适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基的制作方法
适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检验领域，具体涉及一种脆弱类杆菌培养基。
【背景技术】
[0002] 脆弱类杆菌（Bacterooides Fragilis，BF)为革兰阴性短杆菌有荚膜，无芽胞，部 分有菌毛，专性厌氧。BF是人体正常菌群的组成部分，也是临床上重要的条件致病菌，可引 起人体很多部位感染，感染症状遍及临床各科，检出率高，占临床厌氧菌分离株的25%、类杆 菌分离株的50%，其中腹泻患者BF分离率达9. 2%~26. 8%。
[0003] BF的临床测定主要为PCR和细胞培养，PCR的敏感度高，5小时既可以获得结果， 具有快速和敏感的特性，但是存在以下缺陷：①粪便标本中含有PCR抑制物，易造成假阴性 结果；②需要复杂的实验条件，费用较高。而细胞培养是BF目前最可靠的检验方法，但BF 的专性厌氧和苛养性质，导致其培养时间较长，在绝对无氧的情况下，使用2d开始有个别 样本开始生长，7d无阳性菌落出现方能达到阴性检验标准。由于鉴定时间长，所以上述的 检验很难指导临床治疗，延误时机。目前BF培养的使用的培养基多为胆汁七叶苷（BBE)琼 月旨，其成分含有胆汁，胆汁用以抑制对之敏感的厌氧菌，只有耐胆汁的脆弱类杆菌和可变梭 杆菌、死亡梭杆菌不被抑制，从而起到选择性培养的目的。但是BBE培养基存在下述缺陷： ①不能抑制可变梭杆菌、死亡梭杆菌的生长；②对于需氧菌和兼性厌氧菌的灭杀效果不了， 因此要加入庆大霉素 l〇〇mg/L，但庆大霉素对于BF同样产生微弱的抑制作业，导致其生长 缓慢；③如果不加入庆大霉素，就需要严格的无氧环境，由于基层医院检验科大多缺乏绝对 无氧检验设备，因此大多用"厌氧缸培养法"，所谓的厌氧缸即干燥缸，通过物理化学的方法 耗尽缸内氧气，造成厌氧环境。厌氧缸法的氧气耗尽需要时间，影响了专性厌氧杆菌BF的 生长和分呙。
[0004] 故寻找一种新的培养基，能够在"厌氧缸培养"的环境下快速检测，对于基层临床 医院尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于粪便标本的脆弱 类杆菌生长的选择培养基。
[0006] 本发明解决其技术问题的技术方案是：适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，其特 征在于，每升培养基中含有：胰酪蛋白胨8g ;葡萄糖5g ;酵母粉8g ;氯化钠5g ;琼脂15g ;升 麻甙2. 5g ;猪胆粉20g ;缬氨酸0. 3g ;无菌热变形小牛血清50ml ;蒸馏水加至1000m。
[0007] 上述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
[0008] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、脆弱类杆菌分离率高的特点。
[0009] 1、所述的胰酪蛋白胨含有多种糖类、氨基酸、维生素和微量元素为脆弱类杆菌生 长提供能量，葡萄糖提供碳源，酵母粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因 子、微量元素等营养成分，促进脆弱类杆菌的繁殖和生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂 为培养基的凝固剂。
[0010] 2、缬氨酸为厌氧菌营养剂；L-高精氨酸为激活剂，促进缬氨酸的吸收；γ -氨基丁 酸为营养增强剂，促进脆弱类杆菌生长。
[0011] 3、猪胆粉和升麻戒（Cimicifugoside)的使用：猪胆粉中的胆汁成分用以抑制对 之敏感的厌氧菌，而升麻甙用以分离脆弱类杆菌和可变梭杆菌、死亡梭杆菌，其分离作用在 于可以选择性抑制厌氧梭杆菌属核苷透膜转运，作用途径为梭杆菌属细胞壁上的外膜蛋白 OMP和fadA黏附蛋白，而由于脆弱类杆菌无上述特异性蛋白，因此升麻甙对于脆弱类杆菌 无杀灭作用。基础实验证实：将脆弱类杆菌和可变梭杆菌、死亡梭杆菌菌株分别接种到含有 3g/L升麻甙的胆汁琼脂培养基和普通胆汁琼脂培养基，于37°C厌氧培养7d，脆弱类杆菌阳 性检出率100%，而可变梭杆菌、死亡梭杆菌菌株阳性检出率为0%。由此证实，升麻甙对于可 变梭杆菌、死亡梭杆菌具有较好的灭菌作用，且对于脆弱类杆菌无明显影响。
[0012] 4、热变形小牛血清具有选择性的抗菌效果，其热变形方法为：取无菌小牛血清 80 °C下加热IOmin，在45 °C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。普 通的无菌小牛血清仅仅起到营养基质的作用，并无选择性的抗菌效果，而热变形小牛血清 抗菌性质针对需氧菌，一方面改变需氧菌细胞壁结构，造成通透性增加而死亡，另一方面可 以降低培养基的氧化还原电势，促进无氧环境而加速需氧菌死亡，而该种抗菌作用仅针对 于需氧菌，对于厌氧菌则无效。通过实验将同一需氧的大肠杆菌菌株和厌氧的梭杆菌菌株 分别接种到厌氧培养基和配方中添加了 80ml/L的热变形小牛血清的优化厌氧培养基上， 于密封干燥缸环境37°C下培养，24h、48h鉴定，24h时添加热变形小牛血清大肠杆菌阳性检 出率为50%，没有添加热变形小牛血清的培养基上大肠杆菌阳性检出率为80% ;48h检测结 果为添加热变形小牛血清的培养基梭杆菌阳性检出率70%，没有添加热变形小牛血清的培 养基上梭杆菌阳性检出率20% ;由此证实热变形小牛血清在厌氧缸内对需氧菌有较好的抑 制效果，且能通过加速无氧环境而促进厌氧菌生长。
[0013] 5、石菖蒲（Acorus gramineus)属菖蒲科，为禾草状的多年生草本植物，药用部分 为根茎部位。现代医学研宄表明，石菖蒲含α-细辛醚等挥发油及糖类、有机酸、氨基酸、无 机元素等成分，有消肿止痛、化痰开窍、痈疽疥癣等作用，石菖蒲水提液是良好的营养强化 剂，石菖蒲水浸剂（1:3)，在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、星形奴卡菌等皮肤真菌均 有不同程度的抑制作用。有报告指出，石菖蒲煎剂有杀死腹水癌细胞的作用。Masuda T等 研宄发现石菖蒲中的α -细辛醚对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等均有抑制作 用。实验证实，200g/L浓度下的石菖蒲水煮液对于厌氧菌并无杀灭作用，以厌氧培养基为对 照，以厌氧培养基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液为实验组，接种脆弱类杆菌菌株，96h的 阳性检出率分别为70%和60%，二者比较无明显差异（P>0. 05)。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 实施例1，配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨IOg ;葡萄糖2g ;酵母粉 5g ;氯化钠5g ;琼脂15g ;升麻戒3g ;猪胆粉20g ;缴氨酸0.1 g ;无菌小牛血清100mL ;蒸馏水 加至1000ml。制备方法：称取胰酪 蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉； 缬氨酸，用蒸馏水溶解、混匀，121°C下灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌小牛血清混匀，灭 菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0016] 本实施例中的无菌小牛血清仅仅起到营养基质的作用，并无选择性的抗菌效果。
[0017] 实施例2,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8g ;葡萄糖5g ;酵母 粉8g ;氯化钠5g ;琼脂15g ;升麻戒2. 5g ;猪胆粉20g ;缴氨酸0. 3g ;无菌热变形小牛血清 50ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升 麻甙；猪胆粉；缬氨酸；用蒸馏水溶解、混匀，121°C下灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热 变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0018] 所述的无菌热变形小牛血清制备方法为取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。其他实施例中的无菌热 变形小牛血清制备方法与实施例1中相同。
[0019] 实施例3,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨IOg ;葡萄糖3g ;酵母 粉IOg ;氯化钠5g ;琼脂20g ;升麻戒3g ;猪胆粉15g ;缴氨酸0. 5g ;L-高精氨酸0.1 g ;无菌 热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉； 氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸；L-高精氨酸；用蒸馏水溶解、混匀，121°C下灭菌 15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0020] 实施例4,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5g ;葡萄糖5g ;酵母粉 IOg ;氯化钠5g ;琼脂20g ;升麻戒2g ;猪胆粉20g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精氨酸0. 3g ;无菌热 变形小牛血清80ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液250ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法： (1)取50g石菖蒲加水煮沸45min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮 液250ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸； L-高精氨酸，用蒸馏水溶解混匀，然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液中混匀121°C灭菌 15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0021] 实施例5,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨Sg ;葡萄糖3g ;酵母粉 IOg ;氯化钠5g ;琼脂20g ;升麻戒3g ;猪胆粉15g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精氨酸0. 5g ; γ-氨基 丁酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清100mL ;浓度200g / L的石菖蒲水提液300ml ;蒸馏水加至 1000ml。制备方法：制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮沸60min，过滤，取滤液，调整体积 到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠； 琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸；L-高精氨酸；γ -氨基丁酸蒸馏水溶解、混匀，溶于步骤所 得的石菖蒲提取液中混匀，121 °C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0022] 所述石菖蒲水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。
[0023] 本发明所得脆弱类杆菌培养基用于粪便标本，具有检出可靠、脆弱类杆菌分离率 高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。
[0024] 1对象与方法。
[0025] I. 1培养基制备：实验组共设5组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施 例3方案组、实施例4方案组、实施例5方案组。对照组为购自青岛海博生物技术有限公司 的胆汁七叶苷（BBE)琼脂，其中胆汁的浓度为20g/L、七叶苷浓度为Ig / L。
[0026] 1. 2标本采集培养方法：119例腹泻患儿(年龄3~12岁)，采集粪便黏液后接种于各 实验组和对照组培养基。在37°C下，厌氧缸(普通干燥缸)培养，分别于2d挑取细小菌落进 行菌属鉴定，如无疑似菌落出现则培养至7d时进行菌属鉴定。
[0027] 1.3检出阳性标准：依据《临床微生物学诊断与图解》，外观形态为菌落灰白色、圆 形微凸，且表面光滑，边缘整齐；革兰氏染色阴性；D引哚反应（-);触酶反应（+ )。
[0028] 2结果：19例腹泻患儿粪便标本培养2d和7d阳性检出情况见下表，
以BBE培养基7d培养结果为阳性检出率对照标准。上述结果可以看出，培养2d后，对 照组的阳性检出率明显低于标准值（P〈〇. 001)，表明由于厌氧缸需要氧气耗尽过程，48h内 并不能提供一个很好的无氧生长环境，杂菌繁殖迅速，脆弱类杆菌生长缓慢，因此2d时不 能阳性检出率低，需要7d才可以达到检出目的。而各实施例组培养2d后，阳性检出率与对 照组比较，均具有明显差异（P〈〇. 05)，与标准值差异无统计学意义（P>0. 05)，既各实施例 组2d培养结果具有诊断价值。
[0029] 本发明培养基用于在干燥缸环境下培养脆弱类杆菌，检出可靠，分离率高，从而缩 短确诊时间。
【主权项】
1. 适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，其特征在于，每升培养基中含有：胰酪蛋白胨 8g;葡萄糖5g;酵母粉8g;氯化钠5g;琼脂15g;升麻戒2. 5g;猪胆粉20g;缴氨酸0. 3g;无 菌热变形小牛血清50ml;蒸馏水加至1000m。2. 根据权利要求1所述的适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，其特征在于，所述的无 菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰 蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
【专利摘要】本发明公开了一种适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，属于微生物检验领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸；无菌热变形小牛血清，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，脆弱类杆菌分离率高的特点。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04
【公开号】CN104894216
【申请号】CN201510343231
【发明人】钟伟萍
【申请人】钟伟萍
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检验领域，具体涉及一种脆弱类杆菌培养基。
【背景技术】
[0002] 脆弱类杆菌（Bacterooides Fragilis，BF)为革兰阴性短杆菌有荚膜，无芽胞，部 分有菌毛，专性厌氧。BF是人体正常菌群的组成部分，也是临床上重要的条件致病菌，可引 起人体很多部位感染，感染症状遍及临床各科，检出率高，占临床厌氧菌分离株的25%、类杆 菌分离株的50%，其中腹泻患者BF分离率达9. 2%~26. 8%。
[0003] BF的临床测定主要为PCR和细胞培养，PCR的敏感度高，5小时既可以获得结果， 具有快速和敏感的特性，但是存在以下缺陷：①粪便标本中含有PCR抑制物，易造成假阴性 结果；②需要复杂的实验条件，费用较高。而细胞培养是BF目前最可靠的检验方法，但BF 的专性厌氧和苛养性质，导致其培养时间较长，在绝对无氧的情况下，使用2d开始有个别 样本开始生长，7d无阳性菌落出现方能达到阴性检验标准。由于鉴定时间长，所以上述的 检验很难指导临床治疗，延误时机。目前BF培养的使用的培养基多为胆汁七叶苷（BBE)琼 月旨，其成分含有胆汁，胆汁用以抑制对之敏感的厌氧菌，只有耐胆汁的脆弱类杆菌和可变梭 杆菌、死亡梭杆菌不被抑制，从而起到选择性培养的目的。但是BBE培养基存在下述缺陷： ①不能抑制可变梭杆菌、死亡梭杆菌的生长；②对于需氧菌和兼性厌氧菌的灭杀效果不了， 因此要加入庆大霉素 l〇〇mg/L，但庆大霉素对于BF同样产生微弱的抑制作业，导致其生长 缓慢；③如果不加入庆大霉素，就需要严格的无氧环境，由于基层医院检验科大多缺乏绝对 无氧检验设备，因此大多用"厌氧缸培养法"，所谓的厌氧缸即干燥缸，通过物理化学的方法 耗尽缸内氧气，造成厌氧环境。厌氧缸法的氧气耗尽需要时间，影响了专性厌氧杆菌BF的 生长和分呙。
[0004] 故寻找一种新的培养基，能够在"厌氧缸培养"的环境下快速检测，对于基层临床 医院尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种适合于粪便标本的脆弱 类杆菌生长的选择培养基。
[0006] 本发明解决其技术问题的技术方案是：适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，其特 征在于，每升培养基中含有：胰酪蛋白胨8g ;葡萄糖5g ;酵母粉8g ;氯化钠5g ;琼脂15g ;升 麻甙2. 5g ;猪胆粉20g ;缬氨酸0. 3g ;无菌热变形小牛血清50ml ;蒸馏水加至1000m。
[0007] 上述的无菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
[0008] 本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、脆弱类杆菌分离率高的特点。
[0009] 1、所述的胰酪蛋白胨含有多种糖类、氨基酸、维生素和微量元素为脆弱类杆菌生 长提供能量，葡萄糖提供碳源，酵母粉富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因 子、微量元素等营养成分，促进脆弱类杆菌的繁殖和生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂 为培养基的凝固剂。
[0010] 2、缬氨酸为厌氧菌营养剂；L-高精氨酸为激活剂，促进缬氨酸的吸收；γ -氨基丁 酸为营养增强剂，促进脆弱类杆菌生长。
[0011] 3、猪胆粉和升麻戒（Cimicifugoside)的使用：猪胆粉中的胆汁成分用以抑制对 之敏感的厌氧菌，而升麻甙用以分离脆弱类杆菌和可变梭杆菌、死亡梭杆菌，其分离作用在 于可以选择性抑制厌氧梭杆菌属核苷透膜转运，作用途径为梭杆菌属细胞壁上的外膜蛋白 OMP和fadA黏附蛋白，而由于脆弱类杆菌无上述特异性蛋白，因此升麻甙对于脆弱类杆菌 无杀灭作用。基础实验证实：将脆弱类杆菌和可变梭杆菌、死亡梭杆菌菌株分别接种到含有 3g/L升麻甙的胆汁琼脂培养基和普通胆汁琼脂培养基，于37°C厌氧培养7d，脆弱类杆菌阳 性检出率100%，而可变梭杆菌、死亡梭杆菌菌株阳性检出率为0%。由此证实，升麻甙对于可 变梭杆菌、死亡梭杆菌具有较好的灭菌作用，且对于脆弱类杆菌无明显影响。
[0012] 4、热变形小牛血清具有选择性的抗菌效果，其热变形方法为：取无菌小牛血清 80 °C下加热IOmin，在45 °C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。普 通的无菌小牛血清仅仅起到营养基质的作用，并无选择性的抗菌效果，而热变形小牛血清 抗菌性质针对需氧菌，一方面改变需氧菌细胞壁结构，造成通透性增加而死亡，另一方面可 以降低培养基的氧化还原电势，促进无氧环境而加速需氧菌死亡，而该种抗菌作用仅针对 于需氧菌，对于厌氧菌则无效。通过实验将同一需氧的大肠杆菌菌株和厌氧的梭杆菌菌株 分别接种到厌氧培养基和配方中添加了 80ml/L的热变形小牛血清的优化厌氧培养基上， 于密封干燥缸环境37°C下培养，24h、48h鉴定，24h时添加热变形小牛血清大肠杆菌阳性检 出率为50%，没有添加热变形小牛血清的培养基上大肠杆菌阳性检出率为80% ;48h检测结 果为添加热变形小牛血清的培养基梭杆菌阳性检出率70%，没有添加热变形小牛血清的培 养基上梭杆菌阳性检出率20% ;由此证实热变形小牛血清在厌氧缸内对需氧菌有较好的抑 制效果，且能通过加速无氧环境而促进厌氧菌生长。
[0013] 5、石菖蒲（Acorus gramineus)属菖蒲科，为禾草状的多年生草本植物，药用部分 为根茎部位。现代医学研宄表明，石菖蒲含α-细辛醚等挥发油及糖类、有机酸、氨基酸、无 机元素等成分，有消肿止痛、化痰开窍、痈疽疥癣等作用，石菖蒲水提液是良好的营养强化 剂，石菖蒲水浸剂（1:3)，在试管内对堇色毛癣菌、同心性毛癣菌、星形奴卡菌等皮肤真菌均 有不同程度的抑制作用。有报告指出，石菖蒲煎剂有杀死腹水癌细胞的作用。Masuda T等 研宄发现石菖蒲中的α -细辛醚对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等均有抑制作 用。实验证实，200g/L浓度下的石菖蒲水煮液对于厌氧菌并无杀灭作用，以厌氧培养基为对 照，以厌氧培养基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液为实验组，接种脆弱类杆菌菌株，96h的 阳性检出率分别为70%和60%，二者比较无明显差异（P>0. 05)。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合实际情况，对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 实施例1，配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨IOg ;葡萄糖2g ;酵母粉 5g ;氯化钠5g ;琼脂15g ;升麻戒3g ;猪胆粉20g ;缴氨酸0.1 g ;无菌小牛血清100mL ;蒸馏水 加至1000ml。制备方法：称取胰酪 蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉； 缬氨酸，用蒸馏水溶解、混匀，121°C下灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌小牛血清混匀，灭 菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0016] 本实施例中的无菌小牛血清仅仅起到营养基质的作用，并无选择性的抗菌效果。
[0017] 实施例2,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨8g ;葡萄糖5g ;酵母 粉8g ;氯化钠5g ;琼脂15g ;升麻戒2. 5g ;猪胆粉20g ;缴氨酸0. 3g ;无菌热变形小牛血清 50ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升 麻甙；猪胆粉；缬氨酸；用蒸馏水溶解、混匀，121°C下灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热 变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0018] 所述的无菌热变形小牛血清制备方法为取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在 45°C下加入灭菌胰蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。其他实施例中的无菌热 变形小牛血清制备方法与实施例1中相同。
[0019] 实施例3,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨IOg ;葡萄糖3g ;酵母 粉IOg ;氯化钠5g ;琼脂20g ;升麻戒3g ;猪胆粉15g ;缴氨酸0. 5g ;L-高精氨酸0.1 g ;无菌 热变形小牛血清80ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法：称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉； 氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸；L-高精氨酸；用蒸馏水溶解、混匀，121°C下灭菌 15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0020] 实施例4,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨5g ;葡萄糖5g ;酵母粉 IOg ;氯化钠5g ;琼脂20g ;升麻戒2g ;猪胆粉20g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精氨酸0. 3g ;无菌热 变形小牛血清80ml ;浓度200g / L的石菖蒲水提液250ml ;蒸馏水加至1000ml。制备方法： (1)取50g石菖蒲加水煮沸45min，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮 液250ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸； L-高精氨酸，用蒸馏水溶解混匀，然后加入步骤（1)所得的石菖蒲提取液中混匀121°C灭菌 15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀，灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0021] 实施例5,配制1000 ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨Sg ;葡萄糖3g ;酵母粉 IOg ;氯化钠5g ;琼脂20g ;升麻戒3g ;猪胆粉15g ;缴氨酸0. 3g ;L-高精氨酸0. 5g ; γ-氨基 丁酸〇. Ig ;无菌热变形小牛血清100mL ;浓度200g / L的石菖蒲水提液300ml ;蒸馏水加至 1000ml。制备方法：制备方法：（1)取60g石菖蒲加水煮沸60min，过滤，取滤液，调整体积 到浓度为200g/L，得石菖蒲水煮液300ml ; (2)称取胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠； 琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸；L-高精氨酸；γ -氨基丁酸蒸馏水溶解、混匀，溶于步骤所 得的石菖蒲提取液中混匀，121 °C灭菌15min，冷却到45°C，加入无菌热变形小牛血清混匀， 灭菌蒸馏水定容到1000 ml后分装。
[0022] 所述石菖蒲水提液浓度200g/L指的是每升含有生药200g。
[0023] 本发明所得脆弱类杆菌培养基用于粪便标本，具有检出可靠、脆弱类杆菌分离率 高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。
[0024] 1对象与方法。
[0025] I. 1培养基制备：实验组共设5组，分别为实施例1方案组、实施例2方案组、实施 例3方案组、实施例4方案组、实施例5方案组。对照组为购自青岛海博生物技术有限公司 的胆汁七叶苷（BBE)琼脂，其中胆汁的浓度为20g/L、七叶苷浓度为Ig / L。
[0026] 1. 2标本采集培养方法：119例腹泻患儿(年龄3~12岁)，采集粪便黏液后接种于各 实验组和对照组培养基。在37°C下，厌氧缸(普通干燥缸)培养，分别于2d挑取细小菌落进 行菌属鉴定，如无疑似菌落出现则培养至7d时进行菌属鉴定。
[0027] 1.3检出阳性标准：依据《临床微生物学诊断与图解》，外观形态为菌落灰白色、圆 形微凸，且表面光滑，边缘整齐；革兰氏染色阴性；D引哚反应（-);触酶反应（+ )。
[0028] 2结果：19例腹泻患儿粪便标本培养2d和7d阳性检出情况见下表，
以BBE培养基7d培养结果为阳性检出率对照标准。上述结果可以看出，培养2d后，对 照组的阳性检出率明显低于标准值（P〈〇. 001)，表明由于厌氧缸需要氧气耗尽过程，48h内 并不能提供一个很好的无氧生长环境，杂菌繁殖迅速，脆弱类杆菌生长缓慢，因此2d时不 能阳性检出率低，需要7d才可以达到检出目的。而各实施例组培养2d后，阳性检出率与对 照组比较，均具有明显差异（P〈〇. 05)，与标准值差异无统计学意义（P>0. 05)，既各实施例 组2d培养结果具有诊断价值。
[0029] 本发明培养基用于在干燥缸环境下培养脆弱类杆菌，检出可靠，分离率高，从而缩 短确诊时间。
【主权项】
1. 适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，其特征在于，每升培养基中含有：胰酪蛋白胨 8g;葡萄糖5g;酵母粉8g;氯化钠5g;琼脂15g;升麻戒2. 5g;猪胆粉20g;缴氨酸0. 3g;无 菌热变形小牛血清50ml;蒸馏水加至1000m。2. 根据权利要求1所述的适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，其特征在于，所述的无 菌热变形小牛血清制备方法为：取无菌小牛血清80°C下加热lOmin，在45°C下加入灭菌胰 蛋白酶酶解90min，酶与底物的质量比为1:150。
【专利摘要】本发明公开了一种适用于粪便标本的厌氧杆菌培养基，属于微生物检验领域，其特征在于，配制1000ml培养基的配方中含有：胰酪蛋白胨；葡萄糖；酵母粉；氯化钠；琼脂；升麻甙；猪胆粉；缬氨酸；无菌热变形小牛血清，蒸馏水加至1000ml。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠，脆弱类杆菌分离率高的特点。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04
【公开号】CN104894216
【申请号】CN201510343231
【发明人】钟伟萍
【申请人】钟伟萍
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日
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