抑制因子I3DYKFK对血管内皮细胞生长因子（VEGF)、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和血小板衍生生长因子（PDGF)等三种促血管生成因子 的表达有明显的抑制作用（表2)。
[0030] 表2路氏双髻鲨血管生成抑制因子对促血管生成因子表达的抑制作用
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术 人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同 等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比Ig: 8~10mL加入到1.0mol/L盐酸胍溶液中，4 °C、振荡抽提32~36h后，于4 °C、10OOO r/min离心15~20min，取上清液装入截留分子量为IkDa的透析袋中，利用pH7. 6的 Tris-HCl缓冲液于4°C以下透析22~24h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软 骨蛋白粗提液置于4 °C，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0. 5~Ih 后，于4 °C以下10 000r/min离心15~25min，取上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙 酮浓度达60%，静置0? 5~Ih后，4 °C以下、10 000r/min离心15~25min，取沉淀置于 截留分子量为IkDa的透析袋内用双蒸水于4 °C以下透析22~24h，透析液冷冻干燥，得 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分； 2) 路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g: 20~25mL加入浓度0. 05mol/L、pH9~10的Gly-NaOH缓冲液，得混合液；将混合 液温度升至45~55 °C预热5~10min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1. 5~ 2. 5%加入酶活力彡2.OXIO5U/g的碱性蛋白酶，酶解温度为45~55 °C，酶解5~6h后， 将溶液升温至90~95°C，并于此温度保持10~15min后，10OOOg离心20~25min，取 上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物； 3) 路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采 用IkDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于IkDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依 次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成 抑制因子。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中的路氏双髻鲨为路氏双 SphyrnaIewini03. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的凝胶过滤层析、细胞膜 色谱和反相高效液相色谱纯化的具体过程为： 凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH6. 5~7. 5磷酸盐缓冲液配成15~25mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用pH6. 5~7. 5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据 215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最强组 分为凝胶层析酶解物； 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40~50yg/mL的溶液，加入 到细胞膜色谱柱进行纯化，根据215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿 囊膜（CAM)血管生成抑制作用最强组分为细胞膜色谱纯化酶解物； RP-HPLC纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80~100yg/mL的溶 液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用得1个高活性多肽 Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys，ESI-MS检测分子量为 796. 90Da04. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱条件为：进样量5~ 10UL;细胞膜色谱柱规格为150mmX4. 6mm，5ym;柱温为37 °C;流动相：三蒸水；紫 外检测波长215nm;流速：0? 2mL/min〇5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 UL;色谱柱是规格为250mmX4. 6mm、5ym的ZorbaxC18;流动相为20 %乙腈；紫外
【专利摘要】本发明涉及一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法。制备时经过路氏双髻鲨软骨匀浆，盐酸胍抽提，丙酮沉淀分级、酶解、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和高效液相色谱纯化，得Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys。该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，对荷Lewis 肺癌小鼠肺癌组织的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/16, C12P21/06
【公开号】CN104894200
【申请号】CN201510238524
【发明人】王斌, 迟长凤, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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