一种厌氧培养基的制作方法
一种厌氧培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及一种厌氧培养基。
【背景技术】
[0002] 微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，专性厌氧菌必须在 无氧的环境中才能生长，厌氧培养基是通过物理、化学等方法营造培养基的无氧环境 以提供专性厌氧菌生长所需要的营养物质和无氧环境而设计的培养基。坏死梭杆菌 (Fusobacterium necrophorum, Fn)为梭杆菌属、革兰氏染色阴性、严格厌氧的细菌。致病 性Fn菌株产生多种独立因子，如白细胞毒素（leukotoxin, Lkt)、溶血素（hemolysin)、血凝 素（hemagglutinin)和内毒素（endotoxin)等，能引发多重哺乳动物(包括人类）和禽类的 坏死杆菌病（necrobacillosis)。坏死梭杆菌是各种化脓坏死性感染疾病的主要和次要病 原，广泛存在于动物和人的口腔、呼吸道和胃肠道等天然腔道内，以及化脓性坏死病灶和梗 死的组织器官内，属条件致病菌。Fn -般通过有创伤的皮肤或粘膜侵入机体，与其他细菌 如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌、化脓性棒状杆菌等化脓类细菌联合感染宿主引起坏死杆菌 病，该病在动物中常见且危害严重，人类主要引起急性咽炎综合症（Lemierre' s)、手部皮 肤、口腔和肺部脓肿。这些疾病典型的症状是存在脓肿或坏死性病灶，并有恶臭气味。此 外，有的还伴随菌血症的发生对宿主生命安全造成严重威胁，临床症状与链球菌性咽炎、细 菌性肺炎症状类似，易误诊。因此作为确诊唯一依据的临床细菌检查的正确与快速鉴定极 为重要。
[0003] 目前，坏死梭杆菌检验手段主要是采用以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)为基础的分子生物学检测方法，该方法需要对样本进行DNA提取和PCR引 物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作复杂，基层实验室难以实现。实验室 常用CDC厌氧菌琼脂培养坏死梭杆菌，由于基层医院检验科大多缺乏无氧检验设备，因此 大多用"厌氧缸培养法"，所谓的厌氧缸是普通的干燥缸，接种好标本的平板或液体培养基 试管放入干燥缸内培养，通过物理化学的方法耗尽缸内氧气，造成厌氧环境。厌氧缸法的氧 气耗尽需要时间，而坏死梭杆菌为专性厌氧杆菌，因此该种培养技术存在以下缺陷：①厌氧 缸内CDC厌氧菌琼脂培养基上的坏死梭杆菌生长缓慢，阳性检出率低，一周左右方可较准 确的作出鉴定；②由于非绝对无氧条件，因此咽喉分泌物标本内需氧菌和兼性厌氧菌具有 生存条件，培养基分离能力差。
【发明内容】
[0004] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于坏死梭杆菌生长 的厌氧培养基。
[0005] 本发明解决其技术问题的技术方案是：一种厌氧培养基，其特征在于，配制 1000ml培养基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.0 g; 葡萄糖5. O~10.0 g ; 酵母粉5. 0~10.0 g ; 氯化钠 5. Og ; 琼脂 15. 0 ~20.0 g ; 牛胆盐〇· 5~1.0 g ; 乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g ; γ-氨基丁酸〇. 1~〇. 5g ; 结页氨酸〇· 1~〇· 5g ; L-高精氨酸0. 01~0. 05g ; 无菌热变形小牛血清50~100mL ; 蒸馏水加至1000ml。
[0006] 上述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
[0007] 上述培养基的制备方法为：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛 胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸；缬氨酸；L-高精氨酸溶于蒸馏水中，混匀， 121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml 后分装。
[0008] 所述的胰酪蛋白胨含有多种糖类、氨基酸、维生素和微量元素为坏死梭杆菌生长 提供能量；葡萄糖提供碳源，酵母粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因子、 微量元素等营养成分，促进坏死梭杆菌的繁殖和生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂为 培养基的凝固剂；γ -氨基丁酸为营养增强剂，促进坏死梭杆菌生长。
[0009] 乙二胺四乙酸二钾镁盐提供坏死梭杆菌生长所需的无机盐，且该浓度下的乙二胺 四乙酸二钾镁盐会产生下述抑菌灭菌作用：①乙二胺四乙酸二钾镁盐置换替代革兰氏阳性 菌中的核糖核酸镁盐，导致其不能生成镁盐-蛋白质复合物（ribonucleoprotein，RNP)，核 酸编码的遗传信息流向活性蛋白质的过程受阻，产生针对于革兰氏阳性菌杀灭作用；②对 于等电点较高的革兰氏阳性菌，乙二胺四乙酸二钾镁盐通过电性络合作用附着于细菌细胞 壁，导致细胞结构变形，进行发挥抑菌灭菌作用。而梭杆菌菌属细胞壁上的外膜蛋白OMP和 fadA黏附蛋白使得坏死梭杆菌的细胞壁区域等电点与乙二胺四乙酸二钾镁盐不匹配，造成 电性络合作用失效，且由于其缺乏核糖核酸镁盐，因此抗菌失效。通过实验分别将咽喉分泌 物标本中常见口腔 细菌化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌、破伤风杆菌、坏死梭杆菌菌株接种到 添加 3g/L的乙二胺四乙酸二钾镁盐⑶C厌氧选择培养基上，对照组为普通⑶C厌氧菌选择 培养基，于37°C、厌氧罐内培养48h后观察，添加乙二胺四乙酸二钾盐的培养基上发现有坏 死梭杆菌菌落，未发现化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌菌落、破伤风杆菌菌落，对 照组培养基上发现化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌、破伤风杆菌和坏死梭杆菌菌 落，由此证实乙二胺四乙酸二钾盐对化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌、破伤风杆 菌有较好的灭菌作用，且对于坏死梭杆菌无明显影响。
[0010] 为了取得更好的灭杂菌作用，配方中加入了牛胆盐，牛胆盐可以抑制革兰氏阳性 菌生长，但为了保持适度的电解质平衡，且其作用仅仅是对于乙二胺四乙酸二钾镁盐的灭 菌增效，因此用量浓度比较小。
[0011] 热变形小牛血清具有选择性的抗菌效果，其热变形方法为：取无菌小牛血清80°C 下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。热变 形小牛血清抗菌性质针对需氧菌，一方面改变需氧菌细胞壁结构，造成通透性增加而死亡， 另一方面可以降低培养基的氧化还原电势，促进无氧环境而加速需氧菌死亡，而该种抗菌 作用仅针对于需氧菌，对于厌氧菌则无效。通过实验将同一大肠杆菌菌株和坏死梭杆菌菌 株分别接种到CDC选择培养基和配方中添加了 80ml/L的热变形小牛血清的优化CDC选择 培养基上，于密封干燥缸环境37°C下培养，24h、48h鉴定，24h时添加热变形小牛血清大肠 杆菌阳性检出率为40%，没有添加热变形小牛血清的培养基上大肠杆菌阳性检出率为70% ; 48h检测结果为添加热变形小牛血清的培养基坏死梭杆菌阳性检出率80%，没有添加热变 形小牛血清的培养基上坏死梭杆菌阳性检出率20% ;由此证实热变形小牛血清在厌氧缸内 对需氧菌有较好的抑制效果，且能通过加速无氧环境而促进厌氧菌生长。
[0012] 缬氨酸为厌氧菌营养剂；L-高精氨酸为激活剂，促进缬氨酸的吸收。
[0013] 石菖蒲(学名：Ac〇rus gramineus)属菖蒲科，为禾草状的多年生草本植物，药用 部分为根茎部位。现代医学研宄表明，石菖蒲含α-细辛醚等挥发油及糖类、有机酸、氨基 酸、无机元素等成分，有消肿止痛、化痰开窍、痈疽疥癣等作用，石菖蒲水提液是良好的营养 强化剂，石菖蒲水浸剂（1:3)，在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、星形奴卡菌等皮肤真 菌均有不同程度的抑制作用。有报告指出，石菖蒲煎剂有杀死腹水癌细胞的作用。Masuda T等研宄发现石菖蒲中的α-细辛醚对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等均有抑制 作用。实验证实，200g/L浓度下的石菖蒲水煮液对于厌氧菌并无杀灭作用，以厌氧培养基为 对照，以厌氧培养基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液为实验组，接种坏死梭杆菌菌株，96h 的阳性检出率分别为50%和60%，二者比较无明显差异（P>0. 05)。
[0014] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、坏死梭杆菌分离率高的特点。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0016] 实施例1，配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;葡萄糖5. Og ;酵 母粉5. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;牛胆盐1.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ; γ -氨基丁 酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清100mL ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨； 葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸溶于蒸馏水 中，混匀，121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水 定容 到1000 ml后分装。
[0017] 所述的无菌热变形小牛血清制备方法为取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。其他实施例中的无菌热 变形小牛血清制备方法与实施例1中相同。
[0018] 实施例2,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;葡萄糖10.0 g ;酵 母粉8. Og ;氯化钠 5. Og ;琼脂15. Og ;牛胆盐0. 5g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ; γ -氨基 丁酸〇. 3g ;缴氨酸0.1 g ;无菌热变形小牛血清50ml ;蒸馏水加至1000 ml。制备方法：称取胰 酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸； 缬氨酸，溶于蒸馏水中，混匀，121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混 匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0019] 实施例3,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;葡萄糖8. Og ;酵 母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐0. 75g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ; γ -氨 基丁酸0. 5g ;缴氨酸0. 5g ;L-高精氨酸0. 05g ;无菌热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至 1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙 酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸；缬氨酸；L-高精氨酸，溶于蒸馏水中，混匀，121°C，灭菌15min， 冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。
[0020] 实施例4,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;葡萄糖5. Og ;酵母 粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐0. 75g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ; γ -氨基丁酸 0. 5g ;无菌热变形小牛血清80ml ;200g / L石菖蒲水提液200ml ;蒸馏水加至1000ml。制备 方法：（1)取40g石菖蒲加水煮沸30min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖 蒲水煮液200ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙 酸二钾镁盐；γ -氨基丁酸，溶于蒸馏水中，与步骤（1)所得的石菖蒲提取液混匀，121°C灭 菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0021] 实施例5,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;葡萄糖8. Og ;酵母 粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐0. 5g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ; γ -氨基丁酸 〇. 3g ;缬氨酸0. 5g ;无菌热变形小牛血清80ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液250ml ;蒸馏 水加至1000 ml。制备方法：（1)取50g石菖蒲加水煮沸45min，过滤，取滤液，调整体积到浓 度为200g/L，得石菖蒲水煮液250ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂； 牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ -氨基丁酸；缬氨酸，溶于蒸馏水中，与步骤（1)所得的 石菖蒲提取液混匀，121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸 馏水定容到1000 ml后分装。
[0022] 实施例6,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;葡萄糖10.0 g ;酵 母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐1.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ; γ -氨基丁 酸〇. Ig ;缬氨酸〇. 3g ;L-高精氨酸0.0 lg ;无菌热变形小牛血清100mL ;浓度200g / L的 石菖蒲水提液300ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮 沸60min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取胰酪蛋 白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ -氨基丁酸；缬氨 酸；L-高精氨酸，溶于蒸馏水中，与步骤（1)所得的石菖蒲提取液混匀，121°C灭菌15min，冷 却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0023] 所述石菖蒲水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。
[0024] 本发明所得厌氧培养基用于咽喉分泌物标本坏死梭杆菌培养，具有检出可靠、分 离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。
[0025] 1对象与方法。
[0026] I. 1培养基制备：实验组共设6组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施 例3方案组、实施例4方案组、实施例5方案组、实施例6方案组。对照组为普通⑶C厌氧 菌琼脂，其配方为：胰酪蛋白胨15g / L、大豆蛋白胨5g / L、酵母粉5g/L;L-胱氨酸盐酸盐 0.4g/L;琼脂15g / L、氯化钠5g / L、无菌维生素 K 0.01g/L、无菌氯化血红素0.005g/L、 无菌绵羊血50ml / L。
[0027] I. 2标本采集培养方法：高度疑似急性咽炎综合征的患者27例，其临床表现以口 咽感染而引起的持续高热和脓肿的扩散转移为特征，存在脓肿或坏死性病灶，并有恶臭气 味。用无菌拭子采集咽部病灶分泌物后取出，分别接种于各实验组和对照组培养基。在37°C 下，厌氧缸培养，分别于48h、96h挑取细小菌落进行菌属鉴定。各样本编号送检PCR做分子 生物学鉴定。
[0028] 1.3检出阳性标准：取出培养皿，依据《临床微生物学诊断与图解》，观察培养基上 菌落生长状况，阳性菌体呈杆状，无芽孢，无荚膜，菌落半透明或不透明，表面不光滑，边缘 呈扇样或蚀状，中间凸起。最终结果金标准为PCR鉴定。
[0029] 2结果：27份急性咽炎综合症患者咽喉分泌物标本，经PCR最后鉴定为坏死梭杆菌 阳性的为25例。48h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养48小时后，各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有极明 显差异（Ρ〈〇· 005)。
[0030] 96h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养96小时后，对照组（CDC)的阳性检出率有所提高，但是各实施 例组与对照组阳性检出率比较，均具有明显差异（P〈〇. 05)。各实施例组与PCR检测结果比 较，阳性检出率差异无统计学意义（P>〇. 05)，而对照组阳性检出率则明显低于PCR检测结 果（Ρ〈0· 001)。
[0031] 以上结果表明，标本经过本发明实施例培养基干燥缸内培养后，48h时已经出现明 显增长，分离率明显高于现有的培养基（CDC)，96小时后，各实施例与对照组阳性检出率差 异缩小，但区别仍具有统计学意义，各实施例真阳性检出率与PCR检测比较，已无统计学差 异，而普通CDC厌氧菌琼脂培养基厌氧缸内培养营养不足，杂菌繁殖迅速，坏死梭杆菌生长 缓慢，虽然96h时出现明显菌株阳性生长，但阳性检出率仍明显低于PCR检测结果，起不了 诊断作用。本发明培养基用于在干燥缸环境下培养坏死梭杆菌，检出可靠，分离率高，从而 缩短确诊时间。
【主权项】
1. 一种厌氧培养基，其特征在于配制1000 ml培养基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.Og; 葡萄糖2. 0~5.Og; 酵母粉5. 0~10.Og; 氯化钠5.Og; 琼脂 15. 0 ~20.Og; 牛胆盐〇? 5~I.Og; 乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g;y-氨基丁酸〇. 1~〇. 5g; 结页氨酸〇? 1~〇? 5g; L-高精氨酸〇? 1~〇? 5g; 无菌热变形小牛血清50~100mL; 蒸馏水加至1000 ml; 其中所述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
【专利摘要】本发明公开了一种厌氧培养基及其制备方法。属于检验微生物培养领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸；缬氨酸；L-高精氨酸；无菌热变形小牛血清，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，坏死梭杆菌分离率高的特点。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04
【公开号】CN104894215
【申请号】CN201510343131
【发明人】刘名霞
【申请人】刘名霞
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及一种厌氧培养基。
【背景技术】
[0002] 微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，专性厌氧菌必须在 无氧的环境中才能生长，厌氧培养基是通过物理、化学等方法营造培养基的无氧环境 以提供专性厌氧菌生长所需要的营养物质和无氧环境而设计的培养基。坏死梭杆菌 (Fusobacterium necrophorum, Fn)为梭杆菌属、革兰氏染色阴性、严格厌氧的细菌。致病 性Fn菌株产生多种独立因子，如白细胞毒素（leukotoxin, Lkt)、溶血素（hemolysin)、血凝 素（hemagglutinin)和内毒素（endotoxin)等，能引发多重哺乳动物(包括人类）和禽类的 坏死杆菌病（necrobacillosis)。坏死梭杆菌是各种化脓坏死性感染疾病的主要和次要病 原，广泛存在于动物和人的口腔、呼吸道和胃肠道等天然腔道内，以及化脓性坏死病灶和梗 死的组织器官内，属条件致病菌。Fn -般通过有创伤的皮肤或粘膜侵入机体，与其他细菌 如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌、化脓性棒状杆菌等化脓类细菌联合感染宿主引起坏死杆菌 病，该病在动物中常见且危害严重，人类主要引起急性咽炎综合症（Lemierre' s)、手部皮 肤、口腔和肺部脓肿。这些疾病典型的症状是存在脓肿或坏死性病灶，并有恶臭气味。此 外，有的还伴随菌血症的发生对宿主生命安全造成严重威胁，临床症状与链球菌性咽炎、细 菌性肺炎症状类似，易误诊。因此作为确诊唯一依据的临床细菌检查的正确与快速鉴定极 为重要。
[0003] 目前，坏死梭杆菌检验手段主要是采用以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)为基础的分子生物学检测方法，该方法需要对样本进行DNA提取和PCR引 物设计，且需要配备PCR相关仪器设备，成本昂贵，操作复杂，基层实验室难以实现。实验室 常用CDC厌氧菌琼脂培养坏死梭杆菌，由于基层医院检验科大多缺乏无氧检验设备，因此 大多用"厌氧缸培养法"，所谓的厌氧缸是普通的干燥缸，接种好标本的平板或液体培养基 试管放入干燥缸内培养，通过物理化学的方法耗尽缸内氧气，造成厌氧环境。厌氧缸法的氧 气耗尽需要时间，而坏死梭杆菌为专性厌氧杆菌，因此该种培养技术存在以下缺陷：①厌氧 缸内CDC厌氧菌琼脂培养基上的坏死梭杆菌生长缓慢，阳性检出率低，一周左右方可较准 确的作出鉴定；②由于非绝对无氧条件，因此咽喉分泌物标本内需氧菌和兼性厌氧菌具有 生存条件，培养基分离能力差。
【发明内容】
[0004] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于坏死梭杆菌生长 的厌氧培养基。
[0005] 本发明解决其技术问题的技术方案是：一种厌氧培养基，其特征在于，配制 1000ml培养基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.0 g; 葡萄糖5. O~10.0 g ; 酵母粉5. 0~10.0 g ; 氯化钠 5. Og ; 琼脂 15. 0 ~20.0 g ; 牛胆盐〇· 5~1.0 g ; 乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g ; γ-氨基丁酸〇. 1~〇. 5g ; 结页氨酸〇· 1~〇· 5g ; L-高精氨酸0. 01~0. 05g ; 无菌热变形小牛血清50~100mL ; 蒸馏水加至1000ml。
[0006] 上述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
[0007] 上述培养基的制备方法为：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛 胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸；缬氨酸；L-高精氨酸溶于蒸馏水中，混匀， 121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml 后分装。
[0008] 所述的胰酪蛋白胨含有多种糖类、氨基酸、维生素和微量元素为坏死梭杆菌生长 提供能量；葡萄糖提供碳源，酵母粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因子、 微量元素等营养成分，促进坏死梭杆菌的繁殖和生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂为 培养基的凝固剂；γ -氨基丁酸为营养增强剂，促进坏死梭杆菌生长。
[0009] 乙二胺四乙酸二钾镁盐提供坏死梭杆菌生长所需的无机盐，且该浓度下的乙二胺 四乙酸二钾镁盐会产生下述抑菌灭菌作用：①乙二胺四乙酸二钾镁盐置换替代革兰氏阳性 菌中的核糖核酸镁盐，导致其不能生成镁盐-蛋白质复合物（ribonucleoprotein，RNP)，核 酸编码的遗传信息流向活性蛋白质的过程受阻，产生针对于革兰氏阳性菌杀灭作用；②对 于等电点较高的革兰氏阳性菌，乙二胺四乙酸二钾镁盐通过电性络合作用附着于细菌细胞 壁，导致细胞结构变形，进行发挥抑菌灭菌作用。而梭杆菌菌属细胞壁上的外膜蛋白OMP和 fadA黏附蛋白使得坏死梭杆菌的细胞壁区域等电点与乙二胺四乙酸二钾镁盐不匹配，造成 电性络合作用失效，且由于其缺乏核糖核酸镁盐，因此抗菌失效。通过实验分别将咽喉分泌 物标本中常见口腔 细菌化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌、破伤风杆菌、坏死梭杆菌菌株接种到 添加 3g/L的乙二胺四乙酸二钾镁盐⑶C厌氧选择培养基上，对照组为普通⑶C厌氧菌选择 培养基，于37°C、厌氧罐内培养48h后观察，添加乙二胺四乙酸二钾盐的培养基上发现有坏 死梭杆菌菌落，未发现化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌菌落、破伤风杆菌菌落，对 照组培养基上发现化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌、破伤风杆菌和坏死梭杆菌菌 落，由此证实乙二胺四乙酸二钾盐对化脓链球菌、肺炎链球菌、凝固酶葡萄球菌、破伤风杆 菌有较好的灭菌作用，且对于坏死梭杆菌无明显影响。
[0010] 为了取得更好的灭杂菌作用，配方中加入了牛胆盐，牛胆盐可以抑制革兰氏阳性 菌生长，但为了保持适度的电解质平衡，且其作用仅仅是对于乙二胺四乙酸二钾镁盐的灭 菌增效，因此用量浓度比较小。
[0011] 热变形小牛血清具有选择性的抗菌效果，其热变形方法为：取无菌小牛血清80°C 下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。热变 形小牛血清抗菌性质针对需氧菌，一方面改变需氧菌细胞壁结构，造成通透性增加而死亡， 另一方面可以降低培养基的氧化还原电势，促进无氧环境而加速需氧菌死亡，而该种抗菌 作用仅针对于需氧菌，对于厌氧菌则无效。通过实验将同一大肠杆菌菌株和坏死梭杆菌菌 株分别接种到CDC选择培养基和配方中添加了 80ml/L的热变形小牛血清的优化CDC选择 培养基上，于密封干燥缸环境37°C下培养，24h、48h鉴定，24h时添加热变形小牛血清大肠 杆菌阳性检出率为40%，没有添加热变形小牛血清的培养基上大肠杆菌阳性检出率为70% ; 48h检测结果为添加热变形小牛血清的培养基坏死梭杆菌阳性检出率80%，没有添加热变 形小牛血清的培养基上坏死梭杆菌阳性检出率20% ;由此证实热变形小牛血清在厌氧缸内 对需氧菌有较好的抑制效果，且能通过加速无氧环境而促进厌氧菌生长。
[0012] 缬氨酸为厌氧菌营养剂；L-高精氨酸为激活剂，促进缬氨酸的吸收。
[0013] 石菖蒲(学名：Ac〇rus gramineus)属菖蒲科，为禾草状的多年生草本植物，药用 部分为根茎部位。现代医学研宄表明，石菖蒲含α-细辛醚等挥发油及糖类、有机酸、氨基 酸、无机元素等成分，有消肿止痛、化痰开窍、痈疽疥癣等作用，石菖蒲水提液是良好的营养 强化剂，石菖蒲水浸剂（1:3)，在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、星形奴卡菌等皮肤真 菌均有不同程度的抑制作用。有报告指出，石菖蒲煎剂有杀死腹水癌细胞的作用。Masuda T等研宄发现石菖蒲中的α-细辛醚对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等均有抑制 作用。实验证实，200g/L浓度下的石菖蒲水煮液对于厌氧菌并无杀灭作用，以厌氧培养基为 对照，以厌氧培养基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液为实验组，接种坏死梭杆菌菌株，96h 的阳性检出率分别为50%和60%，二者比较无明显差异（P>0. 05)。
[0014] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、坏死梭杆菌分离率高的特点。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0016] 实施例1，配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;葡萄糖5. Og ;酵 母粉5. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂15. Og ;牛胆盐1.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ; γ -氨基丁 酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清100mL ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨； 葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸溶于蒸馏水 中，混匀，121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水 定容 到1000 ml后分装。
[0017] 所述的无菌热变形小牛血清制备方法为取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。其他实施例中的无菌热 变形小牛血清制备方法与实施例1中相同。
[0018] 实施例2,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;葡萄糖10.0 g ;酵 母粉8. Og ;氯化钠 5. Og ;琼脂15. Og ;牛胆盐0. 5g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2. 5g ; γ -氨基 丁酸〇. 3g ;缴氨酸0.1 g ;无菌热变形小牛血清50ml ;蒸馏水加至1000 ml。制备方法：称取胰 酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸； 缬氨酸，溶于蒸馏水中，混匀，121 °C，灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混 匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0019] 实施例3,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;葡萄糖8. Og ;酵 母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐0. 75g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ; γ -氨 基丁酸0. 5g ;缴氨酸0. 5g ;L-高精氨酸0. 05g ;无菌热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至 1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙 酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸；缬氨酸；L-高精氨酸，溶于蒸馏水中，混匀，121°C，灭菌15min， 冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000ml后分装。
[0020] 实施例4,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;葡萄糖5. Og ;酵母 粉8. Og ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐0. 75g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ; γ -氨基丁酸 0. 5g ;无菌热变形小牛血清80ml ;200g / L石菖蒲水提液200ml ;蒸馏水加至1000ml。制备 方法：（1)取40g石菖蒲加水煮沸30min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖 蒲水煮液200ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙 酸二钾镁盐；γ -氨基丁酸，溶于蒸馏水中，与步骤（1)所得的石菖蒲提取液混匀，121°C灭 菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0021] 实施例5,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5. Og ;葡萄糖8. Og ;酵母 粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐0. 5g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐2g ; γ -氨基丁酸 〇. 3g ;缬氨酸0. 5g ;无菌热变形小牛血清80ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液250ml ;蒸馏 水加至1000 ml。制备方法：（1)取50g石菖蒲加水煮沸45min，过滤，取滤液，调整体积到浓 度为200g/L，得石菖蒲水煮液250ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂； 牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ -氨基丁酸；缬氨酸，溶于蒸馏水中，与步骤（1)所得的 石菖蒲提取液混匀，121°C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸 馏水定容到1000 ml后分装。
[0022] 实施例6,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;葡萄糖10.0 g ;酵 母粉10.0 g ;氯化钠5. Og ;琼脂20.0 g ;牛胆盐1.0 g ;乙二胺四乙酸二钾镁盐3g ; γ -氨基丁 酸〇. Ig ;缬氨酸〇. 3g ;L-高精氨酸0.0 lg ;无菌热变形小牛血清100mL ;浓度200g / L的 石菖蒲水提液300ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮 沸60min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取胰酪蛋 白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ -氨基丁酸；缬氨 酸；L-高精氨酸，溶于蒸馏水中，与步骤（1)所得的石菖蒲提取液混匀，121°C灭菌15min，冷 却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0023] 所述石菖蒲水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。
[0024] 本发明所得厌氧培养基用于咽喉分泌物标本坏死梭杆菌培养，具有检出可靠、分 离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。
[0025] 1对象与方法。
[0026] I. 1培养基制备：实验组共设6组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施 例3方案组、实施例4方案组、实施例5方案组、实施例6方案组。对照组为普通⑶C厌氧 菌琼脂，其配方为：胰酪蛋白胨15g / L、大豆蛋白胨5g / L、酵母粉5g/L;L-胱氨酸盐酸盐 0.4g/L;琼脂15g / L、氯化钠5g / L、无菌维生素 K 0.01g/L、无菌氯化血红素0.005g/L、 无菌绵羊血50ml / L。
[0027] I. 2标本采集培养方法：高度疑似急性咽炎综合征的患者27例，其临床表现以口 咽感染而引起的持续高热和脓肿的扩散转移为特征，存在脓肿或坏死性病灶，并有恶臭气 味。用无菌拭子采集咽部病灶分泌物后取出，分别接种于各实验组和对照组培养基。在37°C 下，厌氧缸培养，分别于48h、96h挑取细小菌落进行菌属鉴定。各样本编号送检PCR做分子 生物学鉴定。
[0028] 1.3检出阳性标准：取出培养皿，依据《临床微生物学诊断与图解》，观察培养基上 菌落生长状况，阳性菌体呈杆状，无芽孢，无荚膜，菌落半透明或不透明，表面不光滑，边缘 呈扇样或蚀状，中间凸起。最终结果金标准为PCR鉴定。
[0029] 2结果：27份急性咽炎综合症患者咽喉分泌物标本，经PCR最后鉴定为坏死梭杆菌 阳性的为25例。48h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养48小时后，各实施例组与对照组阳性检出率比较均具有极明 显差异（Ρ〈〇· 005)。
[0030] 96h各组检出阳性、假阳性、阴性、假阴性菌株例数见下表，
上述结果可以看出，培养96小时后，对照组（CDC)的阳性检出率有所提高，但是各实施 例组与对照组阳性检出率比较，均具有明显差异（P〈〇. 05)。各实施例组与PCR检测结果比 较，阳性检出率差异无统计学意义（P>〇. 05)，而对照组阳性检出率则明显低于PCR检测结 果（Ρ〈0· 001)。
[0031] 以上结果表明，标本经过本发明实施例培养基干燥缸内培养后，48h时已经出现明 显增长，分离率明显高于现有的培养基（CDC)，96小时后，各实施例与对照组阳性检出率差 异缩小，但区别仍具有统计学意义，各实施例真阳性检出率与PCR检测比较，已无统计学差 异，而普通CDC厌氧菌琼脂培养基厌氧缸内培养营养不足，杂菌繁殖迅速，坏死梭杆菌生长 缓慢，虽然96h时出现明显菌株阳性生长，但阳性检出率仍明显低于PCR检测结果，起不了 诊断作用。本发明培养基用于在干燥缸环境下培养坏死梭杆菌，检出可靠，分离率高，从而 缩短确诊时间。
【主权项】
1. 一种厌氧培养基，其特征在于配制1000 ml培养基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.Og; 葡萄糖2. 0~5.Og; 酵母粉5. 0~10.Og; 氯化钠5.Og; 琼脂 15. 0 ~20.Og; 牛胆盐〇? 5~I.Og; 乙二胺四乙酸二钾镁盐2~3g;y-氨基丁酸〇. 1~〇. 5g; 结页氨酸〇? 1~〇? 5g; L-高精氨酸〇? 1~〇? 5g; 无菌热变形小牛血清50~100mL; 蒸馏水加至1000 ml; 其中所述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
【专利摘要】本发明公开了一种厌氧培养基及其制备方法。属于检验微生物培养领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；牛胆盐；乙二胺四乙酸二钾镁盐；γ-氨基丁酸；缬氨酸；L-高精氨酸；无菌热变形小牛血清，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，坏死梭杆菌分离率高的特点。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04
【公开号】CN104894215
【申请号】CN201510343131
【发明人】刘名霞
【申请人】刘名霞
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
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