一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法
一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积 (confinement area)的方法。
【背景技术】
[0002] 细胞质膜的多种重要功能都与膜的流动性密切相关。作为细胞质膜的重要组成部 分，膜蛋白可以发生侧向扩散及胞吞循环，通过这些运动在信号传递及物质运输中起着非 常关键的作用。因此，检测膜蛋白的分布及扩散运动已成为研宄生物膜的一个重要内容。然 而，这种在纳米级别的膜结构上微秒尺度的快速运动，用常规的显微镜成像是无法观察到 的。
[0003] 通过荧光标记，运用高分辨率的单分子成像技术可以实现在纳米级别上对膜蛋白 分子的动态进行活体成像，结合单颗粒追踪技术（single particle tracking, SPT)，可以 得到膜蛋白分子的个体特异性质，经过统计也可以得到群体的平均值，从而揭示接近生理 活性状态下的膜蛋白运动特征。然而，具体如何实现这一目的，在现有技术中尚未有明确报 道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法。其中， 所述侧向受限面积是蛋白质在细胞膜上扩散时所被限制的区域范围的面积。所述侧向受限 面积具体是指，蛋白质在细胞膜上的扩散由于细胞骨架作用、膜筏微区作用、分子间相互作 用等原因而被限制在一定区域范围内，这个区域的面积被称为侧向受限面积。
[0005] 本发明所提供的检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，具体可包括以下 步骤：
[0006] (1)将待测细胞膜蛋白的编码基因与荧光标记蛋白的编码基因进行融合，得到融 合基因，将所述融合基因导入受体植物，获得转基因植物；所述转基因植物表达所述融合 基因编码的融合蛋白，从而在所述转基因植物中实现对所述待测细胞膜蛋白的单色荧光标 记；
[0007] (2)使用可变角全内反射焚光显微镜（variable angle-total internal reflection fluorescence microscope, VA-TIRFM)对所述转基因植物的活体材料进行观 察，获得时间序列图像；
[0008] 所述时间序列图像为检测被所述荧光标记蛋白进行了单色荧光标记的所述待 测细胞膜蛋白时，在可变角全内反射荧光显微镜下连续拍摄的图像（如连续拍摄50-200 帧）；
[0009] (3)利用单颗粒追踪技术（SPT)对所述时间序列图像中的荧光点进行识别和追 踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移（mean square displacement，MSD)；
[0010] ⑷利用Origin软件（如0rigin8. 6软件）将步骤⑶所得的荧光点随时间的平 均平方位移进行拟合，拟合的方程为如下式I :
[0011] y = A「A2e-kx 式 I
[0012] 拟合时，以所述平均平方位移作为y值，以所述时间为X值，通过拟合得到常数A1 的值；
[0013] 将值代入如下式II，计算获得L 2的值：
[0014] L2=SA1 式 II
[0015] 式II中，L2为荧光点在细胞膜上的运动范围（μπι2)，即为所述待测细胞膜蛋白的 侧向受限面积。
[0016] 在所述方法的步骤（1)中，所述待测细胞膜蛋白最好为来自于所述受体植物的蛋 白，当然也可以为其他来源的植物蛋白。所述待测细胞膜蛋白为在所述受体植物的表皮细 胞中表达的细胞膜蛋白。所述表皮细胞具体可为来自于所述受体植物的根、胚轴或叶片等 部位的表皮细胞，这是为了以便于可变角全内反射显微镜的检测。
[0017] 在本发明中，所述荧光标记蛋白具体为绿色荧光蛋白GFP。所述待测细胞膜蛋白具 体为拟南芥向光素 phot 1。所述植物具体为拟南芥。
[0018] 进一步，在本发明的一个实施例中，所述转基因植物具体为在photl-5突变体背景 下转入融合基因 photl-GFP的拟南芥，该拟南芥来自文献"Sakamoto and Briggs. Cellular and subcellular localization of phototropin I. Plant Cell, 2002, 14:1723-1735"中。
[0019] 在本发明中，步骤（2)中，使用所述可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植 物的活体材料进行观察的过程中，采用的激发波长为473nm或488nm，曝光时间为IOOrns或 200ms，EMCCD增益值为345,连续拍摄图像50-200帧（如200帧）。
[0020] 在所述方法的步骤（2)中，所述转基因植物的活体材料可为所述转基因植物幼苗 的胚轴或根或叶片。
[0021] 在所述方法的步骤（3)中，所述利用单颗粒追踪技术对所述时间序列图像中 的焚光点进行识别和追踪，得到焚光点随着时间的轨迹，米用的是在文献" Jaqaman et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.Nat. Methods, 2008, 5:695 - 702"中公开过的追踪方法，公众可从文献补充材料（网址http:// www. nature. com/nmeth/journal/v5/n8/full/nmeth. 1237. html)获得程序。
[0022] 在所述方法的步骤（3)中，所述计算荧光点随时间的平均平方位移的公式为如下 式 III :
[0023] MSD = (X-Xtl)2+(y_yQ)2 式 III
[0024] 式III中，MSD为平均平方位移，&和y ^代表荧光点的初始坐标，X和y为荧光点 在某一特定时刻的坐标。
[0025] 在所述方法的步骤（3)中，所述计算荧光点随时间的平均平方位移时，所选取的 荧光点为在所述时间序列图像中存在14帧以上的荧光点。
[0026] 在所述方法的步骤（4)中，利用所述Origin软件（如0rigin8. 6软件）将所述 荧光点随时间的平均平方位移进行拟合时，之所以选择如式I (y = A1-A2^kx)所示的拟合方 程，是因为：式I (y = A1-A2^Tkx)与如下式IV所示方程对应；
[0027] MSD = r il - €邓式 IV 5 L i，s I
[0028] 所述式IV为现有技术公开的MSD与L2之间关系的方程，来自文献"Mercer et al.Regulation of presynaptic strength by control ling Ca2+channel mobility:effects of cholesterol depletion on release at the cone ribbon synapse. J. Neurophysiol，2012, 107:3468 - 3478"。式 IV 中，A1 正好对应手，所以将 A1 的值 * 代入所述式II(L2=SA1)即可获得L2的值Um2)。
[0029] 在所述方法的步骤（4)中，利用所述Origin软件（如0rigin8. 6软件）进行拟合 的所述荧光点随时间的平均平方位移是按照如下方法获得的：将步骤（3)所得的在每一时 刻不同荧光点的平均平方位移求平均值，误差值为标准差，得到平均平方位移均值随时间 变化的数据。
[0030] 本发明提供了一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，并对拟南芥向 光素 Photl在暗培养和蓝光处理两种条件下在细胞膜上的侧向受限面积进行了测算。实验 结果表明：蓝光光照会使Photl-GFP在胚轴细胞膜上的侧向受限面积从0. 051 ym2增加到 0. 15 μπι2。本发明测算活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法简单，重复性好，可以计算 出蛋白的个体信息，也可以计算群体平均信息。
【附图说明】
[0031] 图1为可变角全内反射荧光显微镜拍摄到的暗培养状态（左）和蓝光处理 (6000 ymol/m2)后（右）的photl-GFP在胚轴部位的图像。标尺=5μηι。
[0032] 图2为图1两幅图像中photl-GFP荧光点在时间序列中追踪到的轨迹。
[0033] 图3为暗培养状态（左，η = 45)和蓝光处理后（右，n = 51)photl-GFP荧光点的 MSD随时间的变化曲线。
[0034] 图4为photl-GFP在暗培养条件下45个数据和蓝光处理后51个数据随时间的 MSD平均值及拟合曲线。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 在photl-5突变体背景下转入融合基因 photl-GFP的拟南芥：在文献"Sakamoto and Briggs. Cellular and subcellular localization of phototropin I.Plan t Cell, 2002, 14:1723-1735"中公开过，公众可从中国科学院植物研宄所获得。
[0038] 实施例1、检测拟南芥中向光素 photl在细胞膜上的侧向受限面积
[0039] 用于检测膜上侧向受限面积的蛋白为拟南芥向光素 photl，这种蛋白在拟南芥胚 轴的表皮细胞膜上有表达。标记Photl的标签使用的是绿色荧光蛋白GFP。
[0040] 一、植物材料
[0041] 1、转基因拟南芥的获得
[0042] 本发明所用的在photl-5突变体背景下转入融合基因 photl-GFP的拟南芥来自 文献"Sakamoto and Briggs. Cellular and subcellular localization of phototropin I. Plant Cell, 2002, 14:1723-1735"中公开过，公众可从中国科学院植物研宄所获得。 [0043] 2、拟南芥种子的培养
[0044] 将转基因拟南芥种子置于I. 5ml离心管中，加入2. 5% (体积分数）的次氯酸钠浸 泡lOmin，再用灭菌水清洗5次，播种到添加有1.0% (lg/100ml)蔗糖、1.0% (lg/100ml) 琼脂、pH值为5. 8的1/2MS培养基上，22°C黑暗培养4天，得到黄化的拟南芥幼苗。拟南芥 黄化幼苗胚轴为检测材料。
[0045] 二、膜蛋白侧向受限面积检测
[0046] 1、可变角全内反射荧光显微镜观察植物材料并获得时间序列图像
[0047] 将上述拟南芥黄化幼苗直接置于或蓝光处理（6000 μmol/m2)后置于可变角全内 反射荧光显微镜下观测胚轴，曝光时间为200ms，激发光波长为473nm，EMC⑶增益值为345， 拍摄帧数为200,获得photl-GFP在暗培养状态或蓝光处理后的时间序列图像。图1为用可 变角全内反射荧光显微镜拍摄的暗培养（左）或蓝光处理后（右）的Photl-GFP的时间序 列图像中的一帧。
[0048] 2、计算荧光点随时间的平均平方位移
[0049] (1)用单颗粒追踪程序（SPT)获得上述时间序列图像中荧光点的轨迹及相应坐 标° 米用的是在文献''Jaqaman et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods, 2008, 5:695 - 702" 中公开过的追踪方法，公众可从 文献补充材料（网址 http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n8/full/nmeth. 1237. html)获得程序。
[0050] 图2为暗培养（左）或蓝光处理后（右）的photl-GFP的运动轨迹。
[0051] (2)取在所述事件序列图像中存在14帧以上（不少于3s)的荧光点随时间的坐标 信息，通过如下公式计算出每一时刻的平均平方位移（mean square displacement，MSD):
[0052] MSD = (x-x〇)2+ (y-y〇)2
[0053] 式中，Xtl和y C1代表荧光点的初始坐标，x和y为荧光点在某一特定时刻的坐标。
[0054] 本实施例中统计了暗培养条件下的45个photl-GFP荧光点，蓝光处理后的51个 photl-GFP荧光点的平均平方位移随时间变化曲线。图3为暗培养条件（左）和蓝光处理 后（右）photl-GFP荧光点的平均平方位移随时间变化曲线图。
[0055] 3、计算荧光点的受限面积
[0056] (1)将上述得到的不同处理组的数据分别在每一时刻取平均平方位移（MSD)的平 均值，误差值为标准差，得到每组的平均平方位移（MSD)均值随时间变化的数据。
[0057] (2)将上述数据导入Origin 8. 6软件，作散点图。将两条曲线分别用Exponential Fit中的如下公式进行拟合：
[0058] y = A1-A2^kx
[0059] 拟合时，以所述平均平方位移均值作为y值，以所述时间为X值，通过拟合得到常 数A1的值；
[0060] 与以上拟合公式对应的现有技术中公开的MSD与L2之间关系的方程（来自文 献''Mercer et al. Regulation of presynaptic strength by controlling Ca2+channel mobility:effects of cholesterol depletion on release at the cone ribbon synapse. J. Neurophysiol，2012, 107:3468 - 3478"）如下：
[0062] 其中，A1正好对应方程中的f，所以将A1的值代入公式（L 2= 3A)即可获得L2的 值Um2)。L2的值为荧光点在细胞膜上的运动范围Um2)，即为photl-GFP在细胞膜上的 侧向受限面积。
[0063] 本实施例中，常数Al的值分别为：暗培养状态，0. 017 ;蓝光处理后，0. 050。则可计 算出暗培养状态下photl-GFP在细胞膜上的侧向受限面积约为0. 051 μπι2,而6000 ymol/m2 蓝光处理后Photl-GFP在细胞膜上的侧向受限面积增大到0. 15 μ m2。图4为暗培养状态和 蓝光处理后的平均平方位移均值随时间变化的数据值及拟合曲线。
【主权项】
1. 一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，包括以下步骤： (1) 将待测细胞膜蛋白的编码基因与荧光标记蛋白的编码基因进行融合，得到融合基 因，将所述融合基因导入受体植物，获得转基因植物；所述转基因植物表达所述融合基因编 码的融合蛋白，从而在所述转基因植物中实现对所述待测细胞膜蛋白的单色荧光标记； (2) 使用可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察，获得时 间序列图像； 所述时间序列图像为检测被所述荧光标记蛋白进行了单色荧光标记的所述待测细胞 膜蛋白时，在可变角全内反射荧光显微镜下连续拍摄的图像； (3) 利用单颗粒追踪技术对所述时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光 点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移； (4) 利用Origin软件将步骤（3)所得的荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，拟合 的方程为如下式I: y=A1-A2^kx 式I 拟合时，以所述平均平方位移作为y值，以所述时间为X值，通过拟合得到常数心的 值； 将所述4的值代入如下式II，计算获得L2的值： L2= 3A!式II 式II中，L2为荧光点在细胞膜上的运动范围，即为所述待测细胞膜蛋白的侧向受限面 积。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述荧光标记蛋白为绿色荧 光蛋白GFP。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述待测细胞膜蛋白为 拟南芥向光素photl。4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述植物为拟南芥。5. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，使用所述可变角全 内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察的过程中，采用的激发波长为 473nm或488nm，曝光时间为IOOms或200ms，EMCCD增益值为345,连续拍摄图像50-200帧。6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述转基因植物的活 体材料为所述转基因植物幼苗的胚轴或根或叶片。7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述计算荧光点随时 间的平均平方位移的公式为如下式III: MSD= (x-x0)2+(y_y0)2 式III 式III中，MSD为平均平方位移，Xtl和y^代表荧光点的初始坐标，X和y为荧光点在某 一特定时刻的坐标。8. 根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述计算荧光点随 时间的平均平方位移时，所选取的荧光点为在所述时间序列图像中存在14帧以上的荧光 点。
【专利摘要】本发明公开了一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法。该方法包括：(1)使植物中表达一种融合蛋白，以获得对待测蛋白进行单色荧光标记的转基因植物材料；(2)使用可变角全内反射荧光显微镜对转基因植物材料进行观察，获得时间序列图像；(3)利用单颗粒追踪技术对时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移；(4)利用Origin软件将荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，得到对应的常数，计算出荧光点的运动范围。利用本方法测算活体细胞中膜蛋白侧向受限面积的方法简单，重复性好，可以计算出蛋白的个体信息，也可以计算群体平均信息。
【IPC分类】C12N15/82, C12Q1/02
【公开号】CN104894210
【申请号】CN201510276169
【发明人】林金星, 薛轶群, 王晓华
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积 (confinement area)的方法。
【背景技术】
[0002] 细胞质膜的多种重要功能都与膜的流动性密切相关。作为细胞质膜的重要组成部 分，膜蛋白可以发生侧向扩散及胞吞循环，通过这些运动在信号传递及物质运输中起着非 常关键的作用。因此，检测膜蛋白的分布及扩散运动已成为研宄生物膜的一个重要内容。然 而，这种在纳米级别的膜结构上微秒尺度的快速运动，用常规的显微镜成像是无法观察到 的。
[0003] 通过荧光标记，运用高分辨率的单分子成像技术可以实现在纳米级别上对膜蛋白 分子的动态进行活体成像，结合单颗粒追踪技术（single particle tracking, SPT)，可以 得到膜蛋白分子的个体特异性质，经过统计也可以得到群体的平均值，从而揭示接近生理 活性状态下的膜蛋白运动特征。然而，具体如何实现这一目的，在现有技术中尚未有明确报 道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法。其中， 所述侧向受限面积是蛋白质在细胞膜上扩散时所被限制的区域范围的面积。所述侧向受限 面积具体是指，蛋白质在细胞膜上的扩散由于细胞骨架作用、膜筏微区作用、分子间相互作 用等原因而被限制在一定区域范围内，这个区域的面积被称为侧向受限面积。
[0005] 本发明所提供的检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，具体可包括以下 步骤：
[0006] (1)将待测细胞膜蛋白的编码基因与荧光标记蛋白的编码基因进行融合，得到融 合基因，将所述融合基因导入受体植物，获得转基因植物；所述转基因植物表达所述融合 基因编码的融合蛋白，从而在所述转基因植物中实现对所述待测细胞膜蛋白的单色荧光标 记；
[0007] (2)使用可变角全内反射焚光显微镜（variable angle-total internal reflection fluorescence microscope, VA-TIRFM)对所述转基因植物的活体材料进行观 察，获得时间序列图像；
[0008] 所述时间序列图像为检测被所述荧光标记蛋白进行了单色荧光标记的所述待 测细胞膜蛋白时，在可变角全内反射荧光显微镜下连续拍摄的图像（如连续拍摄50-200 帧）；
[0009] (3)利用单颗粒追踪技术（SPT)对所述时间序列图像中的荧光点进行识别和追 踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移（mean square displacement，MSD)；
[0010] ⑷利用Origin软件（如0rigin8. 6软件）将步骤⑶所得的荧光点随时间的平 均平方位移进行拟合，拟合的方程为如下式I :
[0011] y = A「A2e-kx 式 I
[0012] 拟合时，以所述平均平方位移作为y值，以所述时间为X值，通过拟合得到常数A1 的值；
[0013] 将值代入如下式II，计算获得L 2的值：
[0014] L2=SA1 式 II
[0015] 式II中，L2为荧光点在细胞膜上的运动范围（μπι2)，即为所述待测细胞膜蛋白的 侧向受限面积。
[0016] 在所述方法的步骤（1)中，所述待测细胞膜蛋白最好为来自于所述受体植物的蛋 白，当然也可以为其他来源的植物蛋白。所述待测细胞膜蛋白为在所述受体植物的表皮细 胞中表达的细胞膜蛋白。所述表皮细胞具体可为来自于所述受体植物的根、胚轴或叶片等 部位的表皮细胞，这是为了以便于可变角全内反射显微镜的检测。
[0017] 在本发明中，所述荧光标记蛋白具体为绿色荧光蛋白GFP。所述待测细胞膜蛋白具 体为拟南芥向光素 phot 1。所述植物具体为拟南芥。
[0018] 进一步，在本发明的一个实施例中，所述转基因植物具体为在photl-5突变体背景 下转入融合基因 photl-GFP的拟南芥，该拟南芥来自文献"Sakamoto and Briggs. Cellular and subcellular localization of phototropin I. Plant Cell, 2002, 14:1723-1735"中。
[0019] 在本发明中，步骤（2)中，使用所述可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植 物的活体材料进行观察的过程中，采用的激发波长为473nm或488nm，曝光时间为IOOrns或 200ms，EMCCD增益值为345,连续拍摄图像50-200帧（如200帧）。
[0020] 在所述方法的步骤（2)中，所述转基因植物的活体材料可为所述转基因植物幼苗 的胚轴或根或叶片。
[0021] 在所述方法的步骤（3)中，所述利用单颗粒追踪技术对所述时间序列图像中 的焚光点进行识别和追踪，得到焚光点随着时间的轨迹，米用的是在文献" Jaqaman et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.Nat. Methods, 2008, 5:695 - 702"中公开过的追踪方法，公众可从文献补充材料（网址http:// www. nature. com/nmeth/journal/v5/n8/full/nmeth. 1237. html)获得程序。
[0022] 在所述方法的步骤（3)中，所述计算荧光点随时间的平均平方位移的公式为如下 式 III :
[0023] MSD = (X-Xtl)2+(y_yQ)2 式 III
[0024] 式III中，MSD为平均平方位移，&和y ^代表荧光点的初始坐标，X和y为荧光点 在某一特定时刻的坐标。
[0025] 在所述方法的步骤（3)中，所述计算荧光点随时间的平均平方位移时，所选取的 荧光点为在所述时间序列图像中存在14帧以上的荧光点。
[0026] 在所述方法的步骤（4)中，利用所述Origin软件（如0rigin8. 6软件）将所述 荧光点随时间的平均平方位移进行拟合时，之所以选择如式I (y = A1-A2^kx)所示的拟合方 程，是因为：式I (y = A1-A2^Tkx)与如下式IV所示方程对应；
[0027] MSD = r il - €邓式 IV 5 L i，s I
[0028] 所述式IV为现有技术公开的MSD与L2之间关系的方程，来自文献"Mercer et al.Regulation of presynaptic strength by control ling Ca2+channel mobility:effects of cholesterol depletion on release at the cone ribbon synapse. J. Neurophysiol，2012, 107:3468 - 3478"。式 IV 中，A1 正好对应手，所以将 A1 的值 * 代入所述式II(L2=SA1)即可获得L2的值Um2)。
[0029] 在所述方法的步骤（4)中，利用所述Origin软件（如0rigin8. 6软件）进行拟合 的所述荧光点随时间的平均平方位移是按照如下方法获得的：将步骤（3)所得的在每一时 刻不同荧光点的平均平方位移求平均值，误差值为标准差，得到平均平方位移均值随时间 变化的数据。
[0030] 本发明提供了一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，并对拟南芥向 光素 Photl在暗培养和蓝光处理两种条件下在细胞膜上的侧向受限面积进行了测算。实验 结果表明：蓝光光照会使Photl-GFP在胚轴细胞膜上的侧向受限面积从0. 051 ym2增加到 0. 15 μπι2。本发明测算活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法简单，重复性好，可以计算 出蛋白的个体信息，也可以计算群体平均信息。
【附图说明】
[0031] 图1为可变角全内反射荧光显微镜拍摄到的暗培养状态（左）和蓝光处理 (6000 ymol/m2)后（右）的photl-GFP在胚轴部位的图像。标尺=5μηι。
[0032] 图2为图1两幅图像中photl-GFP荧光点在时间序列中追踪到的轨迹。
[0033] 图3为暗培养状态（左，η = 45)和蓝光处理后（右，n = 51)photl-GFP荧光点的 MSD随时间的变化曲线。
[0034] 图4为photl-GFP在暗培养条件下45个数据和蓝光处理后51个数据随时间的 MSD平均值及拟合曲线。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 在photl-5突变体背景下转入融合基因 photl-GFP的拟南芥：在文献"Sakamoto and Briggs. Cellular and subcellular localization of phototropin I.Plan t Cell, 2002, 14:1723-1735"中公开过，公众可从中国科学院植物研宄所获得。
[0038] 实施例1、检测拟南芥中向光素 photl在细胞膜上的侧向受限面积
[0039] 用于检测膜上侧向受限面积的蛋白为拟南芥向光素 photl，这种蛋白在拟南芥胚 轴的表皮细胞膜上有表达。标记Photl的标签使用的是绿色荧光蛋白GFP。
[0040] 一、植物材料
[0041] 1、转基因拟南芥的获得
[0042] 本发明所用的在photl-5突变体背景下转入融合基因 photl-GFP的拟南芥来自 文献"Sakamoto and Briggs. Cellular and subcellular localization of phototropin I. Plant Cell, 2002, 14:1723-1735"中公开过，公众可从中国科学院植物研宄所获得。 [0043] 2、拟南芥种子的培养
[0044] 将转基因拟南芥种子置于I. 5ml离心管中，加入2. 5% (体积分数）的次氯酸钠浸 泡lOmin，再用灭菌水清洗5次，播种到添加有1.0% (lg/100ml)蔗糖、1.0% (lg/100ml) 琼脂、pH值为5. 8的1/2MS培养基上，22°C黑暗培养4天，得到黄化的拟南芥幼苗。拟南芥 黄化幼苗胚轴为检测材料。
[0045] 二、膜蛋白侧向受限面积检测
[0046] 1、可变角全内反射荧光显微镜观察植物材料并获得时间序列图像
[0047] 将上述拟南芥黄化幼苗直接置于或蓝光处理（6000 μmol/m2)后置于可变角全内 反射荧光显微镜下观测胚轴，曝光时间为200ms，激发光波长为473nm，EMC⑶增益值为345， 拍摄帧数为200,获得photl-GFP在暗培养状态或蓝光处理后的时间序列图像。图1为用可 变角全内反射荧光显微镜拍摄的暗培养（左）或蓝光处理后（右）的Photl-GFP的时间序 列图像中的一帧。
[0048] 2、计算荧光点随时间的平均平方位移
[0049] (1)用单颗粒追踪程序（SPT)获得上述时间序列图像中荧光点的轨迹及相应坐 标° 米用的是在文献''Jaqaman et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods, 2008, 5:695 - 702" 中公开过的追踪方法，公众可从 文献补充材料（网址 http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n8/full/nmeth. 1237. html)获得程序。
[0050] 图2为暗培养（左）或蓝光处理后（右）的photl-GFP的运动轨迹。
[0051] (2)取在所述事件序列图像中存在14帧以上（不少于3s)的荧光点随时间的坐标 信息，通过如下公式计算出每一时刻的平均平方位移（mean square displacement，MSD):
[0052] MSD = (x-x〇)2+ (y-y〇)2
[0053] 式中，Xtl和y C1代表荧光点的初始坐标，x和y为荧光点在某一特定时刻的坐标。
[0054] 本实施例中统计了暗培养条件下的45个photl-GFP荧光点，蓝光处理后的51个 photl-GFP荧光点的平均平方位移随时间变化曲线。图3为暗培养条件（左）和蓝光处理 后（右）photl-GFP荧光点的平均平方位移随时间变化曲线图。
[0055] 3、计算荧光点的受限面积
[0056] (1)将上述得到的不同处理组的数据分别在每一时刻取平均平方位移（MSD)的平 均值，误差值为标准差，得到每组的平均平方位移（MSD)均值随时间变化的数据。
[0057] (2)将上述数据导入Origin 8. 6软件，作散点图。将两条曲线分别用Exponential Fit中的如下公式进行拟合：
[0058] y = A1-A2^kx
[0059] 拟合时，以所述平均平方位移均值作为y值，以所述时间为X值，通过拟合得到常 数A1的值；
[0060] 与以上拟合公式对应的现有技术中公开的MSD与L2之间关系的方程（来自文 献''Mercer et al. Regulation of presynaptic strength by controlling Ca2+channel mobility:effects of cholesterol depletion on release at the cone ribbon synapse. J. Neurophysiol，2012, 107:3468 - 3478"）如下：
[0062] 其中，A1正好对应方程中的f，所以将A1的值代入公式（L 2= 3A)即可获得L2的 值Um2)。L2的值为荧光点在细胞膜上的运动范围Um2)，即为photl-GFP在细胞膜上的 侧向受限面积。
[0063] 本实施例中，常数Al的值分别为：暗培养状态，0. 017 ;蓝光处理后，0. 050。则可计 算出暗培养状态下photl-GFP在细胞膜上的侧向受限面积约为0. 051 μπι2,而6000 ymol/m2 蓝光处理后Photl-GFP在细胞膜上的侧向受限面积增大到0. 15 μ m2。图4为暗培养状态和 蓝光处理后的平均平方位移均值随时间变化的数据值及拟合曲线。
【主权项】
1. 一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法，包括以下步骤： (1) 将待测细胞膜蛋白的编码基因与荧光标记蛋白的编码基因进行融合，得到融合基 因，将所述融合基因导入受体植物，获得转基因植物；所述转基因植物表达所述融合基因编 码的融合蛋白，从而在所述转基因植物中实现对所述待测细胞膜蛋白的单色荧光标记； (2) 使用可变角全内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察，获得时 间序列图像； 所述时间序列图像为检测被所述荧光标记蛋白进行了单色荧光标记的所述待测细胞 膜蛋白时，在可变角全内反射荧光显微镜下连续拍摄的图像； (3) 利用单颗粒追踪技术对所述时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光 点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移； (4) 利用Origin软件将步骤（3)所得的荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，拟合 的方程为如下式I: y=A1-A2^kx 式I 拟合时，以所述平均平方位移作为y值，以所述时间为X值，通过拟合得到常数心的 值； 将所述4的值代入如下式II，计算获得L2的值： L2= 3A!式II 式II中，L2为荧光点在细胞膜上的运动范围，即为所述待测细胞膜蛋白的侧向受限面 积。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述荧光标记蛋白为绿色荧 光蛋白GFP。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述待测细胞膜蛋白为 拟南芥向光素photl。4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述植物为拟南芥。5. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，使用所述可变角全 内反射荧光显微镜对所述转基因植物的活体材料进行观察的过程中，采用的激发波长为 473nm或488nm，曝光时间为IOOms或200ms，EMCCD增益值为345,连续拍摄图像50-200帧。6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述转基因植物的活 体材料为所述转基因植物幼苗的胚轴或根或叶片。7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述计算荧光点随时 间的平均平方位移的公式为如下式III: MSD= (x-x0)2+(y_y0)2 式III 式III中，MSD为平均平方位移，Xtl和y^代表荧光点的初始坐标，X和y为荧光点在某 一特定时刻的坐标。8. 根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述计算荧光点随 时间的平均平方位移时，所选取的荧光点为在所述时间序列图像中存在14帧以上的荧光 点。
【专利摘要】本发明公开了一种检测活体植物细胞膜蛋白侧向受限面积的方法。该方法包括：(1)使植物中表达一种融合蛋白，以获得对待测蛋白进行单色荧光标记的转基因植物材料；(2)使用可变角全内反射荧光显微镜对转基因植物材料进行观察，获得时间序列图像；(3)利用单颗粒追踪技术对时间序列图像中的荧光点进行识别和追踪，得到荧光点随着时间的轨迹，进而计算荧光点随时间的平均平方位移；(4)利用Origin软件将荧光点随时间的平均平方位移进行拟合，得到对应的常数，计算出荧光点的运动范围。利用本方法测算活体细胞中膜蛋白侧向受限面积的方法简单，重复性好，可以计算出蛋白的个体信息，也可以计算群体平均信息。
【IPC分类】C12N15/82, C12Q1/02
【公开号】CN104894210
【申请号】CN201510276169
【发明人】林金星, 薛轶群, 王晓华
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月26日
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