用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基的制作方法
用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及用于牙垢标本的具核梭杆菌选择培养 基。
【背景技术】
[0002] 微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性培养基是用来 促进或抑制一定类型的生物体(如细胞或细菌等）而设计的培养基，利用这种培养基可以将 所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。牙周病是口腔两大类主要疾病之一，在我国 有很高的发病率，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, Fn)属革兰氏阴性专性厌氧杆 菌，与牙周疾病的炎症反应密切相关，是在牙周病中起主导作用的微生物，也是成人牙周炎 和青少年牙周炎的可疑致病菌之一。该菌除可引起口腔疾病外，还可引起身体其他部位的 感染，包括脑、肺和肝，血液和关节，胸和腹部。目前，具核梭杆菌检验手段主要是龈下菌斑 采样进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)该种方法需要对样本进行 DNA提取和PCR引物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作复杂。实验室常用 CDC厌氧菌琼脂培养具核梭杆菌，由于基层医院检验科大多缺乏无氧检验设备，因此大多用 "厌氧缸培养法"，所谓的厌氧缸是普通的干燥缸，接种好标本的平板或液体培养基试管放 入干燥缸内培养，通过物理化学的方法耗尽缸内氧气，造成厌氧环境。厌氧缸法的氧气耗 尽需要时间，而具核梭杆菌为专性厌氧杆菌，因此该种培养技术存在以下缺陷：①厌氧缸内 CDC厌氧菌琼脂培养基上的具核梭杆菌生长缓慢，阳性检出率低，一周左右方可较准确的作 出鉴定；②由于非绝对无氧条件，因此牙垢标本内需氧菌和兼性厌氧菌具有生存条件，培养 基分离能力差。此外，现有的CDC厌氧菌琼脂培养基培养过程中很难将牙垢标本中的卟啉 单胞菌、普氏杆菌、消化链球菌，以及溶血链球菌、变形链球菌、韦荣球菌、金黄色葡萄球菌、 衣氏和内氏放线菌、白色念珠菌等口腔常驻菌分离出去，影响具核梭杆菌的生长和分离。
【发明内容】
[0003] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于具核梭杆菌生长 的选择培养基。
[0004] 本发明解决其技术问题的技术方案是：用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基，其特 征在于，配制1000 ml培养基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.0 g; 豌豆淀粉2. 0~5. Og ; 酵母粉5. 0~10.0 g ; 氯化钠5. Og ; 琼脂 15. 0 ~20.0 g ; 乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g ; 结页氨酸〇· 1~〇· 5g ; L-高精氨酸〇· 1~〇· 5g ; 无菌热变形小牛血清50~100mL ; 蒸馏水加至1000ml。
[0005] 上述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
[0006] 上述培养基的制备方法为： (1) 称取豌豆淀粉在50~70°C下，100mL蒸馏水中糊化； (2) 称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精 氨酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀，121°C，灭菌15min，冷却到45°C，加 入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0007] 所述的胰酪蛋白胨含有多种糖类、氨基酸、维生素和微量元素为具核梭杆菌生长 提供能量，豌豆淀粉提供碳源，酵母粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因 子、微量元素等营养成分，促进具核梭杆菌的繁殖和生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂 为培养基的凝固剂；缬氨酸为厌氧菌营养剂；乙二胺四乙酸二钾镁盐提供具核梭杆菌生长 所需的无机盐，且该浓度下的乙二胺四乙酸二钾镁盐通过电性络合作用附着于细菌细胞 壁，导致细胞结构变形，进行发挥抑菌灭菌作用，而具核梭杆菌细胞壁上的外膜蛋白OMP和 fadA黏附蛋白使得具核梭杆菌的细胞壁区域等电点与乙二胺四乙酸二钾镁盐不匹配，造成 电性络合作用失效，因此抗菌失效。通过实验分别将口腔常见厌氧菌卟啉单胞菌、普氏杆 菌、韦荣球菌、具核梭杆菌菌株接种到添加3g/L的乙二胺四乙酸二钾镁盐CDC厌氧选择培 养基上，对照组为普通⑶C厌氧菌选择培养基，于37°C、厌氧罐内培养48h后观察，添加乙 二胺四乙酸二钾盐的培养基上发现小型具核梭杆菌半透明菌落，未发现卟啉单胞菌、普氏 杆菌、韦荣球菌菌落，对照组培养基上发现卟啉单胞菌、普氏杆菌、韦荣球菌、具核梭杆菌菌 落，由此证实乙二胺四乙酸二钾盐对卟啉单胞菌、普氏杆菌、韦荣球菌有较好的灭菌作用， 且对于具核梭杆菌无明显影响。
[0008] 热变形小牛血清具有选择性的抗菌效果，其热变形方法为：取无菌小牛血清80°C 下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。热变 形小牛血清抗菌性质针对需氧菌，一方面改变需氧菌细胞壁结构，造成通透性增加而死亡， 另一方面可以降低培养基的氧化还原电势，促进无氧环境而加速需氧菌死亡，而该种抗菌 作用仅针对于需氧菌，对于厌氧菌则无效。通过实验将同一大肠杆菌菌株和具核梭杆菌菌 株分别接种到CDC选择培养基和配方中添加了 80ml/L的热变形小牛血清的优化CDC选择 培养基上，于密封干燥缸环境37°C下培养，24h、48h鉴定，24h时添加热变形小牛血清大肠 杆菌阳性检出率为50%，没有添加热变形小牛血清的培养基上大肠杆菌阳性检出率为80% ; 48h检测结果为添加热变形小牛血清的培养基具核梭杆菌阳性检出率70%，没有添加热变 形小牛血清的培养基上具核梭杆菌阳性检出率20% ;由此证实热变形小牛血清在厌氧缸内 对需氧菌有较好的抑制效果，且能通过加速无氧环境而促进厌氧菌生长。L-高精氨酸为 激活剂，促进缬氨酸的吸收；γ -氨基丁酸为营养增强剂，促进具核梭杆菌生长；石菖蒲(学 名：Acorus gramineus)属菖蒲科，为禾草状的多年生草本植物，药用部分为根莖部位。现 代医学研宄表明，石菖蒲含α -细辛醚等挥发油及糖类、有机酸、氨基酸、无机元素等成分， 有消肿止痛、化痰开窍、痈疽疥癣等作用，石菖蒲水提液是良好的营养强化剂，石菖蒲水浸 剂（1:3)，在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、星形奴卡菌等皮肤真菌均有不同程度的 抑制作用。有报告指出，石菖蒲煎剂有杀死腹水癌细胞的作用。Masuda T等研宄发现石菖 蒲中的α-细辛醚对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等均有抑制作用。实验证实， 200g/L浓度下的石菖蒲水煮液对于厌氧菌并无杀灭作用，以厌氧培养基为对照，以厌氧培 养基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液为实验组，接种具核梭杆菌菌株，96h的阳性检出率 分别为60%和70%，二者比较无明显差异（P>0. 05)。
[0009] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、具核梭杆菌分离率高的特点。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0011] 实施例1，配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉2. Og ; 酵母粉5. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ;缴氨酸0.1 g ;无菌热 变形小牛血清100mL ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)称取豌豆淀粉在70°C下，100mL 蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨 酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀，121°C，灭菌15min，冷却到45°C，加入 无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0012] 所述的无菌热变形小牛血清制备方法为取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。其他实施例中的无菌热 变形小牛血清制备方法与实施例1中相同。
[0013] 实施例2,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉5. Og ;酵 母粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精氨 酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清50ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)称取豌豆淀粉在 50°C下，100mL蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸 二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀，121°C， 灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分 装。
[0014] 实施例3,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉3. Og ; 酵母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ;缴氨酸0. 5g ; γ -氨 基丁酸〇. Olg ;无菌热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)称取豌豆 淀粉在70°C下，100mL蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺 四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；γ -氨基丁酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀， 121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml 后分装。
[0015] 实施例4,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;豌豆淀粉5. Og ;酵 母粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ;缴氨酸0.1 g ;无菌热变形 小牛血清80ml ;200g / L石菖蒲水提液200ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)取40g 石菖蒲加水煮沸30min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液200ml ; (2)称取豌豆淀粉在60°C下，100mL蒸馏水中糊化；（3)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠； 琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸，用蒸馏水溶解后与步骤（2)得到的糊化淀粉混匀， 然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液中混匀121°c灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热 变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0016] 实施例5,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉2. Og ; 酵母粉5. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂18. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精 氨酸〇. 3g ; γ -氨基丁酸0. 05g ;无菌热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方 法：（1)称取豌豆淀粉在50°C下，100mL蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化 钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸；γ-氨基丁酸，用蒸馏水溶解后与 步骤（1)得到的糊化淀粉混勾，121°C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清 混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0017] 实施例6,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;豌豆淀粉5. Og ; 酵母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ;缬氨酸0. 3g ;L-高精 氨酸〇. 3g ;无菌热变形小牛血清80ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液250ml ;蒸馏水加 至1000ml。制备方法：（1)取50g石菖蒲加水煮沸45min，过滤，取滤液，调整体积到浓度 为200g/L，得石菖蒲水煮液250ml ; (2)称取豌豆淀粉在70°C下，100mL蒸馏水中糊化；（3) 称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸， 用蒸馏水溶解后与步骤（2)得到的糊化淀粉混匀，然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液 中混匀121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到 1000 ml后分装。
[0018] 实施例7,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉5. Og ; 酵母粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ;缴氨酸0. 3g ; γ -氨 基丁酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清50ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液300ml ;蒸馏水加 至1000ml。制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮沸60min，过滤，取滤液，调整体积到浓度 为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取豌豆淀粉在60°C下，100mL蒸馏水中糊化；（3) 称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；γ-氨基丁酸， 用蒸馏水溶解后与步骤（2)得到的糊化淀粉混匀，然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液 中混匀121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到 1000 ml后分装。
[0019] 实施例8,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉3. Og ; 酵母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ;缬氨酸0. 3g ;L-高精 氨酸〇. 5g ; γ -氨基丁酸0.0 lg ;无菌热变形小牛血清100mL ;浓度200g / L的石菖蒲水提 液300ml ;蒸馏水加至1000 ml。制备方法：制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮沸60min，过 滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取豌豆淀粉在60°C 下，100mL蒸馏水中糊化；（3)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾 镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸；γ -氨基丁酸与步骤（2)得到的糊化淀粉蒸馏水溶解、混匀，溶 于步骤所得的石菖蒲提取液中混匀121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血 清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0020] 所述石菖蒲水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。
[0021] 本发明所得的具核梭杆菌培养基用于牙垢标本，具有检出可靠、具核梭杆菌分离 率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。
[0022] 1对象与方法。
[0023] I. 1培养基制备：实验组共设5组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施 例3方案组、实施例6方案组、实施例8方案组。对照组为普通⑶C厌氧菌琼脂，其配方为： 胰酪蛋白胨15g / L、大豆蛋白胨5g / L、酵母粉5g/L ;L-胱氨酸盐酸盐0. 4g/L ;琼脂15g / L、氯化钠5g / L、无菌维生素 K 0. 01g/L、无菌氯化血红素0. 005g/L、无菌绵羊血50ml / L0
[0024] 1. 2菌斑采集培养方法：牙周病患者32例，隔湿唾液，龈上刮治器去除龈上牙石， 碘酊消毒后，用无菌Gracey刮治器采集2颗患病牙齿龈下菌斑。将采集的菌斑悬浮于Iml 灭菌生理盐水，用接种环分区划线接种于各实验组和对照组培养基。在37°C下，厌氧缸培 养，分别于48h、96h挑取细小菌落进行菌属鉴定。各样本编号送检PCR做分子生物学鉴定。
[0025] 1. 3检出阳性标准：取出培养皿，观察培养基上菌落生长状况，菌体细长，无芽孢， 两端尖，有时呈长丝状，菌落半透明，边缘不整齐。依据《临床微生物学诊断与图解》检验， 最终结果金标准为PCR鉴定。
[0026] 2结果：32份牙周病患者牙垢标本培养经PCR最后鉴定为具核梭杆菌阳性的为29 例。48h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养48小时后，各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有极明 显差异（Ρ〈0·001)。
[0027] 96h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养96小时后，对照组（CDC)的阳性检出率有所提高，但是各实施 例组与对照组阳性检出率比较，均具有明显差异（P〈〇. 05)。各实施例组与PCR检测结果比 较，阳性检出率差异无统计学意义（P>〇. 05)，而对照组阳性检出率则明显低于PCR检测结 果（Ρ〈0· 001)。
[0028] 以上结果表明，牙垢标本经过本发明实施例培养基干燥缸内培养后，48h时已经出现 明显增长，分离率明显高于现有的培养基（CDC)，96小时后，各实施例与对照组阳性检出率差 异缩小，但区别仍具有统计学意义，各实施例真阳性检出率与PCR检测比较，已无统计学差异， 而普通CDC厌氧菌琼脂培养基厌氧缸内培养营养不足，杂菌繁殖迅速，具核梭杆菌生长缓慢， 虽然96h时出现明显菌株阳性生长，但阳性检出率仍明显低于PCR检测结果，起不了诊断作用。 本发明培养基用于在干燥缸环境下培养具核梭杆菌，检出可靠，分离率高，从而缩短确诊时间。
【主权项】
1.用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基，其特征在于：每升培养基中含有：胰酪蛋白胨 5.O~10.Og;豌豆淀粉2.O~5.Og;酵母粉5.O~10.Og;氯化钠5.Og;琼脂15.O~20.Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g;缬氨酸0. 1~0. 5g;L-高精氨酸0. 1~0. 5g;无菌热变形小 牛血清50~100mL;蒸馏水加至1000 ml;其中所述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取 无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量 比为1:150。
【专利摘要】本发明公开了用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基。属于检验微生物培养领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨；豌豆淀粉；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸；无菌热变形小牛血清，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，具核梭杆菌分离率高的特点。
【IPC分类】C12Q1/04
【公开号】CN104894213
【申请号】CN201510340903
【发明人】鲁莉, 董礼艳, 段海平, 刘艳
【申请人】鲁莉
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及用于牙垢标本的具核梭杆菌选择培养 基。
【背景技术】
[0002] 微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性培养基是用来 促进或抑制一定类型的生物体(如细胞或细菌等）而设计的培养基，利用这种培养基可以将 所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。牙周病是口腔两大类主要疾病之一，在我国 有很高的发病率，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, Fn)属革兰氏阴性专性厌氧杆 菌，与牙周疾病的炎症反应密切相关，是在牙周病中起主导作用的微生物，也是成人牙周炎 和青少年牙周炎的可疑致病菌之一。该菌除可引起口腔疾病外，还可引起身体其他部位的 感染，包括脑、肺和肝，血液和关节，胸和腹部。目前，具核梭杆菌检验手段主要是龈下菌斑 采样进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)该种方法需要对样本进行 DNA提取和PCR引物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作复杂。实验室常用 CDC厌氧菌琼脂培养具核梭杆菌，由于基层医院检验科大多缺乏无氧检验设备，因此大多用 "厌氧缸培养法"，所谓的厌氧缸是普通的干燥缸，接种好标本的平板或液体培养基试管放 入干燥缸内培养，通过物理化学的方法耗尽缸内氧气，造成厌氧环境。厌氧缸法的氧气耗 尽需要时间，而具核梭杆菌为专性厌氧杆菌，因此该种培养技术存在以下缺陷：①厌氧缸内 CDC厌氧菌琼脂培养基上的具核梭杆菌生长缓慢，阳性检出率低，一周左右方可较准确的作 出鉴定；②由于非绝对无氧条件，因此牙垢标本内需氧菌和兼性厌氧菌具有生存条件，培养 基分离能力差。此外，现有的CDC厌氧菌琼脂培养基培养过程中很难将牙垢标本中的卟啉 单胞菌、普氏杆菌、消化链球菌，以及溶血链球菌、变形链球菌、韦荣球菌、金黄色葡萄球菌、 衣氏和内氏放线菌、白色念珠菌等口腔常驻菌分离出去，影响具核梭杆菌的生长和分离。
【发明内容】
[0003] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于具核梭杆菌生长 的选择培养基。
[0004] 本发明解决其技术问题的技术方案是：用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基，其特 征在于，配制1000 ml培养基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.0 g; 豌豆淀粉2. 0~5. Og ; 酵母粉5. 0~10.0 g ; 氯化钠5. Og ; 琼脂 15. 0 ~20.0 g ; 乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g ; 结页氨酸〇· 1~〇· 5g ; L-高精氨酸〇· 1~〇· 5g ; 无菌热变形小牛血清50~100mL ; 蒸馏水加至1000ml。
[0005] 上述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
[0006] 上述培养基的制备方法为： (1) 称取豌豆淀粉在50~70°C下，100mL蒸馏水中糊化； (2) 称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精 氨酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀，121°C，灭菌15min，冷却到45°C，加 入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0007] 所述的胰酪蛋白胨含有多种糖类、氨基酸、维生素和微量元素为具核梭杆菌生长 提供能量，豌豆淀粉提供碳源，酵母粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因 子、微量元素等营养成分，促进具核梭杆菌的繁殖和生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂 为培养基的凝固剂；缬氨酸为厌氧菌营养剂；乙二胺四乙酸二钾镁盐提供具核梭杆菌生长 所需的无机盐，且该浓度下的乙二胺四乙酸二钾镁盐通过电性络合作用附着于细菌细胞 壁，导致细胞结构变形，进行发挥抑菌灭菌作用，而具核梭杆菌细胞壁上的外膜蛋白OMP和 fadA黏附蛋白使得具核梭杆菌的细胞壁区域等电点与乙二胺四乙酸二钾镁盐不匹配，造成 电性络合作用失效，因此抗菌失效。通过实验分别将口腔常见厌氧菌卟啉单胞菌、普氏杆 菌、韦荣球菌、具核梭杆菌菌株接种到添加3g/L的乙二胺四乙酸二钾镁盐CDC厌氧选择培 养基上，对照组为普通⑶C厌氧菌选择培养基，于37°C、厌氧罐内培养48h后观察，添加乙 二胺四乙酸二钾盐的培养基上发现小型具核梭杆菌半透明菌落，未发现卟啉单胞菌、普氏 杆菌、韦荣球菌菌落，对照组培养基上发现卟啉单胞菌、普氏杆菌、韦荣球菌、具核梭杆菌菌 落，由此证实乙二胺四乙酸二钾盐对卟啉单胞菌、普氏杆菌、韦荣球菌有较好的灭菌作用， 且对于具核梭杆菌无明显影响。
[0008] 热变形小牛血清具有选择性的抗菌效果，其热变形方法为：取无菌小牛血清80°C 下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。热变 形小牛血清抗菌性质针对需氧菌，一方面改变需氧菌细胞壁结构，造成通透性增加而死亡， 另一方面可以降低培养基的氧化还原电势，促进无氧环境而加速需氧菌死亡，而该种抗菌 作用仅针对于需氧菌，对于厌氧菌则无效。通过实验将同一大肠杆菌菌株和具核梭杆菌菌 株分别接种到CDC选择培养基和配方中添加了 80ml/L的热变形小牛血清的优化CDC选择 培养基上，于密封干燥缸环境37°C下培养，24h、48h鉴定，24h时添加热变形小牛血清大肠 杆菌阳性检出率为50%，没有添加热变形小牛血清的培养基上大肠杆菌阳性检出率为80% ; 48h检测结果为添加热变形小牛血清的培养基具核梭杆菌阳性检出率70%，没有添加热变 形小牛血清的培养基上具核梭杆菌阳性检出率20% ;由此证实热变形小牛血清在厌氧缸内 对需氧菌有较好的抑制效果，且能通过加速无氧环境而促进厌氧菌生长。L-高精氨酸为 激活剂，促进缬氨酸的吸收；γ -氨基丁酸为营养增强剂，促进具核梭杆菌生长；石菖蒲(学 名：Acorus gramineus)属菖蒲科，为禾草状的多年生草本植物，药用部分为根莖部位。现 代医学研宄表明，石菖蒲含α -细辛醚等挥发油及糖类、有机酸、氨基酸、无机元素等成分， 有消肿止痛、化痰开窍、痈疽疥癣等作用，石菖蒲水提液是良好的营养强化剂，石菖蒲水浸 剂（1:3)，在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、星形奴卡菌等皮肤真菌均有不同程度的 抑制作用。有报告指出，石菖蒲煎剂有杀死腹水癌细胞的作用。Masuda T等研宄发现石菖 蒲中的α-细辛醚对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等均有抑制作用。实验证实， 200g/L浓度下的石菖蒲水煮液对于厌氧菌并无杀灭作用，以厌氧培养基为对照，以厌氧培 养基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液为实验组，接种具核梭杆菌菌株，96h的阳性检出率 分别为60%和70%，二者比较无明显差异（P>0. 05)。
[0009] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、具核梭杆菌分离率高的特点。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0011] 实施例1，配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉2. Og ; 酵母粉5. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ;缴氨酸0.1 g ;无菌热 变形小牛血清100mL ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)称取豌豆淀粉在70°C下，100mL 蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨 酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀，121°C，灭菌15min，冷却到45°C，加入 无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0012] 所述的无菌热变形小牛血清制备方法为取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。其他实施例中的无菌热 变形小牛血清制备方法与实施例1中相同。
[0013] 实施例2,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉5. Og ;酵 母粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精氨 酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清50ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)称取豌豆淀粉在 50°C下，100mL蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸 二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀，121°C， 灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分 装。
[0014] 实施例3,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉3. Og ; 酵母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ;缴氨酸0. 5g ; γ -氨 基丁酸〇. Olg ;无菌热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)称取豌豆 淀粉在70°C下，100mL蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺 四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；γ -氨基丁酸，用蒸馏水溶解后与步骤（1)得到的糊化淀粉混匀， 121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml 后分装。
[0015] 实施例4,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;豌豆淀粉5. Og ;酵 母粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ;缴氨酸0.1 g ;无菌热变形 小牛血清80ml ;200g / L石菖蒲水提液200ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：（1)取40g 石菖蒲加水煮沸30min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液200ml ; (2)称取豌豆淀粉在60°C下，100mL蒸馏水中糊化；（3)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠； 琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸，用蒸馏水溶解后与步骤（2)得到的糊化淀粉混匀， 然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液中混匀121°c灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热 变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0016] 实施例5,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉2. Og ; 酵母粉5. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂18. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精 氨酸〇. 3g ; γ -氨基丁酸0. 05g ;无菌热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方 法：（1)称取豌豆淀粉在50°C下，100mL蒸馏水中糊化；（2)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化 钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸；γ-氨基丁酸，用蒸馏水溶解后与 步骤（1)得到的糊化淀粉混勾，121°C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清 混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0017] 实施例6,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;豌豆淀粉5. Og ; 酵母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ;缬氨酸0. 3g ;L-高精 氨酸〇. 3g ;无菌热变形小牛血清80ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液250ml ;蒸馏水加 至1000ml。制备方法：（1)取50g石菖蒲加水煮沸45min，过滤，取滤液，调整体积到浓度 为200g/L，得石菖蒲水煮液250ml ; (2)称取豌豆淀粉在70°C下，100mL蒸馏水中糊化；（3) 称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸， 用蒸馏水溶解后与步骤（2)得到的糊化淀粉混匀，然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液 中混匀121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到 1000 ml后分装。
[0018] 实施例7,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉5. Og ; 酵母粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ;缴氨酸0. 3g ; γ -氨 基丁酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清50ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液300ml ;蒸馏水加 至1000ml。制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮沸60min，过滤，取滤液，调整体积到浓度 为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取豌豆淀粉在60°C下，100mL蒸馏水中糊化；（3) 称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；γ-氨基丁酸， 用蒸馏水溶解后与步骤（2)得到的糊化淀粉混匀，然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液 中混匀121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到 1000 ml后分装。
[0019] 实施例8,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉3. Og ; 酵母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ;缬氨酸0. 3g ;L-高精 氨酸〇. 5g ; γ -氨基丁酸0.0 lg ;无菌热变形小牛血清100mL ;浓度200g / L的石菖蒲水提 液300ml ;蒸馏水加至1000 ml。制备方法：制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮沸60min，过 滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取豌豆淀粉在60°C 下，100mL蒸馏水中糊化；（3)称取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾 镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸；γ -氨基丁酸与步骤（2)得到的糊化淀粉蒸馏水溶解、混匀，溶 于步骤所得的石菖蒲提取液中混匀121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血 清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0020] 所述石菖蒲水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。
[0021] 本发明所得的具核梭杆菌培养基用于牙垢标本，具有检出可靠、具核梭杆菌分离 率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。
[0022] 1对象与方法。
[0023] I. 1培养基制备：实验组共设5组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施 例3方案组、实施例6方案组、实施例8方案组。对照组为普通⑶C厌氧菌琼脂，其配方为： 胰酪蛋白胨15g / L、大豆蛋白胨5g / L、酵母粉5g/L ;L-胱氨酸盐酸盐0. 4g/L ;琼脂15g / L、氯化钠5g / L、无菌维生素 K 0. 01g/L、无菌氯化血红素0. 005g/L、无菌绵羊血50ml / L0
[0024] 1. 2菌斑采集培养方法：牙周病患者32例，隔湿唾液，龈上刮治器去除龈上牙石， 碘酊消毒后，用无菌Gracey刮治器采集2颗患病牙齿龈下菌斑。将采集的菌斑悬浮于Iml 灭菌生理盐水，用接种环分区划线接种于各实验组和对照组培养基。在37°C下，厌氧缸培 养，分别于48h、96h挑取细小菌落进行菌属鉴定。各样本编号送检PCR做分子生物学鉴定。
[0025] 1. 3检出阳性标准：取出培养皿，观察培养基上菌落生长状况，菌体细长，无芽孢， 两端尖，有时呈长丝状，菌落半透明，边缘不整齐。依据《临床微生物学诊断与图解》检验， 最终结果金标准为PCR鉴定。
[0026] 2结果：32份牙周病患者牙垢标本培养经PCR最后鉴定为具核梭杆菌阳性的为29 例。48h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养48小时后，各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有极明 显差异（Ρ〈0·001)。
[0027] 96h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养96小时后，对照组（CDC)的阳性检出率有所提高，但是各实施 例组与对照组阳性检出率比较，均具有明显差异（P〈〇. 05)。各实施例组与PCR检测结果比 较，阳性检出率差异无统计学意义（P>〇. 05)，而对照组阳性检出率则明显低于PCR检测结 果（Ρ〈0· 001)。
[0028] 以上结果表明，牙垢标本经过本发明实施例培养基干燥缸内培养后，48h时已经出现 明显增长，分离率明显高于现有的培养基（CDC)，96小时后，各实施例与对照组阳性检出率差 异缩小，但区别仍具有统计学意义，各实施例真阳性检出率与PCR检测比较，已无统计学差异， 而普通CDC厌氧菌琼脂培养基厌氧缸内培养营养不足，杂菌繁殖迅速，具核梭杆菌生长缓慢， 虽然96h时出现明显菌株阳性生长，但阳性检出率仍明显低于PCR检测结果，起不了诊断作用。 本发明培养基用于在干燥缸环境下培养具核梭杆菌，检出可靠，分离率高，从而缩短确诊时间。
【主权项】
1.用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基，其特征在于：每升培养基中含有：胰酪蛋白胨 5.O~10.Og;豌豆淀粉2.O~5.Og;酵母粉5.O~10.Og;氯化钠5.Og;琼脂15.O~20.Og ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g;缬氨酸0. 1~0. 5g;L-高精氨酸0. 1~0. 5g;无菌热变形小 牛血清50~100mL;蒸馏水加至1000 ml;其中所述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取 无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量 比为1:150。
【专利摘要】本发明公开了用于牙垢标本的具核梭杆菌培养基。属于检验微生物培养领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨；豌豆淀粉；酵母粉；氯化钠；琼脂；乙二胺四乙酸二钾镁盐；缬氨酸；L-高精氨酸；无菌热变形小牛血清，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，具核梭杆菌分离率高的特点。
【IPC分类】C12Q1/04
【公开号】CN104894213
【申请号】CN201510340903
【发明人】鲁莉, 董礼艳, 段海平, 刘艳
【申请人】鲁莉
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
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