残粒样脂蛋白胆甾醇的定量方法及用于其的试剂盒的制作方法
残粒样脂蛋白胆甾醇的定量方法及用于其的试剂盒的制作方法
【专利说明】残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法及用于其的试剂盒
[0001]本申请是2011年11月9日提交的题为“残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法及用于其的试剂盒”的PCT/JP2011/075837号发明专利申请的分案申请，原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为201180054103.0。
技术领域
[0002]本发明涉及残粒样脂蛋白(RLP)中的胆留醇的定量方法及用于其的试剂盒。
【背景技术】
[0003]血液中所含的脂蛋白利用超速离心分离根据密度的不同而可分为乳糜微粒、超低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。已知这些脂蛋白的甘油三酯、胆留醇等脂质或蛋白等的含量不同，各自在生物体内表现出不同的作用。
[0004]RLP是乳糜微粒、VLDL等甘油三酯含量多的脂蛋白的中间代谢产物，通常会被迅速代谢而从血液中消失，但代谢中产生任何异常时则会停留、蓄积于血液中。RLP容易沉积于动脉壁，被认为是动脉硬化引发性的脂蛋白之一。
[0005]作为RLP中的胆留醇的定量方法，已知有利用含有抗ApoA-1单克隆抗体和抗ApoB-1OO单克隆抗体的亲和胶，将RLP从血清中分离，对分离的RLP中所含的胆留醇进行测定的方法，用于该方法的试剂已有市售。
[0006]另一方面，近来作为不需要分离操作的RLP胆留醇的定量方法，报道有使胆甾醇酯酶、胆留醇氧化酶或胆留醇脱氢酶、以及磷脂酶与待测物试样作用的方法(专利文献I)。另外也报道有使用2种表面活性剂的方法(专利文献2)、使用脂蛋白脂肪酶活性和胆甾醇酯酶活性的比率为12?7000的胆留醇酯酶的方法(专利文献3)、使用具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系表面活性剂的方法(专利文献4)。
[0007]现有技术文献专利文献
专利文献1:日本专利4456715号公报专利文献2:W02007/066760号公报专利文献3:W02006/057377号公报专利文献4:W02007/083523号公报。
【发明内容】
[0008]发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供用于不需要分离操作而简便、且准确地定量待测物试样中的RLP胆留醇的方法和用于该方法的试剂盒。
[0009]用于解决技术问题的手段本申请发明人发现:在酶法测定含有各种脂蛋白的被测物试样的胆留醇时，若使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶作用，则RLP以外的脂蛋白会发生反应，若使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，则包括RLP的所有脂蛋白均会发生反应。于是，通过利用该见解，想到了不需进行分离操作，即可简便地对RLP中的胆留醇进行定量的方法，从而完成了本发明。
[0010]即，本发明如下所述:
[I]含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白的待测物中的残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法，该方法含有:
(1)将残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤，和
(2)对残留的残粒样脂蛋白中的胆留醇进行定量的步骤；
在前述步骤(I)中，使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，在前述步骤(2)中使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用。
[0011][2] [I]所述的方法，其中，前述步骤(I)含有使前述胆留醇酯酶与胆留醇氧化酶作用，并将生成的过氧化氢除去的步骤；前述步骤(2)含有使前述胆留醇酯酶与胆甾醇氧化酶作用，并对生成的过氧化氢进行定量的步骤。
[0012][3] [I]或[2]所述的方法，其中，前述步骤(I)和前述步骤(2)是在非离子系表面活性剂的存在下进行。
[0013][4] [I]?[3]中任一项所述的方法，其中，前述步骤⑴和前述步骤(2)中所用的前述非离子系表面活性剂是选自HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙稀烧基酿、聚氧化稀烧基酿和聚氧乙稀烧基苯基酿中的至少I种。
[0014][5] [I]?[4]中任一项所述的方法，其中，在前述步骤⑴中，进一步使磷脂酶作用。
[0015][6]残粒样脂蛋白胆留醇定量用试剂盒，其至少含有以下2种试剂组合物:
(i)含有分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶来作为胆甾醇酯酶的、用于将被测物试样中的残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆留醇除去并引导至反应体系外的试剂组合物；
(?)含有分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶来作为胆留醇酯酶的、用于对残粒样脂蛋白胆留醇进行定量的试剂组合物。
[0016][7] [6]所述的试剂盒，其中，至少前述(i)的试剂组合物含有胆留醇氧化酶。
[0017][8] [6]或[7]所述的试剂盒，其中，前述⑴和(ii)的试剂组合物至少含有选自HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少I种非离子表面活性剂。
[0018][6]?[8]中任一项所述的试剂盒，其中，前述(i)的试剂组合物进一步含有磷脂酶。
[0019]发明效果
根据本发明，提供可不需分离操作而简便、且准确地定量待测物试样中的RLP胆甾醇的新方法和用于该方法的试剂盒。
【附图说明】
[0020][图1]是示出利用下述实施例1中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0021][图2]是示出利用下述实施例2中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0022][图3]是示出利用下述实施例3中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0023][图4]是示出利用下述实施例4中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0024][图5]是示出利用下述实施例5中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0025][图6]是示出利用下述实施例6中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0026][图7]是示出利用下述实施例7中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
【具体实施方式】
[0027]作为脂蛋白中所含的胆甾醇，有酯型胆甾醇(胆甾醇酯)和游离型胆甾醇。本发明中，简称为“胆留醇”的情形包含上述两者。
[0028]本发明的方法中要定量的RLP意指合并了乳糜微粒残粒与VLDL残粒的脂蛋白。
[0029]供于本发明的方法的待测物只要含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白则没有特别限定，通常为血液(包含全血、血清和血浆)等体液或其稀释物。
[0030]本发明中的步骤(I)中，将RLP以外的脂蛋白中的胆甾醇选择性地除去。这里，“除去”意指分解胆留醇、并且使其分解物在后续的步骤(2)中不被检测出。作为将RLP以外的脂蛋白中所含的胆留醇选择性地除去的方法，可举出例如使胆留醇氧化酶、特定的胆甾醇酯酶(后述)作用于被测物试样，并将生成的过氧化氢除去的方法。作为将过氧化氢除去的方法，可举出使过氧化氢酶作用而分解为水和氧的方法、或利用过氧化物酶的作用将例如与过氧化氢反应而生成无色醌的氢供体化合物转化为无色醌的方法等，但并不限定于此。
[0031]应予说明，在第I步骤中，将特定的脂蛋白中的胆留醇选择性地除去的方法被广泛用于LDL胆甾醇的定量方法(例如W098/47005、US6194164 BI等)或HDL胆甾醇的定量方法(例如W098/26090、US6479249 B2等)等，为周知的方法(这些专利公报通过参照并入本文)。本发明的步骤(I)除了使用后述特定的胆留醇酯酶以外，还可以通过这些周知的方法来实施。这里，“除去”意指分解胆留醇、并且使其分解物在后续的第2步骤中不被检测出。作为将RLP以外的脂蛋白，即HDL、LDL、VLDL和CM等中所含的胆甾醇选择性地除去的方法，可举出以下方法。即，第I方法中，使胆留醇酯酶和胆留醇氧化酶作用于被检试样，并将生成的过氧化氢除去。通过胆留醇酯酶的作用，脂蛋白中的酯型胆留醇被水解而生成游离型胆留醇与脂肪酸。接着，该生成的游离型胆留醇与原本存在于脂蛋白中的游离型胆甾醇通过胆留醇氧化酶的作用而被氧化，生成胆留烯酮与过氧化氢。将该生成的过氧化氢除去。作为将过氧化氢除去的方法，可举出:使过氧化氢酶作用而分解为水与氧的方法；以及利用过氧化物酶的作用，使之与例如DAOS (N-乙基-N- (2-羟基磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺)之类的、与过氧化氢反应而生成无色醌的苯酚系或苯胺系氢供体化合物反应，而将过氧化氢转化为无色醌的方法等，但并不限定于此。
[0032]本发明的步骤(I)中，可以使用或不使用磷脂酶，但若使用适宜的磷脂酶，则可以促进RLP以外的脂蛋白中胆留醇的除去。作为磷脂酶的优选具体例，可举出:磷脂酶C(PLC)、鞘磷脂酶(SPC)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C ( P1-PLC，以上均为旭化成制药株式会社(旭化成7 7 — Y社)制)、鞘磷脂酶(来源于蜡状芽孢杆菌)、鞘磷脂酶(来源于金黄色葡萄球菌)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (来源于蜡状芽孢杆菌，以上均为SIGMA社制)等，但并不限定于此。
[0033]后续的步骤⑵中，在前述步骤⑴的产物中加入后述特定的胆甾醇酯酶，酶法定量RLP中的胆留醇。胆留醇的酶法定量方法本身在本领域是周知的，可举出例如:使胆甾醇氧化酶和胆留醇酯酶作用于胆留醇，将生成的过氧化氢通过过氧化物酶与氢供体和氢受体而转变为醌色素，对该色素进行吸光度测定来进行定量的方法。这些是被广泛使用的周知的方法，在上述W098/47005和W098/26090中也有记载。
[0034]应予说明，需要将步骤⑴中生成的过氧化氢用过氧化氢酶分解，并在步骤⑵中抑制该过氧化氢酶时，在步骤(2)中使用例如叠氮化钠之类的过氧化氢酶抑制剂来抑制过氧化氢酶。
[0035]本发明的步骤⑴和步骤(2)中，理想的是共存非离子系表面活性剂。若使用适宜的表面活性剂，则可以促进各步骤中的酶反应。作为适宜的表面活性剂，可举出HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚。作为表面活性剂的具体例，可举出:EMULGEN A-60,EMULGEN 707,EMULGEN 709、EMULGEN 909 (以上均为花王社制)、BLAUNON DSP-9、BLAUNON DSP-12.5 (以上均为青木油脂社制)等。
[0036]在步骤⑴和步骤⑵中共存的表面活性剂可以相同或不同。表面活性剂在反应液中的浓度优选为0.05%?5%、更优选为0.1%?1%。
[0037]作为本发明中使用的胆留醇氧化酶，只要是具有将胆留醇氧化而生成过氧化氢的能力的酶则没有特别限定，可举出例如来源于动物或微生物的胆甾醇酯酶。它们可以是通过基因操作制作的，也不管有无化学修饰。
[0038]本发明中使用的各酶的使用量根据酶而不同，没有特别限制，通常以0.0OlU?2000U/mL、优选 0.1 ?1000U/mL 来使用。
[0039]作为本发明中使用的氢供体，优选为苯胺衍生物，作为苯胺衍生物，可举出:N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基_N_(2_羟基-3-磺丙基)_3，5- 二甲基苯胺(MA0S)、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N- (2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N- (3-磺丙基)苯胺(HALPS)、N- (3-磺丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)等。
[0040]作为氢受体，可以使用4-氨基安替比林或甲基苯并噻唑酮腙(7于少O V千7、/口 V 匕卜'、7、/>)等。
[0041]本发明的各步骤优选在pH5?pH1下进行，进一步优选在pH6?pH8下进行。
[0042]对于反应温度，各步骤均优选在2°C?45 °C下进行，进一步优选在25°C?40°C下进行。对于反应时间，各步骤均优选进行I?10分钟，进一步优选进行3?7分钟。
[0043]本发明的最大特征在于，在步骤(I)和步骤(2)中，各自使用不同的特定的胆甾醇酯酶。如上所述，本申请发明人发现:在酶法测定含有各种脂蛋白的被测物试样的胆甾醇时，若使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶(以下，有时方便地称为“高分子量胆留醇酯酶”)作用，则RLP以外的脂蛋白会发生反应，若使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶(以下，有时方便地称为“低分子量胆甾醇酯酶”)作用，则包括RLP的所有脂蛋白均会反应。虽然不受理论束缚，但认为在RLP内部，连同酯型胆留醇，还大量存在有甘油三酯，这形成立体障碍，使大型的高分子量胆留醇酯酶无法接近粒子内部的酯型胆留醇，从而无法反应。
[0044]利用上述见解，本发明的方法中，在步骤(I)中使高分子量胆留醇酯酶作用，在步骤(2)中使低分子量胆留醇酯酶作用。如上所述，由于在步骤(I)中，生成的胆留醇(来源于RLP以外的脂蛋白的胆甾醇)被除去，因而在步骤(2)中，仅RLP胆甾醇被定量。
[0045]胆留醇酯酶和其亚基的分子量通过常法的SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)来测定。众所周知，SDS-PAGE是还原条件下的电泳，因而在胆甾醇酯酶由多个亚基构成时，胆甾醇酯酶会被解离为各亚基，因而各亚基的分子量得到测定。另一方面，胆留醇酯酶不具有亚基时，胆留醇酯酶的分子量得到测定。
[0046]作为高分子量胆甾醇酯酶的市售例，可举出:胆甾醇酯酶(CEBP-M ;旭化成制药株式会社制，分子量62kDa)、胆甾醇酯酶(CHE-XE ;龟甲万株式会社ν 3 — W社)制，分子量54kDa)等。
[0047]作为低分子量胆甾醇酯酶的市售例，可举出:胆甾醇酯酶(CEN ;旭化成制药株式会社制，分子量29.5kDa)、胆甾醇酯酶“Amano”2 (CHE2 ;天野酶株式会社(天野工V铲彳U社)制，分子量30kDa)、胆留醇酯酶“Amano”3 (CHE3 ;天野酶株式会社制，分子量30kDa)等。
[0048]实施本发明的定量方法时，可以将所用的试剂分为多种试剂组合物。本发明中，作为试剂，可以制备例如下述2种试剂组合物:用于进行将RLP以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤(即步骤(I))的试剂组合物、与用于进行测定RLP的胆留醇的步骤(即步骤(2))的试剂组合物。
[0049]用于进行步骤(I)的试剂组合物中至少含有高分子量胆留醇酯酶。该试剂组合物中可进一步含有上述表面活性剂或胆留醇氧化酶、苯胺衍生物等氢供体、除去过氧化氢的过氧化氢酶等。
[0050]用于进行步骤⑵的试剂组合物中至少含有低分子量胆甾醇酯酶。該试剂组合物中可进一步含有表面活性剂或4-氨基安替比林等氢受体、过氧化物酶等。
[0051]用于进行步骤(I)的试剂组合物和用于进行步骤(2)的试剂组合物中，可以根据需要添加I价阳离子(例如一价金属离子)、2价阳离子(例如二价金属离子)或它们的盐、聚阴离子(例如肝素、葡聚糖硫酸盐、磷钨酸盐)、血清白蛋白。另外，各试剂组合物的PH在中性附近、例如PH5?pH9、优选pH6?8，可以添加缓冲液来调整pH。
[0052]根据本发明的方法对RLP中的胆留醇进行定量时，可以通过向被测物试样添加用于进行步骤(I)的试剂组合物进行反应，接着添加用于进行步骤(2)的试剂组合物进行反应，并测定吸光度来进行。应予说明，如上所述，在步骤(I)和步骤(2)中，除了上述各自使用特定的胆留醇酯酶以外，可以按照通常的方法来进行。
[0053]以下，基于实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。实施例
[0054]实施例1
如下所述制备用于进行步骤(I)的试剂组合物A(实施例2以后也将用于进行步骤(I)的试剂组合物称为“试剂组合物A”)、用于进行步骤(2)的试剂组合物B (实施例2以后也将用于进行步骤(2)的试剂组合物称为“试剂组合物B”)。
[0055]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药(旭化成7 7 — Y)制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
TOOS2.0mmoI/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0056]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0057]在血清试样5 μ L中加入试剂组合物A 270 μ L，在37°C反应5分钟后，加入试剂组合物B 90 μ L反应5分钟，测定主波长600nm、副波长700nm下的吸光度。
[0058]作为比较对象法，使用了使用抗RLP单克隆抗体的、大冢制药株式会社(大塚製薬社)制的RLP-cholesterol “JMRO” II (商品名)来比较RLP胆甾醇浓度。其结果示于图1o
[0059]如图1所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO"II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0060]实施例2
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0061]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v) ο
[0062]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L 胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0063]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIM RO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图2。
[0064]如图2所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0065]实施例3
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0066]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v) ο
[0067]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN 709 (商品名)0.1%(w/v)。
[0068]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图3。
[0069]如图3所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0070]实施例4
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0071]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L BLAUNON DSP-12.5 (商品名)0.l%(w/v)。
[0072]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0073]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图4。
[0074]如图4所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0075]实施例5
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0076]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)
牛血清白蛋白0.1% (w/V)。
[0077]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0078]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图5。
[0079]如图5所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0080]实施例6
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0081]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[龟甲万株式会社制CHE-XE]5U/mL胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
TOOS2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)
牛血清白蛋白0.1% (w/V)。
[0082]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN 709 (商品名)0.1%(w/v)。
[0083]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图6。
[0084]如图6所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0085]实施例7
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0086]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v) ο
[0087]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[天野酶株式会社制CHE-2]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN 709 (商品名)0.1%(w/v)。
[0088]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图7。
[0089]如图7所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
【主权项】
1.含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白的待测物中的残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法，该方法含有: (1)将残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤，和 (2)对残留的残粒样脂蛋白中的胆留醇进行定量的步骤； 在前述步骤(I)中，使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，在前述步骤(2)中使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用。2.权利要求1所述的方法，其中，前述步骤(I)含有使前述胆留醇酯酶与胆留醇氧化酶作用，并将生成的过氧化氢除去的步骤；前述步骤(2)含有使前述胆留醇酯酶与胆留醇氧化酶作用，并对生成的过氧化氢进行定量的步骤。3.权利要求1或2所述的方法，其中，前述步骤⑴和前述步骤(2)是在非离子系表面活性剂的存在下进行。4.权利要求1?3中任一项所述的方法，其中，前述步骤(I)和前述步骤(2)中所用的前述非离子系表面活性剂是选自HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少I种。5.权利要求1?4中任一项所述的方法，其中，在前述步骤(I)中，进一步使磷脂酶作用。
【专利摘要】本发明涉及残粒样脂蛋白(RLP)中的胆甾醇的定量方法及用于其的试剂盒。公开了用于不需要分离操作而简便、且准确地定量待测物试样中的残粒样脂蛋白胆甾醇的方法及用于该方法的试剂盒。含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白的待测物中的残粒样脂蛋白胆甾醇的定量方法含有下述步骤：(1)将残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤；与(2)对残留的残粒样脂蛋白中的胆甾醇进行定量的步骤。在步骤(1)中，使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，在步骤(2)中，使分子量为40kDa以下的胆甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用。
【IPC分类】G01N33/92, C12Q1/26, C12Q1/44
【公开号】CN104894220
【申请号】CN201510179746
【发明人】平尾裕子
【申请人】电化生研株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2011年11月9日
【公告号】CN103314113A, CN103314113B, EP2639310A1, EP2639310A4, US8906638, US20130230873, WO2012063866A1
【专利说明】残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法及用于其的试剂盒
[0001]本申请是2011年11月9日提交的题为“残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法及用于其的试剂盒”的PCT/JP2011/075837号发明专利申请的分案申请，原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为201180054103.0。
技术领域
[0002]本发明涉及残粒样脂蛋白(RLP)中的胆留醇的定量方法及用于其的试剂盒。
【背景技术】
[0003]血液中所含的脂蛋白利用超速离心分离根据密度的不同而可分为乳糜微粒、超低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。已知这些脂蛋白的甘油三酯、胆留醇等脂质或蛋白等的含量不同，各自在生物体内表现出不同的作用。
[0004]RLP是乳糜微粒、VLDL等甘油三酯含量多的脂蛋白的中间代谢产物，通常会被迅速代谢而从血液中消失，但代谢中产生任何异常时则会停留、蓄积于血液中。RLP容易沉积于动脉壁，被认为是动脉硬化引发性的脂蛋白之一。
[0005]作为RLP中的胆留醇的定量方法，已知有利用含有抗ApoA-1单克隆抗体和抗ApoB-1OO单克隆抗体的亲和胶，将RLP从血清中分离，对分离的RLP中所含的胆留醇进行测定的方法，用于该方法的试剂已有市售。
[0006]另一方面，近来作为不需要分离操作的RLP胆留醇的定量方法，报道有使胆甾醇酯酶、胆留醇氧化酶或胆留醇脱氢酶、以及磷脂酶与待测物试样作用的方法(专利文献I)。另外也报道有使用2种表面活性剂的方法(专利文献2)、使用脂蛋白脂肪酶活性和胆甾醇酯酶活性的比率为12?7000的胆留醇酯酶的方法(专利文献3)、使用具有苯磺酸结构的表面活性剂或聚丙烯酸系表面活性剂的方法(专利文献4)。
[0007]现有技术文献专利文献
专利文献1:日本专利4456715号公报专利文献2:W02007/066760号公报专利文献3:W02006/057377号公报专利文献4:W02007/083523号公报。
【发明内容】
[0008]发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供用于不需要分离操作而简便、且准确地定量待测物试样中的RLP胆留醇的方法和用于该方法的试剂盒。
[0009]用于解决技术问题的手段本申请发明人发现:在酶法测定含有各种脂蛋白的被测物试样的胆留醇时，若使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶作用，则RLP以外的脂蛋白会发生反应，若使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，则包括RLP的所有脂蛋白均会发生反应。于是，通过利用该见解，想到了不需进行分离操作，即可简便地对RLP中的胆留醇进行定量的方法，从而完成了本发明。
[0010]即，本发明如下所述:
[I]含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白的待测物中的残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法，该方法含有:
(1)将残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤，和
(2)对残留的残粒样脂蛋白中的胆留醇进行定量的步骤；
在前述步骤(I)中，使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，在前述步骤(2)中使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用。
[0011][2] [I]所述的方法，其中，前述步骤(I)含有使前述胆留醇酯酶与胆留醇氧化酶作用，并将生成的过氧化氢除去的步骤；前述步骤(2)含有使前述胆留醇酯酶与胆甾醇氧化酶作用，并对生成的过氧化氢进行定量的步骤。
[0012][3] [I]或[2]所述的方法，其中，前述步骤(I)和前述步骤(2)是在非离子系表面活性剂的存在下进行。
[0013][4] [I]?[3]中任一项所述的方法，其中，前述步骤⑴和前述步骤(2)中所用的前述非离子系表面活性剂是选自HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙稀烧基酿、聚氧化稀烧基酿和聚氧乙稀烧基苯基酿中的至少I种。
[0014][5] [I]?[4]中任一项所述的方法，其中，在前述步骤⑴中，进一步使磷脂酶作用。
[0015][6]残粒样脂蛋白胆留醇定量用试剂盒，其至少含有以下2种试剂组合物:
(i)含有分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶来作为胆甾醇酯酶的、用于将被测物试样中的残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆留醇除去并引导至反应体系外的试剂组合物；
(?)含有分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶来作为胆留醇酯酶的、用于对残粒样脂蛋白胆留醇进行定量的试剂组合物。
[0016][7] [6]所述的试剂盒，其中，至少前述(i)的试剂组合物含有胆留醇氧化酶。
[0017][8] [6]或[7]所述的试剂盒，其中，前述⑴和(ii)的试剂组合物至少含有选自HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少I种非离子表面活性剂。
[0018][6]?[8]中任一项所述的试剂盒，其中，前述(i)的试剂组合物进一步含有磷脂酶。
[0019]发明效果
根据本发明，提供可不需分离操作而简便、且准确地定量待测物试样中的RLP胆甾醇的新方法和用于该方法的试剂盒。
【附图说明】
[0020][图1]是示出利用下述实施例1中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0021][图2]是示出利用下述实施例2中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0022][图3]是示出利用下述实施例3中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0023][图4]是示出利用下述实施例4中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0024][图5]是示出利用下述实施例5中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0025][图6]是示出利用下述实施例6中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
[0026][图7]是示出利用下述实施例7中记载的本发明的方法而得的RLP中胆甾醇的定量结果、与利用使用抗RLP单克隆抗体的公知方法而得的定量结果的相关关系的图。
【具体实施方式】
[0027]作为脂蛋白中所含的胆甾醇，有酯型胆甾醇(胆甾醇酯)和游离型胆甾醇。本发明中，简称为“胆留醇”的情形包含上述两者。
[0028]本发明的方法中要定量的RLP意指合并了乳糜微粒残粒与VLDL残粒的脂蛋白。
[0029]供于本发明的方法的待测物只要含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白则没有特别限定，通常为血液(包含全血、血清和血浆)等体液或其稀释物。
[0030]本发明中的步骤(I)中，将RLP以外的脂蛋白中的胆甾醇选择性地除去。这里，“除去”意指分解胆留醇、并且使其分解物在后续的步骤(2)中不被检测出。作为将RLP以外的脂蛋白中所含的胆留醇选择性地除去的方法，可举出例如使胆留醇氧化酶、特定的胆甾醇酯酶(后述)作用于被测物试样，并将生成的过氧化氢除去的方法。作为将过氧化氢除去的方法，可举出使过氧化氢酶作用而分解为水和氧的方法、或利用过氧化物酶的作用将例如与过氧化氢反应而生成无色醌的氢供体化合物转化为无色醌的方法等，但并不限定于此。
[0031]应予说明，在第I步骤中，将特定的脂蛋白中的胆留醇选择性地除去的方法被广泛用于LDL胆甾醇的定量方法(例如W098/47005、US6194164 BI等)或HDL胆甾醇的定量方法(例如W098/26090、US6479249 B2等)等，为周知的方法(这些专利公报通过参照并入本文)。本发明的步骤(I)除了使用后述特定的胆留醇酯酶以外，还可以通过这些周知的方法来实施。这里，“除去”意指分解胆留醇、并且使其分解物在后续的第2步骤中不被检测出。作为将RLP以外的脂蛋白，即HDL、LDL、VLDL和CM等中所含的胆甾醇选择性地除去的方法，可举出以下方法。即，第I方法中，使胆留醇酯酶和胆留醇氧化酶作用于被检试样，并将生成的过氧化氢除去。通过胆留醇酯酶的作用，脂蛋白中的酯型胆留醇被水解而生成游离型胆留醇与脂肪酸。接着，该生成的游离型胆留醇与原本存在于脂蛋白中的游离型胆甾醇通过胆留醇氧化酶的作用而被氧化，生成胆留烯酮与过氧化氢。将该生成的过氧化氢除去。作为将过氧化氢除去的方法，可举出:使过氧化氢酶作用而分解为水与氧的方法；以及利用过氧化物酶的作用，使之与例如DAOS (N-乙基-N- (2-羟基磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺)之类的、与过氧化氢反应而生成无色醌的苯酚系或苯胺系氢供体化合物反应，而将过氧化氢转化为无色醌的方法等，但并不限定于此。
[0032]本发明的步骤(I)中，可以使用或不使用磷脂酶，但若使用适宜的磷脂酶，则可以促进RLP以外的脂蛋白中胆留醇的除去。作为磷脂酶的优选具体例，可举出:磷脂酶C(PLC)、鞘磷脂酶(SPC)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C ( P1-PLC，以上均为旭化成制药株式会社(旭化成7 7 — Y社)制)、鞘磷脂酶(来源于蜡状芽孢杆菌)、鞘磷脂酶(来源于金黄色葡萄球菌)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C (来源于蜡状芽孢杆菌，以上均为SIGMA社制)等，但并不限定于此。
[0033]后续的步骤⑵中，在前述步骤⑴的产物中加入后述特定的胆甾醇酯酶，酶法定量RLP中的胆留醇。胆留醇的酶法定量方法本身在本领域是周知的，可举出例如:使胆甾醇氧化酶和胆留醇酯酶作用于胆留醇，将生成的过氧化氢通过过氧化物酶与氢供体和氢受体而转变为醌色素，对该色素进行吸光度测定来进行定量的方法。这些是被广泛使用的周知的方法，在上述W098/47005和W098/26090中也有记载。
[0034]应予说明，需要将步骤⑴中生成的过氧化氢用过氧化氢酶分解，并在步骤⑵中抑制该过氧化氢酶时，在步骤(2)中使用例如叠氮化钠之类的过氧化氢酶抑制剂来抑制过氧化氢酶。
[0035]本发明的步骤⑴和步骤(2)中，理想的是共存非离子系表面活性剂。若使用适宜的表面活性剂，则可以促进各步骤中的酶反应。作为适宜的表面活性剂，可举出HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚。作为表面活性剂的具体例，可举出:EMULGEN A-60,EMULGEN 707,EMULGEN 709、EMULGEN 909 (以上均为花王社制)、BLAUNON DSP-9、BLAUNON DSP-12.5 (以上均为青木油脂社制)等。
[0036]在步骤⑴和步骤⑵中共存的表面活性剂可以相同或不同。表面活性剂在反应液中的浓度优选为0.05%?5%、更优选为0.1%?1%。
[0037]作为本发明中使用的胆留醇氧化酶，只要是具有将胆留醇氧化而生成过氧化氢的能力的酶则没有特别限定，可举出例如来源于动物或微生物的胆甾醇酯酶。它们可以是通过基因操作制作的，也不管有无化学修饰。
[0038]本发明中使用的各酶的使用量根据酶而不同，没有特别限制，通常以0.0OlU?2000U/mL、优选 0.1 ?1000U/mL 来使用。
[0039]作为本发明中使用的氢供体，优选为苯胺衍生物，作为苯胺衍生物，可举出:N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基_N_(2_羟基-3-磺丙基)_3，5- 二甲基苯胺(MA0S)、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N- (2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N- (3-磺丙基)苯胺(HALPS)、N- (3-磺丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)等。
[0040]作为氢受体，可以使用4-氨基安替比林或甲基苯并噻唑酮腙(7于少O V千7、/口 V 匕卜'、7、/>)等。
[0041]本发明的各步骤优选在pH5?pH1下进行，进一步优选在pH6?pH8下进行。
[0042]对于反应温度，各步骤均优选在2°C?45 °C下进行，进一步优选在25°C?40°C下进行。对于反应时间，各步骤均优选进行I?10分钟，进一步优选进行3?7分钟。
[0043]本发明的最大特征在于，在步骤(I)和步骤(2)中，各自使用不同的特定的胆甾醇酯酶。如上所述，本申请发明人发现:在酶法测定含有各种脂蛋白的被测物试样的胆甾醇时，若使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶(以下，有时方便地称为“高分子量胆留醇酯酶”)作用，则RLP以外的脂蛋白会发生反应，若使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆留醇酯酶(以下，有时方便地称为“低分子量胆甾醇酯酶”)作用，则包括RLP的所有脂蛋白均会反应。虽然不受理论束缚，但认为在RLP内部，连同酯型胆留醇，还大量存在有甘油三酯，这形成立体障碍，使大型的高分子量胆留醇酯酶无法接近粒子内部的酯型胆留醇，从而无法反应。
[0044]利用上述见解，本发明的方法中，在步骤(I)中使高分子量胆留醇酯酶作用，在步骤(2)中使低分子量胆留醇酯酶作用。如上所述，由于在步骤(I)中，生成的胆留醇(来源于RLP以外的脂蛋白的胆甾醇)被除去，因而在步骤(2)中，仅RLP胆甾醇被定量。
[0045]胆留醇酯酶和其亚基的分子量通过常法的SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)来测定。众所周知，SDS-PAGE是还原条件下的电泳，因而在胆甾醇酯酶由多个亚基构成时，胆甾醇酯酶会被解离为各亚基，因而各亚基的分子量得到测定。另一方面，胆留醇酯酶不具有亚基时，胆留醇酯酶的分子量得到测定。
[0046]作为高分子量胆甾醇酯酶的市售例，可举出:胆甾醇酯酶(CEBP-M ;旭化成制药株式会社制，分子量62kDa)、胆甾醇酯酶(CHE-XE ;龟甲万株式会社ν 3 — W社)制，分子量54kDa)等。
[0047]作为低分子量胆甾醇酯酶的市售例，可举出:胆甾醇酯酶(CEN ;旭化成制药株式会社制，分子量29.5kDa)、胆甾醇酯酶“Amano”2 (CHE2 ;天野酶株式会社(天野工V铲彳U社)制，分子量30kDa)、胆留醇酯酶“Amano”3 (CHE3 ;天野酶株式会社制，分子量30kDa)等。
[0048]实施本发明的定量方法时，可以将所用的试剂分为多种试剂组合物。本发明中，作为试剂，可以制备例如下述2种试剂组合物:用于进行将RLP以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤(即步骤(I))的试剂组合物、与用于进行测定RLP的胆留醇的步骤(即步骤(2))的试剂组合物。
[0049]用于进行步骤(I)的试剂组合物中至少含有高分子量胆留醇酯酶。该试剂组合物中可进一步含有上述表面活性剂或胆留醇氧化酶、苯胺衍生物等氢供体、除去过氧化氢的过氧化氢酶等。
[0050]用于进行步骤⑵的试剂组合物中至少含有低分子量胆甾醇酯酶。該试剂组合物中可进一步含有表面活性剂或4-氨基安替比林等氢受体、过氧化物酶等。
[0051]用于进行步骤(I)的试剂组合物和用于进行步骤(2)的试剂组合物中，可以根据需要添加I价阳离子(例如一价金属离子)、2价阳离子(例如二价金属离子)或它们的盐、聚阴离子(例如肝素、葡聚糖硫酸盐、磷钨酸盐)、血清白蛋白。另外，各试剂组合物的PH在中性附近、例如PH5?pH9、优选pH6?8，可以添加缓冲液来调整pH。
[0052]根据本发明的方法对RLP中的胆留醇进行定量时，可以通过向被测物试样添加用于进行步骤(I)的试剂组合物进行反应，接着添加用于进行步骤(2)的试剂组合物进行反应，并测定吸光度来进行。应予说明，如上所述，在步骤(I)和步骤(2)中，除了上述各自使用特定的胆留醇酯酶以外，可以按照通常的方法来进行。
[0053]以下，基于实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。实施例
[0054]实施例1
如下所述制备用于进行步骤(I)的试剂组合物A(实施例2以后也将用于进行步骤(I)的试剂组合物称为“试剂组合物A”)、用于进行步骤(2)的试剂组合物B (实施例2以后也将用于进行步骤(2)的试剂组合物称为“试剂组合物B”)。
[0055]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药(旭化成7 7 — Y)制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
TOOS2.0mmoI/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0056]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0057]在血清试样5 μ L中加入试剂组合物A 270 μ L，在37°C反应5分钟后，加入试剂组合物B 90 μ L反应5分钟，测定主波长600nm、副波长700nm下的吸光度。
[0058]作为比较对象法，使用了使用抗RLP单克隆抗体的、大冢制药株式会社(大塚製薬社)制的RLP-cholesterol “JMRO” II (商品名)来比较RLP胆甾醇浓度。其结果示于图1o
[0059]如图1所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO"II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0060]实施例2
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0061]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v) ο
[0062]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L 胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0063]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIM RO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图2。
[0064]如图2所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0065]实施例3
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0066]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v) ο
[0067]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN 709 (商品名)0.1%(w/v)。
[0068]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图3。
[0069]如图3所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0070]实施例4
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0071]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L BLAUNON DSP-12.5 (商品名)0.l%(w/v)。
[0072]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0073]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图4。
[0074]如图4所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0075]实施例5
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0076]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)
牛血清白蛋白0.1% (w/V)。
[0077]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)。
[0078]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图5。
[0079]如图5所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0080]实施例6
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0081]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[龟甲万株式会社制CHE-XE]5U/mL胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
TOOS2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v)
牛血清白蛋白0.1% (w/V)。
[0082]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEN]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN 709 (商品名)0.1%(w/v)。
[0083]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图6。
[0084]如图6所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
[0085]实施例7
如下所述制备试剂组合物A和试剂组合物B。
[0086]试剂组合物A
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[旭化成制药制CEBP-M]5U/mL
胆甾醇氧化酶2.5U/mL
鞘磷脂酶[旭化成制药制SPC]2.5U/mL
过氧化氢酶1000U/mL
T00S2.0mmol/L
EMULGEN A-60 (商品名)0.l%(w/v) ο
[0087]试剂组合物B
PIPES 缓冲液，pH6.850mmol/L
胆甾醇酯酶[天野酶株式会社制CHE-2]4U/mL
4-氨基安替比林4.0mmol/L
过氧化物酶20单位/mL
叠氮化钠0.05%(w/v)
EMULGEN 709 (商品名)0.1%(w/v)。
[0088]以与实施例1相同的流程进行测定，与通过RLP-cholesterol “JIMRO” II (商品名)所得的值进行比较。其结果示于图7。
[0089]如图7所示，本实施例的方法与使用了 RLP胆甾醇测定用试剂RLP-cholesterol "JIMRO" II (商品名)的方法显示出良好的相关性。
【主权项】
1.含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白的待测物中的残粒样脂蛋白胆留醇的定量方法，该方法含有: (1)将残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤，和 (2)对残留的残粒样脂蛋白中的胆留醇进行定量的步骤； 在前述步骤(I)中，使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，在前述步骤(2)中使分子量为40kDa以下的胆留醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用。2.权利要求1所述的方法，其中，前述步骤(I)含有使前述胆留醇酯酶与胆留醇氧化酶作用，并将生成的过氧化氢除去的步骤；前述步骤(2)含有使前述胆留醇酯酶与胆留醇氧化酶作用，并对生成的过氧化氢进行定量的步骤。3.权利要求1或2所述的方法，其中，前述步骤⑴和前述步骤(2)是在非离子系表面活性剂的存在下进行。4.权利要求1?3中任一项所述的方法，其中，前述步骤(I)和前述步骤(2)中所用的前述非离子系表面活性剂是选自HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧化烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少I种。5.权利要求1?4中任一项所述的方法，其中，在前述步骤(I)中，进一步使磷脂酶作用。
【专利摘要】本发明涉及残粒样脂蛋白(RLP)中的胆甾醇的定量方法及用于其的试剂盒。公开了用于不需要分离操作而简便、且准确地定量待测物试样中的残粒样脂蛋白胆甾醇的方法及用于该方法的试剂盒。含有包含残粒样脂蛋白的多种脂蛋白的待测物中的残粒样脂蛋白胆甾醇的定量方法含有下述步骤：(1)将残粒样脂蛋白以外的脂蛋白中的胆甾醇除去的步骤；与(2)对残留的残粒样脂蛋白中的胆甾醇进行定量的步骤。在步骤(1)中，使分子量超过40kDa且不具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用，在步骤(2)中，使分子量为40kDa以下的胆甾醇酯酶或具有分子量40kDa以下的亚基的胆甾醇酯酶作用。
【IPC分类】G01N33/92, C12Q1/26, C12Q1/44
【公开号】CN104894220
【申请号】CN201510179746
【发明人】平尾裕子
【申请人】电化生研株式会社
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2011年11月9日
【公告号】CN103314113A, CN103314113B, EP2639310A1, EP2639310A4, US8906638, US20130230873, WO2012063866A1
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