一种产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的单菌落琼脂块筛选方法
一种产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的单菌落琼脂块筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产羟脯氨酸菌株的筛选，具体的说是一种以固体培养方式，利用单菌 落琼脂块法和氨基酸显色法筛选产反式-4-羟脯氨酸菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 反式-4-轻脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-ProLine)又名L-轻脯氨酸，是轻脯氨酸 在自然界中最为常见的一种立体异构体，是一种高附加值的小品种氨基酸，最早发现于动 物胶原蛋白中。它广泛应用合成碳青霉烯类抗生素、血管紧张肽转化酶抑制剂、消炎药等， 如厄他培南、美罗培南；作为合成多种聚合物的必不可少的手性原料之一，在化工合成方面 发挥着重要作用；由于反式-4-羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，在食品工业上亦可作 为食品添加剂使用。此外，它还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因 此在美容业方面有着应用领域。反式-4-羟脯氨酸在国内外具有广阔的市场空间，目前，世 界用量500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。因此，筛选高产反式-4-羟脯氨酸 菌株有重大而深远的意义。
[0003] 近年来，国内外对L-羟脯氨酸发酵的研宄很多，主要围绕着菌种基因工程改造、 发酵工艺条件优化、溶剂提取和产量检测等方面进行。无论是通过基因工程技术还是常规 的诱变方法，最终都将涉及到从改造后的菌株中分离高产L-羟脯氨酸菌株的问题。
[0004] L-羟脯氨酸含量测定通常用的方法是比色法、氨基酸自动分析法、气相色谱/质 谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等，这些方法不适合大批量筛选诱变育种后产生的不 定向突变菌株。
[0005] 综上，本发明提供一种以固体培养方式，利用单菌落琼脂块法和氨基酸显色法筛 选高产L-羟脯氨酸菌株的方法。此方法利用打孔琼脂块的大小、厚度一致及生长状态均匀 等条件，使被筛选的菌落处于生长状况和营养条件比较一致的状态。此方法模拟了摇瓶发 酵时各菌株间在相同条件下发酵产羟脯氨酸的情况，显著减少了工作量，通过显色深浅以 及显色圈与菌落直径之比，确定L-羟脯氨酸产量高低，缩短了筛选周期，提高菌种选育效 率，为实现大批量筛选产L-羟脯氨酸菌株奠定基础。
【发明内容】
[0006] 发明解决的技术问题是提供一种方便的筛选产L-羟脯氨酸菌株的单菌落琼脂块 法
[0007] 本发明技术内容如下：
[0008] (1)发酵培养基琼脂平板的制备：培养基成分能够维持菌体生长，以及能促使羟 化酶的表达，完成L-脯氨酸到反式-4-羟脯氨酸的转化，灭菌后，待培养基冷却至适宜温度 时，等量分装至培养皿中。
[0009] (2)标准色板的制备：
[0010] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0011] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0012] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I :1)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0013] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0014] ⑤点加5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0015] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0016] (2)重组大肠杆菌经诱变后，稀释涂布于平板培养基，适宜温度培养至2_左右的 单菌落长出。
[0017] (3)用打孔器将单菌落取出置于滤纸上，使菌落产生的L-羟脯氨酸渗透到滤纸 上，待其干燥。
[0018] (4)点加试剂①，热风吹干，不同氨基酸显示不同颜色；试剂①配制：B引哚醌溶于 乙醇和冰醋酸中。
[0019] (5)点加试剂②，热风吹干，L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色；试剂 ②配制：对二氨基苯甲醛溶于丙酮和浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增 深发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0020] (6)据显色圈深浅与标准色板对比，显色越深，以及显色圈与菌落直径之比越大， L-羟脯氨酸产量越高。
[0021] 本发明的原理：各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可以借此辨认氨 基酸。氨对吲哚醌显色没有妨碍，但其灵敏度不是太高，显色不是太稳定，颜色只有在绝对 干燥的环境中才能保存。在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成深蓝色化合物，羟脯氨酸 与吲哚醌反应形成墨绿色，墨绿色和深蓝色不易区分；再点加试剂②中含有对二氨基苯甲 醛进一步区分，L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色。但在本发明中由于L-脯氨 酸和L-羟脯氨酸的浓度较小，二者与吲哚醌显色会与理论上略微有些差异。
[0022] 测羟脯氨酸含量的方法主要有：比色法、氨基酸自动分析法、气相色谱/质谱法、 高效液相色谱法、毛细管电泳法等。传统的测定羟脯氨酸的方法是比色法，其操作步骤繁 琐，影响因素多，样品需要量大，且特异性、灵敏性差；与比色法相比，氨基酸自动分析法是 一种快速、准确、灵敏度高的测定方法，但其费用高，普通实验难以实现，而且存在需要较多 缓冲液、反应温度高、反应速度慢等局限。20世纪70年代，高效液相色谱技术的发展为提高 测定羟脯氨酸含量的灵敏度提供了新途径，但该方法需要对样品进行一定程度上的衍生， 并且柱后衍生需要附加装置；20世纪80年代发展起来的毛细管电泳与电化学测定相结合 的技术成为氨基酸分析的新的发展趋势，具有进样量少、绝对灵敏度高、分辨率高等特点。 以上检测技术一般需要先发酵培养待筛选羟脯氨酸生产菌株，无法方便快速地用于大批量 的菌种筛选。
[0023] 本发明所述的方法能够通过滤纸上个体菌落显色颜色的深浅，与标准比色板比 较，从而筛选高产L-羟脯氨酸的菌株。本发明适用于大批量筛选诱变育种发生不定向突变 的菌株，有效缩短了筛选周期。下面通过实施例对发明作进一步的说明，其目的是更好的理 解本发明的内容；但不以本实施例对发明造成限制。
【附图说明】：
[0024] 图1不同浓度的L-脯氨酸溶液点加在滤纸上的状况，均不显色，第一个为对照， ι-ll号浓度依次增大。
[0025] 图2不同浓度的L-羟脯氨酸溶液点加在滤纸上的状况，均不显色，第一个为对照， ι-ll号浓度依次增大。
[0026] 图3不同浓度的L-脯氨酸和L-羟脯氨酸混合液（I: 1)点加在滤纸上后的状况， 均不显色，第一个为对照，1-11号浓度依次增大。
[0027] 图4在图1的基础上点加试剂①后的显色情况，即L-脯氨酸与试剂①显蓝色，第 一个为对照，ι-ll号显色逐渐加深。
[0028] 图5在图2的基础上点加试剂①后的显色情况，即试剂①与L-羟脯氨酸不显色。
[0029] 图6在图3的基础上点加试剂①后的显色情况，即试剂①与L-脯氨酸和L-羟脯 氨酸混合液（1:1)显蓝色，颜色随溶液浓度增大依次加深。
[0030] 图7在图4的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②使L-脯氨酸褪色。
[0031] 图8在图5的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②L-羟脯氨酸显玫红色， 颜色随溶液浓度增大依次加深。
[0032] 图9在图6的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②使L-脯氨酸和L-羟脯 氨酸混合液（1:1)显玫红色，颜色随溶液浓度增大依次加深，为标准色板。
[0033] 图10为本发明实例1中高产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他4株菌为高产菌。
[0034] 图11为本发明实例1中低产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他4株菌为低产菌。
[0035] 图12为本发明实例2中高产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他5株菌为高产菌。
[0036] 图13为本发明实例2中低产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他5株菌为低产菌。
[0037] 例 1
[0038] (1)取以下原料配成培养基：甘油20g/l，胰蛋白胨8.81g/l，磷酸氢二钾2g/l， 硫酸铵 5g/l，NaCl 2g/l，Mg2+0.0 2 %，Ca2+O. 2 %，L-脯氨酸 8. 98g/l，Fe2+2mmoL/l，琼脂 1.5%，其余为水，于121°〇灭菌151^11，待培养基冷却至60°〇左右时，加入适量氨苄青霉素， 以IOml/个培养皿分装培养基。
[0039] (2)氨苄青霉素母液制备：准确称取50mg氨苄青霉素，溶解后定容至1ml，得到 5〇g/l氨苄青霉素母液；然后过滤除菌备用。
[0040] (3)试剂①配制：Ig吲噪醌溶于100mL乙醇和IOml冰醋酸；试剂②配制：Ig对二 氨基苯甲醛溶于90ml丙酮和IOml浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深 发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0041] (4)标准色板制备：
[0042] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0043] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0044] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I: I)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0045] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0046] ⑤点加 5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0047] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0048] (5)使用经常压室温等离子体诱变处理的菌株为出发菌株，取诱变后浓度为 ΙΟΛιΓ 1的菌悬液0. lml，涂布于平板上，35°C培养24_36h，可发现平板上长出直径为2mm左 右的单菌落。
[0049] (6)与步骤（5)同时，取等量的出发菌株ΙΟΛιΓ1的菌悬液，涂布于平板上，35°C培 养24-36h，可发现平板上长出大小合适的单菌落。选定菌落直径大小为I. 4-1. 5mm的菌落 为对照菌。
[0050] (7)初步选取步骤（5)中菌落直径大于对照菌直径的菌株为高产L-羟脯氨酸的菌 株，菌落直径小于对照菌直径的菌株为低产L-羟脯氨酸的菌株。
[0051] (8)用直径为3_的打孔器分别将菌落大于对照菌株的4株菌和菌落小于对照菌 的4株菌打孔，打孔前将每个菌落对应的转接到LB培养基中保存。
[0052] (9)用镊子分别取出步骤（8)的8株单菌落琼脂块和对照菌的单菌落琼脂块（共 9株菌）置于滤纸上，个菌落间成3cm间距排列，待其干燥。
[0053] (10)用枪头点加试剂①5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸不显色，L-脯氨酸显深蓝色。
[0054] (11)用枪头点加试剂②5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸变为玫红色，其他氨基酸褪 色。
[0055] (12)菌落大于对照菌株的4株菌，据显色圈与菌落直径之比越大（表1)，以及显 色圈越深（图10)，L-羟脯氨酸产量越高。
[0056] 表1:出发菌和高产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度
[0057]
[0058] (13)菌落小于对照菌的4株菌，据显色圈与菌落直径之比越小（表2)，以及显色 圈越浅（图11)，L-羟脯氨酸产量越低。
[0059] 表2:出发菌和低产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度
[00601
[0061] (14)验证高产菌：挑取步骤（8)中保存的9株菌转接到含氨苄抗生素的LB平板 上，37°C恒温培养24h。取IOml液体LB培养基于100mL的三角瓶中，灭菌后接入平板上的 菌种（包括出发菌株），37°C，220r/min培养8h，进行菌种活化；在250ml三角瓶中装入30ml 发酵基，灭菌后接入活化的菌种，35°C，220r/min，培养24h，每个菌株做两个平行。为了保证 菌株的稳定性，连续做3代，取发酵液，测定羟脯氨酸的含量。结果见表3和表4。
[0062] 以上羟脯氨酸产量的数据说明了从本发明所设计平板上挑取的菌落大于出发菌 株的菌株发酵产生的羟脯氨酸量总体上高于出发菌株，即正突变率大100%，但并不代表大 菌落就一定是高产羟脯氨酸的菌株。这说明运用本发明可使筛选高产羟脯氨酸的菌株具有 一定的方向性，减少筛选的盲目性，减少工作量，提高筛选效果。
[0063] 表3 :出发菌株和高产菌株的L-羟脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0064]
[0065] 提高率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0066] 表4 :出发菌株和低产菌株的L-轻脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0067]
[0068] 降低率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0069] 例 2
[0070] (1)取以下原料配成培养基：甘油20g/l，胰蛋白胨8.81g/l，磷酸氢二钾2g/l， 硫酸铵 5g/l，NaCl 2g/l，Mg2+0.0 2 %，Ca2+O. 2 %，L-脯氨酸 8. 98g/l，Fe2+2mmoL/l，琼脂 1.5%，其余为水，于121°〇灭菌151^11，待培养基冷却至60°〇左右时，加入适量氨苄青霉素， 以IOml/个培养皿分装培养基。
[0071] (2)氨苄青霉素母液制备：准确称取50mg氨苄青霉素，溶解后定容至1ml，得到 5〇g/l氨苄青霉素母液；然后过滤除菌备用。
[0072] (3)试剂①配制：Ig吲哚醌溶于100mL乙醇和IOml冰醋酸；试剂②配制：Ig对二 氨基苯甲醛溶于90ml丙酮和IOml浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深 发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0073] (4)标准色板制备：
[0074] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0075] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0076] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I: I)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0077] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0078] ⑤点加 5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0079] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0080] (5)使用经常压室温等离子体和亚硝酸钠复合诱变处理的菌株为出发菌株，取诱 变后浓度为ΙΟΛιΓ 1的菌悬液0. lml，涂布于平板上，35°C培养24-36h，可发现平板上长出大 小合适的单菌落。
[0081] (6)与步骤（5)同时，取等量的出发菌株ΙΟΛιΓ1的菌悬液，涂布于平板上，35°C培 养24-36h，可发现平板上长出大小合适的单菌落。选定菌落直径大小为I. 4-1. 5mm的菌落 为对照菌。
[0082] (7)初步选取步骤（5)中菌落直径大于对照菌直径的菌株为高产L-羟脯氨酸的菌 株，菌落直径小于对照菌直径的菌株为低产L-羟脯氨酸的菌株。
[0083] (8)用直径为3mm的打孔器分别将菌落大于对照菌株的5株菌和菌落小于对照菌 的5株菌打孔，打孔前将每个菌落对应的转接到LB培养基中保存。
[0084] (9)用镊子分别取出步骤（8)的10株单菌落琼脂块和出发菌株的单菌落琼脂块 (共11株菌）置于滤纸上，个菌落间成3cm间距排列，待其干燥。
[0085] (10)用枪头点加试剂①5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸不显色，L-脯氨酸显深蓝色。
[0086] (11)用枪头点加试剂②5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸变为玫红色，其他氨基酸褪 色。
[0087] 表5:出发菌和高产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度
[0088]
[0089] (12)菌落大于对照菌株的5株菌，据显色圈与菌落直径之比越大（表5)，以及显 色圈越深（图12)，L-羟脯氨酸产量越高。
[0090] (13)菌落小于对照菌的5株菌，据显色圈与菌落直径之比越小（表6)，以及显色 圈越浅（图13)，L-羟脯氨酸产量越低。
[0091] 表6:出发菌和低产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度 [00921
[0093] (14)验证高产菌：挑取步骤（8)中保存的11株菌转接到含氨苄抗生素的LB平 板上，37°C恒温培养24h。取IOml液体LB培养基于100mL的三角瓶中，灭菌后接入平板上 的菌种（包括出发菌株），37°C，220r/min培养8h，进行菌种活化；在250ml三角瓶中装入 30ml发酵基，灭菌后接入活化的菌种，35°C，220r/min，培养24h，每个菌株做两个平行。为 了保证菌株的稳定性，连续做3代，取发酵液，测定羟脯氨酸的含量。结果如下表7和表8 :
[0094] 表7 :出发菌株和高产菌株的L-羟脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0095]
[0096] 提高率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0097] 表8 :出发菌株和低产菌株的L-轻脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0098]
[0099] 降低率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0100] 以上羟脯氨酸产量的数据说明了从本发明所设计平板上挑取的菌落大于出发菌 株的菌株发酵产生的羟脯氨酸量总体上高于出发菌株，即正突变率大100%，但并不代表大 菌落就一定是高产羟脯氨酸的菌株。这说明运用本发明可使筛选高产羟脯氨酸的菌株具有 一定的方向性，减少筛选的盲目性，减少工作量，提高筛选效果。
【主权项】
1. 一种快速筛选产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法，包括如下步骤： (1) 重组大肠杆菌经诱变后，稀释涂布于平板培养基，培养至大小合适的单菌落长出； (2) 用打孔器将单菌落取出置于可吸附性材料上，以使菌落产生的反式-4-羟脯氨酸 渗透到滤纸上； (3) 用移液枪分别点加试剂①和试剂②，使其显色； (4) 挑选出产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌菌株。2. 根据权利要求1所述的一种快速筛选产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法，其 特征在于步骤（1)中所述诱变方法是但不限于常压室温等离子体和化学试剂处理全基因 组DNA的复合诱变。3. 根据权利要求1所述的一种平板培养基，其特征在于步骤（1)中所述培养基成分能 够维持菌体生长，以及能促使羟化酶的表达，实现L-脯氨酸到反式-4-羟脯氨酸的转化。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)中的可吸附性材料是但不局限于 滤纸这样的可吸附氨基酸的材料。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中的试剂①为吲哚醌溶于乙醇和 冰醋酸的溶液。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中的试剂②为对二氨基苯甲醛溶 于丙酮和浓盐酸的溶液。
【专利摘要】本发明公开了利用单菌落琼脂块筛选产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法。该方法采用重组大肠杆菌为出发菌株，经诱变后，涂布到所设计的平板上，培养至有大小合适的菌落长出；用不锈钢打孔器将菌落依次打成圆形的琼脂块，用镊子夹取琼脂块放置于可吸附性材料上，待其干燥；加试剂①不同氨基酸显示不同颜色；点加试剂②后只有L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色。据显色圈与菌落直径之比，以及显色圈深浅，筛选产反式-4-羟脯氨酸的菌株。本发明的优点是提供了一种以固体培养方式，利用单菌落琼脂块法方便快速的筛选出高产菌株，使筛选具有一定的定向性，大大减少了筛选菌株工作量。
【IPC分类】C12Q1/10
【公开号】CN104894218
【申请号】CN201510254026
【发明人】张震宇, 王金霞, 孙付保, 丁灿灿
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产羟脯氨酸菌株的筛选，具体的说是一种以固体培养方式，利用单菌 落琼脂块法和氨基酸显色法筛选产反式-4-羟脯氨酸菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 反式-4-轻脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-ProLine)又名L-轻脯氨酸，是轻脯氨酸 在自然界中最为常见的一种立体异构体，是一种高附加值的小品种氨基酸，最早发现于动 物胶原蛋白中。它广泛应用合成碳青霉烯类抗生素、血管紧张肽转化酶抑制剂、消炎药等， 如厄他培南、美罗培南；作为合成多种聚合物的必不可少的手性原料之一，在化工合成方面 发挥着重要作用；由于反式-4-羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，在食品工业上亦可作 为食品添加剂使用。此外，它还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因 此在美容业方面有着应用领域。反式-4-羟脯氨酸在国内外具有广阔的市场空间，目前，世 界用量500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。因此，筛选高产反式-4-羟脯氨酸 菌株有重大而深远的意义。
[0003] 近年来，国内外对L-羟脯氨酸发酵的研宄很多，主要围绕着菌种基因工程改造、 发酵工艺条件优化、溶剂提取和产量检测等方面进行。无论是通过基因工程技术还是常规 的诱变方法，最终都将涉及到从改造后的菌株中分离高产L-羟脯氨酸菌株的问题。
[0004] L-羟脯氨酸含量测定通常用的方法是比色法、氨基酸自动分析法、气相色谱/质 谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等，这些方法不适合大批量筛选诱变育种后产生的不 定向突变菌株。
[0005] 综上，本发明提供一种以固体培养方式，利用单菌落琼脂块法和氨基酸显色法筛 选高产L-羟脯氨酸菌株的方法。此方法利用打孔琼脂块的大小、厚度一致及生长状态均匀 等条件，使被筛选的菌落处于生长状况和营养条件比较一致的状态。此方法模拟了摇瓶发 酵时各菌株间在相同条件下发酵产羟脯氨酸的情况，显著减少了工作量，通过显色深浅以 及显色圈与菌落直径之比，确定L-羟脯氨酸产量高低，缩短了筛选周期，提高菌种选育效 率，为实现大批量筛选产L-羟脯氨酸菌株奠定基础。
【发明内容】
[0006] 发明解决的技术问题是提供一种方便的筛选产L-羟脯氨酸菌株的单菌落琼脂块 法
[0007] 本发明技术内容如下：
[0008] (1)发酵培养基琼脂平板的制备：培养基成分能够维持菌体生长，以及能促使羟 化酶的表达，完成L-脯氨酸到反式-4-羟脯氨酸的转化，灭菌后，待培养基冷却至适宜温度 时，等量分装至培养皿中。
[0009] (2)标准色板的制备：
[0010] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0011] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0012] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I :1)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0013] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0014] ⑤点加5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0015] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0016] (2)重组大肠杆菌经诱变后，稀释涂布于平板培养基，适宜温度培养至2_左右的 单菌落长出。
[0017] (3)用打孔器将单菌落取出置于滤纸上，使菌落产生的L-羟脯氨酸渗透到滤纸 上，待其干燥。
[0018] (4)点加试剂①，热风吹干，不同氨基酸显示不同颜色；试剂①配制：B引哚醌溶于 乙醇和冰醋酸中。
[0019] (5)点加试剂②，热风吹干，L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色；试剂 ②配制：对二氨基苯甲醛溶于丙酮和浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增 深发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0020] (6)据显色圈深浅与标准色板对比，显色越深，以及显色圈与菌落直径之比越大， L-羟脯氨酸产量越高。
[0021] 本发明的原理：各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可以借此辨认氨 基酸。氨对吲哚醌显色没有妨碍，但其灵敏度不是太高，显色不是太稳定，颜色只有在绝对 干燥的环境中才能保存。在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成深蓝色化合物，羟脯氨酸 与吲哚醌反应形成墨绿色，墨绿色和深蓝色不易区分；再点加试剂②中含有对二氨基苯甲 醛进一步区分，L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色。但在本发明中由于L-脯氨 酸和L-羟脯氨酸的浓度较小，二者与吲哚醌显色会与理论上略微有些差异。
[0022] 测羟脯氨酸含量的方法主要有：比色法、氨基酸自动分析法、气相色谱/质谱法、 高效液相色谱法、毛细管电泳法等。传统的测定羟脯氨酸的方法是比色法，其操作步骤繁 琐，影响因素多，样品需要量大，且特异性、灵敏性差；与比色法相比，氨基酸自动分析法是 一种快速、准确、灵敏度高的测定方法，但其费用高，普通实验难以实现，而且存在需要较多 缓冲液、反应温度高、反应速度慢等局限。20世纪70年代，高效液相色谱技术的发展为提高 测定羟脯氨酸含量的灵敏度提供了新途径，但该方法需要对样品进行一定程度上的衍生， 并且柱后衍生需要附加装置；20世纪80年代发展起来的毛细管电泳与电化学测定相结合 的技术成为氨基酸分析的新的发展趋势，具有进样量少、绝对灵敏度高、分辨率高等特点。 以上检测技术一般需要先发酵培养待筛选羟脯氨酸生产菌株，无法方便快速地用于大批量 的菌种筛选。
[0023] 本发明所述的方法能够通过滤纸上个体菌落显色颜色的深浅，与标准比色板比 较，从而筛选高产L-羟脯氨酸的菌株。本发明适用于大批量筛选诱变育种发生不定向突变 的菌株，有效缩短了筛选周期。下面通过实施例对发明作进一步的说明，其目的是更好的理 解本发明的内容；但不以本实施例对发明造成限制。
【附图说明】：
[0024] 图1不同浓度的L-脯氨酸溶液点加在滤纸上的状况，均不显色，第一个为对照， ι-ll号浓度依次增大。
[0025] 图2不同浓度的L-羟脯氨酸溶液点加在滤纸上的状况，均不显色，第一个为对照， ι-ll号浓度依次增大。
[0026] 图3不同浓度的L-脯氨酸和L-羟脯氨酸混合液（I: 1)点加在滤纸上后的状况， 均不显色，第一个为对照，1-11号浓度依次增大。
[0027] 图4在图1的基础上点加试剂①后的显色情况，即L-脯氨酸与试剂①显蓝色，第 一个为对照，ι-ll号显色逐渐加深。
[0028] 图5在图2的基础上点加试剂①后的显色情况，即试剂①与L-羟脯氨酸不显色。
[0029] 图6在图3的基础上点加试剂①后的显色情况，即试剂①与L-脯氨酸和L-羟脯 氨酸混合液（1:1)显蓝色，颜色随溶液浓度增大依次加深。
[0030] 图7在图4的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②使L-脯氨酸褪色。
[0031] 图8在图5的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②L-羟脯氨酸显玫红色， 颜色随溶液浓度增大依次加深。
[0032] 图9在图6的基础上点加试剂②后的显色情况，即试剂②使L-脯氨酸和L-羟脯 氨酸混合液（1:1)显玫红色，颜色随溶液浓度增大依次加深，为标准色板。
[0033] 图10为本发明实例1中高产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他4株菌为高产菌。
[0034] 图11为本发明实例1中低产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他4株菌为低产菌。
[0035] 图12为本发明实例2中高产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他5株菌为高产菌。
[0036] 图13为本发明实例2中低产羟脯氨酸菌株在滤纸上的显色情况：1号菌为对照 菌，其他5株菌为低产菌。
[0037] 例 1
[0038] (1)取以下原料配成培养基：甘油20g/l，胰蛋白胨8.81g/l，磷酸氢二钾2g/l， 硫酸铵 5g/l，NaCl 2g/l，Mg2+0.0 2 %，Ca2+O. 2 %，L-脯氨酸 8. 98g/l，Fe2+2mmoL/l，琼脂 1.5%，其余为水，于121°〇灭菌151^11，待培养基冷却至60°〇左右时，加入适量氨苄青霉素， 以IOml/个培养皿分装培养基。
[0039] (2)氨苄青霉素母液制备：准确称取50mg氨苄青霉素，溶解后定容至1ml，得到 5〇g/l氨苄青霉素母液；然后过滤除菌备用。
[0040] (3)试剂①配制：Ig吲噪醌溶于100mL乙醇和IOml冰醋酸；试剂②配制：Ig对二 氨基苯甲醛溶于90ml丙酮和IOml浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深 发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0041] (4)标准色板制备：
[0042] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0043] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0044] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I: I)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0045] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0046] ⑤点加 5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0047] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0048] (5)使用经常压室温等离子体诱变处理的菌株为出发菌株，取诱变后浓度为 ΙΟΛιΓ 1的菌悬液0. lml，涂布于平板上，35°C培养24_36h，可发现平板上长出直径为2mm左 右的单菌落。
[0049] (6)与步骤（5)同时，取等量的出发菌株ΙΟΛιΓ1的菌悬液，涂布于平板上，35°C培 养24-36h，可发现平板上长出大小合适的单菌落。选定菌落直径大小为I. 4-1. 5mm的菌落 为对照菌。
[0050] (7)初步选取步骤（5)中菌落直径大于对照菌直径的菌株为高产L-羟脯氨酸的菌 株，菌落直径小于对照菌直径的菌株为低产L-羟脯氨酸的菌株。
[0051] (8)用直径为3_的打孔器分别将菌落大于对照菌株的4株菌和菌落小于对照菌 的4株菌打孔，打孔前将每个菌落对应的转接到LB培养基中保存。
[0052] (9)用镊子分别取出步骤（8)的8株单菌落琼脂块和对照菌的单菌落琼脂块（共 9株菌）置于滤纸上，个菌落间成3cm间距排列，待其干燥。
[0053] (10)用枪头点加试剂①5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸不显色，L-脯氨酸显深蓝色。
[0054] (11)用枪头点加试剂②5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸变为玫红色，其他氨基酸褪 色。
[0055] (12)菌落大于对照菌株的4株菌，据显色圈与菌落直径之比越大（表1)，以及显 色圈越深（图10)，L-羟脯氨酸产量越高。
[0056] 表1:出发菌和高产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度
[0057]
[0058] (13)菌落小于对照菌的4株菌，据显色圈与菌落直径之比越小（表2)，以及显色 圈越浅（图11)，L-羟脯氨酸产量越低。
[0059] 表2:出发菌和低产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度
[00601
[0061] (14)验证高产菌：挑取步骤（8)中保存的9株菌转接到含氨苄抗生素的LB平板 上，37°C恒温培养24h。取IOml液体LB培养基于100mL的三角瓶中，灭菌后接入平板上的 菌种（包括出发菌株），37°C，220r/min培养8h，进行菌种活化；在250ml三角瓶中装入30ml 发酵基，灭菌后接入活化的菌种，35°C，220r/min，培养24h，每个菌株做两个平行。为了保证 菌株的稳定性，连续做3代，取发酵液，测定羟脯氨酸的含量。结果见表3和表4。
[0062] 以上羟脯氨酸产量的数据说明了从本发明所设计平板上挑取的菌落大于出发菌 株的菌株发酵产生的羟脯氨酸量总体上高于出发菌株，即正突变率大100%，但并不代表大 菌落就一定是高产羟脯氨酸的菌株。这说明运用本发明可使筛选高产羟脯氨酸的菌株具有 一定的方向性，减少筛选的盲目性，减少工作量，提高筛选效果。
[0063] 表3 :出发菌株和高产菌株的L-羟脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0064]
[0065] 提高率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0066] 表4 :出发菌株和低产菌株的L-轻脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0067]
[0068] 降低率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0069] 例 2
[0070] (1)取以下原料配成培养基：甘油20g/l，胰蛋白胨8.81g/l，磷酸氢二钾2g/l， 硫酸铵 5g/l，NaCl 2g/l，Mg2+0.0 2 %，Ca2+O. 2 %，L-脯氨酸 8. 98g/l，Fe2+2mmoL/l，琼脂 1.5%，其余为水，于121°〇灭菌151^11，待培养基冷却至60°〇左右时，加入适量氨苄青霉素， 以IOml/个培养皿分装培养基。
[0071] (2)氨苄青霉素母液制备：准确称取50mg氨苄青霉素，溶解后定容至1ml，得到 5〇g/l氨苄青霉素母液；然后过滤除菌备用。
[0072] (3)试剂①配制：Ig吲哚醌溶于100mL乙醇和IOml冰醋酸；试剂②配制：Ig对二 氨基苯甲醛溶于90ml丙酮和IOml浓盐酸混合液（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深 发黑，灵敏度低，故用时新鲜少量配制）。
[0073] (4)标准色板制备：
[0074] ①制备L-脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/ 1、0· 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0075] ②制备L-羟脯氨酸不同浓度梯度溶液：浓度分别为0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、 0· 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、0. 55g/l、0. 60g/l ;
[0076] ③制备L-脯氨酸和L-羟脯氨酸的不同浓度梯度（I: I)混合液：二者浓度分别为 0g/l、0. 10g/l、0. 15g/l、0. 20g/l、0. 25g/l、0. 30g/l、0. 35g/l、0. 40g/l、0. 45g/l、0. 50g/l、 0·55g/l、0. 60g/l ;
[0077] ④将以上制备的三种溶液，每个浓度分别取5 μ I点加到三张滤纸上，间隔为3cm， 热风吹干后如图1-图3 ;
[0078] ⑤点加 5 μ 1试剂①后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图4-图6 ;
[0079] ⑥点加5 μ 1试剂②后，热风吹干，三种不同浓度梯度的溶液显色如图7-图9。
[0080] (5)使用经常压室温等离子体和亚硝酸钠复合诱变处理的菌株为出发菌株，取诱 变后浓度为ΙΟΛιΓ 1的菌悬液0. lml，涂布于平板上，35°C培养24-36h，可发现平板上长出大 小合适的单菌落。
[0081] (6)与步骤（5)同时，取等量的出发菌株ΙΟΛιΓ1的菌悬液，涂布于平板上，35°C培 养24-36h，可发现平板上长出大小合适的单菌落。选定菌落直径大小为I. 4-1. 5mm的菌落 为对照菌。
[0082] (7)初步选取步骤（5)中菌落直径大于对照菌直径的菌株为高产L-羟脯氨酸的菌 株，菌落直径小于对照菌直径的菌株为低产L-羟脯氨酸的菌株。
[0083] (8)用直径为3mm的打孔器分别将菌落大于对照菌株的5株菌和菌落小于对照菌 的5株菌打孔，打孔前将每个菌落对应的转接到LB培养基中保存。
[0084] (9)用镊子分别取出步骤（8)的10株单菌落琼脂块和出发菌株的单菌落琼脂块 (共11株菌）置于滤纸上，个菌落间成3cm间距排列，待其干燥。
[0085] (10)用枪头点加试剂①5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸不显色，L-脯氨酸显深蓝色。
[0086] (11)用枪头点加试剂②5 μ 1，热风吹干，L-羟脯氨酸变为玫红色，其他氨基酸褪 色。
[0087] 表5:出发菌和高产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度
[0088]
[0089] (12)菌落大于对照菌株的5株菌，据显色圈与菌落直径之比越大（表5)，以及显 色圈越深（图12)，L-羟脯氨酸产量越高。
[0090] (13)菌落小于对照菌的5株菌，据显色圈与菌落直径之比越小（表6)，以及显色 圈越浅（图13)，L-羟脯氨酸产量越低。
[0091] 表6:出发菌和低产菌的菌落直径与显色圈大小及显色程度 [00921
[0093] (14)验证高产菌：挑取步骤（8)中保存的11株菌转接到含氨苄抗生素的LB平 板上，37°C恒温培养24h。取IOml液体LB培养基于100mL的三角瓶中，灭菌后接入平板上 的菌种（包括出发菌株），37°C，220r/min培养8h，进行菌种活化；在250ml三角瓶中装入 30ml发酵基，灭菌后接入活化的菌种，35°C，220r/min，培养24h，每个菌株做两个平行。为 了保证菌株的稳定性，连续做3代，取发酵液，测定羟脯氨酸的含量。结果如下表7和表8 :
[0094] 表7 :出发菌株和高产菌株的L-羟脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0095]
[0096] 提高率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0097] 表8 :出发菌株和低产菌株的L-轻脯氨酸产量（g/Ι)测定表
[0098]
[0099] 降低率=(诱变菌株羟脯氨酸产量-出发菌株羟脯氨酸产量）/出发菌株羟脯氨 酸产量X 100%
[0100] 以上羟脯氨酸产量的数据说明了从本发明所设计平板上挑取的菌落大于出发菌 株的菌株发酵产生的羟脯氨酸量总体上高于出发菌株，即正突变率大100%，但并不代表大 菌落就一定是高产羟脯氨酸的菌株。这说明运用本发明可使筛选高产羟脯氨酸的菌株具有 一定的方向性，减少筛选的盲目性，减少工作量，提高筛选效果。
【主权项】
1. 一种快速筛选产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法，包括如下步骤： (1) 重组大肠杆菌经诱变后，稀释涂布于平板培养基，培养至大小合适的单菌落长出； (2) 用打孔器将单菌落取出置于可吸附性材料上，以使菌落产生的反式-4-羟脯氨酸 渗透到滤纸上； (3) 用移液枪分别点加试剂①和试剂②，使其显色； (4) 挑选出产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌菌株。2. 根据权利要求1所述的一种快速筛选产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法，其 特征在于步骤（1)中所述诱变方法是但不限于常压室温等离子体和化学试剂处理全基因 组DNA的复合诱变。3. 根据权利要求1所述的一种平板培养基，其特征在于步骤（1)中所述培养基成分能 够维持菌体生长，以及能促使羟化酶的表达，实现L-脯氨酸到反式-4-羟脯氨酸的转化。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)中的可吸附性材料是但不局限于 滤纸这样的可吸附氨基酸的材料。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中的试剂①为吲哚醌溶于乙醇和 冰醋酸的溶液。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中的试剂②为对二氨基苯甲醛溶 于丙酮和浓盐酸的溶液。
【专利摘要】本发明公开了利用单菌落琼脂块筛选产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的方法。该方法采用重组大肠杆菌为出发菌株，经诱变后，涂布到所设计的平板上，培养至有大小合适的菌落长出；用不锈钢打孔器将菌落依次打成圆形的琼脂块，用镊子夹取琼脂块放置于可吸附性材料上，待其干燥；加试剂①不同氨基酸显示不同颜色；点加试剂②后只有L-羟脯氨酸颜色变为玫红色，其他氨基酸褪色。据显色圈与菌落直径之比，以及显色圈深浅，筛选产反式-4-羟脯氨酸的菌株。本发明的优点是提供了一种以固体培养方式，利用单菌落琼脂块法方便快速的筛选出高产菌株，使筛选具有一定的定向性，大大减少了筛选菌株工作量。
【IPC分类】C12Q1/10
【公开号】CN104894218
【申请号】CN201510254026
【发明人】张震宇, 王金霞, 孙付保, 丁灿灿
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
最新回复(0)