一种dna聚合酶错配率的检测方法
一种dna聚合酶错配率的检测方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种生物学检测方法。更具体地，涉及一种酶学检测方法。【
背景技术：
】[0002]DNA聚合酶保真性检测的经典方法，是利用蓝白斑显色的方法，以蓝白斑比例的形式反映DNA聚合酶扩增LacZα基因时的突变率，来衡量DNA聚合酶保真性。最传统的方法是利用λ噬菌体携带扩增的LacZa基因，感染细胞后进行蓝白斑显色，例如KellyS.Lundberg等（High-fidelityamplificationusingathermostableDNApolymeraseisolatedfromPyrococcusfuriosus,1991，Gene)、JaniceCline等(PCRfidelityofPfuDNApolymeraseandotherthermostableDNApolymerases，1996,NucleicAcidsResearch)。该方法操作繁琐，且有造成实验室发生噬菌体污染的风险。也有学者开发出基于质粒而非菌体的检测方法，如StanislawK等（Plasmid-basedLacZaassayforDNApolymerasefidelity:applicationtoarchaealfamiIy-BDNApolymerase,2009,NucleicAcidsResearch)、BrianJ.Keith等(Aplasmid-basedIacZageneassayforDNApolymerasefidelitymeasurement,2013,AnalyticalBiochemistry)。但这些方法都要用到切刻内切酶，制备含有单链区域的质粒（即"GappedDNA"），实验步骤较为繁琐。另有学者扩增含有部分抗性基因片段的LacZa基因，然后利用载体与片段间抗性基因的功能性互补消除背景干扰，如WayneM.Barne等(ThefidefityofTaqpolymerasecatalyzingPCRisimprovedbyanN-terminaldeletion,1992,Gene)。但该方法扩增插入片段时，可能在抗性基因片段上出现突变，使得重组质粒无法正常生长，导致克隆数减少，低估DNA聚合酶的错配率。[0003]因此，需要提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。【
发明内容】[0004]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。[0005]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：[0006]一种DNA聚合酶错配率的检测方法，该方法包括如下步骤：[0007]1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；[0008]2)内切酶酶切，获得线性化质粒；[0009]3)扩增LacZa基因；[0010]4)将步骤3)获得的LacZa基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；[0011]5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；[0012]6)计算错配率。[0013]本发明所述同义突变是指：通过突变获得与野生型ccdB基因（见序列表SEQIDNo.2)DNA序列不同的突变型ccdB的DNA序列，但是突变型ccdB基因编码的ccdB蛋白序列与野生型ccdB基因编码的蛋白序列相同。同义突变的目的是为了在野生型ccdB基因的DNA序列内引入内切酶的酶切位点，即突变型ccdB基因具有内切酶酶切位点。突变型ccdB基因通过同义突变获得的酶切位点应该在步骤1)所述的质粒上是唯一的。优选地，酶切位点位于突变型ccdB基因序列中间靠近5'端部分。优选地，酶切位点为高效内切酶识别的位点。[0014]本发明方法的原理是：ccdB基因是致死基因，其编码毒素蛋白ccdB，含有ccdB基因的质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体，将会导致宿主菌体的死亡。LacZa基因编码β-半乳糖苷酶（简称β-gal)。β-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。LacZa基因插入突变型ccdB基因中，破坏了突变型ccdB基因的编码序列，使其不能表达ccdB蛋白（如图1和6所示）。[0015]DNA聚合酶扩增LacZa基因，并将其连接到含有突变型ccdB基因的质粒中，然后将质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体。当LacZa基因不能插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因表达ccdB蛋白，会造成宿主菌体的死亡；当LacZa基因插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因不表达ccdB蛋白，而表达β-gal，如果LacZa基因无突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色（蓝斑），如果LacZa基因有突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈白色（白斑），白斑数量与蓝斑数量之和为总菌斑数量。白斑数量越多，则DNA聚合酶的错配率越高，反之则越低。[0016]错配率直接反映DNA聚合酶的保真性一错配率越高，保真性越低。因此可以直接将错配率作为保真性的评价指标。在PCR体系与条件相同的情况下，用不同PCR酶扩增LacZa基因（如图5所示）并完成上述实验，便可以根据数据比较不同DNA聚合酶的保真性。即DNA聚合酶的错配率计算方法为：[0017](1-错配率）x=蓝斑数/总菌斑数[0018]将上式变形，最终可得：[0019][0020]其中，步骤（1)中含有突变型ccdB基因的质粒构建方法可采用常规的构建方法，如对含有野生型ccdB基因的质粒进行点突变，或通过PCR的方法突变野生型ccdB基因以获得突变型ccdB基因，然后将突变型ccdB基因的PCR产物或其内切酶酶切产物连接到载体上，或者通过基因重组的方法连接到载体上，或者其他能够实现相同目的的实验手段，其中所述载体不含有可表达ccdB蛋白的基因，或可表达与ccdB蛋白相同功能产物的基因。[0021]优选地，步骤4)所述LacZα基因连接到所述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。通过基因重组，所述LacZa基因插入到突变型ccdB基因中。其中所述LacZα基因的DNA序列见序列表SEQIDNo.1。[0022]优选地，步骤1)所述的质粒不表达抗ccdB蛋白毒性的基因。[0023]优选地，步骤2)中酶切时内切酶识别的位点为步骤1)引入的酶切位点。[0024]优选地，步骤5)所述宿主菌为对ccdB蛋白毒性无抗性的细菌，更优选为对ccdB蛋白无抗性的大肠杆菌，如DH5α、ToplO或Transl-Tl。[0025]优选地，步骤5)所述培养基为固体培养基。优选地所述培养基含有X-gal和IPTG，其中X-gal和IPTG的用量为本领域的常规用量。宿主菌的培养时间根据菌体性质决定。培养结束后分别计算其中蓝斑和白斑的数量，蓝斑和白斑的数量之和为总菌斑数量。所述错配率的计算方法为：[0026](1-错配率）x=蓝斑数/总菌斑数[0027]将上式变形，最终可得：[0028][0029]本发明的有益效果如下：[0030]与传统方法相比，本发明提供的一种将LacZa基因插入突变型ccdB基因的DNA聚合酶错配率检测方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。【附图说明】[0031]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。[0032]图1示出制备方法原理图[0033]图2不出pEASY-BluntZeroCloningVector质粒结构。[0034]图3不出缺失LacZa基因后的pEASY-BluntZeroCloningVector(记为PlasmidI)质粒结构。[0035]图4示出突变后的Plasmid1质粒结构。[0036][0037]图5示出LacZα基因的PCR扩增产物。[0038]图6示出LacZa基因在突变产生的酶切位点处插入ccdB基因后，生成的重组质粒。【具体实施方式】[0039]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。[0040]实施例中所用的材料及来源分别为：pEASY_BluntZeroCloningVector、EasyTaqDNAPolymerase、TransTaqHiFiDNAPolymerase、TransStartFastPfuDNAPolymerase、FastMutagenesisSystem、EasyPureQuickGelExtractionKit、T4DNALigase、pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit、Transl_TlPhageResistantChemicallyCompetentCell(北京全式金生物技术有限公司），SmaI、EcoRV限制性内切酶（NEB公司），OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受态细胞）、引物合成、测序（Lifetechnologies公司）。[0041]实施例1:DNA聚合酶错配率的检测[0042]1.制备含有野生型ccdB基因的质粒[0043]用反向PCR然后自连的方法，缺失pEASY-BluntZeroCloningVector载体中的LacZa基因，仅保留载体上的野生型ccdB基因。[0044]反向PCR引物为5'磷酸化引物，序列如下：[0045]PlasmidIPrimerF:5'-CAGTTTAAGGTTTACACC-3'（见序列表SEQIDNo.3)[0046]PlasmidIPrimerR:5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTG-3'（见序列表SEQIDNo.4)[0047]pEASY-BluntZeroCloningVector为模板（Template)，其含有LacZα与ccdB的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR反应体系如下：[0048]pEASY-BluntZeroCloningVectorIμLPlasmidIPrimerF(10μΜ)IμLPlasmidIPrimerR(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μLddH20加至50μ1[0049]PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C20秒，55°C20秒，72°C1分钟，共25个循环；72°C10分钟；PCR结束后，取5μ1于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0050]然后用EasyPureQuickGelExtractionKit回收纯化PCR产物，用T4DNALigase自连，转化OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受态细胞），挑单克隆，测序验证，对测序正确的菌落提质粒，质粒记为Plasmid1。[0051]2.含有突变型ccdB基因的质粒的构建：[0052]在野生型ccdB基因中突变产生SmaI酶切位点。[0053]野生型ccdB基因突变引物如下：[0054]MutationForwardPrimer:5'-GATATTATTGACACCCCGGGGCGACG-3'（见序列表SEQIDNo.5)[0055]MutationReversePrimer:5'-GGTGTCAATAATATCACTCTGTACA-3'（见序列表SEQIDNo.6)[0056]Plasmid1为模板（Template)，其含有野生型ccdB基因，质粒结构如图3所示，突变反应体系如下：[0057]Plasmid110ngMutationForwardPrimer(10μΜ)IμLMutationReversePrimer(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μΙddH2O加申.50μL[0058]PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C20秒，55°C20秒，72°C1分钟，共25个循环；72°C10分钟；PCR结束后，取5μ1于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0059]然后用DMT酶（或DpnI酶）消化PCR产物，取2μ1酶消化产物，转化OneShot?cc当前第1页1 2 dB Survival?2TlR Competent Cells (感受态细胞），挑单克隆，测序验证，对测序正确的 菌落提质粒，其中突变型ccdB基因的DNA序列见序列表SEQ ID No. 7。
[0060] 3.制备线性化质粒：
[0061] 用SmaI内切酶酶切含有突变型ccdB基因的质粒，电泳检测酶切效果；然后用 EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化酶切产物，即得到线性化质粒。
[0062] 4.扩增 LacZa 基因
[0063] 根据SEQ ID No. 1中LacZa基因序列设计引物，在下述引物序列中，斜体且加下 划线的DNA序列为所述质粒上SmaI酶切位点两侧序列，在LacZ a基因两侧引入后，以便进 行后续重组实验。
[0064] LacZ a Forward Primer:
[0065] 5' -GATATTATTGACACCCCGACCATGATTACGCCAAGC-3' (见序列表 SEQ ID No. 8)
[0066] LacZ a Reverse Primer:
[0067] 5' -CACCATCCGTCGCCCCTTCATTACCGTACGTATAGGCTGC-3' (见序列表 SEQ ID No. 9)
[0068] 以 pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 为模板（Template)，其含有 LacZ α 与 ccdB 的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR体系如下：
[0069] PCR反应体系：
[0070] pEASY-Blunt Zero Cloning Vector I μL LacZa Forward Primer (10 μΜ) I μL LacZa Reverse Primer (10 μΜ) I μL 2.5 mM dNTPs 4 μL DNA Polymerase 2.5 units Buffer to I X dd H2O 加至 50 μL
[0071] 其中 DNA 聚合酶为 EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase 或 TransStart FastPfu DNA Polymerase。
[0072] PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 20秒，共30个循 环；72°C 10分钟；PCR结束后，取5 μ 1于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化扩增产物。
[0073] 5.基因重组，转化
[0074] 用 pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit (试剂盒），将步骤 3 制备的 线性化质粒与步骤4制备的LacZ α基因 PCR产物连接起来，反应体系如下：
[0075] 2X Assembly Mix 5 μL 线性化质粒 50 ng LacZa .姑闲 10 ng CldH2O 加至 10 μL
[0076] 50 °C反应15分钟，然后取2 μ 1连接产物转化Transl-TlPhage Resistant Chemically Competent Cell，并涂布于预先涂有X-Gal与IPTG的Kan+抗性LB琼脂糖平 板上，过夜培养，计数蓝白斑，具体数据如下：
[0077] 蓝斑 白斑 总克隆数 EasyTaq 8658 1359 10017 TransTaq HiFi 9692 466 10158 FastPfu 9902 73 9975
[0078] 6.计算突变率
[0079] 按照突变率计算公式，计算得到三种酶突变率具体数据如下：
[0080] EasyTaq 18 XICT6
[0081] TransTaq HiFi 5. 8 X KT6
[0082] TransStart 0.9 XICT6
[0083] 实施例2 :
[0084] L制备含有野生型ccdB基因的质粒
[0085] 同实施例1.
[0086] 2.含有突变型ccdB基因的质粒的构建：
[0087] 在野生型ccdB基因中突变产生EcoRV酶切位点。
[0088] ccdB基因突变引物如下：
[0089] Mutation Forward Primer:5'-TGTACAGAGTGATATTATTGACACGC-3'（见序列表 SEQ ID No. 10)
[0090] Mutation Reverse Primer:5'-CCATCCGTCGCCCCGGCGTGTCAATG-3'（见序列表 SEQ ID No. 11)
[0091] 以Plasmid I为模板（Template)，含有野生型ccdB基因，质粒结构如图3所示）， 突变反应体系如下：
[0092] Plasmid I 10 ng Mutation Forward Primer (10 μΜ) I μL Mutation Reverse Primer (10 μΜ) I μL 2><TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye) 25 μL dd H2O 加 .半.50 μL
[0093] PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 1分钟，共25个 循环；72°C 10分钟；PCR结束后，取5 μ 1于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0094] 然后用DMT酶消化PCR产物，取2 μ 1消化产物，转化One Shot? ccdB Survival?2TlR Competent Cells (感受态细胞），挑单克隆，测序验证，对测序正确的菌落 提质粒。其中突变型ccdB基因的DNA序列见序列表SEQ ID No. 12。
[0095] 3.制备线性化质粒：
[0096] 用EcoRV酶切上述含有同义ccdB基因的质粒，电泳检测酶切效果；然后对酶切产 物去磷酸化。最后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit纯化反应产物，即得到线性化 载体。
[0097] 4.扩增 LacZa 基因
[0098] 根据LacZ a基因序列设计并合成一对5'磷酸化引物：
[0099] LacZ a Forward Primer:
[0100] 5'-ACCATGATTACGCCAAGC-3'（见序列表 SEQ ID No. 13)
[0101] LacZ a Reverse Primer:
[0102] 5'-GTCATTACCGTACGTATAGGCTGC-3'（见序列表 SEQ ID No. 14)
[0103] 以 pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 为模板（Template)，其含有 LacZ α 与 ccdB 的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR体系如下：
[0104] PCR反应体系：
[0105] pEASY-Blunt Zero Cloning Vector I μL LacZcx Forward Primer (10 μΜ) I μL LacZa Reverse Primer (10 μΜ) I μL 2.5 mM dNTPs 4 μL DNA Polymerase 2.5 units Buffer to I X dd H2O 加负50 μ丨
[0106] 其中 DNA 聚合酶为 EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase 或 TransStart FastPfu DNA Polymerase。
[0107] PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 20秒，共30个循 环；72°C 10分钟；PCR结束后，取5 μ 1于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit (试剂盒）纯化扩增产物。
[0108] 5.连接，转化
[0109] 用T4DNA Ligase (DNA连接酶），将步骤3制备的线性化载体与步骤4制备的 LacZa基因连接起来，反应体系如下：
[0110] 5χΤ4 DNA Ligase Buffer 2 μL Τ4 DNA Ligase 0.5 μΙ 线性化质粒 50 ng LacZa 基因 IOng dd H2O 加至 10 μL
[0111] 25 °C反应2小时，然后取2μ 1连接产物转化Transl-Tl Phage Resistant Chemically Competent Cell (感受态细胞），并涂布于预先涂有X-Gal与IPTG的Kan+抗 性LB琼脂糖平板上，过夜培养，计数蓝白斑，具体数据如下：
[0112] 蓝斑 白斑 总克隆数 EasyTaq 8705 1205 9910 TransTaq HiFi 9660 473 10133 FastPfu 10011 90 10101
[0113] 6.计算突变率
[0114] 按照突变率计算公式，计算得到三种酶突变率具体数据如下：
[0115] EasyTaq 1.6X10 5
[0116] TransTaq HiFi 5. 9 X KT6
[0117] TransStart I. IXlCT6
[0118] 实施例3:
[0119] 我们另用Stanislaw K、Brian J. Keith等的方法与Wayne M. Barne等的方法作为 对照，同样测试了以上三种酶的突变率，记为传统方法1、传统方法2。具体实施方案参考背 景技术中提及的文献资料进行实验。不同突变率检测方法的比较结果详见下面的表1。
[0120] 表1.不同突变率检测方法比较
[0121]
[0122] 比较结论
[0123] 1、本发明的两个实施例，数据一致。
[0124] 2、传统方法1与本发明相比，数据基本一致，但耗时较长且花费很高。
[0125] 3、传统方法2与本发明相比，由于方法本身的缺陷，数据整体偏低，且耗时较长， 花费较高。
[0126] 4、综上，本发明与传统方法相比，数据准确，且具有操作简单、快速、成本低的特 点。
[0127] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一种DNA聚合酶错配率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野 生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的； 2) 内切酶酶切，获得线性化质粒； 3) 扩增LacZa基因； 4) 将步骤3)获得的LacZ a基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物； 5) 转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养； 6) 计算错配率。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述质粒不表达抗ccdB蛋 白毒性的基因。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中酶切时内切酶识别的位点 为步骤1)引入的酶切位点。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LacZ a基因的DNA序列如序列 表 SEQ ID No. 1 所示。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4)所述LacZ a基因连接到所 述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述宿主菌为对ccdB蛋白无抗性的 大肠杆菌。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述宿主菌为DH5 a、ToplO或 Transl-Tl08. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述培养基为固体培养基。9. 根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于：所述培养基含有X-gal和IPTG。10. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述错配率的计算方法为：
【专利摘要】本发明公开一种DNA聚合酶错配率的检测方法，包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化上述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。本发明提供的方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。
【IPC分类】C12Q1/48
【公开号】CN104894221
【申请号】CN201510271941
【发明人】耿亮, 贺翠婷, 辛文, 马静
【申请人】北京全式金生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种生物学检测方法。更具体地，涉及一种酶学检测方法。【
背景技术：
】[0002]DNA聚合酶保真性检测的经典方法，是利用蓝白斑显色的方法，以蓝白斑比例的形式反映DNA聚合酶扩增LacZα基因时的突变率，来衡量DNA聚合酶保真性。最传统的方法是利用λ噬菌体携带扩增的LacZa基因，感染细胞后进行蓝白斑显色，例如KellyS.Lundberg等（High-fidelityamplificationusingathermostableDNApolymeraseisolatedfromPyrococcusfuriosus,1991，Gene)、JaniceCline等(PCRfidelityofPfuDNApolymeraseandotherthermostableDNApolymerases，1996,NucleicAcidsResearch)。该方法操作繁琐，且有造成实验室发生噬菌体污染的风险。也有学者开发出基于质粒而非菌体的检测方法，如StanislawK等（Plasmid-basedLacZaassayforDNApolymerasefidelity:applicationtoarchaealfamiIy-BDNApolymerase,2009,NucleicAcidsResearch)、BrianJ.Keith等(Aplasmid-basedIacZageneassayforDNApolymerasefidelitymeasurement,2013,AnalyticalBiochemistry)。但这些方法都要用到切刻内切酶，制备含有单链区域的质粒（即"GappedDNA"），实验步骤较为繁琐。另有学者扩增含有部分抗性基因片段的LacZa基因，然后利用载体与片段间抗性基因的功能性互补消除背景干扰，如WayneM.Barne等(ThefidefityofTaqpolymerasecatalyzingPCRisimprovedbyanN-terminaldeletion,1992,Gene)。但该方法扩增插入片段时，可能在抗性基因片段上出现突变，使得重组质粒无法正常生长，导致克隆数减少，低估DNA聚合酶的错配率。[0003]因此，需要提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。【
发明内容】[0004]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种操作简便、准确的DNA聚合酶错配率的检测方法。[0005]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：[0006]一种DNA聚合酶错配率的检测方法，该方法包括如下步骤：[0007]1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；[0008]2)内切酶酶切，获得线性化质粒；[0009]3)扩增LacZa基因；[0010]4)将步骤3)获得的LacZa基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；[0011]5)转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；[0012]6)计算错配率。[0013]本发明所述同义突变是指：通过突变获得与野生型ccdB基因（见序列表SEQIDNo.2)DNA序列不同的突变型ccdB的DNA序列，但是突变型ccdB基因编码的ccdB蛋白序列与野生型ccdB基因编码的蛋白序列相同。同义突变的目的是为了在野生型ccdB基因的DNA序列内引入内切酶的酶切位点，即突变型ccdB基因具有内切酶酶切位点。突变型ccdB基因通过同义突变获得的酶切位点应该在步骤1)所述的质粒上是唯一的。优选地，酶切位点位于突变型ccdB基因序列中间靠近5'端部分。优选地，酶切位点为高效内切酶识别的位点。[0014]本发明方法的原理是：ccdB基因是致死基因，其编码毒素蛋白ccdB，含有ccdB基因的质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体，将会导致宿主菌体的死亡。LacZa基因编码β-半乳糖苷酶（简称β-gal)。β-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。LacZa基因插入突变型ccdB基因中，破坏了突变型ccdB基因的编码序列，使其不能表达ccdB蛋白（如图1和6所示）。[0015]DNA聚合酶扩增LacZa基因，并将其连接到含有突变型ccdB基因的质粒中，然后将质粒转入对ccdB蛋白无抗性的宿主菌体。当LacZa基因不能插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因表达ccdB蛋白，会造成宿主菌体的死亡；当LacZa基因插入到突变型ccdB基因时，突变型ccdB基因不表达ccdB蛋白，而表达β-gal，如果LacZa基因无突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色（蓝斑），如果LacZa基因有突变，用X-Gal为底物进行染色时，呈白色（白斑），白斑数量与蓝斑数量之和为总菌斑数量。白斑数量越多，则DNA聚合酶的错配率越高，反之则越低。[0016]错配率直接反映DNA聚合酶的保真性一错配率越高，保真性越低。因此可以直接将错配率作为保真性的评价指标。在PCR体系与条件相同的情况下，用不同PCR酶扩增LacZa基因（如图5所示）并完成上述实验，便可以根据数据比较不同DNA聚合酶的保真性。即DNA聚合酶的错配率计算方法为：[0017](1-错配率）x=蓝斑数/总菌斑数[0018]将上式变形，最终可得：[0019][0020]其中，步骤（1)中含有突变型ccdB基因的质粒构建方法可采用常规的构建方法，如对含有野生型ccdB基因的质粒进行点突变，或通过PCR的方法突变野生型ccdB基因以获得突变型ccdB基因，然后将突变型ccdB基因的PCR产物或其内切酶酶切产物连接到载体上，或者通过基因重组的方法连接到载体上，或者其他能够实现相同目的的实验手段，其中所述载体不含有可表达ccdB蛋白的基因，或可表达与ccdB蛋白相同功能产物的基因。[0021]优选地，步骤4)所述LacZα基因连接到所述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。通过基因重组，所述LacZa基因插入到突变型ccdB基因中。其中所述LacZα基因的DNA序列见序列表SEQIDNo.1。[0022]优选地，步骤1)所述的质粒不表达抗ccdB蛋白毒性的基因。[0023]优选地，步骤2)中酶切时内切酶识别的位点为步骤1)引入的酶切位点。[0024]优选地，步骤5)所述宿主菌为对ccdB蛋白毒性无抗性的细菌，更优选为对ccdB蛋白无抗性的大肠杆菌，如DH5α、ToplO或Transl-Tl。[0025]优选地，步骤5)所述培养基为固体培养基。优选地所述培养基含有X-gal和IPTG，其中X-gal和IPTG的用量为本领域的常规用量。宿主菌的培养时间根据菌体性质决定。培养结束后分别计算其中蓝斑和白斑的数量，蓝斑和白斑的数量之和为总菌斑数量。所述错配率的计算方法为：[0026](1-错配率）x=蓝斑数/总菌斑数[0027]将上式变形，最终可得：[0028][0029]本发明的有益效果如下：[0030]与传统方法相比，本发明提供的一种将LacZa基因插入突变型ccdB基因的DNA聚合酶错配率检测方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。【附图说明】[0031]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。[0032]图1示出制备方法原理图[0033]图2不出pEASY-BluntZeroCloningVector质粒结构。[0034]图3不出缺失LacZa基因后的pEASY-BluntZeroCloningVector(记为PlasmidI)质粒结构。[0035]图4示出突变后的Plasmid1质粒结构。[0036][0037]图5示出LacZα基因的PCR扩增产物。[0038]图6示出LacZa基因在突变产生的酶切位点处插入ccdB基因后，生成的重组质粒。【具体实施方式】[0039]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。[0040]实施例中所用的材料及来源分别为：pEASY_BluntZeroCloningVector、EasyTaqDNAPolymerase、TransTaqHiFiDNAPolymerase、TransStartFastPfuDNAPolymerase、FastMutagenesisSystem、EasyPureQuickGelExtractionKit、T4DNALigase、pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit、Transl_TlPhageResistantChemicallyCompetentCell(北京全式金生物技术有限公司），SmaI、EcoRV限制性内切酶（NEB公司），OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受态细胞）、引物合成、测序（Lifetechnologies公司）。[0041]实施例1:DNA聚合酶错配率的检测[0042]1.制备含有野生型ccdB基因的质粒[0043]用反向PCR然后自连的方法，缺失pEASY-BluntZeroCloningVector载体中的LacZa基因，仅保留载体上的野生型ccdB基因。[0044]反向PCR引物为5'磷酸化引物，序列如下：[0045]PlasmidIPrimerF:5'-CAGTTTAAGGTTTACACC-3'（见序列表SEQIDNo.3)[0046]PlasmidIPrimerR:5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTG-3'（见序列表SEQIDNo.4)[0047]pEASY-BluntZeroCloningVector为模板（Template)，其含有LacZα与ccdB的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR反应体系如下：[0048]pEASY-BluntZeroCloningVectorIμLPlasmidIPrimerF(10μΜ)IμLPlasmidIPrimerR(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μLddH20加至50μ1[0049]PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C20秒，55°C20秒，72°C1分钟，共25个循环；72°C10分钟；PCR结束后，取5μ1于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0050]然后用EasyPureQuickGelExtractionKit回收纯化PCR产物，用T4DNALigase自连，转化OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受态细胞），挑单克隆，测序验证，对测序正确的菌落提质粒，质粒记为Plasmid1。[0051]2.含有突变型ccdB基因的质粒的构建：[0052]在野生型ccdB基因中突变产生SmaI酶切位点。[0053]野生型ccdB基因突变引物如下：[0054]MutationForwardPrimer:5'-GATATTATTGACACCCCGGGGCGACG-3'（见序列表SEQIDNo.5)[0055]MutationReversePrimer:5'-GGTGTCAATAATATCACTCTGTACA-3'（见序列表SEQIDNo.6)[0056]Plasmid1为模板（Template)，其含有野生型ccdB基因，质粒结构如图3所示，突变反应体系如下：[0057]Plasmid110ngMutationForwardPrimer(10μΜ)IμLMutationReversePrimer(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μΙddH2O加申.50μL[0058]PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C20秒，55°C20秒，72°C1分钟，共25个循环；72°C10分钟；PCR结束后，取5μ1于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。[0059]然后用DMT酶（或DpnI酶）消化PCR产物，取2μ1酶消化产物，转化OneShot?cc当前第1页1 2 dB Survival?2TlR Competent Cells (感受态细胞），挑单克隆，测序验证，对测序正确的 菌落提质粒，其中突变型ccdB基因的DNA序列见序列表SEQ ID No. 7。
[0060] 3.制备线性化质粒：
[0061] 用SmaI内切酶酶切含有突变型ccdB基因的质粒，电泳检测酶切效果；然后用 EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化酶切产物，即得到线性化质粒。
[0062] 4.扩增 LacZa 基因
[0063] 根据SEQ ID No. 1中LacZa基因序列设计引物，在下述引物序列中，斜体且加下 划线的DNA序列为所述质粒上SmaI酶切位点两侧序列，在LacZ a基因两侧引入后，以便进 行后续重组实验。
[0064] LacZ a Forward Primer:
[0065] 5' -GATATTATTGACACCCCGACCATGATTACGCCAAGC-3' (见序列表 SEQ ID No. 8)
[0066] LacZ a Reverse Primer:
[0067] 5' -CACCATCCGTCGCCCCTTCATTACCGTACGTATAGGCTGC-3' (见序列表 SEQ ID No. 9)
[0068] 以 pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 为模板（Template)，其含有 LacZ α 与 ccdB 的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR体系如下：
[0069] PCR反应体系：
[0070] pEASY-Blunt Zero Cloning Vector I μL LacZa Forward Primer (10 μΜ) I μL LacZa Reverse Primer (10 μΜ) I μL 2.5 mM dNTPs 4 μL DNA Polymerase 2.5 units Buffer to I X dd H2O 加至 50 μL
[0071] 其中 DNA 聚合酶为 EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase 或 TransStart FastPfu DNA Polymerase。
[0072] PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 20秒，共30个循 环；72°C 10分钟；PCR结束后，取5 μ 1于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收纯化扩增产物。
[0073] 5.基因重组，转化
[0074] 用 pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit (试剂盒），将步骤 3 制备的 线性化质粒与步骤4制备的LacZ α基因 PCR产物连接起来，反应体系如下：
[0075] 2X Assembly Mix 5 μL 线性化质粒 50 ng LacZa .姑闲 10 ng CldH2O 加至 10 μL
[0076] 50 °C反应15分钟，然后取2 μ 1连接产物转化Transl-TlPhage Resistant Chemically Competent Cell，并涂布于预先涂有X-Gal与IPTG的Kan+抗性LB琼脂糖平 板上，过夜培养，计数蓝白斑，具体数据如下：
[0077] 蓝斑 白斑 总克隆数 EasyTaq 8658 1359 10017 TransTaq HiFi 9692 466 10158 FastPfu 9902 73 9975
[0078] 6.计算突变率
[0079] 按照突变率计算公式，计算得到三种酶突变率具体数据如下：
[0080] EasyTaq 18 XICT6
[0081] TransTaq HiFi 5. 8 X KT6
[0082] TransStart 0.9 XICT6
[0083] 实施例2 :
[0084] L制备含有野生型ccdB基因的质粒
[0085] 同实施例1.
[0086] 2.含有突变型ccdB基因的质粒的构建：
[0087] 在野生型ccdB基因中突变产生EcoRV酶切位点。
[0088] ccdB基因突变引物如下：
[0089] Mutation Forward Primer:5'-TGTACAGAGTGATATTATTGACACGC-3'（见序列表 SEQ ID No. 10)
[0090] Mutation Reverse Primer:5'-CCATCCGTCGCCCCGGCGTGTCAATG-3'（见序列表 SEQ ID No. 11)
[0091] 以Plasmid I为模板（Template)，含有野生型ccdB基因，质粒结构如图3所示）， 突变反应体系如下：
[0092] Plasmid I 10 ng Mutation Forward Primer (10 μΜ) I μL Mutation Reverse Primer (10 μΜ) I μL 2><TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye) 25 μL dd H2O 加 .半.50 μL
[0093] PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 1分钟，共25个 循环；72°C 10分钟；PCR结束后，取5 μ 1于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0094] 然后用DMT酶消化PCR产物，取2 μ 1消化产物，转化One Shot? ccdB Survival?2TlR Competent Cells (感受态细胞），挑单克隆，测序验证，对测序正确的菌落 提质粒。其中突变型ccdB基因的DNA序列见序列表SEQ ID No. 12。
[0095] 3.制备线性化质粒：
[0096] 用EcoRV酶切上述含有同义ccdB基因的质粒，电泳检测酶切效果；然后对酶切产 物去磷酸化。最后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit纯化反应产物，即得到线性化 载体。
[0097] 4.扩增 LacZa 基因
[0098] 根据LacZ a基因序列设计并合成一对5'磷酸化引物：
[0099] LacZ a Forward Primer:
[0100] 5'-ACCATGATTACGCCAAGC-3'（见序列表 SEQ ID No. 13)
[0101] LacZ a Reverse Primer:
[0102] 5'-GTCATTACCGTACGTATAGGCTGC-3'（见序列表 SEQ ID No. 14)
[0103] 以 pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 为模板（Template)，其含有 LacZ α 与 ccdB 的融合基因，质粒结构如图2所示，PCR体系如下：
[0104] PCR反应体系：
[0105] pEASY-Blunt Zero Cloning Vector I μL LacZcx Forward Primer (10 μΜ) I μL LacZa Reverse Primer (10 μΜ) I μL 2.5 mM dNTPs 4 μL DNA Polymerase 2.5 units Buffer to I X dd H2O 加负50 μ丨
[0106] 其中 DNA 聚合酶为 EasyTaq DNA Polymerase、TransTaq HiFi DNA Polymerase 或 TransStart FastPfu DNA Polymerase。
[0107] PCR反应条件为：94°C预变性5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 20秒，共30个循 环；72°C 10分钟；PCR结束后，取5 μ 1于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。然后用EasyPure Quick Gel Extraction Kit (试剂盒）纯化扩增产物。
[0108] 5.连接，转化
[0109] 用T4DNA Ligase (DNA连接酶），将步骤3制备的线性化载体与步骤4制备的 LacZa基因连接起来，反应体系如下：
[0110] 5χΤ4 DNA Ligase Buffer 2 μL Τ4 DNA Ligase 0.5 μΙ 线性化质粒 50 ng LacZa 基因 IOng dd H2O 加至 10 μL
[0111] 25 °C反应2小时，然后取2μ 1连接产物转化Transl-Tl Phage Resistant Chemically Competent Cell (感受态细胞），并涂布于预先涂有X-Gal与IPTG的Kan+抗 性LB琼脂糖平板上，过夜培养，计数蓝白斑，具体数据如下：
[0112] 蓝斑 白斑 总克隆数 EasyTaq 8705 1205 9910 TransTaq HiFi 9660 473 10133 FastPfu 10011 90 10101
[0113] 6.计算突变率
[0114] 按照突变率计算公式，计算得到三种酶突变率具体数据如下：
[0115] EasyTaq 1.6X10 5
[0116] TransTaq HiFi 5. 9 X KT6
[0117] TransStart I. IXlCT6
[0118] 实施例3:
[0119] 我们另用Stanislaw K、Brian J. Keith等的方法与Wayne M. Barne等的方法作为 对照，同样测试了以上三种酶的突变率，记为传统方法1、传统方法2。具体实施方案参考背 景技术中提及的文献资料进行实验。不同突变率检测方法的比较结果详见下面的表1。
[0120] 表1.不同突变率检测方法比较
[0121]
[0122] 比较结论
[0123] 1、本发明的两个实施例，数据一致。
[0124] 2、传统方法1与本发明相比，数据基本一致，但耗时较长且花费很高。
[0125] 3、传统方法2与本发明相比，由于方法本身的缺陷，数据整体偏低，且耗时较长， 花费较高。
[0126] 4、综上，本发明与传统方法相比，数据准确，且具有操作简单、快速、成本低的特 点。
[0127] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一种DNA聚合酶错配率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野 生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的； 2) 内切酶酶切，获得线性化质粒； 3) 扩增LacZa基因； 4) 将步骤3)获得的LacZ a基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物； 5) 转化所述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养； 6) 计算错配率。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述质粒不表达抗ccdB蛋 白毒性的基因。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中酶切时内切酶识别的位点 为步骤1)引入的酶切位点。4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LacZ a基因的DNA序列如序列 表 SEQ ID No. 1 所示。5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤4)所述LacZ a基因连接到所 述线性化质粒的方法为基因重组或通过DNA连接酶连接。6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述宿主菌为对ccdB蛋白无抗性的 大肠杆菌。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述宿主菌为DH5 a、ToplO或 Transl-Tl08. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述培养基为固体培养基。9. 根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于：所述培养基含有X-gal和IPTG。10. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述错配率的计算方法为：
【专利摘要】本发明公开一种DNA聚合酶错配率的检测方法，包括如下步骤：1)制备含有突变型ccdB基因的质粒，其中所述突变型ccdB基因是通过同义突变在野生型ccdB基因内引入内切酶的酶切位点，所述酶切位点在所述质粒上是唯一的；2)内切酶酶切，获得线性化质粒；3)扩增LacZα基因；4)将步骤3)获得的LacZα基因连接到所述线性化质粒，获得连接产物；5)转化上述连接产物至宿主菌，并在培养基上进行培养；6)计算错配率。本发明提供的方法，具有操作简单、快速且成本低的特点。
【IPC分类】C12Q1/48
【公开号】CN104894221
【申请号】CN201510271941
【发明人】耿亮, 贺翠婷, 辛文, 马静
【申请人】北京全式金生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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