利用蛇足石杉细胞和内生真菌共培养富集石杉碱甲的方法
利用蛇足石杉细胞和内生真菌共培养富集石杉碱甲的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种植物细胞培养生产石松生物碱技术，具体地说是以植物细胞培养 技术为手段，利用蛇足石杉细胞和内生菌共培养富集石松生物碱石杉碱甲，并以高效液相 色谱仪为检测工具，对石杉碱甲和麦角留醇进行检测，以确定石杉碱甲的最佳收获时间及 继代培养时间点。
【背景技术】：
[0002] 石杉碱甲（huperzine A)是石杉科石杉属植物蛇足石杉中提取出的一种生物碱， 具有高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制活性，可用于治疗重症肌无力、提高青少年学习能力以 及改善老年人记忆功能等，有着极大的市场需求。但蛇足石杉野生资源有限，且石杉碱甲在 全草中含量甚微，长期采挖野生蛇足石杉必将导致资源的枯竭，另外，石杉碱甲合成成本较 为高昂，难以实现产业化。长期以来蛇足石杉和内生真菌共存，基于生物模拟效应，内生真 菌往往能产生与宿主相同或相似的生物活性成分，而麦角留醇（ergosterol)又可以作为 真菌生物量的衡量标准。
[0003] 利用植物细胞培养技术生产石杉碱甲因其具有环境友好、生产周期短、可控性强 等优点而日益受到人们的重视。
[0004] 本发明避开了当前愈伤组织诱导法获取蛇足石杉单细胞中极难完全去除内生真 菌的难点，通过蛇足石杉细胞和内生真菌共培养来富集石杉碱甲，再利用高效液相色谱检 测培养液中蛇足石杉和麦角留醇的含量，通过二者的含量变化确定细胞继代培养及石杉碱 甲收获的最佳时间。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是提供一种通过蛇足石杉细胞和内生真菌的共培养体系来富集石 杉碱甲的方法，细胞的收获时间由石杉碱甲和麦角留醇的相对含量决定。这对蛇足石杉自 然资源的保护和石杉碱甲的开发利用及实现工业化生产有十分重要的理论意义和实用价 值。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] (1)生产有效生物碱的蛇足石杉人工驯化培养：用于栽培蛇足石杉的土壤组成为 兰花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7;保持蛇足石杉的生存环境湿度在95%以上；保持蛇 足石杉的生存环境光照在IOOLx左右；首次将苔藓用于驯化培养中，将苔藓铺于土壤表面， 优势在于苔藓起到保湿作用，且维持了一个良好的生态环境。
[0008] (2)蛇足石杉单细胞获取：取蛇足石杉叶片，依次用以下方法进行表面消毒：70% 酒精5〇8,0.511^/1孔雀石绿81]1；[11，3%双氧水101]1；[11，无菌水3次 ；借助于透明胶带剥离叶 片表面蜡质，将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘 贴2~3次以剥离蜡质；机械破碎法获取植物叶肉单细胞，将已剥离蜡质的叶片划成极小的 小块，刮下置于碾钵中，加入5~IOmL液体培养基，碾磨1~3min后，将混合悬液通过双层 200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min，取沉 淀用培养液再悬浮。
[0009] (3)蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立：蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒 温培养箱暗培养，约10天左右更换一次液体培养基，所用液体培养基主要成分包括MS基本 培养基，5. 0mg/L2,4-D，1.0 mg/LKT，20.0 g/L 蔗糖，调节 pH 为 5. 8。
[0010] (4)活细胞的观察计数：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红染液按4 : 1的比例混合 染色，静置15~20min后观察计数。
[0011] (5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取：取培养液5. OmL，置于冰箱冷冻室，反复冷冻解 冻三次；将培养液及细胞解冻后，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理 2次，每次20min，其间间隔lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲 醇，按上述方法再次提取，滤过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇；用色谱甲醇充分溶解旋 蒸得到的浸膏，转移至西林瓶，甲醇挥发，得到浸膏；甲醇挥发后得到的浸膏用ImL色谱甲 醇充分溶解，用〇. 22 μ m的微孔滤膜过滤。
[0012] (6)石杉碱甲及麦角甾醇的检测：采用的反相色谱柱为Agilent TC (：18柱，由 美国Agilent公司生产，规格4. 6X 150mm，填料粒度5 μ m，检测石杉碱甲的流动相为甲 醇：0.08mol/L醋酸铵（25 : 75, v/v)，波长为310nm，检测麦角甾醇的流动相为甲醇：水 (95 : 5，v/v)，波长为282nm，两者所用流速均为1.000mL/min，温度均为25°C。其中石杉 碱甲的保留时间为9. 191min，麦角甾醇的保留时间为10. 716min。
[0013] (7)分析石杉碱甲含量随培养时间的变化趋势：利用高效液相色谱快速地检测培 养体系中石杉碱甲和麦角留醇的含量，得出最佳收获及继代培养时间，以富集石杉碱甲。
[0014] 本发明具有如下优点：
[0015] 1、通过共培养的方法来富集石杉碱甲，利用蛇足石杉长期与内生真菌共生的特 点，不对外植体进行彻底的灭菌，使内生真菌与植物细胞平衡生长，一方面内生真菌也能产 生石杉碱甲，富集了产物；另一方面内生真菌作为诱导子可促使植物细胞生成石杉碱甲。
[0016] 2、借助于透明胶带剥离叶片表面蜡质，从而使植物细胞更易从母体上脱落而游离 出单个植物细胞以进行悬浮培养。
[0017] 3、用机械破碎法直接获取蛇足石杉单细胞，克服了两个缺点：1)因长期与内生菌 共生而完全灭菌极其困难；2)因生长缓慢而从外植体形成愈伤组织耗时极长。
[0018] 4、采用活体染色法，方便地辨认活细胞，确定悬浮细胞的生长状态。
[0019] 5、取样后立刻将培养液超声20min，并放入冰箱冷冻，有利于细胞的破碎并阻止了 细胞和细菌的生长，保证了实验的准确性。
【附图说明】：
[0020] 图1为石杉碱甲标准品与共培养体系提取液高效液相色谱对照图；
[0021] 图2为麦角留醇标准品与共培养体系提取液高效液相色谱对照图；
[0022] 图3为24天培养周期内石杉碱甲和麦角甾醇的含量变化曲线；
[0023] 图4为24天培养周期内石杉碱甲活细胞数量变化曲线；
[0024] 图5为共培养体系前7天石杉碱甲含量变化曲线。
【具体实施方式】：
[0025] 下面结合色谱图，最本发明作进一步描述。
[0026] 实验仪器与试药：Agilent 1100系列高效液相色谱仪由美国Agilent公司生产， 对照品石杉碱甲和麦角留醇均购于四川省维克奇生物科技有限公司；石杉碱甲-内生真菌 培养物由申请人提供；HPLC分析色谱纯试剂：甲醇、纯净水和0. 08mol/L醋酸铵溶液；提取 用分析纯试剂：甲醇。
[0027] 色谱条件：色谱柱为Agilent TC (：18柱，由美国Agilent公司生产，规格 4· 6X 150mm，填料粒度5 μπι，流速为L 000mL/min，紫外检测波长石杉碱甲为310nm，麦角甾 醇为282nm，柱温为25°C，石杉碱甲流动相为甲醇：0· 08mol/L醋酸铵（25 : 75, v/v)，麦角 甾醇流动相为甲醇：水（95 : 5, v/v)。
[0028] 制定标准曲线：根据两种成分对照品的标准含量，采用外标法，准确定量石杉碱 甲-内生菌培养体系中石杉碱甲及麦角甾醇的含量。精密称取石杉碱甲、麦角甾醇5mg制成 100 μ g/mL的标准溶液，分别取不同体积的该标液配成5,10,15, 20, 25, 30, 35,40,45 μ g/ mL系列浓度梯度的标准溶液，取以上各浓度的对照品溶液10 μ L进样，按上述色谱条件分 别测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制石杉碱甲和麦角留醇的标准曲线，得到各 自的回归方程及相关系数。
[0029] 精确度试验：取5 μ g/mL的石杉碱甲对照品溶液重复进样5次，计算RSD ;
[0030] 重复性试验：取培养液提取物重复测定5次，计算峰面积的RSD ;
[0031] 稳定性试验：取培养液提取物分别在l，2,4,8，12h进样，计算峰面积的RSD ;
[0032] 加样回收率实验：将0. 5mL标准品加入到1.0 mL培养液提取物中，重复进样5次， 计算加样回收率实验及其RSD。
[0033] 方法学考察结果如下所示：
[0034]
[0035] 实施例一
[0036] 1.蛇足石杉人工驯化培养条件的优化：蛇足石杉植株来源-福建省。将同一批蛇 足石杉植株随机分栽在四个花盆里，每个花盆三株植株。分别探宄土壤比例和有无铺苔藓 对其生长状况的影响，并用湿度计分别测量其土壤的湿度、PH和光照强度。所得实验结果 如下表所示：
[0037]
[0038] 通过表格归纳，确定蛇足石杉人工驯化培养条件为：用于栽培蛇足石杉的土壤组 成为兰花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7;保持蛇足石杉的生存环境湿度在95%以上；保 持蛇足石杉的生存环境光照在IOOLx左右。从实验中可以看出，苔藓对于蛇足石杉的生长 状况十分重要，原因可能在于将苔藓铺于土壤表面，苔藓起到保湿作用，且维持了一个良好 的生态环境。
[0039] 2.蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立：随机取蛇足石杉叶片80片，用软毛刷 和洗涤剂清洗表面，然后带入超净工作台，依次用以下方法进行表面消毒：70%酒精50s， 0. 5mg/L孔雀石绿8min，3%双氧水lOmin，无菌水3次。将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上， 用小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴3次以剥离蜡质，将已剥离蜡质的叶片划成 极小的小块，刮下置于已灭菌的研钵中，加入IOmL液体培养基，碾磨3min后，将混合悬液 通过双层200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心 2min，取沉淀用培养液再悬浮。所用液体培养基主要成分包括MS基本培养基， 5. 0mg/L2， 4-D，1.0 mg/LKT，20.0 g/L 蔗糖，调节 pH 为 5. 8。
[0040] 将蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒温培养箱暗培养，第10天更换一次液体培 养基，每2天对活细胞进行观察计数，方法为：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红染液按4 : 1 的比例混合染色，静置20min后观察。观察后发现，蛇足石杉细胞的初始浓度为5. OX IO4/ mL，在第8天达到最大浓度8. OX 104/mL，此后细胞数量急剧减少，第16天起基本死亡。 [0041] 3.石杉碱甲-内生真菌培养液提取物的制备：取培养液5. OmL，反复冷冻解冻三 次，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理2次，每次20min，其间间隔 lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲醇，按上述方法再次提取，滤 过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。将浸膏用ImL色谱甲醇充分溶解，用0. 22 μ m的微 孔滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
[0042] 4.石杉碱甲和麦角甾醇的分离分析：石杉碱甲和麦角甾醇每次进样均为10 μ L， 温度均为25°C，流速均为I. 000mL/min，检测石杉碱甲所用流动相为甲醇：0. 08mol/L醋酸 铵（25 : 75, v/v)，检测波长310nm;麦角留醇流动相为甲醇：水（95 : 5, v/v)，检测波长 282nm。蛇足石杉-内生菌共培养体系中石杉碱甲的含量在第4天达到峰值，麦角留醇在第 12天达到峰值。
[0043] 实施例二
[0044] 1.按照土壤组成为兰花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7 ;保持蛇足石杉的生存 环境湿度在95%以上；保持蛇足石杉的生存环境光照在IOOLx左右对蛇足石杉植株进行人 工驯化。
[0045] 2.蛇足石杉-内生菌共培养体系的建立：随机取蛇足石杉叶片80片，用软毛刷 和洗涤剂清洗表面，然后带入超净工作台，依次用以下方法进行表面消毒：70%酒精50s， 0.511^/1孔雀石绿81]1；[11，3%双氧水101]1；[11，无菌水3次。将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用 小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴3次以剥离蜡质，将已剥离蜡质的叶片划成极 小的小块，刮下置于已灭菌的研钵中，加入IOmL液体培养基，碾磨3min后，将混合悬液通过 双层200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min， 取沉淀用培养液再悬浮。将蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒温培养箱暗培养，第10天更 换一次液体培养基，每2天对活细胞进行观察计数，方法为：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红 染液按4 : 1的比例混合染色，静置20min后观察。
[0046] 此次实验探宄了不同基础培养基对植物细胞-内生真菌共培养体系中的植物细 胞的影响。所用液体培养基主要成分除了基本培养基外，均包括5. 0mg/L2,4-D，1.0 mg/LKT， 20.0 g/L蔗糖，调节pH为5. 8。考察结果如下表所示：
[0047?
[0048] 对于蛇足石杉外植体来说，MS培养基和1/2MS培养基对其影响并不大；而在共培 养体系中，MS优于1/2MS，由此可知，因共培养体系消耗营养物质更快，1/2MS提供养分不 足，故MS培养基更适合于共培养体系。
[0049] 3.石杉碱甲-内生真菌培养液提取物的制备：取培养液5. OmL，反复冷冻解冻三 次，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理2次，每次20min，其间间隔 lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲醇，按上述方法再次提取，滤 过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。将浸膏用ImL色谱甲醇充分溶解，用0. 22 μ m的微 孔滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
[0050] 4.石杉碱甲和麦角甾醇的分离分析：石杉碱甲和麦角甾醇每次进样均为10 μ L， 温度均为25°C，流速均为I. 000mL/min，检测石杉碱甲所用流动相为甲醇：0. 08mol/L醋酸 铵（25 : 75, v/v)，检测波长310nm;麦角留醇流动相为甲醇：水（95 : 5, v/v)，检测波长 282nm。蛇足石杉-内生菌共培养体系中石杉碱甲的含量在第4天达到峰值，麦角留醇在第 12天达到峰值，比初始浓度提高了 33. 05%，并且麦角留醇对体系中石杉碱甲含量的增加 无明显作用。
【主权项】
1. 利用蛇足石杉细胞和内生菌共培养富集石杉碱甲的方法，其特征在于该方法包括以 下步骤： (1) 生产石杉碱甲的蛇足石杉人工驯化培养； (2) 蛇足石杉单细胞获取； (3) 蛇足石杉-内生菌共培养体系的建立； (4) 活细胞的观察计数； (5) 石杉碱甲及麦角留醇的提取； (6) 石杉碱甲及麦角甾醇的检测； (7) 分析石杉碱甲含量随培养时间的变化趋势，得出最佳收获时间以富集石杉碱甲或 者进行继代培养。2. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：用植物细胞活体染色剂对共培养体系中蛇 足石杉悬浮细胞染色并计数。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用石杉碱甲和麦角留醇来衡量共培养体 系中植物细胞和内生菌的生长情况。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)生产石杉碱甲的蛇足石杉 人工驯化培养是指：模拟蛇足石杉自然生存环境。人工驯化培养条件如下： (1) 用于栽培蛇足石杉的土壤组成为沙土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7。 (2) 保持蛇足石杉的生存环境湿度在95%以上。 (3) 保持蛇足石杉的生存环境光照在IOOLx左右。 (4) 首次将苔藓用于驯化培养中，将苔藓铺于土壤表面，优势在于苔藓起到保湿作用， 维持了一个良好的生态环境。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑵蛇足石杉单细胞获取是指： 对蛇足石杉叶片进行表面消毒，以除去叶片表面的真菌及细菌，用机械破碎法获取叶肉细 胞，按如下步骤进行： (1) 蛇足石杉叶片进行表面消毒，取蛇足石杉叶片，依次用以下方法除去叶片表面的真 菌及细菌：7〇%酒精5〇8,0.5111〖凡孔雀石绿8111；[11，3%双氧水1〇111；[11，无菌水3次。 (2) 借助于透明胶带剥离叶片表面蜡质，将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用小刀刮去 叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴2~3次以剥离蜡质。 (3) 机械破碎法获取植物叶肉单细胞，将已剥离蜡质的叶片划成极小的小块，刮下置于 碾钵中，加入5~IOmL液体培养基，碾磨1~3min后，将混合悬液通过双层200目尼龙网 过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min，取沉淀用培养液再 悬浮。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)蛇足石杉-内生真菌共培养 体系的建立是指：蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒温培养箱暗培养，约10天左右更换一 次液体培养基，所用液体培养基主要成分包括MS基本培养基，5. 0mg/L2,4-D，I.Omg/LKT， 20.Og/L鹿糖，调节pH为5. 8。7. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（4)活细胞的观察计数是指：将蛇 足石杉悬浮细胞与中性红染液按4 : 1的比例混合染色，静置15~20min后观察计数。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5)石杉碱甲及麦角留醇的提 取按如下步骤进行： (1) 取样：取培养液5.OmL，置于冰箱冷冻室，反复冷冻解冻三次； (2) 将培养液及细胞解冻后，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理 2次，每次20min，其间间隔lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲 醇，按上述方法再次提取，滤过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。 (3) 用色谱甲醇充分溶解旋蒸得到的浸膏，转移至西林瓶，甲醇挥发，得到浸膏。 (4) 甲醇挥发后得到的浸膏用ImL色谱甲醇充分溶解，用0. 22ym的微孔滤膜过滤。9. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：使用高效液相色谱仪，用AgilentTCC18柱 对石杉碱甲和麦角留醇进行分析。所述步骤（6)石杉碱甲及麦角留醇的检测是指： (1) 以甲醇：〇. 〇8mol/L醋酸铵（25 : 75,v/v)为流动相，流速为1.000mL/min，温度 为25°C，在波长310nm下建立石杉碱甲标准曲线，在同样条件下检测提取物中石杉碱甲的 含量； (2) 以甲醇：水（95 : 5,v/v)为流动相，流速为1.000mL/min，温度为25°C，在波长 282nm下建立麦角甾醇标准曲线，在同样条件下检测提取物中麦角甾醇的含量； (3) 根据检测的实验结果，做出培养体系中石杉碱甲和麦角留醇的含量变化曲线。10. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：由体系中石杉碱甲和麦角留醇的检测含量 做出变化曲线，确定进行最佳收获及继代培养的时间点，以富集石杉碱甲。
【专利摘要】本发明涉及一种蛇足石杉细胞培养生产石松生物碱技术，按照如下步骤进行：(1)生产石杉碱甲的蛇足石杉人工驯化培养；(2)蛇足石杉单细胞获取；(3)蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立；(4)活细胞的观察计数；(5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取；(6)石杉碱甲及麦角甾醇的检测。即用HPLC分别检测该体系中石杉碱甲和麦角甾醇的含量，流动相分别为甲醇：0.08mol/L醋酸铵(25∶75，v/v)，甲醇∶水(95∶5，v/v)。通过两者的含量变化发现该体系中内生真菌对石杉碱甲含量的提高无显著影响，且石杉碱甲的含量在第4天达峰值，比原始含量增加33.05％，此时可收获或继代培养。本发明在蛇足石杉未彻底灭菌的前提下，富集了该体系中的石杉碱甲，此过程快捷且经济。
【IPC分类】C12P39/00, C12P17/12, C12R1/645
【公开号】CN104894206
【申请号】CN201510325447
【发明人】张起辉, 方帅, 蔡龚莉, 郭圆圆, 孙宗良, 罗洁
【申请人】重庆大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月12日
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种植物细胞培养生产石松生物碱技术，具体地说是以植物细胞培养 技术为手段，利用蛇足石杉细胞和内生菌共培养富集石松生物碱石杉碱甲，并以高效液相 色谱仪为检测工具，对石杉碱甲和麦角留醇进行检测，以确定石杉碱甲的最佳收获时间及 继代培养时间点。
【背景技术】：
[0002] 石杉碱甲（huperzine A)是石杉科石杉属植物蛇足石杉中提取出的一种生物碱， 具有高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制活性，可用于治疗重症肌无力、提高青少年学习能力以 及改善老年人记忆功能等，有着极大的市场需求。但蛇足石杉野生资源有限，且石杉碱甲在 全草中含量甚微，长期采挖野生蛇足石杉必将导致资源的枯竭，另外，石杉碱甲合成成本较 为高昂，难以实现产业化。长期以来蛇足石杉和内生真菌共存，基于生物模拟效应，内生真 菌往往能产生与宿主相同或相似的生物活性成分，而麦角留醇（ergosterol)又可以作为 真菌生物量的衡量标准。
[0003] 利用植物细胞培养技术生产石杉碱甲因其具有环境友好、生产周期短、可控性强 等优点而日益受到人们的重视。
[0004] 本发明避开了当前愈伤组织诱导法获取蛇足石杉单细胞中极难完全去除内生真 菌的难点，通过蛇足石杉细胞和内生真菌共培养来富集石杉碱甲，再利用高效液相色谱检 测培养液中蛇足石杉和麦角留醇的含量，通过二者的含量变化确定细胞继代培养及石杉碱 甲收获的最佳时间。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是提供一种通过蛇足石杉细胞和内生真菌的共培养体系来富集石 杉碱甲的方法，细胞的收获时间由石杉碱甲和麦角留醇的相对含量决定。这对蛇足石杉自 然资源的保护和石杉碱甲的开发利用及实现工业化生产有十分重要的理论意义和实用价 值。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] (1)生产有效生物碱的蛇足石杉人工驯化培养：用于栽培蛇足石杉的土壤组成为 兰花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7;保持蛇足石杉的生存环境湿度在95%以上；保持蛇 足石杉的生存环境光照在IOOLx左右；首次将苔藓用于驯化培养中，将苔藓铺于土壤表面， 优势在于苔藓起到保湿作用，且维持了一个良好的生态环境。
[0008] (2)蛇足石杉单细胞获取：取蛇足石杉叶片，依次用以下方法进行表面消毒：70% 酒精5〇8,0.511^/1孔雀石绿81]1；[11，3%双氧水101]1；[11，无菌水3次 ；借助于透明胶带剥离叶 片表面蜡质，将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘 贴2~3次以剥离蜡质；机械破碎法获取植物叶肉单细胞，将已剥离蜡质的叶片划成极小的 小块，刮下置于碾钵中，加入5~IOmL液体培养基，碾磨1~3min后，将混合悬液通过双层 200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min，取沉 淀用培养液再悬浮。
[0009] (3)蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立：蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒 温培养箱暗培养，约10天左右更换一次液体培养基，所用液体培养基主要成分包括MS基本 培养基，5. 0mg/L2,4-D，1.0 mg/LKT，20.0 g/L 蔗糖，调节 pH 为 5. 8。
[0010] (4)活细胞的观察计数：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红染液按4 : 1的比例混合 染色，静置15~20min后观察计数。
[0011] (5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取：取培养液5. OmL，置于冰箱冷冻室，反复冷冻解 冻三次；将培养液及细胞解冻后，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理 2次，每次20min，其间间隔lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲 醇，按上述方法再次提取，滤过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇；用色谱甲醇充分溶解旋 蒸得到的浸膏，转移至西林瓶，甲醇挥发，得到浸膏；甲醇挥发后得到的浸膏用ImL色谱甲 醇充分溶解，用〇. 22 μ m的微孔滤膜过滤。
[0012] (6)石杉碱甲及麦角甾醇的检测：采用的反相色谱柱为Agilent TC (：18柱，由 美国Agilent公司生产，规格4. 6X 150mm，填料粒度5 μ m，检测石杉碱甲的流动相为甲 醇：0.08mol/L醋酸铵（25 : 75, v/v)，波长为310nm，检测麦角甾醇的流动相为甲醇：水 (95 : 5，v/v)，波长为282nm，两者所用流速均为1.000mL/min，温度均为25°C。其中石杉 碱甲的保留时间为9. 191min，麦角甾醇的保留时间为10. 716min。
[0013] (7)分析石杉碱甲含量随培养时间的变化趋势：利用高效液相色谱快速地检测培 养体系中石杉碱甲和麦角留醇的含量，得出最佳收获及继代培养时间，以富集石杉碱甲。
[0014] 本发明具有如下优点：
[0015] 1、通过共培养的方法来富集石杉碱甲，利用蛇足石杉长期与内生真菌共生的特 点，不对外植体进行彻底的灭菌，使内生真菌与植物细胞平衡生长，一方面内生真菌也能产 生石杉碱甲，富集了产物；另一方面内生真菌作为诱导子可促使植物细胞生成石杉碱甲。
[0016] 2、借助于透明胶带剥离叶片表面蜡质，从而使植物细胞更易从母体上脱落而游离 出单个植物细胞以进行悬浮培养。
[0017] 3、用机械破碎法直接获取蛇足石杉单细胞，克服了两个缺点：1)因长期与内生菌 共生而完全灭菌极其困难；2)因生长缓慢而从外植体形成愈伤组织耗时极长。
[0018] 4、采用活体染色法，方便地辨认活细胞，确定悬浮细胞的生长状态。
[0019] 5、取样后立刻将培养液超声20min，并放入冰箱冷冻，有利于细胞的破碎并阻止了 细胞和细菌的生长，保证了实验的准确性。
【附图说明】：
[0020] 图1为石杉碱甲标准品与共培养体系提取液高效液相色谱对照图；
[0021] 图2为麦角留醇标准品与共培养体系提取液高效液相色谱对照图；
[0022] 图3为24天培养周期内石杉碱甲和麦角甾醇的含量变化曲线；
[0023] 图4为24天培养周期内石杉碱甲活细胞数量变化曲线；
[0024] 图5为共培养体系前7天石杉碱甲含量变化曲线。
【具体实施方式】：
[0025] 下面结合色谱图，最本发明作进一步描述。
[0026] 实验仪器与试药：Agilent 1100系列高效液相色谱仪由美国Agilent公司生产， 对照品石杉碱甲和麦角留醇均购于四川省维克奇生物科技有限公司；石杉碱甲-内生真菌 培养物由申请人提供；HPLC分析色谱纯试剂：甲醇、纯净水和0. 08mol/L醋酸铵溶液；提取 用分析纯试剂：甲醇。
[0027] 色谱条件：色谱柱为Agilent TC (：18柱，由美国Agilent公司生产，规格 4· 6X 150mm，填料粒度5 μπι，流速为L 000mL/min，紫外检测波长石杉碱甲为310nm，麦角甾 醇为282nm，柱温为25°C，石杉碱甲流动相为甲醇：0· 08mol/L醋酸铵（25 : 75, v/v)，麦角 甾醇流动相为甲醇：水（95 : 5, v/v)。
[0028] 制定标准曲线：根据两种成分对照品的标准含量，采用外标法，准确定量石杉碱 甲-内生菌培养体系中石杉碱甲及麦角甾醇的含量。精密称取石杉碱甲、麦角甾醇5mg制成 100 μ g/mL的标准溶液，分别取不同体积的该标液配成5,10,15, 20, 25, 30, 35,40,45 μ g/ mL系列浓度梯度的标准溶液，取以上各浓度的对照品溶液10 μ L进样，按上述色谱条件分 别测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制石杉碱甲和麦角留醇的标准曲线，得到各 自的回归方程及相关系数。
[0029] 精确度试验：取5 μ g/mL的石杉碱甲对照品溶液重复进样5次，计算RSD ;
[0030] 重复性试验：取培养液提取物重复测定5次，计算峰面积的RSD ;
[0031] 稳定性试验：取培养液提取物分别在l，2,4,8，12h进样，计算峰面积的RSD ;
[0032] 加样回收率实验：将0. 5mL标准品加入到1.0 mL培养液提取物中，重复进样5次， 计算加样回收率实验及其RSD。
[0033] 方法学考察结果如下所示：
[0034]
[0035] 实施例一
[0036] 1.蛇足石杉人工驯化培养条件的优化：蛇足石杉植株来源-福建省。将同一批蛇 足石杉植株随机分栽在四个花盆里，每个花盆三株植株。分别探宄土壤比例和有无铺苔藓 对其生长状况的影响，并用湿度计分别测量其土壤的湿度、PH和光照强度。所得实验结果 如下表所示：
[0037]
[0038] 通过表格归纳，确定蛇足石杉人工驯化培养条件为：用于栽培蛇足石杉的土壤组 成为兰花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7;保持蛇足石杉的生存环境湿度在95%以上；保 持蛇足石杉的生存环境光照在IOOLx左右。从实验中可以看出，苔藓对于蛇足石杉的生长 状况十分重要，原因可能在于将苔藓铺于土壤表面，苔藓起到保湿作用，且维持了一个良好 的生态环境。
[0039] 2.蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立：随机取蛇足石杉叶片80片，用软毛刷 和洗涤剂清洗表面，然后带入超净工作台，依次用以下方法进行表面消毒：70%酒精50s， 0. 5mg/L孔雀石绿8min，3%双氧水lOmin，无菌水3次。将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上， 用小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴3次以剥离蜡质，将已剥离蜡质的叶片划成 极小的小块，刮下置于已灭菌的研钵中，加入IOmL液体培养基，碾磨3min后，将混合悬液 通过双层200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心 2min，取沉淀用培养液再悬浮。所用液体培养基主要成分包括MS基本培养基， 5. 0mg/L2， 4-D，1.0 mg/LKT，20.0 g/L 蔗糖，调节 pH 为 5. 8。
[0040] 将蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒温培养箱暗培养，第10天更换一次液体培 养基，每2天对活细胞进行观察计数，方法为：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红染液按4 : 1 的比例混合染色，静置20min后观察。观察后发现，蛇足石杉细胞的初始浓度为5. OX IO4/ mL，在第8天达到最大浓度8. OX 104/mL，此后细胞数量急剧减少，第16天起基本死亡。 [0041] 3.石杉碱甲-内生真菌培养液提取物的制备：取培养液5. OmL，反复冷冻解冻三 次，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理2次，每次20min，其间间隔 lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲醇，按上述方法再次提取，滤 过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。将浸膏用ImL色谱甲醇充分溶解，用0. 22 μ m的微 孔滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
[0042] 4.石杉碱甲和麦角甾醇的分离分析：石杉碱甲和麦角甾醇每次进样均为10 μ L， 温度均为25°C，流速均为I. 000mL/min，检测石杉碱甲所用流动相为甲醇：0. 08mol/L醋酸 铵（25 : 75, v/v)，检测波长310nm;麦角留醇流动相为甲醇：水（95 : 5, v/v)，检测波长 282nm。蛇足石杉-内生菌共培养体系中石杉碱甲的含量在第4天达到峰值，麦角留醇在第 12天达到峰值。
[0043] 实施例二
[0044] 1.按照土壤组成为兰花土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7 ;保持蛇足石杉的生存 环境湿度在95%以上；保持蛇足石杉的生存环境光照在IOOLx左右对蛇足石杉植株进行人 工驯化。
[0045] 2.蛇足石杉-内生菌共培养体系的建立：随机取蛇足石杉叶片80片，用软毛刷 和洗涤剂清洗表面，然后带入超净工作台，依次用以下方法进行表面消毒：70%酒精50s， 0.511^/1孔雀石绿81]1；[11，3%双氧水101]1；[11，无菌水3次。将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用 小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴3次以剥离蜡质，将已剥离蜡质的叶片划成极 小的小块，刮下置于已灭菌的研钵中，加入IOmL液体培养基，碾磨3min后，将混合悬液通过 双层200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min， 取沉淀用培养液再悬浮。将蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒温培养箱暗培养，第10天更 换一次液体培养基，每2天对活细胞进行观察计数，方法为：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红 染液按4 : 1的比例混合染色，静置20min后观察。
[0046] 此次实验探宄了不同基础培养基对植物细胞-内生真菌共培养体系中的植物细 胞的影响。所用液体培养基主要成分除了基本培养基外，均包括5. 0mg/L2,4-D，1.0 mg/LKT， 20.0 g/L蔗糖，调节pH为5. 8。考察结果如下表所示：
[0047?
[0048] 对于蛇足石杉外植体来说，MS培养基和1/2MS培养基对其影响并不大；而在共培 养体系中，MS优于1/2MS，由此可知，因共培养体系消耗营养物质更快，1/2MS提供养分不 足，故MS培养基更适合于共培养体系。
[0049] 3.石杉碱甲-内生真菌培养液提取物的制备：取培养液5. OmL，反复冷冻解冻三 次，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理2次，每次20min，其间间隔 lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲醇，按上述方法再次提取，滤 过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。将浸膏用ImL色谱甲醇充分溶解，用0. 22 μ m的微 孔滤膜过滤，滤液供HPLC测定。
[0050] 4.石杉碱甲和麦角甾醇的分离分析：石杉碱甲和麦角甾醇每次进样均为10 μ L， 温度均为25°C，流速均为I. 000mL/min，检测石杉碱甲所用流动相为甲醇：0. 08mol/L醋酸 铵（25 : 75, v/v)，检测波长310nm;麦角留醇流动相为甲醇：水（95 : 5, v/v)，检测波长 282nm。蛇足石杉-内生菌共培养体系中石杉碱甲的含量在第4天达到峰值，麦角留醇在第 12天达到峰值，比初始浓度提高了 33. 05%，并且麦角留醇对体系中石杉碱甲含量的增加 无明显作用。
【主权项】
1. 利用蛇足石杉细胞和内生菌共培养富集石杉碱甲的方法，其特征在于该方法包括以 下步骤： (1) 生产石杉碱甲的蛇足石杉人工驯化培养； (2) 蛇足石杉单细胞获取； (3) 蛇足石杉-内生菌共培养体系的建立； (4) 活细胞的观察计数； (5) 石杉碱甲及麦角留醇的提取； (6) 石杉碱甲及麦角甾醇的检测； (7) 分析石杉碱甲含量随培养时间的变化趋势，得出最佳收获时间以富集石杉碱甲或 者进行继代培养。2. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：用植物细胞活体染色剂对共培养体系中蛇 足石杉悬浮细胞染色并计数。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用石杉碱甲和麦角留醇来衡量共培养体 系中植物细胞和内生菌的生长情况。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)生产石杉碱甲的蛇足石杉 人工驯化培养是指：模拟蛇足石杉自然生存环境。人工驯化培养条件如下： (1) 用于栽培蛇足石杉的土壤组成为沙土 ：河沙=2 : 1，土壤pH约为7。 (2) 保持蛇足石杉的生存环境湿度在95%以上。 (3) 保持蛇足石杉的生存环境光照在IOOLx左右。 (4) 首次将苔藓用于驯化培养中，将苔藓铺于土壤表面，优势在于苔藓起到保湿作用， 维持了一个良好的生态环境。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑵蛇足石杉单细胞获取是指： 对蛇足石杉叶片进行表面消毒，以除去叶片表面的真菌及细菌，用机械破碎法获取叶肉细 胞，按如下步骤进行： (1) 蛇足石杉叶片进行表面消毒，取蛇足石杉叶片，依次用以下方法除去叶片表面的真 菌及细菌：7〇%酒精5〇8,0.5111〖凡孔雀石绿8111；[11，3%双氧水1〇111；[11，无菌水3次。 (2) 借助于透明胶带剥离叶片表面蜡质，将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用小刀刮去 叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴2~3次以剥离蜡质。 (3) 机械破碎法获取植物叶肉单细胞，将已剥离蜡质的叶片划成极小的小块，刮下置于 碾钵中，加入5~IOmL液体培养基，碾磨1~3min后，将混合悬液通过双层200目尼龙网 过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min，取沉淀用培养液再 悬浮。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)蛇足石杉-内生真菌共培养 体系的建立是指：蛇足石杉单细胞悬浮液置于24°C恒温培养箱暗培养，约10天左右更换一 次液体培养基，所用液体培养基主要成分包括MS基本培养基，5. 0mg/L2,4-D，I.Omg/LKT， 20.Og/L鹿糖，调节pH为5. 8。7. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤（4)活细胞的观察计数是指：将蛇 足石杉悬浮细胞与中性红染液按4 : 1的比例混合染色，静置15~20min后观察计数。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5)石杉碱甲及麦角留醇的提 取按如下步骤进行： (1) 取样：取培养液5.OmL，置于冰箱冷冻室，反复冷冻解冻三次； (2) 将培养液及细胞解冻后，旋转蒸发除去水分，用IOmL甲醇溶解，在30°C下超声处理 2次，每次20min，其间间隔lOmin，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入IOmL甲 醇，按上述方法再次提取，滤过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。 (3) 用色谱甲醇充分溶解旋蒸得到的浸膏，转移至西林瓶，甲醇挥发，得到浸膏。 (4) 甲醇挥发后得到的浸膏用ImL色谱甲醇充分溶解，用0. 22ym的微孔滤膜过滤。9. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：使用高效液相色谱仪，用AgilentTCC18柱 对石杉碱甲和麦角留醇进行分析。所述步骤（6)石杉碱甲及麦角留醇的检测是指： (1) 以甲醇：〇. 〇8mol/L醋酸铵（25 : 75,v/v)为流动相，流速为1.000mL/min，温度 为25°C，在波长310nm下建立石杉碱甲标准曲线，在同样条件下检测提取物中石杉碱甲的 含量； (2) 以甲醇：水（95 : 5,v/v)为流动相，流速为1.000mL/min，温度为25°C，在波长 282nm下建立麦角甾醇标准曲线，在同样条件下检测提取物中麦角甾醇的含量； (3) 根据检测的实验结果，做出培养体系中石杉碱甲和麦角留醇的含量变化曲线。10. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：由体系中石杉碱甲和麦角留醇的检测含量 做出变化曲线，确定进行最佳收获及继代培养的时间点，以富集石杉碱甲。
【专利摘要】本发明涉及一种蛇足石杉细胞培养生产石松生物碱技术，按照如下步骤进行：(1)生产石杉碱甲的蛇足石杉人工驯化培养；(2)蛇足石杉单细胞获取；(3)蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立；(4)活细胞的观察计数；(5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取；(6)石杉碱甲及麦角甾醇的检测。即用HPLC分别检测该体系中石杉碱甲和麦角甾醇的含量，流动相分别为甲醇：0.08mol/L醋酸铵(25∶75，v/v)，甲醇∶水(95∶5，v/v)。通过两者的含量变化发现该体系中内生真菌对石杉碱甲含量的提高无显著影响，且石杉碱甲的含量在第4天达峰值，比原始含量增加33.05％，此时可收获或继代培养。本发明在蛇足石杉未彻底灭菌的前提下，富集了该体系中的石杉碱甲，此过程快捷且经济。
【IPC分类】C12P39/00, C12P17/12, C12R1/645
【公开号】CN104894206
【申请号】CN201510325447
【发明人】张起辉, 方帅, 蔡龚莉, 郭圆圆, 孙宗良, 罗洁
【申请人】重庆大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月12日
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