一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法
一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，具体涉及一种混菌发酵木薯生产 丙酮、丁醇和乙醇的方法。
【背景技术】：
[0002] 现有的以木薯为原料发酵生产乙醇的工艺通过木薯原料蒸煮糊化、液化、糖化、发 酵，对发酵醪液进行蒸馏分离得到乙醇，其工艺流程如下：首先将木薯原料粉碎调浆，然后 对其进行蒸煮，使其糊化，加入α -淀粉酶进行液化，然后加入糖化酶使淀粉水解为可发酵 性糖，补加氮磷源并灭菌，然后接种培养成熟的酿酒酵母种子进行发酵，或者是糖化工艺和 发酵工艺同步进行，发酵结束后对发酵醪液进行蒸馏得到乙醇。
[0003] 现有的以木薯为原料发酵法生产丙酮、丁醇和乙醇的工艺是通过木薯原料粉碎， 添加氮磷源后直接灭菌配制发酵培养基，接种培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液进行发酵， 发酵结束后对发酵醪液进行蒸馏得到丙酮、丁醇和乙醇。由于丙酮丁醇梭菌能够产淀粉酶 和糖化酶，因此可以直接利用木薯淀粉进行发酵。
[0004] 目前技术存在以下的问题和不足：1、木薯乙醇发酵工艺中原料的糖化工艺需要加 入淀粉酶和糖化酶，淀粉酶和糖化酶价格昂贵，降低了产品的价格竞争力；2、木薯乙醇发酵 工艺中液化、糖化与发酵分开进行，整个过程能耗巨大。3、木薯丁醇发酵工艺中总溶剂（丙 酮、丁醇和乙醇）的得率较低，仅为〇. 30-0. 35g/g葡萄糖。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中酿酒酵母木薯乙醇发酵和丙酮丁醇梭菌木薯丁 醇发酵中单菌发酵存在的问题，提供一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案予以实现的：
[0007] -种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
[0008] a、以木薯为碳源，将木薯原料粉碎，添加氮源、磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯 发酵培养基；
[0009] b、将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于步骤a得到 的木薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇；丙酮丁醇梭菌种子液接种后 第〇-48h再接种酿酒酵母种子液，接种量为5 % -10% ;厌氧发酵温度为30-37〇 C，厌氧发 酵时间为24-108h。
[0010] 木薯发酵培养基中木薯浓度为75-275g/L，木薯发酵培养基补加的氮源或磷源选 自以下之一或者其混合：玉米浆、玉米粉、麸皮、米糠、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、硫酸 铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢 钾、磷酸氢钠；氮源和磷源的添加量为木薯用量的〇% -20%。
[0011] 所述培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液，是将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处 理后，迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37〇 C，培 养时间为12-36h。
[0012] 所述培养成熟的酿酒酵母种子液，是将酿酒酵母菌种接种于酿酒酵母种子培养基 中，进行种子培养，培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h。
[0013] 丙酮丁醇梭菌种子培养基优选为玉米醪，酿酒酵母种子培养基优选为YH)培养 基。
[0014] 本发明的有益效果如下：
[0015] (1)本发明以木薯为碳源，添加氮磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵培养基， 一方面，可以利用丙酮丁醇梭菌产生淀粉酶和糖化酶对木薯发酵培养基中的淀粉进行糖 化，得到可发酵性糖，从而避免使用商业淀粉酶和糖化酶带来的高昂成本。
[0016] 另一方面，木薯中的淀粉可以被丙酮丁醇梭菌的淀粉酶和糖化酶酶解为可发酵性 糖，丙酮丁醇梭菌进一步将可发酵性糖转化为总溶剂（丙酮、丁醇和乙醇），但是单独采用 丙酮丁醇梭菌发酵存在总溶剂得率较低的问题；而单独采用酿酒酵母存在不能直接利用木 薯淀粉的问题，木薯淀粉必须先被丙酮丁醇梭菌的淀粉酶和糖化酶酶解为可发酵性糖才可 以被酿酒酵母利用合成乙醇，本申请将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液 先后接种于木薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，乙醇得率较高，提 高总溶剂对木薯淀粉的得率，避免了单独丙酮丁醇梭菌或单独酿酒酵母发酵的问题。
[0017] (2)本发明使用木薯原料进行丙酮、丁醇和乙醇的发酵法生产，实现非粮作物发酵 生产丙酮、丁醇和乙醇，对非粮作物液体生物燃料生产研宄有重要意义。
【具体实施方式】：
[0018] 以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019] 本发明所使用的菌种分别为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)和酿 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，丙酮丁醇梭菌种子培养基为玉米醪，酿酒酵母种子 培养基为YH)培养基；以木薯为碳源，补加氮源、磷源配制木薯发酵培养基。
[0020] 本发明采用的丙酮丁醇梭菌种子培养基配制和灭菌方法：玉米粉碎，过40目筛 后，加水调制5% (m/V)玉米浆，100°C蒸煮20min后分装，121°C灭菌120min，得到丙酮丁醇 梭菌种子培养基。
[0021] 本发明采用的酿酒酵母种子培养基配制和灭菌方法：Yro培养基组成为葡萄糖 20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，115°C灭菌30min，得到酿酒酵母种子培养基。
[0022] 本发明采用的木薯发酵培养基配制和灭菌方法：将木薯干粉碎后，过40目筛，加 水调浆至木薯含量75至275g/L，补加麸皮为氮磷源，麸皮用量为5-18. 3g/L，121 °C灭菌 120min，得到木薯发酵培养基。
[0023] 将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处理后，迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种 子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h得到培养成熟的丙酮丁 醇梭菌种子液。
[0024] 将酿酒酵母菌种接种于Yro培养基中，进行种子培养，培养温度为30-37?，培养 时间为12_36h得到培养成熟的酿酒酵母种子液。
[0025] 将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于木薯发酵培养 基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，丙酮丁醇梭菌种子液接种后第〇_48h再接种 酿酒酵母种子液，接种量为5% -10%，厌氧发酵温度为30-37°C，厌氧发酵时间为24-108h。
[0026] 采用气相色谱法测定丙酮、丁醇和乙醇含量。
[0027] 下面结合实施例对本发明的方法作进一步的说明。
[0028] 实施例1 :
[0029] 1、配制种子培养基：
[0030] 丙酮丁醇梭菌种子培养基配制：将玉米粉碎，过40目筛，加水调浆至5% (m/V)， 100°c蒸煮20min后，将玉米醪分装至20mL试管，IOmL试管，121°C灭菌120min得到丙酮丁 醇梭菌种子培养基。
[0031] 酿酒酵母种子培养基配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨 20g/L，酵母粉10g/L，115°C灭菌 30min得到酿酒酵母种子培养基。
[0032] 2、配制木薯发酵培养基：将木薯干粉碎，过40目筛，加水调浆至木薯含量75g/L， 麸皮5g/L，121°C灭菌120min得到木薯发酵培养基。
[0033] 3、发酵工艺
[0034] (1)丙酮丁醇梭菌种子培养：将丙酮丁醇梭菌孢子悬液100°C热激90s，迅速冷却 至室温，以5%接种量接种于5% (m/V)玉米醪培养基中，37°C静置培养24h后，转接至5% (m/V)玉米醪培养基37°C静置培养12h，接种量5%。
[0035] (2)酿酒酵母种子培养：挑取一环Yro斜面保藏的酿酒酵母菌种，接种于50mL YPD 培养基中，30°C培养24h，转速160rpm。
[0036] (3)将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液同时接种于200mL木薯 发酵培养基中，接种量为5%，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，发酵温度为37°C， 发酵时间为l〇8h。
[0037] (4)采用气相色谱法测定发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇含量，色谱柱型号 DB-FFAP(30mX2. 5mm IDXO. 25uM)，载气为氦气，检测器为火焰离子化检测器，进样口和检 测器温度均为250°C，进样量为0. 5uL，分流比3 : 1，氢气流速30mL/min，空气流速为400mL/ min，柱温：初温60°C，停留0. 5min，终温170°C，升温速率20°C /min。发酵时间108h后，发 酵液中各溶剂浓度分别为丙酮5. 28g/L，丁醇11. 77g/L，乙醇5. 26g/L，总溶剂为22. 31g/L， 总溶剂得率为0. 338g/g。
[0038] 对比例1 :
[0039] 参考实施例1，不同之处在于采用不同的接种方式，发酵结果如表1所示。
[0040] 表1不同接种方式发酵结果比较
[0041]
[0042] 注：本实施例中所用木薯淀粉含量为80% ;单独接种培养基与混菌发酵培养基相 同，接种量均为5%。
[0043] 实施例2 :
[0044] 1、配制种子培养基：同实施例1。
[0045] 2、配制木薯发酵培养基：同实施例1。
[0046] 3、发酵工艺：
[0047] (1)丙酮丁醇梭菌种子培养：同实施例1。
[0048] (2)酿酒酵母种子培养：同实施例1。
[0049] (3)将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液接种至200mL木薯发酵培养基中，进行厌 氧发酵，培养温度为37°C，接种量为5%，发酵时间为24h。丙酮丁醇梭菌接种后24h，将培养 成熟的酿酒酵母种子液接种至丙酮丁醇梭菌木薯发酵培养基中，混合均匀，进行混菌发酵， 接种量为5%，发酵温度为30°C，发酵时间为108h。
[0050] (4)采用气相色谱法测定发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇含量，色谱柱型号 DB-FFAP(30mX2. 5mm IDXO. 25uM)，载气为氦气，检测器为火焰离子化检测器，进样口和检 测器温度均为250°C，进样量为0. 5uL，分流比3 : 1，氢气流速30mL/min，空气流速为400mL/ min，柱温：初温60°C，停留0. 5min，终温170°C，升温速率20°C /min。发酵时间108h后，发 酵液中各溶剂浓度分别为丙酮4. 66g/L，丁醇10. 71g/L，乙醇7. 65g/L，总溶剂为23. 02g/L， 总溶剂得率为0. 349g/g。
[0051] 对比例2:
[0052] 参考实施例2,不同之处在于采用不同的接种方式，发酵结果如表2所示。
[0053] 表2不同接种方式发酵结果比较
[0054]
[0055] 注：本实施例中所用木薯淀粉含量为80% ;单独接种培养基与混菌发酵培养基相 同，接种量均为5%。
【主权项】
1. 一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： a、 以木薯为碳源，将木薯原料粉碎，添加氮源、磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵 培养基； b、 将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于步骤a得到的木 薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇；丙酮丁醇梭菌种子液接种后第 〇_48h再接种酿酒酵母种子液，接种量为5% -10% ;厌氧发酵温度为30-37°C，厌氧发酵时 间为 24-108h。2. 根据权利要求1所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，木 薯发酵培养基中木薯浓度为75-275g/L。3. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，木薯发酵培养基补加的氮源或磷源选自以下之一或者其混合：玉米浆、玉米粉、麸皮、 米糠、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸 氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钠；氮源和磷源的添加量为木薯用量的 0% _20%〇4. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，所述培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液，是将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处理后， 迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37°C，培养时 间为 12-36h。5. 根据权利要求4所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，丙 酮丁醇梭菌种子培养基为玉米醪。6. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，所述培养成熟的酿酒酵母种子液，是将酿酒酵母菌种接种于酿酒酵母种子培养基中， 进行种子培养，培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h。7. 根据权利要求6所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，酿 酒酵母种子培养基为YH)培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，以木薯为碳源，添加氮磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵培养基；然后利用丙酮丁醇梭菌产生淀粉酶和糖化酶，对木薯发酵培养基糖化得到酿酒酵母可发酵性糖，从而避免商业淀粉酶和糖化酶带来的高昂成本；同时利用酿酒酵母发酵木薯糖化制得的酿酒酵母可发酵性糖生产丙酮、丁醇和乙醇，实现丙酮丁醇梭菌和酿酒酵母协作的混菌发酵，溶剂的得率有明显提高。本发明使用木薯原料进行丙酮、丁醇和乙醇的发酵法生产，实现非粮作物发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，对非粮作物液体生物燃料生产研究有重要意义。
【IPC分类】C12P7/16, C12P7/28, C12P39/00, C12R1/145, C12R1/865, C12P7/06
【公开号】CN104894207
【申请号】CN201510366702
【发明人】陈新德, 齐高相, 熊莲, 林晓清, 陈雪芳, 黄超, 程镜蓉
【申请人】中国科学院广州能源研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，具体涉及一种混菌发酵木薯生产 丙酮、丁醇和乙醇的方法。
【背景技术】：
[0002] 现有的以木薯为原料发酵生产乙醇的工艺通过木薯原料蒸煮糊化、液化、糖化、发 酵，对发酵醪液进行蒸馏分离得到乙醇，其工艺流程如下：首先将木薯原料粉碎调浆，然后 对其进行蒸煮，使其糊化，加入α -淀粉酶进行液化，然后加入糖化酶使淀粉水解为可发酵 性糖，补加氮磷源并灭菌，然后接种培养成熟的酿酒酵母种子进行发酵，或者是糖化工艺和 发酵工艺同步进行，发酵结束后对发酵醪液进行蒸馏得到乙醇。
[0003] 现有的以木薯为原料发酵法生产丙酮、丁醇和乙醇的工艺是通过木薯原料粉碎， 添加氮磷源后直接灭菌配制发酵培养基，接种培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液进行发酵， 发酵结束后对发酵醪液进行蒸馏得到丙酮、丁醇和乙醇。由于丙酮丁醇梭菌能够产淀粉酶 和糖化酶，因此可以直接利用木薯淀粉进行发酵。
[0004] 目前技术存在以下的问题和不足：1、木薯乙醇发酵工艺中原料的糖化工艺需要加 入淀粉酶和糖化酶，淀粉酶和糖化酶价格昂贵，降低了产品的价格竞争力；2、木薯乙醇发酵 工艺中液化、糖化与发酵分开进行，整个过程能耗巨大。3、木薯丁醇发酵工艺中总溶剂（丙 酮、丁醇和乙醇）的得率较低，仅为〇. 30-0. 35g/g葡萄糖。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中酿酒酵母木薯乙醇发酵和丙酮丁醇梭菌木薯丁 醇发酵中单菌发酵存在的问题，提供一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案予以实现的：
[0007] -种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，该方法包括以下步骤：
[0008] a、以木薯为碳源，将木薯原料粉碎，添加氮源、磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯 发酵培养基；
[0009] b、将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于步骤a得到 的木薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇；丙酮丁醇梭菌种子液接种后 第〇-48h再接种酿酒酵母种子液，接种量为5 % -10% ;厌氧发酵温度为30-37〇 C，厌氧发 酵时间为24-108h。
[0010] 木薯发酵培养基中木薯浓度为75-275g/L，木薯发酵培养基补加的氮源或磷源选 自以下之一或者其混合：玉米浆、玉米粉、麸皮、米糠、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、硫酸 铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢 钾、磷酸氢钠；氮源和磷源的添加量为木薯用量的〇% -20%。
[0011] 所述培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液，是将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处 理后，迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37〇 C，培 养时间为12-36h。
[0012] 所述培养成熟的酿酒酵母种子液，是将酿酒酵母菌种接种于酿酒酵母种子培养基 中，进行种子培养，培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h。
[0013] 丙酮丁醇梭菌种子培养基优选为玉米醪，酿酒酵母种子培养基优选为YH)培养 基。
[0014] 本发明的有益效果如下：
[0015] (1)本发明以木薯为碳源，添加氮磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵培养基， 一方面，可以利用丙酮丁醇梭菌产生淀粉酶和糖化酶对木薯发酵培养基中的淀粉进行糖 化，得到可发酵性糖，从而避免使用商业淀粉酶和糖化酶带来的高昂成本。
[0016] 另一方面，木薯中的淀粉可以被丙酮丁醇梭菌的淀粉酶和糖化酶酶解为可发酵性 糖，丙酮丁醇梭菌进一步将可发酵性糖转化为总溶剂（丙酮、丁醇和乙醇），但是单独采用 丙酮丁醇梭菌发酵存在总溶剂得率较低的问题；而单独采用酿酒酵母存在不能直接利用木 薯淀粉的问题，木薯淀粉必须先被丙酮丁醇梭菌的淀粉酶和糖化酶酶解为可发酵性糖才可 以被酿酒酵母利用合成乙醇，本申请将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液 先后接种于木薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，乙醇得率较高，提 高总溶剂对木薯淀粉的得率，避免了单独丙酮丁醇梭菌或单独酿酒酵母发酵的问题。
[0017] (2)本发明使用木薯原料进行丙酮、丁醇和乙醇的发酵法生产，实现非粮作物发酵 生产丙酮、丁醇和乙醇，对非粮作物液体生物燃料生产研宄有重要意义。
【具体实施方式】：
[0018] 以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019] 本发明所使用的菌种分别为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)和酿 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，丙酮丁醇梭菌种子培养基为玉米醪，酿酒酵母种子 培养基为YH)培养基；以木薯为碳源，补加氮源、磷源配制木薯发酵培养基。
[0020] 本发明采用的丙酮丁醇梭菌种子培养基配制和灭菌方法：玉米粉碎，过40目筛 后，加水调制5% (m/V)玉米浆，100°C蒸煮20min后分装，121°C灭菌120min，得到丙酮丁醇 梭菌种子培养基。
[0021] 本发明采用的酿酒酵母种子培养基配制和灭菌方法：Yro培养基组成为葡萄糖 20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，115°C灭菌30min，得到酿酒酵母种子培养基。
[0022] 本发明采用的木薯发酵培养基配制和灭菌方法：将木薯干粉碎后，过40目筛，加 水调浆至木薯含量75至275g/L，补加麸皮为氮磷源，麸皮用量为5-18. 3g/L，121 °C灭菌 120min，得到木薯发酵培养基。
[0023] 将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处理后，迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种 子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h得到培养成熟的丙酮丁 醇梭菌种子液。
[0024] 将酿酒酵母菌种接种于Yro培养基中，进行种子培养，培养温度为30-37?，培养 时间为12_36h得到培养成熟的酿酒酵母种子液。
[0025] 将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于木薯发酵培养 基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，丙酮丁醇梭菌种子液接种后第〇_48h再接种 酿酒酵母种子液，接种量为5% -10%，厌氧发酵温度为30-37°C，厌氧发酵时间为24-108h。
[0026] 采用气相色谱法测定丙酮、丁醇和乙醇含量。
[0027] 下面结合实施例对本发明的方法作进一步的说明。
[0028] 实施例1 :
[0029] 1、配制种子培养基：
[0030] 丙酮丁醇梭菌种子培养基配制：将玉米粉碎，过40目筛，加水调浆至5% (m/V)， 100°c蒸煮20min后，将玉米醪分装至20mL试管，IOmL试管，121°C灭菌120min得到丙酮丁 醇梭菌种子培养基。
[0031] 酿酒酵母种子培养基配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨 20g/L，酵母粉10g/L，115°C灭菌 30min得到酿酒酵母种子培养基。
[0032] 2、配制木薯发酵培养基：将木薯干粉碎，过40目筛，加水调浆至木薯含量75g/L， 麸皮5g/L，121°C灭菌120min得到木薯发酵培养基。
[0033] 3、发酵工艺
[0034] (1)丙酮丁醇梭菌种子培养：将丙酮丁醇梭菌孢子悬液100°C热激90s，迅速冷却 至室温，以5%接种量接种于5% (m/V)玉米醪培养基中，37°C静置培养24h后，转接至5% (m/V)玉米醪培养基37°C静置培养12h，接种量5%。
[0035] (2)酿酒酵母种子培养：挑取一环Yro斜面保藏的酿酒酵母菌种，接种于50mL YPD 培养基中，30°C培养24h，转速160rpm。
[0036] (3)将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液同时接种于200mL木薯 发酵培养基中，接种量为5%，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，发酵温度为37°C， 发酵时间为l〇8h。
[0037] (4)采用气相色谱法测定发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇含量，色谱柱型号 DB-FFAP(30mX2. 5mm IDXO. 25uM)，载气为氦气，检测器为火焰离子化检测器，进样口和检 测器温度均为250°C，进样量为0. 5uL，分流比3 : 1，氢气流速30mL/min，空气流速为400mL/ min，柱温：初温60°C，停留0. 5min，终温170°C，升温速率20°C /min。发酵时间108h后，发 酵液中各溶剂浓度分别为丙酮5. 28g/L，丁醇11. 77g/L，乙醇5. 26g/L，总溶剂为22. 31g/L， 总溶剂得率为0. 338g/g。
[0038] 对比例1 :
[0039] 参考实施例1，不同之处在于采用不同的接种方式，发酵结果如表1所示。
[0040] 表1不同接种方式发酵结果比较
[0041]
[0042] 注：本实施例中所用木薯淀粉含量为80% ;单独接种培养基与混菌发酵培养基相 同，接种量均为5%。
[0043] 实施例2 :
[0044] 1、配制种子培养基：同实施例1。
[0045] 2、配制木薯发酵培养基：同实施例1。
[0046] 3、发酵工艺：
[0047] (1)丙酮丁醇梭菌种子培养：同实施例1。
[0048] (2)酿酒酵母种子培养：同实施例1。
[0049] (3)将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液接种至200mL木薯发酵培养基中，进行厌 氧发酵，培养温度为37°C，接种量为5%，发酵时间为24h。丙酮丁醇梭菌接种后24h，将培养 成熟的酿酒酵母种子液接种至丙酮丁醇梭菌木薯发酵培养基中，混合均匀，进行混菌发酵， 接种量为5%，发酵温度为30°C，发酵时间为108h。
[0050] (4)采用气相色谱法测定发酵液中的丙酮、丁醇和乙醇含量，色谱柱型号 DB-FFAP(30mX2. 5mm IDXO. 25uM)，载气为氦气，检测器为火焰离子化检测器，进样口和检 测器温度均为250°C，进样量为0. 5uL，分流比3 : 1，氢气流速30mL/min，空气流速为400mL/ min，柱温：初温60°C，停留0. 5min，终温170°C，升温速率20°C /min。发酵时间108h后，发 酵液中各溶剂浓度分别为丙酮4. 66g/L，丁醇10. 71g/L，乙醇7. 65g/L，总溶剂为23. 02g/L， 总溶剂得率为0. 349g/g。
[0051] 对比例2:
[0052] 参考实施例2,不同之处在于采用不同的接种方式，发酵结果如表2所示。
[0053] 表2不同接种方式发酵结果比较
[0054]
[0055] 注：本实施例中所用木薯淀粉含量为80% ;单独接种培养基与混菌发酵培养基相 同，接种量均为5%。
【主权项】
1. 一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： a、 以木薯为碳源，将木薯原料粉碎，添加氮源、磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵 培养基； b、 将培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液和酿酒酵母种子液先后接种于步骤a得到的木 薯发酵培养基，进行厌氧混菌发酵生产丙酮、丁醇和乙醇；丙酮丁醇梭菌种子液接种后第 〇_48h再接种酿酒酵母种子液，接种量为5% -10% ;厌氧发酵温度为30-37°C，厌氧发酵时 间为 24-108h。2. 根据权利要求1所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，木 薯发酵培养基中木薯浓度为75-275g/L。3. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，木薯发酵培养基补加的氮源或磷源选自以下之一或者其混合：玉米浆、玉米粉、麸皮、 米糠、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸 氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钠；氮源和磷源的添加量为木薯用量的 0% _20%〇4. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，所述培养成熟的丙酮丁醇梭菌种子液，是将保存的丙酮丁醇梭菌孢子悬液热激处理后， 迅速冷却，接种于丙酮丁醇梭菌种子培养基，进行种子培养；培养温度为30-37°C，培养时 间为 12-36h。5. 根据权利要求4所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，丙 酮丁醇梭菌种子培养基为玉米醪。6. 根据权利要求1或2所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在 于，所述培养成熟的酿酒酵母种子液，是将酿酒酵母菌种接种于酿酒酵母种子培养基中， 进行种子培养，培养温度为30-37°C，培养时间为12-36h。7. 根据权利要求6所述的混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，其特征在于，酿 酒酵母种子培养基为YH)培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种混菌发酵木薯生产丙酮、丁醇和乙醇的方法，以木薯为碳源，添加氮磷源后，经过调浆、灭菌配制成木薯发酵培养基；然后利用丙酮丁醇梭菌产生淀粉酶和糖化酶，对木薯发酵培养基糖化得到酿酒酵母可发酵性糖，从而避免商业淀粉酶和糖化酶带来的高昂成本；同时利用酿酒酵母发酵木薯糖化制得的酿酒酵母可发酵性糖生产丙酮、丁醇和乙醇，实现丙酮丁醇梭菌和酿酒酵母协作的混菌发酵，溶剂的得率有明显提高。本发明使用木薯原料进行丙酮、丁醇和乙醇的发酵法生产，实现非粮作物发酵生产丙酮、丁醇和乙醇，对非粮作物液体生物燃料生产研究有重要意义。
【IPC分类】C12P7/16, C12P7/28, C12P39/00, C12R1/145, C12R1/865, C12P7/06
【公开号】CN104894207
【申请号】CN201510366702
【发明人】陈新德, 齐高相, 熊莲, 林晓清, 陈雪芳, 黄超, 程镜蓉
【申请人】中国科学院广州能源研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日
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