一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉的方法
一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种水溶提取和酶解相结合的制备生物活性胎盘冻干粉的方法。属于 保健食品的研制与开发领域。
【背景技术】
[0002] 胎盘又名"紫河车"，在我国作为传统中药滋补品已有悠久历史，现代科学研宄发 现，胎盘中含有丰富的免疫蛋白、营养多肽、细胞因子、萜类和激素类物质，具有提高造血能 力、卵巢保健、促进泌乳和美容等功能。胎盘的鲜品、干品均可入药，《本草纲目》对其性质、 药效作了详细的阐述：紫河车"味甘或咸"、"性平偏温"，归心、肺、肾经，具有安心养血、益 气、补精、解毒、补血的作用，对疲劳、消瘦、衰弱者有奇效，"久服者，耳聪目明，须发黑，延年 益寿，有夺造化之功"。《本草图经》中曰其主治"男女虚损劳极，不能生育，下元衰惫。"现 代医学发现，在临床上胎盘提取物制品可用于预防肝硬化、改善人体免疫力、治疗病毒性肝 炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等。这是因为胎盘富含对人体有 用的蛋白质、糖、钙、维生素、干扰素、免疫球蛋白、生长因子、溶菌酶、激肽酶、蛋白酶等活性 物质，主要成分是蛋白质和各种酶。值得关注的是，新鲜人胎盘中还含有人绒毛膜促性腺激 素（HCG)、卵泡激素、黄体激素、催乳素等多种雌激素和孕激素。对人体内分泌调节，尤其是 对女性不孕不育和产后泌乳等有治疗和促进作用。
[0003] 胎盘中还含有大量的微小核糖核酸(微小RNA，或称microRNA) [Ouyang Y, Mouillet JF, Coyne CB, Sadovsky Y. Placenta-specific microRNAs in exosomes -good things come in nano-packages. Placenta. 2014;35 Suppl:S69-73. doi: 10. 1016/j. placenta. 2013. 11. 002.]。微小RNA是一种小的内源性非编码RNA分子，大约 由21 - 25个核苷酸组成。这些小的miRNA通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节 一个或多个基因的表达。至今为止已经发现了 3000多个miRNA，其中胎盘衍生的多种微小 RNA在造血调控中发挥关键性作用，是最主要的基因表达调控因子之一，能够通过母婴传播 和通过肉食间接传递，并长期滞留，发挥调控作用。
[0004] 紫河车的传统炮制工艺主要采用烘、烤、焙干等方法干燥，处理温度都在100°c以 上，然后将干燥物研磨成细粉，由于制造温度高，导致胎盘中的活性蛋白肽、激素和微小RNA 等一些热敏性营养成分大量丢失，这样胎盘对人体的有用功效将大打折扣。同时烘烤得到 的产品腥臭难闻，服用后容易引起恶心、反胃等不良反应。
[0005] 胎盘中含有大量大分子的胶原物质和纤连蛋白，其不易被人体消化吸收。现有的 制备胎盘冻干粉的方法，如2014. 02. 12公布的"一种猪胎盘素的分离提取方法"，未经酶 解，仅提取了水溶性物质，损失了胎盘中丰富的胶原等成分；又如2010年3月3日公开的公 开号为10165853A的"利用液氮低温排氧从羊胎盘中提取羊胎素的方法"专利，公开的方法 是在胎盘中加入液氮，粉碎温度24-25?，将胎盘浆进行酶解60分钟，温度40°C，然后用生 理盐水提取、无机膜过滤、超高压灭菌。该方法的主要缺点是：1)粉碎在液氮下进行，条件 苛刻，设备投入高，生产成本高；2 )未将羊胎盘中的天然肽类活性物质，例如水溶性激素、细 胞因子、小分子核糖核酸分离出来就进行酶解，而蛋白酶也水解上述活性物质，破坏了上述 肽类活性物质，产品活性低；3)而且现有的酶解制备工艺，如2011年12月26日申请的申 请号为201110438853. X的"一种制备羊胎盘素和羊胎盘水解胶原浓缩液的方法"中，采用 截留分子量为2000-10000Da的超滤方法浓缩提及，丢失了大量的小分子活性物质。
【发明内容】
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种三步法制备胎盘生物活性粉的方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案利用水溶和酶解获得胎盘生物活性物质并冷冻干燥 成粉，以足月妊娠之健康胎盘为原料，先制备胎盘浆，然后经水溶浸出液获得水溶性蛋白肽 和核酸成分，不溶性残渣经蛋白酶酶解后短期高温失活，两种组分合并后，再冷冻干燥研磨 获得胎盘活性物质冻干粉，并经臭氧消毒处理即可，具体共包括以下步骤： 1) 采集足月正常妊娠的人胎盘，清洗，装入聚丙乙烯塑料样本袋，立即放入-20°c冷冻 保存； 2) 将冷冻胎盘初步解冻并清洗表面，切成约3cm3的小块后，用绞肉机搅为糜状的胎盘 浆； 3) 将胎盘浆与NaCl溶液按照质量（g):体积（mL)为1:8-1:12的比例，与0. 05-0. 8%的 NaCl溶液混匀，在4-10°C的温度下，200-300转/分钟搅拌提取0. 5-1. 5小时，对浸出液以 3000-10000转/min的速度进行管式离心机分离30min，对水溶性上清液进行-20°C冷冻保 存备用，对不溶性沉淀进行酶解操作； 4) 将胎盘不溶性沉淀加入恒温容器中，根据100~250U/g胎盘沉淀的浓度比例加入胃 凝乳蛋白酶，充分混匀后在36°C水浴环境中酶解2. 5h，再根据15~100U/g胎盘的浓度比例 加入胰蛋白酶，在36°C水浴环境中酶解0. 5h，最后在95°C水浴中加热20min使胰蛋白酶失 活，得到胎盘酶解液； 5) 将步骤4)所得的胎盘酶解液与步骤3)所得的水溶性上清合并，放入样品盘中，厚度 0. 5-1. 5cm，在-40°C冻结，置于真空冷冻干燥机隔板上，隔板设置温度为_25°C至_45°C，抽 真空度为抽真空度达到0. 161，冷阱温度-50°C，隔板温度-40°C，真空度0. 161，保持此状态 6-10h ;加热隔板温度至25°C，持续冷冻干燥l_2h。最终产品水分含量小于3. 5%，即进行下 一步粉碎处理； 6) 用带冷却夹套的粉碎机，在通入4-10°C冷却水的情况下，在4000-5000转/分的条 件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘酶解冻干粉，粉碎完成后，使用50-100目的 分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎； 7) 将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在IPPM的臭氧浓度中，灭菌30min，细菌灭菌率 平均为95. 2%，霉菌灭菌率平均为95. 7%。其中细菌灭菌率最高为99.9%，最低灭菌率为 92. 8% ;霉菌灭菌率最高为100%，最低为92. 8%。
[0008] 应用本发明，利用人胎盘制备酶解冻干粉的水解度最高为35. 36%，冻干粉产率最 高为20%，经电泳检测，显示大分子蛋白降解成了小分子肽段。
[0009] 本发明研宄形成了一整套利用人胎盘三步法：水溶提取、酶解大分子蛋白技术和 真空冷冻干燥技术制备人胎盘冻干粉的优化工艺，为利用胎盘资源生产高附加值的营养保 健品提供了切实可行的技术方法和检测方法，具有产业化前景。
[0010] 该方法具有营养物质利用充分，操作步骤简单实用，资源综合利用率高，环保无污 染等特点。本发明的机理是：首先使用水溶液溶解胎盘浆中的水溶性激素、免疫因子、纤 连蛋白、氨基酸、小分子RNA和钙铁锌等营养成分，剩余残渣含有大分子组织蛋白和胶原蛋 白，可用蛋白酶短时间酶解获得酶解短肽链，两个部分合并后一起经过冷冻真空干燥，制备 出胎盘冻干粉，并经臭氧消毒后装胶囊成品。该生产工艺既可保持胎盘中水溶性营养小分 子的生物学活性，又能促进人体对胶原物质和纤连蛋白的吸收，达到对胎盘营养价值的最 大化，我们所采用的水溶+酶解的生产工艺，能最大程度的保留水溶性物质和大分子物质 全组分活性营养物质，并维持其生物学功能不变。
[0011] 在食品和药品等行业中都应用到各类干燥技术，公认的最适合于保持生物活性的 干燥 技术则是真空冷冻干燥技术，该技术在高真空条件下，将原料中冻结的冰晶，由固态升 华到气态，原料在很低的温度完成了干燥过程，因而对原料所具有的生物活性分子和营养 物质损失非常小。
[0012] 本专利所阐述的酶解加低温冻干的工艺，既可保持胎盘中水溶性营养小分子的生 物学活性，又能促进人体对胶原物质和纤连蛋白的吸收，达到对胎盘营养价值的最大化，可 为现代医学的发展做出贡献。
【附图说明】
[0013] 图1为人胎盘活性冻干粉可促进皮肤成纤维细胞增殖和迀移能力，其中A.皮肤 成纤维细胞的培养形态学观察(瑞氏染色，Mag 200X); B.不同浓度的胎盘冻干粉添加可 促进人皮肤成纤维细胞的增殖；C&D.人胎盘活性冻干粉可促进皮肤成纤维细胞在划痕实 验中的迀移能力(瑞氏染色，Mag 40X); 图2胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能.A&B淋巴细胞的增殖形 态学观察（Mag 40X ) ;C:淋巴细胞增殖15天前后计数比较；D :淋巴细胞表达的主要杀瘤 基因的表达检测，对照组的表达量设为1 ; 图3为胎盘活性冻干粉能提高造血干细胞的集落生成能力.A :各系集落的形态观察 (Mag 40X); B.每种植IO4个细胞所得各系集落计数比较。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式。
[0016] 实施例1 该人胎盘活性冻干粉，按下述步骤得到：取自然分娩、微生物学检测合格的人胎盘，将 胎盘装入塑料样本采集袋中，封口并立即放入-20 °C冷冻保存；将胎盘从-20 °C冷冻箱中取 出进行初步解冻，用清水清洗表面至无血渍和其它杂物之后，切割成约3cm3的小块，然后用 绞肉机搅为糜状物，称为胎盘浆，在此过程中温度不超过25°C ; 将胎盘浆加入〇. 05-0. 8%的NaCl溶液，如胎盘为500g，则加入4000-6000mL的NaCl溶 液，在探头式28KHz低频超声波处理装置中，探头深入溶液液面以下3cm，处理量为250ml， 设定超声功率为250w，超声时间20min，提取温度25°C，超声处理之后，迅速置于4°C放置 Ih ;高速低温离心，4°C下，对浸出液以6000转/min的速度进行管式离心机离心30min，取 上清液，即为水溶性物质，其中其可溶性蛋白含量2~10mg/mL。
[0017] 取离心沉淀，与水按照1:5的质量配比混匀，加入具有恒温搅拌功能的容器中，充 分混匀之后，在一定温度（因素一 ：25-39°C)、pH值（因素二：6. 5-10)的恒温磁力搅拌水浴 环境中，加入一定量的胃凝乳蛋白酶（因素三：l〇〇~250U/g)，酶解反应3. 5h，再根据加入胰 蛋白酶（因素四：15~100U/g)，酶解反应0. 5h，最后在95°C水浴中加热20°C，使胰蛋白酶和 胃凝乳蛋白酶充分失活，得到胎盘酶解液； 将水溶液和酶解液合并放入样品盘中，厚度〇. 5-1. 5cm，在-40°C冻结。将冻结的样 品置于真空冷冻干燥机隔板上，抽真空度为抽真空度达到〇. 161，冷阱温度-50°C，隔板温 度-35°C，真空度0. 161，保持此状态8h ;加热隔板温度至25°C，再持续冷冻干燥2h。最终 产品水分含量小于3. 5%，即进行下一步粉碎处理； 将冻干块状产物置于低温高速粉碎机中，在通入4-10 °C冷却水的情况下，在 4000-5000转/分的条件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘半水解冻干粉，粉碎完 成后，使用50-100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎。称重后得出冻干胎 盘粉得率为15%~20%. 将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在IPPM的臭氧浓度中，灭菌30min，细菌灭菌率平 均为95. 2%，霉菌灭菌率平均为95. 7%。其中细菌灭菌率最高为99.9%，最低灭菌率为 92. 8% ;霉菌灭菌率最高为100%，最低为92. 8%。
[0018] 下面是对上述实施例得到的人胎盘活性冻干粉的研宄分析，及其在促进皮肤成纤 维细胞生长、促进免疫细胞增殖、促进造血和促乳方面的应用试验。
[0019] 人胎盘活性冻干粉的氨基酸组成分析 用L-8900型氨基酸自动分析仪（日本日立公司）分析胎盘冻干粉产品的氨基酸组成 及含量，胎盘冻干粉产品中氨基酸含量依照GB/T5009. 124-2003法进行测定：将胎盘冻干 粉溶于6mol/L的HCl中，除氧，置于IKTC烘箱中水解22-24hr，低温烘干并用蒸馏水洗两 次，驱除残余的HC1，用pH 2的HCl溶液配成梯度进样溶液备用(选择出峰较好的图谱)。各 样品中游离氨基酸的测定：用PH2的HCl溶液将各样品配成梯度进样溶液备用(选择出峰较 好的图谱)。进样量均为50 μ 1。最后以所测数据做图。测试结果显示胎盘冻干粉可以为 人体提供更为丰富的氨基酸，是人体获得氨基酸的一种有效途径。
[0020] 表1本发明人胎盘活性冻干粉氨基酸种类和平均数量百分含量
2.人胎盘活性冻干粉可促进皮肤成纤维细胞增殖和迀移能力 2. 1人皮肤成纤维细胞的培养 术中取小块皮肤，大量生理盐水冲洗后，无菌剪碎，贴于25cm2聚苯乙烯细胞培养瓶底 上，置37°C、5% 0)2和100%湿度培养箱2hr，然后缓慢加入含10%胎牛血清的低糖DMEM 培养基(含终浓度均为l〇ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和10ng/ml的成纤维细胞生长因 子FGF-2)，约接种4-8天后有成纤维状细胞长出，每2~3天更换新鲜培养基，补加等量因子， 长满80%瓶底后用0. 25%的胰蛋白酶消化，并以1:4传代培养，瑞氏染色可见皮肤成纤维细 胞呈现典型的梭形形态(如图1中A所示)。
[0021] 细胞增殖检测 用0. 25%的胰蛋白酶消化收集第5代对数生长期细胞，以2X IOVml密度接种于96孔 培养板，每孔200 μ 1。待细胞贴壁后，更换不同的培养基。对照组加入完全培养基(如上)，实 验组在完全培养基的基础上再分别加入浓度均为1 μ g/ml、50 μ g/ml和100 μ g/ml的胎盘 冻干粉，每个组设6复孔，置37°C、5% 0)2和100%湿度培养箱培养0、24、48和72小时后 每孔加入CCK -8溶液20 μ 1，继续孵育2小时终止，490nm波长处测吸光值（OD值）。记录 结果，以各组为横轴，吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。可见1 μ g/ml、50 μ g/ml和100 μ g/ ml的胎盘冻干粉组的生长均高于对照组，其中以50 μ g/ml胎盘冻干粉对人皮肤成纤维细 胞的促增殖效果最明显（图1中B所示)。
[0022] 细胞划痕损伤实验 用0. 25%的胰蛋白酶消化收集第5代对数生长期细胞，以5X IO5Ail的密度接种于24 孔培养板，当细胞生长至覆盖率达90%后，换入含25 μ g/ml丝裂霉素 C的培养基培养I. 5h。 PBS轻柔冲洗6遍后，用大枪头在培养板中每孔刮出一个宽度为1mm的无细胞区域。PBS轻 柔冲洗掉脱落的洗胞4遍后，分组同前，每组3个复孔，加入对照完全培养基或含50 μ g/ml 胎盘冻干粉的完全培养基，显微镜4倍镜下拍照。继续培养12小时后，PBS冲洗3次，4%的 多聚甲醛固定30min，瑞氏染色后显微镜下拍照，计算内迀移入每平方毫米划痕区域的细胞 (图1中C所示)，由图1中D可见终浓度为50 μ g/ml的胎盘冻干粉可显著促进皮肤成纤维 细胞的迀移。
[0023] 3.胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能力 无菌抽取健康供者外周血20 ml，密度梯度离心分离单个核细胞。生理盐水洗两次， 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞密度调整为5 X l〇7ml，加入培养瓶中，置于 100%湿度、37°C和5% CO2培养箱培养(如图2中A所示 )，当天加入IFN-γ (1000 U/ml)，置 于培养箱培养；第2天加入IL-2 (500 U/ml)和抗⑶3单克隆抗体（50 ng/ml)，第3天补加 含等量因子的培养基；以后每2~3天更换新鲜培养基，补加等量因子。每隔1天通过台盼蓝 染色法计数并检测细胞免疫表型和活性，共培养15天后收获细胞。
[0024] 经过15天的培养扩增细胞数量均明显增多，镜下观察可见细胞快速增殖形成 的克隆球（图2中B所示)，对照组细胞总数平均由培养前平均细胞数4. 6±0.38X IO7 达到培养后细胞数5. 6±0. 45X 108,而添加50yg/mL胎盘粉的实验组细胞总数达到 7±0. 75X 108,高于对照组，但无统计学差异（图2中C所示)。 取上述各组扩增前后MNC细胞，各IXlO6个细胞。按Trizol试剂盒说明提取总 RNA;进行RT-PCR获得cDNA，检测颗粒酶（granzyme ) A、颗粒酶B、GM-CSF、颗粒溶素（ Granulysin )、IFN-γ、TGF-betal、TNF-α 和穿孔素（perforin )基因的表达，以 GAPDH 为内参基因，采用SYBR Green Dye I法在PCR仪MX 3000P进行定量PCR反应，以直接分离 的脐血MNC细胞作为对照组并将其结果设为1，实验数据通过CellQuest软件分析。结果 显示添加50 μ g/ml胎盘冻干粉的实验组淋巴细胞扩增后，其TNF- a、GM-CSF和IFN- γ等 相关细胞因子的mRNA表达水平均有不同程度增加，与未添加胎盘粉的对照组相比较，其中 IFN-γ、TGF-betal上调较为明显（/Χ0. 05)，其余因子均大幅上调（/Χ0. 01)。见图2中D所 不O
[0025] 如图2胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能力.：A&B淋巴细胞 的增殖形态学观察（Mag 40X ) ;C:淋巴细胞增殖15天前后计数比较；D :淋巴细胞表达的 主要杀瘤基因的表达检测，对照组的表达量设为1，可见主要的杀瘤相关基因包括颗粒霉素 A/ B和肿瘤坏死因子alpha的表达均可被50 μ g/ml的胎盘冻干粉所促进，胎盘冻干粉组 中的造血相关因子GM-CSF表达也显著提高，而IFN-γ的表达变化不显著，* p〈 0. 05，林 p〈 0· 01。 4. 胎盘活性冻干粉能提高造血干细胞的集落生成能力 取新鲜正常分娩的健康脐带血，梯度密度离心法获得单个核细胞，调整细胞密度为 I X IO7个/100 μ L后，加入封闭液，置4°C放置20min，然后加入抗⑶34免疫磁珠标记细胞， 在4°C孵育30min后使用MACS的磁柱分离细胞，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时， CD34-细胞被洗脱除去，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集组分为CD34+细胞。将分选的 ⑶34+细胞与2ml半固体培养基混合均匀，种于35-mm培养皿，每孔lml，每孔接种1万个细 胞。维持在37°C、5% CO2饱和湿度环境培养14天，实验组在对照组半固体培养基的基础上 再添加终浓度为50 μ g/ml的胎盘冻干粉。在光学显微镜下根据集落中形成的多种血细胞 系的形态特征原位对集落形成细胞进行分类和计数。根据集落的形态可以分为红系集落 (CFU-E)，粒系集落（CFU-G)，巨核系集落（CFU-M)，粒-巨核系集落（CFU-GM)和混合系集落 (CFU-GEMM)，见图3中A ;集落计数统计结果见图3中B，可见添加50 μ g/ml胎盘冻干粉的 实验组的各组集落均高于对照组，证明添加胎盘冻干粉可以显著的促进造血干细胞的集落 形成能力 5. 胎盘活性冻干粉对大鼠泌乳量的影响 实验采用体重250~270 g的健康SD雌性大鼠和雄性大鼠，常规实验饲粮。实验前 期，雌性大鼠与雄性大鼠按照5:1的比例合笼饲养，待雌性大鼠受孕成功，采用单笼喂养， 12 h光照，环境温度为20~25°C，相对湿度50%~60%，自由饮水与采食。40只孕鼠在分娩 后随机分为4组，每组10个：对照组(常规颗粒鼠粮)，胎盘冻干粉IOg组(每天在饲料中 添加 IOg胎盘冻干粉/Kg饲料)，胎盘冻干粉50g组(每天在饲料中添加50g胎盘冻干粉/Kg 饲料)，胎盘冻干粉100g组(每天在饲料中添加 100g胎盘冻干粉/Kg饲料)。
[0026] 研宄发现，由于母鼠乳汁是其仔鼠营养的唯一来源，因此，哺乳仔鼠的增重基本准 确反映了母鼠的泌乳量，是反映母鼠泌乳性能的一个客观指标，大鼠泌乳性能的测定：将每 只泌乳大鼠及其哺育的仔鼠作为一个观察单位记录，分娩当日为第1天，称取仔鼠初生窝 重，隔天定时称重，计算仔鼠窝增重作为母鼠的泌乳量。由表2可知，添加胎盘冻干粉提高 了母鼠总泌乳量，虽然无统计学差异，但其提高作用普遍。
[0027] 表2胎盘冻干粉添加饲喂对仔鼠增重(泌乳量）的影响（n=10, means 土 SD)
【主权项】
1. 一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 采集足月妊娠的人胎盘，将胎盘装入塑料样本采集袋中，封口并立即放入-20°C冷 冻保存； 2) 将胎盘从-20°C冷冻箱中取出进行初步解冻，并用水将表面清洗，切成约3cm3的小 块后，用绞肉机搅拌为糜状物，称为胎盘浆； 3 )将胎盘浆与NaCl溶液按照质量：体积为1:8-1:12的比例，与0. 05-0. 8%的NaCl溶液 混匀，在4-10°C的温度下，200-300转/分钟搅拌提取0. 5-3小时，对浸出液以3000-10000 转/min的速度进行管式离心机分离20-60min，对上清液进行-20°C冷冻保存备用，对不溶 性沉淀进行酶解操作； 4) 将胎盘不溶性沉淀加入恒温容器中，根据100~250U/g胎盘沉淀的浓度比例加入胃 凝乳蛋白酶，充分混匀后在25-39°C水浴环境中酶解2-5h，再根据15~100U/g胎盘的浓度 比例加入胰蛋白酶，在25-39°C水浴环境中酶解0. 2-lh，最后在95°C水浴中加热IOmin使 胰蛋白酶失活，得到胎盘酶解液； 5) 所得的胎盘酶解液与步骤3)所得的水溶性上清合并后放入样品盘中，厚度 0. 5-1. 5cm，在-40°C冻结，置于真空冷冻干燥机隔板上，隔板设置温度为_25°C至_45°C，抽 真空度为抽真空度达到0. 12-0. 18,冷阱温度-50°C，持续冷冻干燥9h，然后加热隔板温度 至15-30°C，再持续冷冻干燥0. 5-3h，真空度0. 005-0. 01，使终产品水分含量小于3. 5%，即 进行下一步粉碎处理； 6 )将冻干后的产品放入带冷却夹套的粉碎机，在通入4-10 °C冷却水的情况下，在 4000-5000转/分的条件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘酶解冻干粉，粉碎完成 后，使用50-100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎； 7)将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在0. 5-5PPM的臭氧浓度中，灭菌20-50min。
【专利摘要】本发明公开了一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉方法，该方法包括有匀浆、水溶、酶解、冷冻干燥和臭氧消毒等五个工艺阶段，将胎盘匀浆后首先将水溶性营养物质提出，不溶性物质经胃凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解后，酶解产物与水溶物共同实现真空干燥，最后通过低温高速粉化。保证了胎盘营养物质的损失少，提高了分离提取效率，所制备的胎盘活性粉易于消化吸收，活性物质能保持在98%以上，为利用胎盘生产保健食品提供了可靠的科学依据与技术手段。
【IPC分类】A61K9/19, A61K38/02, C12P21/06
【公开号】CN104894201
【申请号】CN201510361662
【发明人】刘勇
【申请人】济南唐恩生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种水溶提取和酶解相结合的制备生物活性胎盘冻干粉的方法。属于 保健食品的研制与开发领域。
【背景技术】
[0002] 胎盘又名"紫河车"，在我国作为传统中药滋补品已有悠久历史，现代科学研宄发 现，胎盘中含有丰富的免疫蛋白、营养多肽、细胞因子、萜类和激素类物质，具有提高造血能 力、卵巢保健、促进泌乳和美容等功能。胎盘的鲜品、干品均可入药，《本草纲目》对其性质、 药效作了详细的阐述：紫河车"味甘或咸"、"性平偏温"，归心、肺、肾经，具有安心养血、益 气、补精、解毒、补血的作用，对疲劳、消瘦、衰弱者有奇效，"久服者，耳聪目明，须发黑，延年 益寿，有夺造化之功"。《本草图经》中曰其主治"男女虚损劳极，不能生育，下元衰惫。"现 代医学发现，在临床上胎盘提取物制品可用于预防肝硬化、改善人体免疫力、治疗病毒性肝 炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等。这是因为胎盘富含对人体有 用的蛋白质、糖、钙、维生素、干扰素、免疫球蛋白、生长因子、溶菌酶、激肽酶、蛋白酶等活性 物质，主要成分是蛋白质和各种酶。值得关注的是，新鲜人胎盘中还含有人绒毛膜促性腺激 素（HCG)、卵泡激素、黄体激素、催乳素等多种雌激素和孕激素。对人体内分泌调节，尤其是 对女性不孕不育和产后泌乳等有治疗和促进作用。
[0003] 胎盘中还含有大量的微小核糖核酸(微小RNA，或称microRNA) [Ouyang Y, Mouillet JF, Coyne CB, Sadovsky Y. Placenta-specific microRNAs in exosomes -good things come in nano-packages. Placenta. 2014;35 Suppl:S69-73. doi: 10. 1016/j. placenta. 2013. 11. 002.]。微小RNA是一种小的内源性非编码RNA分子，大约 由21 - 25个核苷酸组成。这些小的miRNA通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节 一个或多个基因的表达。至今为止已经发现了 3000多个miRNA，其中胎盘衍生的多种微小 RNA在造血调控中发挥关键性作用，是最主要的基因表达调控因子之一，能够通过母婴传播 和通过肉食间接传递，并长期滞留，发挥调控作用。
[0004] 紫河车的传统炮制工艺主要采用烘、烤、焙干等方法干燥，处理温度都在100°c以 上，然后将干燥物研磨成细粉，由于制造温度高，导致胎盘中的活性蛋白肽、激素和微小RNA 等一些热敏性营养成分大量丢失，这样胎盘对人体的有用功效将大打折扣。同时烘烤得到 的产品腥臭难闻，服用后容易引起恶心、反胃等不良反应。
[0005] 胎盘中含有大量大分子的胶原物质和纤连蛋白，其不易被人体消化吸收。现有的 制备胎盘冻干粉的方法，如2014. 02. 12公布的"一种猪胎盘素的分离提取方法"，未经酶 解，仅提取了水溶性物质，损失了胎盘中丰富的胶原等成分；又如2010年3月3日公开的公 开号为10165853A的"利用液氮低温排氧从羊胎盘中提取羊胎素的方法"专利，公开的方法 是在胎盘中加入液氮，粉碎温度24-25?，将胎盘浆进行酶解60分钟，温度40°C，然后用生 理盐水提取、无机膜过滤、超高压灭菌。该方法的主要缺点是：1)粉碎在液氮下进行，条件 苛刻，设备投入高，生产成本高；2 )未将羊胎盘中的天然肽类活性物质，例如水溶性激素、细 胞因子、小分子核糖核酸分离出来就进行酶解，而蛋白酶也水解上述活性物质，破坏了上述 肽类活性物质，产品活性低；3)而且现有的酶解制备工艺，如2011年12月26日申请的申 请号为201110438853. X的"一种制备羊胎盘素和羊胎盘水解胶原浓缩液的方法"中，采用 截留分子量为2000-10000Da的超滤方法浓缩提及，丢失了大量的小分子活性物质。
【发明内容】
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种三步法制备胎盘生物活性粉的方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案利用水溶和酶解获得胎盘生物活性物质并冷冻干燥 成粉，以足月妊娠之健康胎盘为原料，先制备胎盘浆，然后经水溶浸出液获得水溶性蛋白肽 和核酸成分，不溶性残渣经蛋白酶酶解后短期高温失活，两种组分合并后，再冷冻干燥研磨 获得胎盘活性物质冻干粉，并经臭氧消毒处理即可，具体共包括以下步骤： 1) 采集足月正常妊娠的人胎盘，清洗，装入聚丙乙烯塑料样本袋，立即放入-20°c冷冻 保存； 2) 将冷冻胎盘初步解冻并清洗表面，切成约3cm3的小块后，用绞肉机搅为糜状的胎盘 浆； 3) 将胎盘浆与NaCl溶液按照质量（g):体积（mL)为1:8-1:12的比例，与0. 05-0. 8%的 NaCl溶液混匀，在4-10°C的温度下，200-300转/分钟搅拌提取0. 5-1. 5小时，对浸出液以 3000-10000转/min的速度进行管式离心机分离30min，对水溶性上清液进行-20°C冷冻保 存备用，对不溶性沉淀进行酶解操作； 4) 将胎盘不溶性沉淀加入恒温容器中，根据100~250U/g胎盘沉淀的浓度比例加入胃 凝乳蛋白酶，充分混匀后在36°C水浴环境中酶解2. 5h，再根据15~100U/g胎盘的浓度比例 加入胰蛋白酶，在36°C水浴环境中酶解0. 5h，最后在95°C水浴中加热20min使胰蛋白酶失 活，得到胎盘酶解液； 5) 将步骤4)所得的胎盘酶解液与步骤3)所得的水溶性上清合并，放入样品盘中，厚度 0. 5-1. 5cm，在-40°C冻结，置于真空冷冻干燥机隔板上，隔板设置温度为_25°C至_45°C，抽 真空度为抽真空度达到0. 161，冷阱温度-50°C，隔板温度-40°C，真空度0. 161，保持此状态 6-10h ;加热隔板温度至25°C，持续冷冻干燥l_2h。最终产品水分含量小于3. 5%，即进行下 一步粉碎处理； 6) 用带冷却夹套的粉碎机，在通入4-10°C冷却水的情况下，在4000-5000转/分的条 件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘酶解冻干粉，粉碎完成后，使用50-100目的 分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎； 7) 将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在IPPM的臭氧浓度中，灭菌30min，细菌灭菌率 平均为95. 2%，霉菌灭菌率平均为95. 7%。其中细菌灭菌率最高为99.9%，最低灭菌率为 92. 8% ;霉菌灭菌率最高为100%，最低为92. 8%。
[0008] 应用本发明，利用人胎盘制备酶解冻干粉的水解度最高为35. 36%，冻干粉产率最 高为20%，经电泳检测，显示大分子蛋白降解成了小分子肽段。
[0009] 本发明研宄形成了一整套利用人胎盘三步法：水溶提取、酶解大分子蛋白技术和 真空冷冻干燥技术制备人胎盘冻干粉的优化工艺，为利用胎盘资源生产高附加值的营养保 健品提供了切实可行的技术方法和检测方法，具有产业化前景。
[0010] 该方法具有营养物质利用充分，操作步骤简单实用，资源综合利用率高，环保无污 染等特点。本发明的机理是：首先使用水溶液溶解胎盘浆中的水溶性激素、免疫因子、纤 连蛋白、氨基酸、小分子RNA和钙铁锌等营养成分，剩余残渣含有大分子组织蛋白和胶原蛋 白，可用蛋白酶短时间酶解获得酶解短肽链，两个部分合并后一起经过冷冻真空干燥，制备 出胎盘冻干粉，并经臭氧消毒后装胶囊成品。该生产工艺既可保持胎盘中水溶性营养小分 子的生物学活性，又能促进人体对胶原物质和纤连蛋白的吸收，达到对胎盘营养价值的最 大化，我们所采用的水溶+酶解的生产工艺，能最大程度的保留水溶性物质和大分子物质 全组分活性营养物质，并维持其生物学功能不变。
[0011] 在食品和药品等行业中都应用到各类干燥技术，公认的最适合于保持生物活性的 干燥 技术则是真空冷冻干燥技术，该技术在高真空条件下，将原料中冻结的冰晶，由固态升 华到气态，原料在很低的温度完成了干燥过程，因而对原料所具有的生物活性分子和营养 物质损失非常小。
[0012] 本专利所阐述的酶解加低温冻干的工艺，既可保持胎盘中水溶性营养小分子的生 物学活性，又能促进人体对胶原物质和纤连蛋白的吸收，达到对胎盘营养价值的最大化，可 为现代医学的发展做出贡献。
【附图说明】
[0013] 图1为人胎盘活性冻干粉可促进皮肤成纤维细胞增殖和迀移能力，其中A.皮肤 成纤维细胞的培养形态学观察(瑞氏染色，Mag 200X); B.不同浓度的胎盘冻干粉添加可 促进人皮肤成纤维细胞的增殖；C&D.人胎盘活性冻干粉可促进皮肤成纤维细胞在划痕实 验中的迀移能力(瑞氏染色，Mag 40X); 图2胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能.A&B淋巴细胞的增殖形 态学观察（Mag 40X ) ;C:淋巴细胞增殖15天前后计数比较；D :淋巴细胞表达的主要杀瘤 基因的表达检测，对照组的表达量设为1 ; 图3为胎盘活性冻干粉能提高造血干细胞的集落生成能力.A :各系集落的形态观察 (Mag 40X); B.每种植IO4个细胞所得各系集落计数比较。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式。
[0016] 实施例1 该人胎盘活性冻干粉，按下述步骤得到：取自然分娩、微生物学检测合格的人胎盘，将 胎盘装入塑料样本采集袋中，封口并立即放入-20 °C冷冻保存；将胎盘从-20 °C冷冻箱中取 出进行初步解冻，用清水清洗表面至无血渍和其它杂物之后，切割成约3cm3的小块，然后用 绞肉机搅为糜状物，称为胎盘浆，在此过程中温度不超过25°C ; 将胎盘浆加入〇. 05-0. 8%的NaCl溶液，如胎盘为500g，则加入4000-6000mL的NaCl溶 液，在探头式28KHz低频超声波处理装置中，探头深入溶液液面以下3cm，处理量为250ml， 设定超声功率为250w，超声时间20min，提取温度25°C，超声处理之后，迅速置于4°C放置 Ih ;高速低温离心，4°C下，对浸出液以6000转/min的速度进行管式离心机离心30min，取 上清液，即为水溶性物质，其中其可溶性蛋白含量2~10mg/mL。
[0017] 取离心沉淀，与水按照1:5的质量配比混匀，加入具有恒温搅拌功能的容器中，充 分混匀之后，在一定温度（因素一 ：25-39°C)、pH值（因素二：6. 5-10)的恒温磁力搅拌水浴 环境中，加入一定量的胃凝乳蛋白酶（因素三：l〇〇~250U/g)，酶解反应3. 5h，再根据加入胰 蛋白酶（因素四：15~100U/g)，酶解反应0. 5h，最后在95°C水浴中加热20°C，使胰蛋白酶和 胃凝乳蛋白酶充分失活，得到胎盘酶解液； 将水溶液和酶解液合并放入样品盘中，厚度〇. 5-1. 5cm，在-40°C冻结。将冻结的样 品置于真空冷冻干燥机隔板上，抽真空度为抽真空度达到〇. 161，冷阱温度-50°C，隔板温 度-35°C，真空度0. 161，保持此状态8h ;加热隔板温度至25°C，再持续冷冻干燥2h。最终 产品水分含量小于3. 5%，即进行下一步粉碎处理； 将冻干块状产物置于低温高速粉碎机中，在通入4-10 °C冷却水的情况下，在 4000-5000转/分的条件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘半水解冻干粉，粉碎完 成后，使用50-100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎。称重后得出冻干胎 盘粉得率为15%~20%. 将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在IPPM的臭氧浓度中，灭菌30min，细菌灭菌率平 均为95. 2%，霉菌灭菌率平均为95. 7%。其中细菌灭菌率最高为99.9%，最低灭菌率为 92. 8% ;霉菌灭菌率最高为100%，最低为92. 8%。
[0018] 下面是对上述实施例得到的人胎盘活性冻干粉的研宄分析，及其在促进皮肤成纤 维细胞生长、促进免疫细胞增殖、促进造血和促乳方面的应用试验。
[0019] 人胎盘活性冻干粉的氨基酸组成分析 用L-8900型氨基酸自动分析仪（日本日立公司）分析胎盘冻干粉产品的氨基酸组成 及含量，胎盘冻干粉产品中氨基酸含量依照GB/T5009. 124-2003法进行测定：将胎盘冻干 粉溶于6mol/L的HCl中，除氧，置于IKTC烘箱中水解22-24hr，低温烘干并用蒸馏水洗两 次，驱除残余的HC1，用pH 2的HCl溶液配成梯度进样溶液备用(选择出峰较好的图谱)。各 样品中游离氨基酸的测定：用PH2的HCl溶液将各样品配成梯度进样溶液备用(选择出峰较 好的图谱)。进样量均为50 μ 1。最后以所测数据做图。测试结果显示胎盘冻干粉可以为 人体提供更为丰富的氨基酸，是人体获得氨基酸的一种有效途径。
[0020] 表1本发明人胎盘活性冻干粉氨基酸种类和平均数量百分含量
2.人胎盘活性冻干粉可促进皮肤成纤维细胞增殖和迀移能力 2. 1人皮肤成纤维细胞的培养 术中取小块皮肤，大量生理盐水冲洗后，无菌剪碎，贴于25cm2聚苯乙烯细胞培养瓶底 上，置37°C、5% 0)2和100%湿度培养箱2hr，然后缓慢加入含10%胎牛血清的低糖DMEM 培养基(含终浓度均为l〇ng/ml的表皮细胞生长因子EGF和10ng/ml的成纤维细胞生长因 子FGF-2)，约接种4-8天后有成纤维状细胞长出，每2~3天更换新鲜培养基，补加等量因子， 长满80%瓶底后用0. 25%的胰蛋白酶消化，并以1:4传代培养，瑞氏染色可见皮肤成纤维细 胞呈现典型的梭形形态(如图1中A所示)。
[0021] 细胞增殖检测 用0. 25%的胰蛋白酶消化收集第5代对数生长期细胞，以2X IOVml密度接种于96孔 培养板，每孔200 μ 1。待细胞贴壁后，更换不同的培养基。对照组加入完全培养基(如上)，实 验组在完全培养基的基础上再分别加入浓度均为1 μ g/ml、50 μ g/ml和100 μ g/ml的胎盘 冻干粉，每个组设6复孔，置37°C、5% 0)2和100%湿度培养箱培养0、24、48和72小时后 每孔加入CCK -8溶液20 μ 1，继续孵育2小时终止，490nm波长处测吸光值（OD值）。记录 结果，以各组为横轴，吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。可见1 μ g/ml、50 μ g/ml和100 μ g/ ml的胎盘冻干粉组的生长均高于对照组，其中以50 μ g/ml胎盘冻干粉对人皮肤成纤维细 胞的促增殖效果最明显（图1中B所示)。
[0022] 细胞划痕损伤实验 用0. 25%的胰蛋白酶消化收集第5代对数生长期细胞，以5X IO5Ail的密度接种于24 孔培养板，当细胞生长至覆盖率达90%后，换入含25 μ g/ml丝裂霉素 C的培养基培养I. 5h。 PBS轻柔冲洗6遍后，用大枪头在培养板中每孔刮出一个宽度为1mm的无细胞区域。PBS轻 柔冲洗掉脱落的洗胞4遍后，分组同前，每组3个复孔，加入对照完全培养基或含50 μ g/ml 胎盘冻干粉的完全培养基，显微镜4倍镜下拍照。继续培养12小时后，PBS冲洗3次，4%的 多聚甲醛固定30min，瑞氏染色后显微镜下拍照，计算内迀移入每平方毫米划痕区域的细胞 (图1中C所示)，由图1中D可见终浓度为50 μ g/ml的胎盘冻干粉可显著促进皮肤成纤维 细胞的迀移。
[0023] 3.胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能力 无菌抽取健康供者外周血20 ml，密度梯度离心分离单个核细胞。生理盐水洗两次， 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞密度调整为5 X l〇7ml，加入培养瓶中，置于 100%湿度、37°C和5% CO2培养箱培养(如图2中A所示 )，当天加入IFN-γ (1000 U/ml)，置 于培养箱培养；第2天加入IL-2 (500 U/ml)和抗⑶3单克隆抗体（50 ng/ml)，第3天补加 含等量因子的培养基；以后每2~3天更换新鲜培养基，补加等量因子。每隔1天通过台盼蓝 染色法计数并检测细胞免疫表型和活性，共培养15天后收获细胞。
[0024] 经过15天的培养扩增细胞数量均明显增多，镜下观察可见细胞快速增殖形成 的克隆球（图2中B所示)，对照组细胞总数平均由培养前平均细胞数4. 6±0.38X IO7 达到培养后细胞数5. 6±0. 45X 108,而添加50yg/mL胎盘粉的实验组细胞总数达到 7±0. 75X 108,高于对照组，但无统计学差异（图2中C所示)。 取上述各组扩增前后MNC细胞，各IXlO6个细胞。按Trizol试剂盒说明提取总 RNA;进行RT-PCR获得cDNA，检测颗粒酶（granzyme ) A、颗粒酶B、GM-CSF、颗粒溶素（ Granulysin )、IFN-γ、TGF-betal、TNF-α 和穿孔素（perforin )基因的表达，以 GAPDH 为内参基因，采用SYBR Green Dye I法在PCR仪MX 3000P进行定量PCR反应，以直接分离 的脐血MNC细胞作为对照组并将其结果设为1，实验数据通过CellQuest软件分析。结果 显示添加50 μ g/ml胎盘冻干粉的实验组淋巴细胞扩增后，其TNF- a、GM-CSF和IFN- γ等 相关细胞因子的mRNA表达水平均有不同程度增加，与未添加胎盘粉的对照组相比较，其中 IFN-γ、TGF-betal上调较为明显（/Χ0. 05)，其余因子均大幅上调（/Χ0. 01)。见图2中D所 不O
[0025] 如图2胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能力.：A&B淋巴细胞 的增殖形态学观察（Mag 40X ) ;C:淋巴细胞增殖15天前后计数比较；D :淋巴细胞表达的 主要杀瘤基因的表达检测，对照组的表达量设为1，可见主要的杀瘤相关基因包括颗粒霉素 A/ B和肿瘤坏死因子alpha的表达均可被50 μ g/ml的胎盘冻干粉所促进，胎盘冻干粉组 中的造血相关因子GM-CSF表达也显著提高，而IFN-γ的表达变化不显著，* p〈 0. 05，林 p〈 0· 01。 4. 胎盘活性冻干粉能提高造血干细胞的集落生成能力 取新鲜正常分娩的健康脐带血，梯度密度离心法获得单个核细胞，调整细胞密度为 I X IO7个/100 μ L后，加入封闭液，置4°C放置20min，然后加入抗⑶34免疫磁珠标记细胞， 在4°C孵育30min后使用MACS的磁柱分离细胞，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时， CD34-细胞被洗脱除去，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集组分为CD34+细胞。将分选的 ⑶34+细胞与2ml半固体培养基混合均匀，种于35-mm培养皿，每孔lml，每孔接种1万个细 胞。维持在37°C、5% CO2饱和湿度环境培养14天，实验组在对照组半固体培养基的基础上 再添加终浓度为50 μ g/ml的胎盘冻干粉。在光学显微镜下根据集落中形成的多种血细胞 系的形态特征原位对集落形成细胞进行分类和计数。根据集落的形态可以分为红系集落 (CFU-E)，粒系集落（CFU-G)，巨核系集落（CFU-M)，粒-巨核系集落（CFU-GM)和混合系集落 (CFU-GEMM)，见图3中A ;集落计数统计结果见图3中B，可见添加50 μ g/ml胎盘冻干粉的 实验组的各组集落均高于对照组，证明添加胎盘冻干粉可以显著的促进造血干细胞的集落 形成能力 5. 胎盘活性冻干粉对大鼠泌乳量的影响 实验采用体重250~270 g的健康SD雌性大鼠和雄性大鼠，常规实验饲粮。实验前 期，雌性大鼠与雄性大鼠按照5:1的比例合笼饲养，待雌性大鼠受孕成功，采用单笼喂养， 12 h光照，环境温度为20~25°C，相对湿度50%~60%，自由饮水与采食。40只孕鼠在分娩 后随机分为4组，每组10个：对照组(常规颗粒鼠粮)，胎盘冻干粉IOg组(每天在饲料中 添加 IOg胎盘冻干粉/Kg饲料)，胎盘冻干粉50g组(每天在饲料中添加50g胎盘冻干粉/Kg 饲料)，胎盘冻干粉100g组(每天在饲料中添加 100g胎盘冻干粉/Kg饲料)。
[0026] 研宄发现，由于母鼠乳汁是其仔鼠营养的唯一来源，因此，哺乳仔鼠的增重基本准 确反映了母鼠的泌乳量，是反映母鼠泌乳性能的一个客观指标，大鼠泌乳性能的测定：将每 只泌乳大鼠及其哺育的仔鼠作为一个观察单位记录，分娩当日为第1天，称取仔鼠初生窝 重，隔天定时称重，计算仔鼠窝增重作为母鼠的泌乳量。由表2可知，添加胎盘冻干粉提高 了母鼠总泌乳量，虽然无统计学差异，但其提高作用普遍。
[0027] 表2胎盘冻干粉添加饲喂对仔鼠增重(泌乳量）的影响（n=10, means 土 SD)
【主权项】
1. 一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 采集足月妊娠的人胎盘，将胎盘装入塑料样本采集袋中，封口并立即放入-20°C冷 冻保存； 2) 将胎盘从-20°C冷冻箱中取出进行初步解冻，并用水将表面清洗，切成约3cm3的小 块后，用绞肉机搅拌为糜状物，称为胎盘浆； 3 )将胎盘浆与NaCl溶液按照质量：体积为1:8-1:12的比例，与0. 05-0. 8%的NaCl溶液 混匀，在4-10°C的温度下，200-300转/分钟搅拌提取0. 5-3小时，对浸出液以3000-10000 转/min的速度进行管式离心机分离20-60min，对上清液进行-20°C冷冻保存备用，对不溶 性沉淀进行酶解操作； 4) 将胎盘不溶性沉淀加入恒温容器中，根据100~250U/g胎盘沉淀的浓度比例加入胃 凝乳蛋白酶，充分混匀后在25-39°C水浴环境中酶解2-5h，再根据15~100U/g胎盘的浓度 比例加入胰蛋白酶，在25-39°C水浴环境中酶解0. 2-lh，最后在95°C水浴中加热IOmin使 胰蛋白酶失活，得到胎盘酶解液； 5) 所得的胎盘酶解液与步骤3)所得的水溶性上清合并后放入样品盘中，厚度 0. 5-1. 5cm，在-40°C冻结，置于真空冷冻干燥机隔板上，隔板设置温度为_25°C至_45°C，抽 真空度为抽真空度达到0. 12-0. 18,冷阱温度-50°C，持续冷冻干燥9h，然后加热隔板温度 至15-30°C，再持续冷冻干燥0. 5-3h，真空度0. 005-0. 01，使终产品水分含量小于3. 5%，即 进行下一步粉碎处理； 6 )将冻干后的产品放入带冷却夹套的粉碎机，在通入4-10 °C冷却水的情况下，在 4000-5000转/分的条件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘酶解冻干粉，粉碎完成 后，使用50-100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎； 7)将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在0. 5-5PPM的臭氧浓度中，灭菌20-50min。
【专利摘要】本发明公开了一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉方法，该方法包括有匀浆、水溶、酶解、冷冻干燥和臭氧消毒等五个工艺阶段，将胎盘匀浆后首先将水溶性营养物质提出，不溶性物质经胃凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解后，酶解产物与水溶物共同实现真空干燥，最后通过低温高速粉化。保证了胎盘营养物质的损失少，提高了分离提取效率，所制备的胎盘活性粉易于消化吸收，活性物质能保持在98%以上，为利用胎盘生产保健食品提供了可靠的科学依据与技术手段。
【IPC分类】A61K9/19, A61K38/02, C12P21/06
【公开号】CN104894201
【申请号】CN201510361662
【发明人】刘勇
【申请人】济南唐恩生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
最新回复(0)