用于区分奶中细胞负载的方法和装置的制造方法
用于区分奶中细胞负载的方法和装置的制造方法
【专利说明】用于区分奶中细胞负载的方法和装置
【背景技术】
[0001] 本发明涉及一种用于通过阻抗微流式细胞术区分原料奶样品中细胞和其它颗粒， 以及细胞不同类型的方法。
[0002] 在限定奶质量的许多参数中，细菌（BCC)和体细胞计数（SCC)是最为重要的，因为 它们显著影响所获得的奶产品的质量，而且还提供有关奶牛健康状况的信息。
[0003] 体细胞是被称为白细胞（淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的白血细胞， 并来源于动物的乳房。这些细胞的数目可响应于细菌感染而增加，这可以导致乳腺炎。通 常，未感染奶牛的奶具有小于1〇〇, 〇〇〇个细胞/毫升，高于300, 000个细胞/毫升的值表示 感染的奶牛，而对于患病的奶牛超过1，〇〇〇, 〇〇〇个细胞/毫升的值是典型的。对于人类食用 或对于进一步加工为供人类食用的食品的阈值在欧洲低于400, 000个细胞/毫升，但在美 国可以更高。一般情况下，SCC高于300, 000个细胞/毫升的奶牛视为被感染（Smith，K.L.， in STANDARDS FOR SOMATIC CELLS IN MILK :PHYSIOLOGICAL AND RE⑶LATORY(1996)， International Dairy Federation Mastitis Newsletter，9月，第7 页）。因此，为了评价奶 质量，可靠和精确的体细胞计数方法是必需的。简单且经常被使用的牛侧加利福尼亚乳腺 炎测试（在EXPERIMENTS AND OBSERVATIONS LEADING TO DEVELOPMENT OF THE CALIFORNIA MASTITIS TEST，Journal of the American Veterinary Medical Association (1957)： 130,199-204中根据它的发明人Schalm和Norlander也称为Schalm测试）是间接的、定性 的方法，并且没有提供这种详细信息以定性人类食用奶的质量。
[0004] 通常，在卸载奶卡车后在乳制品制造商的实验室，每天对来自许多动物而不是来 自个别奶牛的混合奶进行SCC测量。主要原因是因为每次挤奶时的个别动物的测试将过 于昂贵。这也意味着，来自患病奶牛的奶会被健康动物稀释并且平均下来。因此，患病动 物可能在后期仍然不被检测到或发现是生病的，而不影响整体的奶质量评价。此外，也由 于几个农场主的奶混合在一起，所以根据奶负载的平均评价补偿农场主。然而，乳制品制 造商宁愿根据每个农场主的奶的每日配送质量补偿每个农场主，这目前这是不可行的。昂 贵的分析主要涉及到基于光学或电气测量的现有技术。光学测量首先需要在分析前将细 胞标记，因此这通常需要昂贵的化学试剂或耗材。另一方面，电气测量，是基于阻抗分析， 但是，利用阻抗分析，其它非细胞奶颗粒会干扰，并且必须通过几个离心步骤被去除。因此 这些器件不能在农场主的场地使用。因此，要进行许多努力以简化分析方法和降低分析成 本。无标记技术是优选的方法，因为这些技术通常不需要试剂和耗材，并且同时简化了样品 制备过程。迄今所使用的电动工具是所谓的库尔特计数器，它可以计数细胞并且通过大小 区分它们。因为原料奶中含有许多颗粒，主要是与白细胞（5-10微米）具有类似尺寸的脂 肪囊泡，可靠的细胞计数是不可能的，因为这些颗粒容易多于体细胞，并且因此严重干扰测 量。因此，在测量前这些颗粒必须从体细胞中分离出来。这可以通过离心实现，离心时细胞 被沉淀而脂肪囊泡从上清液中被除去，或者，如最近由Grenvall等人于2012年10月18日 在 Cytometry A 上在线发表的 LABEL-FREE SOMATIC CELL CYTOMETRY IN RAW MILK USING A⑶ST0PH0RESIS(2012)中显示的，采用声波技术使脂肪囊泡与体细胞分离。虽然离心通常 需要实验室的基础设施，声泳似乎更有前景，但也使库尔特计数器技术进一步复杂化。
[0005] 传统库尔特计数器采用直流（DC)或低频交流电流（AC，最大1千赫兹）测量阻 抗，允许可靠的细胞计数和细胞大小区分。这种技术已经在过去十年中通过微技术的问 世而得到改进。EP 1 335 198 Bl公开了具有电极配置的微流体方法，其允许覆盖宽频率 范围（100千赫-20兆赫）的细胞阻抗分析。高频分析超出了简单的细胞计数和分选并 且探询细胞的介电特性，其允许在各种应用中的细胞区分，诸如Schade-Kampmann等人在 标题为 ON-CHIP NON-INVASIVE AND LABEL-FREE CELL DISCRMINATION BY MPEDANCE SPECTROSCOPY，Cell Prolif. (2008)，41，830-840 中显示的细胞差异，或 Pierzchalski 等 人在标题为 LABEL-FREE HYBRIDOMA CELL CULTURE QUALITY CONTROL BY A CHIP-BASED MPEDANCE FLOW CYTOMETER，Lab Chip (2012)，12 (21)，4533-4543 中以及 David 等人在标 题为 VIABILITY AND MEMBRANE POTENTIAL ANALYSIS OF BACILLUS MEGATERIUM CELLS BY MPEDANCE FLOW CYTOMETRY， Biotechnology&Bioengineering(2012)，109(2)，883-492 中 分别描述的动物和细菌细胞生存力。与其中信号幅值是用于计数和依大小分选细胞的传统 库尔特计数器测量相反，高频分析提供额外的信息，即使这些细胞具有相同的尺寸。但是， 这种分析还只在实验室环境中实施，其中细胞悬浮于明确定义的介质中。
[0006] 美国专利2012/0310541 Al中已经公开了在巨大频率范围（0.3兆赫-1.4千兆 赫）采用阻抗分析用于分析奶中各种细胞参数的方法。在100兆赫至2千兆赫之间的射频 范围以各种频率对奶的阻抗测量可以提供关于体细胞浓度的指征，但是在一个相对定性的 水平，因为该分析不是在单细胞水平进行的。该方法不够灵敏，不足以以能够用于评价奶质 量的方式确定SSC。
[0007] 预期的是奶颗粒（脂质囊泡）和体细胞在它们的细胞内部的介电性质方面表现不 同，如同 Cheung 等人在 MPEDANCE SPECTROSCOPY FLOW CYTOMETRY :0N-CHIP LABEL-FREE CELL DIFFERENTIATION，Cytometry A(2005)，65A，124-132 中预计的。
[0008] 已经显示，以范围至多达0.1 兆赫的频率对单细胞的阻抗分析允许分割幅值 和相位角分量并允许将细胞区分于非细胞颗粒以及区分活/死细胞（Conrad等人在 IMPEDIMETRIC AND OPTICAL INTERROGATION OF SINGLE CELLS IN A MICROFLUIDIC DEVICE FOR REAL-TIME VIABILITY AND CHEMICAL RESPONSE ASSESSMENT,Biosensors and Bioelecrtronics (2008)，23,845-851中）。但是，用于该分析的器件在测量阻抗信号之前 捕获单细胞，并且因此既不适于细胞密度确定也不适于短时间段内成千上万个细胞的分 析。而且，尽管可以将非细胞颗粒（聚苯乙烯珠）区分于细胞，但对奶颗粒做相同的工作则 需要高很多的频率，因为当暴露于电场时，与聚苯乙烯珠相比，这些脂肪球表现得更类似于 细胞。
[0009] 因此本发明的目的是提出一种用于分析奶的简单且快速的方法和装置，并且更确 切的是，用于将细胞区分于脂质囊泡并且以乳品业和奶生产基地中奶质量控制应用需要的 准确性计数它们。
[0010] 此问题 通过本发明得到解决，如同方法权利要求1和装置权利要求中要求保护 的。进一步有利的实施例在各个从属权利要求中被要求保护。
[0011] 根据权利要求1，在微流体器件中，在〇. 1至30兆赫的范围内采用高频阻抗测量用 于自动区分和计数任何动物乳汁中颗粒，诸如细胞或脂肪球的方法，包括：
[0012] 使原料奶通过过滤器以免堵塞微流体器件；
[0013] 确定奶的阻抗值并根据所述阻抗值校准微流体器件，如果需要的话；
[0014] 计数颗粒并且测量颗粒的阻抗；
[0015] 从其中测量的阻抗分量之一确定分别适于噪声提取和颗粒识别的触发电平；
[0016] 从一个阻抗分量确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发电平；
[0017] 依据幅值和相位角值分析阻抗值；和
[0018] 根据它们的幅值和/或相位角值识别和计数细胞和/或非细胞奶颗粒。
[0019] 根据该方法，使原料奶首先通过具有15-30微米网目尺寸的过滤器，并且随后直 接通过具有约20至40微米的通道尺寸的微流体芯片，这比体细胞的正常尺寸（6-18微米） 稍大，所述微流体芯片包含生成高频交流电场（100千赫-30兆赫）的微电极。原料奶的阻 抗信号以及每个单个体细胞和脂质囊泡经过建立的交流电场引起的阻抗变化被测量。每秒 钟大约1，〇〇〇至10, 〇〇〇个细胞/颗粒被分析，并且每次分析需要大约10至100微升，这花 费少于一分钟。重要的是该方法是通过使用直接从动物配送的原料奶进行。奶的分析可以 离线或在奶流中进行，并且分析结果被实时传递。不必需要特殊的样品制备以及由此而来 的费时测量。
[0020] 此外，根据权利要求1，奶的阻抗值被确定，并且如果需要的话，根据所述阻抗值校 准微流体器件。流体中细胞或颗粒的阻抗分析通常一方面取决于细胞的介电性质，但另一 方面，还取决于流体的电学性质（导电性）。通常，细胞的阻抗信号通过从流体的阻抗信号 中减去它而被确定。然而，流体的阻抗影响细胞阻抗的信号幅度和相位。所以，悬浮于奶中 的同样的体细胞或细菌细胞在奶中产生不同的阻抗变化，具有不同的固有阻抗值。对于单 个分析，这不是一个问题，因为这些值在手动设置的散点图和区分模式上进行分析。对于常 规应用，如奶牛现场奶的分析，自动和简单的方法是最为重要的。但是，奶的可变阻抗值使 自动分析复杂化，因为区分模式必须相应地调整。因此，细胞分析前，确定奶的阻抗并且校 准该芯片，使得细胞的随后分析在标准条件下发生。通过这种方式，细胞的阻抗值表现相同 并且相同的区分模式可以用于不同的奶样品。此外，SSC和原料奶的阻抗值之间存在相关 性，使得流体阻抗或所需的校准的延伸可以被用作所述SCC的早期指标，因此其具有与上 述Schalm测试类似的信息内容。
[0021] 根据权利要求1，接下来，将颗粒计数并且测量颗粒的阻抗。当原料奶通过微流体 芯片时，通过阻抗分析检测每个单个颗粒并且记录其阻抗信号。这些细胞的计数（计数）一 方面提供关于细胞含量的信息，并且另一方面也具有评估奶脂肪含量的潜力。精确的分析 在很大程度上依赖于适当触发参数的选择，其通常由测量的阻抗分量之一（实部或虚部， 幅值和相位角）和其数值（=触发电平）构成。这允许奶颗粒或细胞与从高度敏感的检测 系统产生的噪声信号之间选择性差别。只有满足触发参数的信号被记录并且由此可进行详 细的分析，这可以立即发生在数据采集之后或者发生在稍后使用单独的软件工具时。但是， 采用一定参数触发并不意味着只有触发值被记录。相反，记录这样通过调整过的触发器被 识别的每个单个颗粒或细胞的完整信息，其包含该阻抗信号的所有分量。
[0022] 作为权利要求1的进一步措施，分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数，以及 用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发参数被确定。传统库尔特计数器，例如，简单地测量 由干扰所施加电场的颗粒引起的电流脉冲或电压脉冲。脉冲高度与细胞体积成正比并且被 用于分析粒度分布。通过设定一个适当的脉冲触发值产生颗粒和噪声之间的差别。阻抗是 一个复杂的量，其由一个实部（R)和一个虚部（I)组成，但到目前为止，用于奶中的细胞分 析的阻抗信号从未分成其分量。其原因是，对于DC和低频测量，虚部分别是不存在或不相 关的事实。但是，在高频测量中，这些值变得重要，并且实部和虚部都可用作触发参数用于 从所述噪声提取颗粒信号以及用于利用这些值彼此间的差异区分颗粒。这允许所述颗粒群 的简单而充分的表征。除了这些值，幅值（A，实部和虚部的绝对值）单独地或与所述相位角 组合（Φ，从实部和虚部产生），或由这些值（R，I，A和φ)构成的任何公式也可以用作触发 参数，允许大的和小的细胞之间、非细胞奶颗粒和细胞之间、以及相同类型的死和活细胞之 间更具选择性的差别。除了上述的触发参数，触发频率也可以变化。通常情况下，触发频率 是选定的测量频率之一。因此，取决于要从原料乳分析获得的信息，在各种触发参数中选择 的可能性可以简化并且可能自动读出。因此，例如，利用幅值触发对颗粒大小将是有选择性 的，并且提供有关颗粒群大小分布的信息，尽管所述触发幅值与特定相位角值结合可以很 容易地记录非细胞奶颗粒或者细胞。因此，应用特定触发器可以提供预先选择具有特定性 质的颗粒的方法并且改进微流体系统的性能。例如，奶颗粒通常远远超过原料奶中细胞的 数量。如果这些颗粒之一和一个细胞同时位于检测区域内，细胞信号将被显著影响，并且由 于不可用被拒绝或被记录供以后分析。对于具有高细胞浓度（> IO6细胞/毫升）的奶， 这可导致许多细胞被拒绝，并且因此使细胞计数不准确。利用适当相位值触发的可能性使 得奶颗粒对于所述系统基本上不可见并且显著降低了拒绝率。此外，每时间帧（或液体体 积）可以记录和分析更多的颗粒或细胞，如果只是它们的一部分通过所述触发装置进行检 测。
[0023] 权利要求1的另一项措施是依据幅值和相位角值分析阻抗值。所述阻抗信号的绝 对幅值是细胞尺寸的主要指标。这在宽的频率范围应用并延伸到超过20兆赫的频率。其 它细胞参数，如膜电容和细胞质导电性通过所述相位角值被更好地表示。如果考虑相位值， 在大约10兆赫的频率，所述细胞或颗粒内部以及外膜组成的导电性的差异提供了用于区 分这些颗粒的方法。所述方法也允许在不同频率的颗粒的阻抗测量，其因此允许同时探询 大小、膜电容和细胞质导电性，并且提供关于被分析细胞的生理状态的相关信息。
[0024] 至少，根据它们的幅值和/或相位角值，所述细胞和/或非细胞奶颗粒被选择。在 根据调整过的触发参数记录颗粒和/或细胞之后，可以通过将数据绘制在表示各种阻抗分 量的图形上并针对它们的阻抗值选通出现的细胞群进行详细的分析，所述阻抗值可以简单 地是R-、I-、A-和φ·'值，以及更复杂的函数（例如多项式选通）。
[0025] 所述方法可以在芯片（例如，如同EP 1 335 198 Bl中公开的）上被实现，所述芯 片包含具有电极的所需测量通道和在所述测量通道中颗粒的必要定位。这样的芯片可以根 据所述不同介电性质将单细胞区分于非细胞奶颗粒。此外，特定触发参数的整合可以简化 细胞区分并提供常规分析需要的所需自动化可能性。该芯片可以通过确定所述颗粒通过其 中的两对电极对的两个阻抗测量之间的差异，或者通过测量仅一对电极对之间的阻抗来使 用。因此，相应的装置包括微流体器件，该微流体器件具有入口和出口以及两者之间的微通 道，而所述微通道中的上和下电极在电极之间形成用于奶颗粒通过的检测体积；电构件，用 于将所述电极连接到控制构件以在所述电极之间产生高频AC电场，并测量电极之间有无 颗粒时的电极之间的阻抗；输入和监测构件；适于确定奶的阻抗值和如果需要的话适于根 据所述阻抗值校准所述微流体器件的构件；适于计数颗粒并测量所述颗粒的阻抗的构件； 用以确定分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数的构件；适于确定用于将细胞区分于非 细胞奶颗粒的触发参数的构件；适于根据幅值和相位角值分析阻抗值的构件；以及适于根 据细胞和/或非细胞奶颗粒的幅值和/或相位角值选择所述细胞和/或非细胞奶 颗粒的构 件。
[0026] 由于阻抗流式细胞术是一种无标记技术并且奶不需要任何分析前的预处理，因此 这些方法也可以实时发生，例如，如果所述技术与自动挤奶装置相结合。此外，由于乳制品 奶制造商设想根据交付的奶的质量个别地补偿农场主，实时信息可以经由移动通信技术直 接发送到乳制品工厂。
[0027] 本发明的一个优点是通过直接在未处理的原料奶上进行的高频阻抗分析从奶颗 粒（主要由脂质囊泡组成）区分和计数体细胞。本发明的另一个优点是该方法允许根据所 述SCC的分析在挤奶后直接诊断乳腺炎感染的状态。本发明的另一个优点是将允许快速的 用于在挤奶后直接确定原料奶中BCC的方法。此外，体细胞和细菌细胞两者的生存力都可 以被确定而不需要任何细胞标记。进一步的优点是，所述分析可以直接在原料奶已经通过 微通道后实时获取。
[0028] 为了实现上述以及相关目的，本发明随后包含下文在说明书中充分描述和在权利 要求中特别指出的多个特征。下面的描述和附图详细详细阐述了本发明的某些说明性实施 方案。然而，这些实施方案只是示意性了一小部分其中可以采用本发明的原理的不同方法。 当与所述附图结合考虑时，从本发明下面的详细描述，本发明的其它目的、优点和新颖特征 将变得显而易见。
[0029] 图1 :总结了从14头奶牛得到的原料奶的分析获取的结果，其中6头具有超过 400, 000个细胞/毫升。原料奶的阻抗分析；
[0030] 图2 :在图2A中显示了在0. 5兆赫进行的原料奶的分析，而在图2B中显示了在10 兆赫测定的相同样品；图2C至2E分别显示了未感染奶（33, 000个细胞/毫升）、轻微感染 的奶（390, 000个细胞/毫升）和严重感染的奶（840, 000个细胞/毫升）的分析；2F显示 了通过阻抗流式细胞术进行的SCC和细胞用PI (碘化丙啶）标记后进行的光学计数之间的 关联。
[0031] 图3 :显示了诊断两头感染的奶牛乳腺炎感染的状态的原料奶的分析的结果；
[0032] 图4 :显示了高频阻抗分析的电位的实例；
[0033] 图5 :方法的框图；
[0034] 图6 :具有微通道和电极的微流体芯片的原理描述，所述电极对电极之间的颗粒 具有低和高频率影响；和
[0035] 图7 :测量原理（图7A)和装置的框图（图7B)。
[0036] 采用具有40X40微米感应通道尺寸的芯片进行根据图1的分析。浅色条代表健 康的，黑色条代表感染的样本。直方图以千欧显示绝对阻抗幅值的平均值和标准偏差，这取 决于所述通道尺寸。该图显示，具有较高SCC的原料奶的阻抗值具有较低阻抗幅值。因此， 原料奶的低阻抗值提供了升高的体细胞数的第一质量指标。
[0037] 相对于采用库尔特计数器进行的传统阻抗分析，不仅记录信号的幅值，而且还记 录相位φ。针对阻抗信号的实部触发并将它们绘制在相位-幅值图上，其中每个点代表一个 单细胞或奶颗粒的信号，导致了在图2中所示的数据。所述点图用相关直方图补充（幅值 为y轴，相位为X轴）。图2A显示了在0. 5兆赫进行的原料奶的分析，而图2B显示了在10 兆赫测量的具有相同颗粒和细胞的相同样品。如同所预期的，奶颗粒和体细胞的区分在10 兆赫比在更低频率（图2B中箭头指示体细胞群）更明显。主要差异参数是阻抗信号的相 位角，一个不是采用传统库尔特计数器确定的参数。通过增加所述电子元件的带宽，利用在 更高频率（至多达30兆赫）测量可以获取更好的区分，并且因此可以得到颗粒和细胞的充 分分离而不需要任何分析前的校准。如同图2B中显示的，通过市售软件工具的使用，可以 采用线性或多边形函数使所述体细胞轻易地被选通出，分离于所述奶颗粒并被计数。图2C 至2E提供了进一步的证据，通过选择合适的选通函数，从体细胞中对奶颗粒的所述区分是 可实现的，其提供与那些利用传统的或更复杂的、最先进的光学技术获得的相当的细胞计 数。通过比较由阻抗流式细胞术（IFC)确定的SSC并使用DNA标记染料（PI =碘化丙啶） 以及随后的采用显微镜的光学计数，图2F显示了这样一种关联。可替换地，采用结合测量 的阻抗值的特定公式，触发可以如上所述直接发生。
[0038] 根据本发明，所述方法允许在挤奶后依据权利要求1中提出的所述SCC的分析直 接用于诊断乳腺炎感染的状态。图3显示了用于两头感染的奶牛的原料奶的这种分析的 结果。为此目的，原料奶的较大样品被分析（约50, 000至100, 000个细胞）。再一次，在 使所述样品通过微流体器件之前，其首先用15-30微米过滤。触发如上所述发生。采用所 描述的方法的原料奶阻抗分析允许对体细胞亚群的进一步区分，所述亚群主要由淋巴细胞 (I)、粒细胞（II)和单核细胞/巨噬细胞（III)组成。这些细胞类型显示在它们的信号幅 值（反射大小）、以及它们的信号相位信息上的差异。后者是用于具有重叠尺寸的淋巴细胞 和粒细胞区分的重要标准。通常已知的是，对感染的第一反应导致粒细胞的增加，接着是在 稍后阶段单核细胞/巨噬细胞的增加。图3中的例子显示了两头有乳腺炎的不同奶牛的原 料奶分析，根据巨噬细胞的高计数，图3A表明一头晚期感染的奶牛的奶，而由于其粒细胞 的高计数，图3B表示一头处于较早感染阶段的奶牛的奶。因此，这种奶牛现场方法提供了 机会，用于兽医医生来确定体细胞亚群的相对比率并且因此快速评估乳腺炎的感染状态以 及监测治疗效果，并且因此在现场做出决定而不是等待在他的或其它分析实验室中的长期 分析。
[0039] 原料奶的所述阻抗值可以因为其SCC和奶的其它天然成分（脂肪含量、尿素、乳 糖、水等）而有所不同，这个事实可能影响对常规流程中自动化的需要。为了使用可靠的用 于确定SCC以及其亚群的触发和选通参数，所述阻抗值的内部校准变得必要。通常，所述调 整是最小的，并且只要原料奶流经所述微流体芯片就可以完成。类似于液体的绝对阻抗值， 这种调整的程度可被视为所述SCC的初步指示。内部校准还可以补偿潜在的芯片到芯片的 变化，常规分析期间芯片需要被替换时这种变化可能变得显而易见。
[0040] 由于SCC通常响应于病原细菌而增加，量化原料奶中细菌细胞计数（BCC)也是重 要的。细菌感染产生自外部污染，例如挤奶之前奶运输设备或奶牛乳头缺乏清洁。人类食 用可接受的BCC值在国家与国家之间有所不同，并且范围从100,000到1，000, 000个细胞 /毫升。现今，BCC不是在生产现场确定，因为其对设备齐全的实验室仪器的要求。由于相 当小的细胞尺寸（约1微米），光学成像仪器失效。另一方面，基于阻抗的技术不能使所述 细胞与奶颗粒分离。因此，在大型分析实验室中利用昂贵的流式细胞仪，或在乳制品生产商 或兽医医生的实验室中利用传统平板培养进行定量。因此，通常在挤奶几天后才可得到BCC 值。
[0041] 此外，本发明允许一种快速的用于在挤奶后直接确定原料奶中BCC的方法。类似 于SCC的确定，原料奶被首先使用最大5-10微米的网目尺寸过滤，这将除去大的非细胞颗 粒和一部分体细胞。然后细菌细胞通过具有5X5微米或IOX 10微米（对于装置的增加的 灵敏度）通道尺寸的微流体芯片，并且如上所述应用所述的最佳触发参数被计数。图4显 示了高频阻抗分析的电位的一个例子。原料奶被脱脂（离心），以便更好地说明各种细胞 类型的分辨率。向14天龄并且由于细菌的生长而相当酸的所述奶样品，为了演示目的加入 死亡的和活的酵母细胞、以及死的乳杆菌。清晰可见的是，细菌和酵母具有比奶颗粒更强 的相位信号（如已经对于体细胞显示的），并且死细胞的相位角通常减小（如同David等 人在 VIABILITY AND MEMBRANE POTENTIAL ANALYSIS OF BACILLUS MEGATERIUM CELLS BY IMPEDANCEFLOff CYTOMETRY, Biotechnology and Bioengineering (2012),109(2),483-492 中显示的）。
[0042] 通过偶联到利用 合适芯片的测量的奶样品的顺序过滤可以实现同时的SCC和 BCC，例如通过首先用30微米的过滤器过滤和采用具有20微米通道尺寸的芯片的后续分 析，在相同流中，用10微米的过滤器实施过滤和采用具有5微米通道尺寸的芯片的后续分 析。可替代地，所述基于芯片的阻抗分析的灵敏度（信号与噪声的比值）可以被提高，例如， 通过将所述电子元件的带宽减小到一个较小的频率范围，即从10到20兆赫，其允许在具有 30微米通道尺寸的芯片内的SCC和BCC的同时分析和一个单独的过滤步骤。
[0043] 在图5中，所述方法的原理被描述在框图中。其显示，通过适当的具有取决于通道 尺寸的网目尺寸的过滤构件16,原料奶被过滤。用于过滤的网目尺寸可以是5、15、30微米 或小于芯片的感应通道的任何其它适当尺寸。随后，用于奶的阻抗测量的构件17,通过提供 相应的通道4(图6)进行相应测量，该通道4为比通过所述过滤构件16的颗粒的尺寸更大 的给定量或百分比。所述构件17还包括用于频率选择的构件，其选择用于触发和/或测量 的频率。所述触发频率用于用参照标号18的校准。所述校准被用于阻抗校正，取决于如同 框19中描述的用于颗粒的阻抗测量的微通道4的尺寸，和/或取决于所测量的流体阻抗。 对于所述颗粒的阻抗测量，对用于R-、I-和A-值的单个触发参数或组合这些值并且还包括 阻抗的相位值φ的触发公式（F)进行选择。测量的结果用相应的记录装置20记录，并且随 后根据各自的选通和分析，由相应的构件21执行并如同框22中显示的来完成。框22包括 可以通过方法和装置获得的结果。它包含已经提到的在框17中直接在选择测量频率后不 使用校准接收的流体阻抗值和根据框18的校准之后的阻抗校正。另外，框22包括框21的 选通和分析的结果，它们是：奶颗粒计数、SCC、BCC、体细胞亚群、体细胞/细菌细胞生存力。
[0044] 图6显示了与具有入口 2和出口 3和在两者之间的微通道4的芯片1相关的原 理。过滤器5设置在入口2之前。所述过滤器5可以是一个完整装置的部分或一个单独的 器件。所述过滤器5的网目尺寸取决于将要被分析的颗粒的尺寸和微通道4的直径。所述 微通道4包含用于在两者之间产生交流电场8的电极6和7。原料奶的颗粒9通过过滤器 5进入微通道4。在电极6和7之间，颗粒影响电场并且阻抗或阻抗的变化通过施加高频电 压10来测量。图6显示了电极6和7之间的电场线和电极6和7之间的颗粒9。该图显示 了标号10的低频场和标号11的高频场对模型细胞的作用，所述模型细胞的膜在较高频率 下电表现不同。利用所述芯片，根据所述不同介电性质，单细胞可以区分于非细胞奶颗粒。 另外，特定触发参数的整合可以简化细胞区分并提供基于常规的分析需要的所需的自动化 可能性。
[0045] 图7A显示了两种测量可能性的原理设置。装置40接收来自奶牛乳房的原料奶15 的样品。在该图中其仅用液滴示例性描绘。该装置具有触摸屏，其充当输入构件32和监测 构件33。另一种可能性是在其路经导管42到达挤奶车间的管道43的过程中直接分析来 自所述乳房23的原料奶。这里的分析结果由移动分析单元41传输到农场主的控制站用于 进一步的数据处理。图7B显示了用于形成如上解释的用于任何动物含有的奶的自动实时 确定和分析的方法的装置元件的框图。过滤器5是必需的以避免图6的微流体器件1的微 通道堵塞，但是，所述过滤器可以是装置40的一部分或单独的组件。除了如结合图6描述 的微流体器件1，所述装置40还包括控制构件30,用于在电极6、7产生高频电压并测量电 极6、7之间有和没有颗粒9时所述电极6、7之间的阻抗。此外，还有输入构件32和监测构 件31。所述控制装置30包括构件33,构件33适于确定奶的阻抗值且如果需要的话适于根 据所述阻抗值校准所述微流体器件，适于计数颗粒并测量所述颗粒的阻抗的构件34,确定 分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数的构件35,适于确定用于将细胞区分于非细胞奶 颗粒的触发参数的构件36,适于根据幅值和相位角值分析阻抗值的构件37,以及适于根据 细胞和/或非细胞奶颗粒的幅值和/或相位角值选择所述细胞和/或非细胞奶颗粒的构件 38。进一步包括的是适于确定被分析奶的阻抗值，和/或确定体细胞亚群，和/或确定奶颗 粒含量，和/或确定体细胞或细菌细胞的生存力的构件39。
【主权项】
1. 一种在微流体器件中，在0. 1至30兆赫之间的范围内，采用高频阻抗测量用于自动 区分和计数任何动物奶中的颗粒诸如细胞或脂肪球的方法，包括： -使原料奶通过一个过滤器，以避免堵塞所述微流体器件； -确定所述奶的阻抗值并根据所述阻抗值校准所述微流体器件，如果需要的话， -计数所述颗粒并测量每个颗粒的阻抗分量； -从这些分量中的一个确定分别适于噪声提取和颗粒识别的触发电平； -从一个阻抗分量确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发电平； -依据所述幅值和所述相位角值分析所述阻抗值；以及 -根据它们的幅值和/或相位角值区分和计数所述细胞和/或非细胞奶颗粒。2. 根据权利要求1的方法，包括分析体细胞。3. 根据权利要求1或权利要求2的方法，包括分析细菌细胞。4. 根据前述权利要求中任一项的方法，包括同时的体细胞计数（SCC)和细菌细胞计数 (BCC) 〇5. 根据前述权利要求其中任一项的方法，包括被分析奶的阻抗值的确定，和/或体细 胞亚群的确定，和/或脂肪球含量的测定，和/或体细胞或细菌细胞生存力的测定。6. 用于任何动物奶的自动实时确定和分析的装置，适于实施根据前述权利要求任一项 的方法，包括： 微流体器件（1)，该微流体器件（1)具有一个入口（2)和一个出口（3)以及在两者之间 的微通道（4)，在所述微通道（4)中具有上（6)和下（7)电极，在所述电极（6, 7)之间形成 用于使所述奶颗粒（9)通过的测量体积； 电构件（10,11)，用于将所述电极（6, 7)连接到控制构件（30)以在所述电极（6, 7)产 生高频电压并测量在所述电极（6, 7)之间有和无颗粒（9)时所述电极（6, 7)之间的阻抗； 输入构件（32)和监测构件（31); 构件（33)，适于确定所述奶的阻抗值且适于根据所述阻抗值校准所述微流体器件，如 果需要的话， 适于计数颗粒并测量所述颗粒的阻抗的构件（34); 用以确定分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数的构件（35); 适于确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发参数的构件（36); 适于依据幅值和相位角值分析阻抗值的构件（37);以及 适于根据细胞和/或非细胞奶颗粒的幅值和/或相位角值选择所述细胞和/或非细胞 奶颗粒的构件（38)。7. 根据权利要求6的装置，包括构件（39)，所述构件（39)适于确定被分析奶的阻抗 值、和/或确定体细胞亚群、和/或确定脂肪球含量和/或确定体细胞或细菌细胞的生存 力。
【专利摘要】本发明涉及通过阻抗微流式细胞术区分原料奶样品中的细胞与其它颗粒、以及细胞的不同类型的方法。更确切地，其描述一种就其细菌和体细胞含量而言不需要奶样品预处理使得分析可以直接在生产场地进行的分析原料奶质量的方法。本发明的一个优点是通过对未处理原料奶直接进行的高频阻抗分析从奶颗粒(主要由脂质囊泡组成)区分和计数体细胞。本发明的另一个优点是该方法允许根据所述体细胞计数的分析在挤奶后直接诊断乳腺炎感染的状态。本发明的另一个优点是允许一种快速的用于在挤奶后直接确定原料奶中细菌细胞计数的方法。此外，体细胞和细菌细胞的生存力都可以被确定而不需要任何细胞标记。进一步的优点是，所述分析可以直接在原料奶已经通过微流体器件的微通道后实时获取。
【IPC分类】C12Q1/02, G01N15/06
【公开号】CN104894208
【申请号】CN201510163927
【发明人】M·迪贝拉尔迪诺, G·沙德-坎普曼
【申请人】安弗西斯股份公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月4日
【公告号】EP2916131A1, US20150253302
【专利说明】用于区分奶中细胞负载的方法和装置
【背景技术】
[0001] 本发明涉及一种用于通过阻抗微流式细胞术区分原料奶样品中细胞和其它颗粒， 以及细胞不同类型的方法。
[0002] 在限定奶质量的许多参数中，细菌（BCC)和体细胞计数（SCC)是最为重要的，因为 它们显著影响所获得的奶产品的质量，而且还提供有关奶牛健康状况的信息。
[0003] 体细胞是被称为白细胞（淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的白血细胞， 并来源于动物的乳房。这些细胞的数目可响应于细菌感染而增加，这可以导致乳腺炎。通 常，未感染奶牛的奶具有小于1〇〇, 〇〇〇个细胞/毫升，高于300, 000个细胞/毫升的值表示 感染的奶牛，而对于患病的奶牛超过1，〇〇〇, 〇〇〇个细胞/毫升的值是典型的。对于人类食用 或对于进一步加工为供人类食用的食品的阈值在欧洲低于400, 000个细胞/毫升，但在美 国可以更高。一般情况下，SCC高于300, 000个细胞/毫升的奶牛视为被感染（Smith，K.L.， in STANDARDS FOR SOMATIC CELLS IN MILK :PHYSIOLOGICAL AND RE⑶LATORY(1996)， International Dairy Federation Mastitis Newsletter，9月，第7 页）。因此，为了评价奶 质量，可靠和精确的体细胞计数方法是必需的。简单且经常被使用的牛侧加利福尼亚乳腺 炎测试（在EXPERIMENTS AND OBSERVATIONS LEADING TO DEVELOPMENT OF THE CALIFORNIA MASTITIS TEST，Journal of the American Veterinary Medical Association (1957)： 130,199-204中根据它的发明人Schalm和Norlander也称为Schalm测试）是间接的、定性 的方法，并且没有提供这种详细信息以定性人类食用奶的质量。
[0004] 通常，在卸载奶卡车后在乳制品制造商的实验室，每天对来自许多动物而不是来 自个别奶牛的混合奶进行SCC测量。主要原因是因为每次挤奶时的个别动物的测试将过 于昂贵。这也意味着，来自患病奶牛的奶会被健康动物稀释并且平均下来。因此，患病动 物可能在后期仍然不被检测到或发现是生病的，而不影响整体的奶质量评价。此外，也由 于几个农场主的奶混合在一起，所以根据奶负载的平均评价补偿农场主。然而，乳制品制 造商宁愿根据每个农场主的奶的每日配送质量补偿每个农场主，这目前这是不可行的。昂 贵的分析主要涉及到基于光学或电气测量的现有技术。光学测量首先需要在分析前将细 胞标记，因此这通常需要昂贵的化学试剂或耗材。另一方面，电气测量，是基于阻抗分析， 但是，利用阻抗分析，其它非细胞奶颗粒会干扰，并且必须通过几个离心步骤被去除。因此 这些器件不能在农场主的场地使用。因此，要进行许多努力以简化分析方法和降低分析成 本。无标记技术是优选的方法，因为这些技术通常不需要试剂和耗材，并且同时简化了样品 制备过程。迄今所使用的电动工具是所谓的库尔特计数器，它可以计数细胞并且通过大小 区分它们。因为原料奶中含有许多颗粒，主要是与白细胞（5-10微米）具有类似尺寸的脂 肪囊泡，可靠的细胞计数是不可能的，因为这些颗粒容易多于体细胞，并且因此严重干扰测 量。因此，在测量前这些颗粒必须从体细胞中分离出来。这可以通过离心实现，离心时细胞 被沉淀而脂肪囊泡从上清液中被除去，或者，如最近由Grenvall等人于2012年10月18日 在 Cytometry A 上在线发表的 LABEL-FREE SOMATIC CELL CYTOMETRY IN RAW MILK USING A⑶ST0PH0RESIS(2012)中显示的，采用声波技术使脂肪囊泡与体细胞分离。虽然离心通常 需要实验室的基础设施，声泳似乎更有前景，但也使库尔特计数器技术进一步复杂化。
[0005] 传统库尔特计数器采用直流（DC)或低频交流电流（AC，最大1千赫兹）测量阻 抗，允许可靠的细胞计数和细胞大小区分。这种技术已经在过去十年中通过微技术的问 世而得到改进。EP 1 335 198 Bl公开了具有电极配置的微流体方法，其允许覆盖宽频率 范围（100千赫-20兆赫）的细胞阻抗分析。高频分析超出了简单的细胞计数和分选并 且探询细胞的介电特性，其允许在各种应用中的细胞区分，诸如Schade-Kampmann等人在 标题为 ON-CHIP NON-INVASIVE AND LABEL-FREE CELL DISCRMINATION BY MPEDANCE SPECTROSCOPY，Cell Prolif. (2008)，41，830-840 中显示的细胞差异，或 Pierzchalski 等 人在标题为 LABEL-FREE HYBRIDOMA CELL CULTURE QUALITY CONTROL BY A CHIP-BASED MPEDANCE FLOW CYTOMETER，Lab Chip (2012)，12 (21)，4533-4543 中以及 David 等人在标 题为 VIABILITY AND MEMBRANE POTENTIAL ANALYSIS OF BACILLUS MEGATERIUM CELLS BY MPEDANCE FLOW CYTOMETRY， Biotechnology&Bioengineering(2012)，109(2)，883-492 中 分别描述的动物和细菌细胞生存力。与其中信号幅值是用于计数和依大小分选细胞的传统 库尔特计数器测量相反，高频分析提供额外的信息，即使这些细胞具有相同的尺寸。但是， 这种分析还只在实验室环境中实施，其中细胞悬浮于明确定义的介质中。
[0006] 美国专利2012/0310541 Al中已经公开了在巨大频率范围（0.3兆赫-1.4千兆 赫）采用阻抗分析用于分析奶中各种细胞参数的方法。在100兆赫至2千兆赫之间的射频 范围以各种频率对奶的阻抗测量可以提供关于体细胞浓度的指征，但是在一个相对定性的 水平，因为该分析不是在单细胞水平进行的。该方法不够灵敏，不足以以能够用于评价奶质 量的方式确定SSC。
[0007] 预期的是奶颗粒（脂质囊泡）和体细胞在它们的细胞内部的介电性质方面表现不 同，如同 Cheung 等人在 MPEDANCE SPECTROSCOPY FLOW CYTOMETRY :0N-CHIP LABEL-FREE CELL DIFFERENTIATION，Cytometry A(2005)，65A，124-132 中预计的。
[0008] 已经显示，以范围至多达0.1 兆赫的频率对单细胞的阻抗分析允许分割幅值 和相位角分量并允许将细胞区分于非细胞颗粒以及区分活/死细胞（Conrad等人在 IMPEDIMETRIC AND OPTICAL INTERROGATION OF SINGLE CELLS IN A MICROFLUIDIC DEVICE FOR REAL-TIME VIABILITY AND CHEMICAL RESPONSE ASSESSMENT,Biosensors and Bioelecrtronics (2008)，23,845-851中）。但是，用于该分析的器件在测量阻抗信号之前 捕获单细胞，并且因此既不适于细胞密度确定也不适于短时间段内成千上万个细胞的分 析。而且，尽管可以将非细胞颗粒（聚苯乙烯珠）区分于细胞，但对奶颗粒做相同的工作则 需要高很多的频率，因为当暴露于电场时，与聚苯乙烯珠相比，这些脂肪球表现得更类似于 细胞。
[0009] 因此本发明的目的是提出一种用于分析奶的简单且快速的方法和装置，并且更确 切的是，用于将细胞区分于脂质囊泡并且以乳品业和奶生产基地中奶质量控制应用需要的 准确性计数它们。
[0010] 此问题 通过本发明得到解决，如同方法权利要求1和装置权利要求中要求保护 的。进一步有利的实施例在各个从属权利要求中被要求保护。
[0011] 根据权利要求1，在微流体器件中，在〇. 1至30兆赫的范围内采用高频阻抗测量用 于自动区分和计数任何动物乳汁中颗粒，诸如细胞或脂肪球的方法，包括：
[0012] 使原料奶通过过滤器以免堵塞微流体器件；
[0013] 确定奶的阻抗值并根据所述阻抗值校准微流体器件，如果需要的话；
[0014] 计数颗粒并且测量颗粒的阻抗；
[0015] 从其中测量的阻抗分量之一确定分别适于噪声提取和颗粒识别的触发电平；
[0016] 从一个阻抗分量确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发电平；
[0017] 依据幅值和相位角值分析阻抗值；和
[0018] 根据它们的幅值和/或相位角值识别和计数细胞和/或非细胞奶颗粒。
[0019] 根据该方法，使原料奶首先通过具有15-30微米网目尺寸的过滤器，并且随后直 接通过具有约20至40微米的通道尺寸的微流体芯片，这比体细胞的正常尺寸（6-18微米） 稍大，所述微流体芯片包含生成高频交流电场（100千赫-30兆赫）的微电极。原料奶的阻 抗信号以及每个单个体细胞和脂质囊泡经过建立的交流电场引起的阻抗变化被测量。每秒 钟大约1，〇〇〇至10, 〇〇〇个细胞/颗粒被分析，并且每次分析需要大约10至100微升，这花 费少于一分钟。重要的是该方法是通过使用直接从动物配送的原料奶进行。奶的分析可以 离线或在奶流中进行，并且分析结果被实时传递。不必需要特殊的样品制备以及由此而来 的费时测量。
[0020] 此外，根据权利要求1，奶的阻抗值被确定，并且如果需要的话，根据所述阻抗值校 准微流体器件。流体中细胞或颗粒的阻抗分析通常一方面取决于细胞的介电性质，但另一 方面，还取决于流体的电学性质（导电性）。通常，细胞的阻抗信号通过从流体的阻抗信号 中减去它而被确定。然而，流体的阻抗影响细胞阻抗的信号幅度和相位。所以，悬浮于奶中 的同样的体细胞或细菌细胞在奶中产生不同的阻抗变化，具有不同的固有阻抗值。对于单 个分析，这不是一个问题，因为这些值在手动设置的散点图和区分模式上进行分析。对于常 规应用，如奶牛现场奶的分析，自动和简单的方法是最为重要的。但是，奶的可变阻抗值使 自动分析复杂化，因为区分模式必须相应地调整。因此，细胞分析前，确定奶的阻抗并且校 准该芯片，使得细胞的随后分析在标准条件下发生。通过这种方式，细胞的阻抗值表现相同 并且相同的区分模式可以用于不同的奶样品。此外，SSC和原料奶的阻抗值之间存在相关 性，使得流体阻抗或所需的校准的延伸可以被用作所述SCC的早期指标，因此其具有与上 述Schalm测试类似的信息内容。
[0021] 根据权利要求1，接下来，将颗粒计数并且测量颗粒的阻抗。当原料奶通过微流体 芯片时，通过阻抗分析检测每个单个颗粒并且记录其阻抗信号。这些细胞的计数（计数）一 方面提供关于细胞含量的信息，并且另一方面也具有评估奶脂肪含量的潜力。精确的分析 在很大程度上依赖于适当触发参数的选择，其通常由测量的阻抗分量之一（实部或虚部， 幅值和相位角）和其数值（=触发电平）构成。这允许奶颗粒或细胞与从高度敏感的检测 系统产生的噪声信号之间选择性差别。只有满足触发参数的信号被记录并且由此可进行详 细的分析，这可以立即发生在数据采集之后或者发生在稍后使用单独的软件工具时。但是， 采用一定参数触发并不意味着只有触发值被记录。相反，记录这样通过调整过的触发器被 识别的每个单个颗粒或细胞的完整信息，其包含该阻抗信号的所有分量。
[0022] 作为权利要求1的进一步措施，分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数，以及 用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发参数被确定。传统库尔特计数器，例如，简单地测量 由干扰所施加电场的颗粒引起的电流脉冲或电压脉冲。脉冲高度与细胞体积成正比并且被 用于分析粒度分布。通过设定一个适当的脉冲触发值产生颗粒和噪声之间的差别。阻抗是 一个复杂的量，其由一个实部（R)和一个虚部（I)组成，但到目前为止，用于奶中的细胞分 析的阻抗信号从未分成其分量。其原因是，对于DC和低频测量，虚部分别是不存在或不相 关的事实。但是，在高频测量中，这些值变得重要，并且实部和虚部都可用作触发参数用于 从所述噪声提取颗粒信号以及用于利用这些值彼此间的差异区分颗粒。这允许所述颗粒群 的简单而充分的表征。除了这些值，幅值（A，实部和虚部的绝对值）单独地或与所述相位角 组合（Φ，从实部和虚部产生），或由这些值（R，I，A和φ)构成的任何公式也可以用作触发 参数，允许大的和小的细胞之间、非细胞奶颗粒和细胞之间、以及相同类型的死和活细胞之 间更具选择性的差别。除了上述的触发参数，触发频率也可以变化。通常情况下，触发频率 是选定的测量频率之一。因此，取决于要从原料乳分析获得的信息，在各种触发参数中选择 的可能性可以简化并且可能自动读出。因此，例如，利用幅值触发对颗粒大小将是有选择性 的，并且提供有关颗粒群大小分布的信息，尽管所述触发幅值与特定相位角值结合可以很 容易地记录非细胞奶颗粒或者细胞。因此，应用特定触发器可以提供预先选择具有特定性 质的颗粒的方法并且改进微流体系统的性能。例如，奶颗粒通常远远超过原料奶中细胞的 数量。如果这些颗粒之一和一个细胞同时位于检测区域内，细胞信号将被显著影响，并且由 于不可用被拒绝或被记录供以后分析。对于具有高细胞浓度（> IO6细胞/毫升）的奶， 这可导致许多细胞被拒绝，并且因此使细胞计数不准确。利用适当相位值触发的可能性使 得奶颗粒对于所述系统基本上不可见并且显著降低了拒绝率。此外，每时间帧（或液体体 积）可以记录和分析更多的颗粒或细胞，如果只是它们的一部分通过所述触发装置进行检 测。
[0023] 权利要求1的另一项措施是依据幅值和相位角值分析阻抗值。所述阻抗信号的绝 对幅值是细胞尺寸的主要指标。这在宽的频率范围应用并延伸到超过20兆赫的频率。其 它细胞参数，如膜电容和细胞质导电性通过所述相位角值被更好地表示。如果考虑相位值， 在大约10兆赫的频率，所述细胞或颗粒内部以及外膜组成的导电性的差异提供了用于区 分这些颗粒的方法。所述方法也允许在不同频率的颗粒的阻抗测量，其因此允许同时探询 大小、膜电容和细胞质导电性，并且提供关于被分析细胞的生理状态的相关信息。
[0024] 至少，根据它们的幅值和/或相位角值，所述细胞和/或非细胞奶颗粒被选择。在 根据调整过的触发参数记录颗粒和/或细胞之后，可以通过将数据绘制在表示各种阻抗分 量的图形上并针对它们的阻抗值选通出现的细胞群进行详细的分析，所述阻抗值可以简单 地是R-、I-、A-和φ·'值，以及更复杂的函数（例如多项式选通）。
[0025] 所述方法可以在芯片（例如，如同EP 1 335 198 Bl中公开的）上被实现，所述芯 片包含具有电极的所需测量通道和在所述测量通道中颗粒的必要定位。这样的芯片可以根 据所述不同介电性质将单细胞区分于非细胞奶颗粒。此外，特定触发参数的整合可以简化 细胞区分并提供常规分析需要的所需自动化可能性。该芯片可以通过确定所述颗粒通过其 中的两对电极对的两个阻抗测量之间的差异，或者通过测量仅一对电极对之间的阻抗来使 用。因此，相应的装置包括微流体器件，该微流体器件具有入口和出口以及两者之间的微通 道，而所述微通道中的上和下电极在电极之间形成用于奶颗粒通过的检测体积；电构件，用 于将所述电极连接到控制构件以在所述电极之间产生高频AC电场，并测量电极之间有无 颗粒时的电极之间的阻抗；输入和监测构件；适于确定奶的阻抗值和如果需要的话适于根 据所述阻抗值校准所述微流体器件的构件；适于计数颗粒并测量所述颗粒的阻抗的构件； 用以确定分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数的构件；适于确定用于将细胞区分于非 细胞奶颗粒的触发参数的构件；适于根据幅值和相位角值分析阻抗值的构件；以及适于根 据细胞和/或非细胞奶颗粒的幅值和/或相位角值选择所述细胞和/或非细胞奶 颗粒的构 件。
[0026] 由于阻抗流式细胞术是一种无标记技术并且奶不需要任何分析前的预处理，因此 这些方法也可以实时发生，例如，如果所述技术与自动挤奶装置相结合。此外，由于乳制品 奶制造商设想根据交付的奶的质量个别地补偿农场主，实时信息可以经由移动通信技术直 接发送到乳制品工厂。
[0027] 本发明的一个优点是通过直接在未处理的原料奶上进行的高频阻抗分析从奶颗 粒（主要由脂质囊泡组成）区分和计数体细胞。本发明的另一个优点是该方法允许根据所 述SCC的分析在挤奶后直接诊断乳腺炎感染的状态。本发明的另一个优点是将允许快速的 用于在挤奶后直接确定原料奶中BCC的方法。此外，体细胞和细菌细胞两者的生存力都可 以被确定而不需要任何细胞标记。进一步的优点是，所述分析可以直接在原料奶已经通过 微通道后实时获取。
[0028] 为了实现上述以及相关目的，本发明随后包含下文在说明书中充分描述和在权利 要求中特别指出的多个特征。下面的描述和附图详细详细阐述了本发明的某些说明性实施 方案。然而，这些实施方案只是示意性了一小部分其中可以采用本发明的原理的不同方法。 当与所述附图结合考虑时，从本发明下面的详细描述，本发明的其它目的、优点和新颖特征 将变得显而易见。
[0029] 图1 :总结了从14头奶牛得到的原料奶的分析获取的结果，其中6头具有超过 400, 000个细胞/毫升。原料奶的阻抗分析；
[0030] 图2 :在图2A中显示了在0. 5兆赫进行的原料奶的分析，而在图2B中显示了在10 兆赫测定的相同样品；图2C至2E分别显示了未感染奶（33, 000个细胞/毫升）、轻微感染 的奶（390, 000个细胞/毫升）和严重感染的奶（840, 000个细胞/毫升）的分析；2F显示 了通过阻抗流式细胞术进行的SCC和细胞用PI (碘化丙啶）标记后进行的光学计数之间的 关联。
[0031] 图3 :显示了诊断两头感染的奶牛乳腺炎感染的状态的原料奶的分析的结果；
[0032] 图4 :显示了高频阻抗分析的电位的实例；
[0033] 图5 :方法的框图；
[0034] 图6 :具有微通道和电极的微流体芯片的原理描述，所述电极对电极之间的颗粒 具有低和高频率影响；和
[0035] 图7 :测量原理（图7A)和装置的框图（图7B)。
[0036] 采用具有40X40微米感应通道尺寸的芯片进行根据图1的分析。浅色条代表健 康的，黑色条代表感染的样本。直方图以千欧显示绝对阻抗幅值的平均值和标准偏差，这取 决于所述通道尺寸。该图显示，具有较高SCC的原料奶的阻抗值具有较低阻抗幅值。因此， 原料奶的低阻抗值提供了升高的体细胞数的第一质量指标。
[0037] 相对于采用库尔特计数器进行的传统阻抗分析，不仅记录信号的幅值，而且还记 录相位φ。针对阻抗信号的实部触发并将它们绘制在相位-幅值图上，其中每个点代表一个 单细胞或奶颗粒的信号，导致了在图2中所示的数据。所述点图用相关直方图补充（幅值 为y轴，相位为X轴）。图2A显示了在0. 5兆赫进行的原料奶的分析，而图2B显示了在10 兆赫测量的具有相同颗粒和细胞的相同样品。如同所预期的，奶颗粒和体细胞的区分在10 兆赫比在更低频率（图2B中箭头指示体细胞群）更明显。主要差异参数是阻抗信号的相 位角，一个不是采用传统库尔特计数器确定的参数。通过增加所述电子元件的带宽，利用在 更高频率（至多达30兆赫）测量可以获取更好的区分，并且因此可以得到颗粒和细胞的充 分分离而不需要任何分析前的校准。如同图2B中显示的，通过市售软件工具的使用，可以 采用线性或多边形函数使所述体细胞轻易地被选通出，分离于所述奶颗粒并被计数。图2C 至2E提供了进一步的证据，通过选择合适的选通函数，从体细胞中对奶颗粒的所述区分是 可实现的，其提供与那些利用传统的或更复杂的、最先进的光学技术获得的相当的细胞计 数。通过比较由阻抗流式细胞术（IFC)确定的SSC并使用DNA标记染料（PI =碘化丙啶） 以及随后的采用显微镜的光学计数，图2F显示了这样一种关联。可替换地，采用结合测量 的阻抗值的特定公式，触发可以如上所述直接发生。
[0038] 根据本发明，所述方法允许在挤奶后依据权利要求1中提出的所述SCC的分析直 接用于诊断乳腺炎感染的状态。图3显示了用于两头感染的奶牛的原料奶的这种分析的 结果。为此目的，原料奶的较大样品被分析（约50, 000至100, 000个细胞）。再一次，在 使所述样品通过微流体器件之前，其首先用15-30微米过滤。触发如上所述发生。采用所 描述的方法的原料奶阻抗分析允许对体细胞亚群的进一步区分，所述亚群主要由淋巴细胞 (I)、粒细胞（II)和单核细胞/巨噬细胞（III)组成。这些细胞类型显示在它们的信号幅 值（反射大小）、以及它们的信号相位信息上的差异。后者是用于具有重叠尺寸的淋巴细胞 和粒细胞区分的重要标准。通常已知的是，对感染的第一反应导致粒细胞的增加，接着是在 稍后阶段单核细胞/巨噬细胞的增加。图3中的例子显示了两头有乳腺炎的不同奶牛的原 料奶分析，根据巨噬细胞的高计数，图3A表明一头晚期感染的奶牛的奶，而由于其粒细胞 的高计数，图3B表示一头处于较早感染阶段的奶牛的奶。因此，这种奶牛现场方法提供了 机会，用于兽医医生来确定体细胞亚群的相对比率并且因此快速评估乳腺炎的感染状态以 及监测治疗效果，并且因此在现场做出决定而不是等待在他的或其它分析实验室中的长期 分析。
[0039] 原料奶的所述阻抗值可以因为其SCC和奶的其它天然成分（脂肪含量、尿素、乳 糖、水等）而有所不同，这个事实可能影响对常规流程中自动化的需要。为了使用可靠的用 于确定SCC以及其亚群的触发和选通参数，所述阻抗值的内部校准变得必要。通常，所述调 整是最小的，并且只要原料奶流经所述微流体芯片就可以完成。类似于液体的绝对阻抗值， 这种调整的程度可被视为所述SCC的初步指示。内部校准还可以补偿潜在的芯片到芯片的 变化，常规分析期间芯片需要被替换时这种变化可能变得显而易见。
[0040] 由于SCC通常响应于病原细菌而增加，量化原料奶中细菌细胞计数（BCC)也是重 要的。细菌感染产生自外部污染，例如挤奶之前奶运输设备或奶牛乳头缺乏清洁。人类食 用可接受的BCC值在国家与国家之间有所不同，并且范围从100,000到1，000, 000个细胞 /毫升。现今，BCC不是在生产现场确定，因为其对设备齐全的实验室仪器的要求。由于相 当小的细胞尺寸（约1微米），光学成像仪器失效。另一方面，基于阻抗的技术不能使所述 细胞与奶颗粒分离。因此，在大型分析实验室中利用昂贵的流式细胞仪，或在乳制品生产商 或兽医医生的实验室中利用传统平板培养进行定量。因此，通常在挤奶几天后才可得到BCC 值。
[0041] 此外，本发明允许一种快速的用于在挤奶后直接确定原料奶中BCC的方法。类似 于SCC的确定，原料奶被首先使用最大5-10微米的网目尺寸过滤，这将除去大的非细胞颗 粒和一部分体细胞。然后细菌细胞通过具有5X5微米或IOX 10微米（对于装置的增加的 灵敏度）通道尺寸的微流体芯片，并且如上所述应用所述的最佳触发参数被计数。图4显 示了高频阻抗分析的电位的一个例子。原料奶被脱脂（离心），以便更好地说明各种细胞 类型的分辨率。向14天龄并且由于细菌的生长而相当酸的所述奶样品，为了演示目的加入 死亡的和活的酵母细胞、以及死的乳杆菌。清晰可见的是，细菌和酵母具有比奶颗粒更强 的相位信号（如已经对于体细胞显示的），并且死细胞的相位角通常减小（如同David等 人在 VIABILITY AND MEMBRANE POTENTIAL ANALYSIS OF BACILLUS MEGATERIUM CELLS BY IMPEDANCEFLOff CYTOMETRY, Biotechnology and Bioengineering (2012),109(2),483-492 中显示的）。
[0042] 通过偶联到利用 合适芯片的测量的奶样品的顺序过滤可以实现同时的SCC和 BCC，例如通过首先用30微米的过滤器过滤和采用具有20微米通道尺寸的芯片的后续分 析，在相同流中，用10微米的过滤器实施过滤和采用具有5微米通道尺寸的芯片的后续分 析。可替代地，所述基于芯片的阻抗分析的灵敏度（信号与噪声的比值）可以被提高，例如， 通过将所述电子元件的带宽减小到一个较小的频率范围，即从10到20兆赫，其允许在具有 30微米通道尺寸的芯片内的SCC和BCC的同时分析和一个单独的过滤步骤。
[0043] 在图5中，所述方法的原理被描述在框图中。其显示，通过适当的具有取决于通道 尺寸的网目尺寸的过滤构件16,原料奶被过滤。用于过滤的网目尺寸可以是5、15、30微米 或小于芯片的感应通道的任何其它适当尺寸。随后，用于奶的阻抗测量的构件17,通过提供 相应的通道4(图6)进行相应测量，该通道4为比通过所述过滤构件16的颗粒的尺寸更大 的给定量或百分比。所述构件17还包括用于频率选择的构件，其选择用于触发和/或测量 的频率。所述触发频率用于用参照标号18的校准。所述校准被用于阻抗校正，取决于如同 框19中描述的用于颗粒的阻抗测量的微通道4的尺寸，和/或取决于所测量的流体阻抗。 对于所述颗粒的阻抗测量，对用于R-、I-和A-值的单个触发参数或组合这些值并且还包括 阻抗的相位值φ的触发公式（F)进行选择。测量的结果用相应的记录装置20记录，并且随 后根据各自的选通和分析，由相应的构件21执行并如同框22中显示的来完成。框22包括 可以通过方法和装置获得的结果。它包含已经提到的在框17中直接在选择测量频率后不 使用校准接收的流体阻抗值和根据框18的校准之后的阻抗校正。另外，框22包括框21的 选通和分析的结果，它们是：奶颗粒计数、SCC、BCC、体细胞亚群、体细胞/细菌细胞生存力。
[0044] 图6显示了与具有入口 2和出口 3和在两者之间的微通道4的芯片1相关的原 理。过滤器5设置在入口2之前。所述过滤器5可以是一个完整装置的部分或一个单独的 器件。所述过滤器5的网目尺寸取决于将要被分析的颗粒的尺寸和微通道4的直径。所述 微通道4包含用于在两者之间产生交流电场8的电极6和7。原料奶的颗粒9通过过滤器 5进入微通道4。在电极6和7之间，颗粒影响电场并且阻抗或阻抗的变化通过施加高频电 压10来测量。图6显示了电极6和7之间的电场线和电极6和7之间的颗粒9。该图显示 了标号10的低频场和标号11的高频场对模型细胞的作用，所述模型细胞的膜在较高频率 下电表现不同。利用所述芯片，根据所述不同介电性质，单细胞可以区分于非细胞奶颗粒。 另外，特定触发参数的整合可以简化细胞区分并提供基于常规的分析需要的所需的自动化 可能性。
[0045] 图7A显示了两种测量可能性的原理设置。装置40接收来自奶牛乳房的原料奶15 的样品。在该图中其仅用液滴示例性描绘。该装置具有触摸屏，其充当输入构件32和监测 构件33。另一种可能性是在其路经导管42到达挤奶车间的管道43的过程中直接分析来 自所述乳房23的原料奶。这里的分析结果由移动分析单元41传输到农场主的控制站用于 进一步的数据处理。图7B显示了用于形成如上解释的用于任何动物含有的奶的自动实时 确定和分析的方法的装置元件的框图。过滤器5是必需的以避免图6的微流体器件1的微 通道堵塞，但是，所述过滤器可以是装置40的一部分或单独的组件。除了如结合图6描述 的微流体器件1，所述装置40还包括控制构件30,用于在电极6、7产生高频电压并测量电 极6、7之间有和没有颗粒9时所述电极6、7之间的阻抗。此外，还有输入构件32和监测构 件31。所述控制装置30包括构件33,构件33适于确定奶的阻抗值且如果需要的话适于根 据所述阻抗值校准所述微流体器件，适于计数颗粒并测量所述颗粒的阻抗的构件34,确定 分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数的构件35,适于确定用于将细胞区分于非细胞奶 颗粒的触发参数的构件36,适于根据幅值和相位角值分析阻抗值的构件37,以及适于根据 细胞和/或非细胞奶颗粒的幅值和/或相位角值选择所述细胞和/或非细胞奶颗粒的构件 38。进一步包括的是适于确定被分析奶的阻抗值，和/或确定体细胞亚群，和/或确定奶颗 粒含量，和/或确定体细胞或细菌细胞的生存力的构件39。
【主权项】
1. 一种在微流体器件中，在0. 1至30兆赫之间的范围内，采用高频阻抗测量用于自动 区分和计数任何动物奶中的颗粒诸如细胞或脂肪球的方法，包括： -使原料奶通过一个过滤器，以避免堵塞所述微流体器件； -确定所述奶的阻抗值并根据所述阻抗值校准所述微流体器件，如果需要的话， -计数所述颗粒并测量每个颗粒的阻抗分量； -从这些分量中的一个确定分别适于噪声提取和颗粒识别的触发电平； -从一个阻抗分量确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发电平； -依据所述幅值和所述相位角值分析所述阻抗值；以及 -根据它们的幅值和/或相位角值区分和计数所述细胞和/或非细胞奶颗粒。2. 根据权利要求1的方法，包括分析体细胞。3. 根据权利要求1或权利要求2的方法，包括分析细菌细胞。4. 根据前述权利要求中任一项的方法，包括同时的体细胞计数（SCC)和细菌细胞计数 (BCC) 〇5. 根据前述权利要求其中任一项的方法，包括被分析奶的阻抗值的确定，和/或体细 胞亚群的确定，和/或脂肪球含量的测定，和/或体细胞或细菌细胞生存力的测定。6. 用于任何动物奶的自动实时确定和分析的装置，适于实施根据前述权利要求任一项 的方法，包括： 微流体器件（1)，该微流体器件（1)具有一个入口（2)和一个出口（3)以及在两者之间 的微通道（4)，在所述微通道（4)中具有上（6)和下（7)电极，在所述电极（6, 7)之间形成 用于使所述奶颗粒（9)通过的测量体积； 电构件（10,11)，用于将所述电极（6, 7)连接到控制构件（30)以在所述电极（6, 7)产 生高频电压并测量在所述电极（6, 7)之间有和无颗粒（9)时所述电极（6, 7)之间的阻抗； 输入构件（32)和监测构件（31); 构件（33)，适于确定所述奶的阻抗值且适于根据所述阻抗值校准所述微流体器件，如 果需要的话， 适于计数颗粒并测量所述颗粒的阻抗的构件（34); 用以确定分别用于噪声提取和颗粒识别的触发参数的构件（35); 适于确定用于将细胞区分于非细胞奶颗粒的触发参数的构件（36); 适于依据幅值和相位角值分析阻抗值的构件（37);以及 适于根据细胞和/或非细胞奶颗粒的幅值和/或相位角值选择所述细胞和/或非细胞 奶颗粒的构件（38)。7. 根据权利要求6的装置，包括构件（39)，所述构件（39)适于确定被分析奶的阻抗 值、和/或确定体细胞亚群、和/或确定脂肪球含量和/或确定体细胞或细菌细胞的生存 力。
【专利摘要】本发明涉及通过阻抗微流式细胞术区分原料奶样品中的细胞与其它颗粒、以及细胞的不同类型的方法。更确切地，其描述一种就其细菌和体细胞含量而言不需要奶样品预处理使得分析可以直接在生产场地进行的分析原料奶质量的方法。本发明的一个优点是通过对未处理原料奶直接进行的高频阻抗分析从奶颗粒(主要由脂质囊泡组成)区分和计数体细胞。本发明的另一个优点是该方法允许根据所述体细胞计数的分析在挤奶后直接诊断乳腺炎感染的状态。本发明的另一个优点是允许一种快速的用于在挤奶后直接确定原料奶中细菌细胞计数的方法。此外，体细胞和细菌细胞的生存力都可以被确定而不需要任何细胞标记。进一步的优点是，所述分析可以直接在原料奶已经通过微流体器件的微通道后实时获取。
【IPC分类】C12Q1/02, G01N15/06
【公开号】CN104894208
【申请号】CN201510163927
【发明人】M·迪贝拉尔迪诺, G·沙德-坎普曼
【申请人】安弗西斯股份公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月4日
【公告号】EP2916131A1, US20150253302
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