人copb2基因的用途及其相关药物的制作方法
人copb2基因的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人C0PB2基因的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 核糖核酸干扰（RNA interference, RNAi)现象是指当与内源性mRNA编码区某 段序列同源的双链RNA (dsRNA)导入细胞后，该mRNA发生特异性降解，而导致该基因 表达的沉默。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性 的引起 RNAi (Tuschl T, Zamore PD,Sharp PA, Bartel DP. RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at2Ito23nucleotide intervals. Cell2000;101:25-33.)。肿瘤是威胁人类健康的主要疾病。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综 合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的 治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以 抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤 的发生和发展（Uprichard, Susan L. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Letters2005;579:5996-6007. )〇
[0003] C0PB2 (coatomer protein complex, subunit beta2)是一种衣被蛋白复合体，亚 基β2(β原初），是一种蛋白转运蛋白，主要分布在内质网、高尔基堆叠、膜、COPI膜泡衣 被，参与细胞内蛋白运输、内质网商尔基I旲泡介导运输、退行I旲泡介导运输，商尔基内质 网、内商尔基I旲泡介导运输等。
[0004] 有研究发现，C0PB2在多种肿瘤组织呈现高表达。Erdogan等人发现在肺 腺癌中，C0PB2基因呈现高表达，在肺癌侵袭过程中发挥了一定的作用，Meta-分析 发现在乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌和胰腺癌以及脑胶瘤的样本中与PKCiota的表达有 密切的关系。（Erdogan E, Klee EW, Thompson EA, Fields AP.，Meta-analysis of oncogenic protein kinase Ciota signaling in lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2009Marl;15(5) :1527-33)。Sudo等人发现，在间皮瘤细胞中，敲减Copb2基因的表 达后，能明显抑制细胞增殖，有一定的抗凋亡作用。（Sudo H, Tsuji AB, Sugyo A, Kohda M, Sogawa C, Yoshida C, Harada YN, Hino 0, Saga T. Knockdown of COPA, identified by loss-〇f-function screen, induces apoptosis and suppresses tumor growth in mesothelioma mouse model. Genomics. 2010Apr;95(4) :210-6.)，基于以上研究，推测其可 能与肿瘤的发生发展有一定的联系。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开与人 COPB2 (coatomer protein complex, subunit beta2) 基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰（RNAi)为手段研究C0PB2基因在肿瘤细胞的存活 和凋亡过程中的作用。
[0006] 本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了 C0PB2基因在肿瘤发生和发展中的作 用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿 瘤细胞施用一种能够特异性抑制C0PB2基因的转录或翻译，或能够特异性抑制eIF5B蛋白 的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
[0007] 所述肿瘤细胞选自其生长与C0PB2蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的， 所述肿瘤细胞选自肺癌、结肠癌之任一。
[0008] 所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用 量为足够降低C0PB2基因的转录或翻译，或者足够降低C0PB2蛋白的表达或活性的剂量。进 一步的，所述C0PB2基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0009] 所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、 多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0010] 所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶 ΠΙ制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0011] 所述双链RNA、核酶、esiRNA或者ShRNA含有C0PB2基因的启动子序列或C0PB2基 因的信息序列。
[0012] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(SiRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第 二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2 基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所 编码的mRNA片段，并特异性沉默人C0PB2基因的表达。
[0013] 进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。较 优的，所述C0PB2基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-10中之任一序列。
[0014] 所述C0PB2基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默C0PB2基因表达 时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的C0PB2基因中的片段。
[0015] 较佳的，所述C0PB2基因来源于人。
[0016] 本发明第一方面还公开了一种分离的人C0PB2基因在制备或筛选肿瘤治疗药物， 或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0017] 进一步的，所述肿瘤选自肺癌或结肠癌之任一。
[0018] 所述将分离的C0PB2基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其 一，将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制 剂 ;其二，将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药 物或制剂。
[0019] 所述将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治 疗药物或制剂具体是指：将C0PB2基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药 物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内C0PB2基因的表达水平。
[0020] 所述将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治 疗药物或制剂具体是指：C0PB2基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑 制或促进人C0PB2基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的C0PB2基因小 分子干扰RNA (SiRNA)即是以人C0PB2基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤 细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将C0PB2基因及其蛋白 作为作用对象。
[0021] 所述将C0PB2基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将C0PB2基因表达产物作为一项 肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0022] 所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制C0PB2基因的转录或翻译，或能够特异性抑 制C0PB2蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中C0PB2基因的表达水平，达到抑制 肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0023] 所述通过分离的C0PB2基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物 包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病 毒。
[0024] 所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶 ΠΙ制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0025] 所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人C0PB2基因的转录或翻译，或者足够降 低人C0PB2蛋白的表达或活性的剂量。以使人C0PB2基因的表达至少被降低50%、80%、90%、 95% 或 99%。
[0026] 采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人C0PB2基因的表达水 平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人C0PB2基因表 达水平的物质给药于患者。
[0027] 本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中C0PB2基因表达的分离的核酸分子， 所述核酸分子包含：
[0028] a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸 序列；或者
[0029] b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸序列。
[0030] 进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共 同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2基因中15-27个连续的核苷酸序列基 本相同 。较佳的，所述第一链的序列与C0PB2基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同； 更佳的，所述第一链的序列与C0PB2基因中19个连续的核苷酸序列基本相同。
[0031] 更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补 共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。
[0032] 所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19个核苷酸。
[0033] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第 一链的序列如 SEQ ID NO :22 所示，具体为 5' -gcAGAUUAGAGUGUUCAAUUA-3'。
[0034] SEQ ID NO :22所示的siRNA为以SEQ ID NO: 5所示的序列为RNA干扰靶序列设 计的、针对人C0PB2基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互 补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源C0PB2基因表达的作用。
[0035] 进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段 和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义 链片段的序列与C0PB2基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后 可成为小干扰RNA (siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源C0PB2基因表达的作用。
[0036] 更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段 和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义 链片段的序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。
[0037] 较佳的，所述正义链片段与C0PB2基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更 佳的，所述正义链片段与C0PB2基因中19个连续的核苷酸序列基本相同。
[0038] 进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0039] 更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 23所示，具体为：5' -gcAGAUUAGAGU GUUCAAUUAUUCAAGAGAUAAUUGAACACUCUAAUCUgc-3，。
[0040] ShRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人 C0PB2基因表达的作用。
[0041] 编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO: 1-10中之 任一序列及其互补序列。
[0042] 所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与C0PB2基因中的靶序列基 本相同，所述C0PB2基因的靶序列即为SiRNA用于特异性沉默C0PB2基因表达时，被所述 SiRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的C0PB2基因中的片段。
[0043] 较佳的，所述C0PB2基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-10之任一序列。
[0044] 进一步的，所述C0PB2基因来源于人。
[0045] 本发明第三方面，公开了一种C0PB2基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述 分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
[0046] 所述的人C0PB2基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人C0PB2基因 shRNA的基 因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述C0PB2基因干扰核酸构建体为C0PB2基因干 扰慢病毒载体。
[0047] 本发明的C0PB2基因干扰慢病毒载体是将编码前述C0PB2基因 shRNA的DNA片段 克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述C0PB2基因干扰慢病毒载体经 过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通 过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默C0PB2基因的表达。
[0048] 进一步的，所述C0PB2基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤 细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白 (GFP) 0
[0049] 进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0050] 本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人C0PB2基因干扰慢病毒 载体,命名为 pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA。
[0051] 本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为肺癌或结 肠癌。
[0052] 本发明的C0PB2基因 siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗 肿瘤的药物或制剂。C0PB2基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述C0PB2基因 siRNA。当 用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂 量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0053] 本发明第四方面，公开了一种C0PB2基因干扰慢病毒，由前述C0PB2基因干扰慢病 毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞 并产生针对C0PB2基因的小分子干扰RNA，从而抑制肺癌或结肠癌细胞的增殖。该C0PB2基 因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
[0054] 本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含 有前述的分尚的核酸分子，C0PB2基因干扰核酸构建体或C0PB2基因干扰慢病毒中的一种 或多种的组合。
[0055] 进一步的，所述药物组合物含有1~99wt%所述双链RNA、shRNA、C0PB2基因干扰 核酸构建体或C0PB2基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0056] 在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可 以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体 材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖 浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀 粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯）、甜味剂等。
[0057] 本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗肺癌或结肠癌之任一的肿瘤治疗药 物中的应用。
[0058] 该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象 体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤 选自肺癌或结肠癌之任一。
[0059] 所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物 组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一 步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%或99%的部分被抑制。
[0060] 所述方法的对象可以为人。
[0061] 本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的C0PB2基因表达的试剂盒， 所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，C0PB2基因干扰核酸构建体，和/ 或所述的C0PB2基因干扰慢病毒。
[0062] 综上所述，本发明设计了针对人C0PB2基因的10个RNAi靶点序列，构建相应的 C0PB2RNAi 载体，其中编码序列 SEQ ID NO :5 的 RNAi 载体pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA 能够显 著下调C0PB2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv) 作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA能够靶向地将针对C0PB2基因 的RNAi序列高效导入肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞，降低C0PB2基因的表达水平，显 著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的C0PB2基因 沉默是恶性肿瘤潜在的临 床非手术治疗方式。
[0063] 本发明提供的SiRNA或者包含该SiRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性 抑制人C0PB2基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中 C0PB2基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要 意义。
【附图说明】
[0064] 图 I :pGCSIL_GFP 质粒 DNA 图谱
[0065] 图2 :C0PB2-RNAi慢病毒侵染肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞5天后，C0PB2mRNA 的表达水平显著降低
[0066] 图3 :C0PB2-RNAi慢病毒侵染肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制 [0067] 图4 :C0PB2-RNAi慢病毒侵染结肠癌RKO细胞5天后，引起细胞增殖抑制
【具体实施方式】
[0068] 本发明基于多种真核翻译起始因子和肿瘤的发生发展密切相关，C0PB2作为一种 真核翻译起始因子，推测其可能可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。
[0069] 本发明涉及了一组针对人C0PB2基因的小分子干扰RNA (siRNA)序列、RNA干扰 载体和RNA干扰慢病毒。选取人C0PB2mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点 中连续的10-30 (优选15-27,更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因 克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明， 上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源C0PB2基因的表达。
[0070] 发明人发现，采用RNAi方法下调人C0PB2基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的 增殖，这一研究成果表明C0PB2基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合 成和测试了多种针对C0PB2基因的siRNA，筛选出了可有效抑制C0PB2的表达进而抑制肺癌 H1299细胞和结肠癌RKO细胞细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
[0071] 本发明提供了一系列干扰人C0PB2基因的小干扰RNA (siRNA)序列，构建了可特 异性沉默C0PB2基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人C0PB2基因设计的小干扰RNA 及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调C0PB2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本 发明表明C0PB2基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通 过RNAi方式沉默C0PB2基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
[0072] 本发明的设计思路为：
[0073] 本发明通过如下方法来筛选获得一种人C0PB2基因 RNAi慢病毒：从Genbank中 调取人C0PB2基因序列；预测siRNA位点；合成针对C0PB2基因的有效的siRNA序列，两端 含酶切位点粘端的双链DNA Oligo;慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达 C0PB2基因 siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体（Packing Mix, Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉 默C0PB2基因的慢病毒。
[0074] 基于上述方法，本发明提供了 10个干扰C0PB2基因的有效靶点（具体如SEQ ID N01-10所示)，构建了特异干扰人C0PB2基因的慢病毒。
[0075] 同时本发明还公开一种人C0PB2基因 RNAi慢病毒（C0PB2-RNAi )及其制备与应用。
[0076] 本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低C0PB2基因在肿瘤细胞中的表 达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，C0PB2基因是一个原癌基因，可促进肿 瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，C0PB2基因可以为肿瘤治疗的靶 标，慢病毒介导的C0PB2基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
[0077] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制 本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条 件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0078] 实施例1针对人C0PB2基因 RNAi慢病毒的制备
[0079] 1.筛选针对人C0PB2基因的有效的SiRNA靶点
[0080] 从Genbank调取C0PB2 (ΝΜ_004766· 2)基因信息；设计针对C0PB2基因的有效的 siRNA靶点。表1列出了其中10条针对C0PB2基因的有效siRNA靶点序列。
[0081] 表1靶向于人C0PB2基因的siRNA靶点序列
[0082]
[0083] 2.慢病毒载体的制备
[0084] 针对siRNA靶点（以SEQ ID NO :5为例）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘 端的双链DNA Oligo序列(表2);以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体 (上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
[0085] 表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
[0086]
[0087] 通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37°C，反应lh)的载体 DNA和纯化好的双链DNA 01 igo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16°C连 接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操 作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶 于10 μ I LB培养基，混匀取1 μ 1作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通 用 PCR 引物（上游引物序列：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'（SEQ ID NO :15);下游引物 序列：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'（SEQ ID N0:16)，进行 PCR 鉴定实验（PCR 反应体系如 表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆 即为构建成功的针对SEQ ID NO :5的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA。
[0088] 构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SEQ ID N0:17)。构建 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 阴性对照质 粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序 列(表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA。
[0089] 表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
[0090]
[0091] 通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37°C，反应Ih)的载体
[0092] 表4pGCSIL_GFP质粒酶切反应体系
[0093]
[0094] 表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
[0095]
[0097] 表6-1PCR反应体系
[0098]
[0099] 表6-2PCR反应体系程序设定
[0100]
[0101] 3.包装 C0PB2-siRNA 慢病毒
[0102] 以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA的 DNA，配制成lOOng/μ 1储存液。
[0103] 转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血 清的DMEM完全培养基调整细胞密度为I. 5 X IO5细胞/ml，接种于6孔板，37°C，5%C02培养箱 内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml 新鲜的完全培养基。按照 Sigma-aldrich 公司的 MISSION Lentiviral Packaging Mix 试 剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix (PVM) 20 μ 1，PEI12 μ 1，无血清DMEM培 养基400 μ 1，取20 μ 1上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
[0104] 将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基 中，37 °C，5%C02培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加 入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置 (Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（l)4°C，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2) 0. 45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3) 4000g离心，10-15min，至需要的病毒 浓缩体积；（4)离心结束后，将过滤杯和下面 的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收 集杯上，离心2min离心力不超过1000 g ; (5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中 的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的SiRNA 的第一链的序列如SEQ ID NO: 15所示。对照慢病毒的包装过程同C0PB2-siRNA慢病毒，仅 以 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 载体代替 pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA 载体。
[0105] 实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测C0PB2基因的沉默效率
[0106] 处于对数生长期的人肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞 悬液(细胞数约为5 X IOVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复 数（M0I，H1299:1 ;RK0 :2)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基， 待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总 RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见 表7,42°C反应lh，然后在70°C水浴锅中水浴IOmin使逆转录酶失活)。
[0107] 采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA)进行实时定量检测。C0PB2基 因的引物如下：上游引物5 ' -GTGGGGACAAGCCATACCTC-3 '（ SEQ ID NO : 18 )和下游引 物 5' -GTGCTCTCAAGCCGGTAGG-3'（SEQ ID NO :19)。以管家基因 GAPDH 为内参，引物 序列如下：上游引物 5' -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'（SEQ ID NO :20)和下游引物 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'（SEQ ID N0:21)。按表 8 中的比例配置反应体系。
[0108] 表7逆转录反应体系
[0109]
[0110] 表 8Real_time PCR 反应体系
[0111]
[0112] 设定程序为两步法Real-time PCR :预变性95°C，15s ;之后每一步变性95°C，5s ; 退火延伸60°C，3〇S;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95°C变 性lmin，然后冷却至55°C，使DNA双链充分结合。从55°C开始到95°C，每一步增加0. 5°C， 保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔα分析法计算侵染了 C0PB2mRNA的表 达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果（图2)表明，人肺癌 H1299细胞和结肠癌RKO细胞中C0PB2mRNA的表达水平下调了 82. 0%和75. 5%。
[0113] 实施例3检测侵染C0PB2_siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
[0114] 处于对数生长期的人肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞 悬液(细胞数约为5 X IOVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复 数（MOI，H1299:1 ;RK0 :2)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5 天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2X10 4/ml)，以 细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100 μ 1。铺好板后，置37°C、 5%C02培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（Thermo Fisher)检测读 板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每 次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果 如图3-图4所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著 减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度。
[0115] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出 若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种分离的人C0PB2基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、结肠癌之任一。3. -种降低肿瘤细胞中C0PB2基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含： a) 双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸序列； 或者 b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸序列。4. 如权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第 二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。5. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述C0PB2基因的靶序列含有 SEQIDNO: 1-10 中任一序列。6. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA， 该小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO:22所示。7. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQID NO:23所示。8. -种C0PB2基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。9. 如权利要求8所述C0PB2基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述C0PB2基因干扰核 酸构建体为干扰慢病毒载体。10. 如权利要求9所述C0PB2基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体 由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自： pLKO. 1-pur。、pLKO?卜CMV-tGFP、pLKO. 1-puro-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、pLKO.l-Neo、pLK0.l-Ne〇-CMV-tGFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、 pLKO.l-pur〇-CMV-TagRFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagFP635、pLK0. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.l-pur〇-UbC_TagFP635、pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、 pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、 pcDNAL2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5_GW/lacZ中的任一。11. 一种C0PB2基因干扰慢病毒，由权利要求9-10任一权利要求所述干扰慢病毒载体 在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。12. -种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一权利 要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述C0PB2基因干扰核酸构建 体，和/或权利要求11所述的C0PB2基因干扰慢病毒。13. 权利要求12所述药物组合物在制备治疗胃癌、肺癌、结肠癌或胶质瘤的肿瘤治疗 药物中的应用。14. 一种用于降低肿瘤细胞中C0PB2基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括：存在于容器中的，权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任
【专利摘要】本发明公开了人COPB2基因的用途及其相关药物。本发明公开了人COPB2基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人COPB2基因小分子干扰RNA、人COPB2基因干扰核酸构建体、人COPB2基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人COPB2基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中COPB2基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/867, A61P35/00, C12N15/113, C12N7/01, C12Q1/68, A61K48/00
【公开号】CN104894223
【申请号】CN201410081471
【发明人】朱向莹, 孙琴, 高博, 张晓慧, 金杨晟, 瞿红花, 曹跃琼
【申请人】上海吉凯基因化学技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月7日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人C0PB2基因的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 核糖核酸干扰（RNA interference, RNAi)现象是指当与内源性mRNA编码区某 段序列同源的双链RNA (dsRNA)导入细胞后，该mRNA发生特异性降解，而导致该基因 表达的沉默。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性 的引起 RNAi (Tuschl T, Zamore PD,Sharp PA, Bartel DP. RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at2Ito23nucleotide intervals. Cell2000;101:25-33.)。肿瘤是威胁人类健康的主要疾病。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综 合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的 治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以 抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤 的发生和发展（Uprichard, Susan L. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Letters2005;579:5996-6007. )〇
[0003] C0PB2 (coatomer protein complex, subunit beta2)是一种衣被蛋白复合体，亚 基β2(β原初），是一种蛋白转运蛋白，主要分布在内质网、高尔基堆叠、膜、COPI膜泡衣 被，参与细胞内蛋白运输、内质网商尔基I旲泡介导运输、退行I旲泡介导运输，商尔基内质 网、内商尔基I旲泡介导运输等。
[0004] 有研究发现，C0PB2在多种肿瘤组织呈现高表达。Erdogan等人发现在肺 腺癌中，C0PB2基因呈现高表达，在肺癌侵袭过程中发挥了一定的作用，Meta-分析 发现在乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌和胰腺癌以及脑胶瘤的样本中与PKCiota的表达有 密切的关系。（Erdogan E, Klee EW, Thompson EA, Fields AP.，Meta-analysis of oncogenic protein kinase Ciota signaling in lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2009Marl;15(5) :1527-33)。Sudo等人发现，在间皮瘤细胞中，敲减Copb2基因的表 达后，能明显抑制细胞增殖，有一定的抗凋亡作用。（Sudo H, Tsuji AB, Sugyo A, Kohda M, Sogawa C, Yoshida C, Harada YN, Hino 0, Saga T. Knockdown of COPA, identified by loss-〇f-function screen, induces apoptosis and suppresses tumor growth in mesothelioma mouse model. Genomics. 2010Apr;95(4) :210-6.)，基于以上研究，推测其可 能与肿瘤的发生发展有一定的联系。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于公开与人 COPB2 (coatomer protein complex, subunit beta2) 基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰（RNAi)为手段研究C0PB2基因在肿瘤细胞的存活 和凋亡过程中的作用。
[0006] 本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了 C0PB2基因在肿瘤发生和发展中的作 用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿 瘤细胞施用一种能够特异性抑制C0PB2基因的转录或翻译，或能够特异性抑制eIF5B蛋白 的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
[0007] 所述肿瘤细胞选自其生长与C0PB2蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的， 所述肿瘤细胞选自肺癌、结肠癌之任一。
[0008] 所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用 量为足够降低C0PB2基因的转录或翻译，或者足够降低C0PB2蛋白的表达或活性的剂量。进 一步的，所述C0PB2基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0009] 所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、 多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0010] 所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶 ΠΙ制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0011] 所述双链RNA、核酶、esiRNA或者ShRNA含有C0PB2基因的启动子序列或C0PB2基 因的信息序列。
[0012] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(SiRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第 二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2 基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所 编码的mRNA片段，并特异性沉默人C0PB2基因的表达。
[0013] 进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。较 优的，所述C0PB2基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-10中之任一序列。
[0014] 所述C0PB2基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默C0PB2基因表达 时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的C0PB2基因中的片段。
[0015] 较佳的，所述C0PB2基因来源于人。
[0016] 本发明第一方面还公开了一种分离的人C0PB2基因在制备或筛选肿瘤治疗药物， 或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0017] 进一步的，所述肿瘤选自肺癌或结肠癌之任一。
[0018] 所述将分离的C0PB2基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其 一，将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制 剂 ;其二，将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药 物或制剂。
[0019] 所述将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治 疗药物或制剂具体是指：将C0PB2基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药 物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内C0PB2基因的表达水平。
[0020] 所述将C0PB2基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治 疗药物或制剂具体是指：C0PB2基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑 制或促进人C0PB2基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的C0PB2基因小 分子干扰RNA (SiRNA)即是以人C0PB2基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤 细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将C0PB2基因及其蛋白 作为作用对象。
[0021] 所述将C0PB2基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将C0PB2基因表达产物作为一项 肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0022] 所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制C0PB2基因的转录或翻译，或能够特异性抑 制C0PB2蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中C0PB2基因的表达水平，达到抑制 肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0023] 所述通过分离的C0PB2基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物 包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病 毒。
[0024] 所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶 ΠΙ制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0025] 所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人C0PB2基因的转录或翻译，或者足够降 低人C0PB2蛋白的表达或活性的剂量。以使人C0PB2基因的表达至少被降低50%、80%、90%、 95% 或 99%。
[0026] 采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人C0PB2基因的表达水 平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人C0PB2基因表 达水平的物质给药于患者。
[0027] 本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中C0PB2基因表达的分离的核酸分子， 所述核酸分子包含：
[0028] a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸 序列；或者
[0029] b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸序列。
[0030] 进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共 同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2基因中15-27个连续的核苷酸序列基 本相同 。较佳的，所述第一链的序列与C0PB2基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同； 更佳的，所述第一链的序列与C0PB2基因中19个连续的核苷酸序列基本相同。
[0031] 更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补 共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。
[0032] 所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19个核苷酸。
[0033] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第 一链的序列如 SEQ ID NO :22 所示，具体为 5' -gcAGAUUAGAGUGUUCAAUUA-3'。
[0034] SEQ ID NO :22所示的siRNA为以SEQ ID NO: 5所示的序列为RNA干扰靶序列设 计的、针对人C0PB2基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互 补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源C0PB2基因表达的作用。
[0035] 进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段 和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义 链片段的序列与C0PB2基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后 可成为小干扰RNA (siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源C0PB2基因表达的作用。
[0036] 更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段 和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义 链片段的序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。
[0037] 较佳的，所述正义链片段与C0PB2基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更 佳的，所述正义链片段与C0PB2基因中19个连续的核苷酸序列基本相同。
[0038] 进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0039] 更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 23所示，具体为：5' -gcAGAUUAGAGU GUUCAAUUAUUCAAGAGAUAAUUGAACACUCUAAUCUgc-3，。
[0040] ShRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人 C0PB2基因表达的作用。
[0041] 编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO: 1-10中之 任一序列及其互补序列。
[0042] 所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与C0PB2基因中的靶序列基 本相同，所述C0PB2基因的靶序列即为SiRNA用于特异性沉默C0PB2基因表达时，被所述 SiRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的C0PB2基因中的片段。
[0043] 较佳的，所述C0PB2基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-10之任一序列。
[0044] 进一步的，所述C0PB2基因来源于人。
[0045] 本发明第三方面，公开了一种C0PB2基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述 分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
[0046] 所述的人C0PB2基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人C0PB2基因 shRNA的基 因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述C0PB2基因干扰核酸构建体为C0PB2基因干 扰慢病毒载体。
[0047] 本发明的C0PB2基因干扰慢病毒载体是将编码前述C0PB2基因 shRNA的DNA片段 克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述C0PB2基因干扰慢病毒载体经 过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通 过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默C0PB2基因的表达。
[0048] 进一步的，所述C0PB2基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤 细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白 (GFP) 0
[0049] 进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0050] 本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人C0PB2基因干扰慢病毒 载体,命名为 pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA。
[0051] 本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为肺癌或结 肠癌。
[0052] 本发明的C0PB2基因 siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗 肿瘤的药物或制剂。C0PB2基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述C0PB2基因 siRNA。当 用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂 量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0053] 本发明第四方面，公开了一种C0PB2基因干扰慢病毒，由前述C0PB2基因干扰慢病 毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞 并产生针对C0PB2基因的小分子干扰RNA，从而抑制肺癌或结肠癌细胞的增殖。该C0PB2基 因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
[0054] 本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含 有前述的分尚的核酸分子，C0PB2基因干扰核酸构建体或C0PB2基因干扰慢病毒中的一种 或多种的组合。
[0055] 进一步的，所述药物组合物含有1~99wt%所述双链RNA、shRNA、C0PB2基因干扰 核酸构建体或C0PB2基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0056] 在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可 以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体 材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖 浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀 粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯）、甜味剂等。
[0057] 本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗肺癌或结肠癌之任一的肿瘤治疗药 物中的应用。
[0058] 该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象 体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤 选自肺癌或结肠癌之任一。
[0059] 所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物 组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一 步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%或99%的部分被抑制。
[0060] 所述方法的对象可以为人。
[0061] 本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的C0PB2基因表达的试剂盒， 所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，C0PB2基因干扰核酸构建体，和/ 或所述的C0PB2基因干扰慢病毒。
[0062] 综上所述，本发明设计了针对人C0PB2基因的10个RNAi靶点序列，构建相应的 C0PB2RNAi 载体，其中编码序列 SEQ ID NO :5 的 RNAi 载体pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA 能够显 著下调C0PB2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv) 作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA能够靶向地将针对C0PB2基因 的RNAi序列高效导入肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞，降低C0PB2基因的表达水平，显 著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的C0PB2基因 沉默是恶性肿瘤潜在的临 床非手术治疗方式。
[0063] 本发明提供的SiRNA或者包含该SiRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性 抑制人C0PB2基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中 C0PB2基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要 意义。
【附图说明】
[0064] 图 I :pGCSIL_GFP 质粒 DNA 图谱
[0065] 图2 :C0PB2-RNAi慢病毒侵染肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞5天后，C0PB2mRNA 的表达水平显著降低
[0066] 图3 :C0PB2-RNAi慢病毒侵染肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制 [0067] 图4 :C0PB2-RNAi慢病毒侵染结肠癌RKO细胞5天后，引起细胞增殖抑制
【具体实施方式】
[0068] 本发明基于多种真核翻译起始因子和肿瘤的发生发展密切相关，C0PB2作为一种 真核翻译起始因子，推测其可能可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。
[0069] 本发明涉及了一组针对人C0PB2基因的小分子干扰RNA (siRNA)序列、RNA干扰 载体和RNA干扰慢病毒。选取人C0PB2mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点 中连续的10-30 (优选15-27,更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因 克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明， 上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源C0PB2基因的表达。
[0070] 发明人发现，采用RNAi方法下调人C0PB2基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的 增殖，这一研究成果表明C0PB2基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合 成和测试了多种针对C0PB2基因的siRNA，筛选出了可有效抑制C0PB2的表达进而抑制肺癌 H1299细胞和结肠癌RKO细胞细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
[0071] 本发明提供了一系列干扰人C0PB2基因的小干扰RNA (siRNA)序列，构建了可特 异性沉默C0PB2基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人C0PB2基因设计的小干扰RNA 及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调C0PB2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本 发明表明C0PB2基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通 过RNAi方式沉默C0PB2基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
[0072] 本发明的设计思路为：
[0073] 本发明通过如下方法来筛选获得一种人C0PB2基因 RNAi慢病毒：从Genbank中 调取人C0PB2基因序列；预测siRNA位点；合成针对C0PB2基因的有效的siRNA序列，两端 含酶切位点粘端的双链DNA Oligo;慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达 C0PB2基因 siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体（Packing Mix, Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉 默C0PB2基因的慢病毒。
[0074] 基于上述方法，本发明提供了 10个干扰C0PB2基因的有效靶点（具体如SEQ ID N01-10所示)，构建了特异干扰人C0PB2基因的慢病毒。
[0075] 同时本发明还公开一种人C0PB2基因 RNAi慢病毒（C0PB2-RNAi )及其制备与应用。
[0076] 本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低C0PB2基因在肿瘤细胞中的表 达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，C0PB2基因是一个原癌基因，可促进肿 瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，C0PB2基因可以为肿瘤治疗的靶 标，慢病毒介导的C0PB2基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
[0077] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制 本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条 件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0078] 实施例1针对人C0PB2基因 RNAi慢病毒的制备
[0079] 1.筛选针对人C0PB2基因的有效的SiRNA靶点
[0080] 从Genbank调取C0PB2 (ΝΜ_004766· 2)基因信息；设计针对C0PB2基因的有效的 siRNA靶点。表1列出了其中10条针对C0PB2基因的有效siRNA靶点序列。
[0081] 表1靶向于人C0PB2基因的siRNA靶点序列
[0082]
[0083] 2.慢病毒载体的制备
[0084] 针对siRNA靶点（以SEQ ID NO :5为例）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘 端的双链DNA Oligo序列(表2);以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体 (上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
[0085] 表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
[0086]
[0087] 通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37°C，反应lh)的载体 DNA和纯化好的双链DNA 01 igo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16°C连 接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操 作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶 于10 μ I LB培养基，混匀取1 μ 1作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通 用 PCR 引物（上游引物序列：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'（SEQ ID NO :15);下游引物 序列：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'（SEQ ID N0:16)，进行 PCR 鉴定实验（PCR 反应体系如 表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆 即为构建成功的针对SEQ ID NO :5的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA。
[0088] 构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SEQ ID N0:17)。构建 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 阴性对照质 粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序 列(表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA。
[0089] 表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
[0090]
[0091] 通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37°C，反应Ih)的载体
[0092] 表4pGCSIL_GFP质粒酶切反应体系
[0093]
[0094] 表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
[0095]
[0097] 表6-1PCR反应体系
[0098]
[0099] 表6-2PCR反应体系程序设定
[0100]
[0101] 3.包装 C0PB2-siRNA 慢病毒
[0102] 以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA的 DNA，配制成lOOng/μ 1储存液。
[0103] 转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血 清的DMEM完全培养基调整细胞密度为I. 5 X IO5细胞/ml，接种于6孔板，37°C，5%C02培养箱 内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml 新鲜的完全培养基。按照 Sigma-aldrich 公司的 MISSION Lentiviral Packaging Mix 试 剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix (PVM) 20 μ 1，PEI12 μ 1，无血清DMEM培 养基400 μ 1，取20 μ 1上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
[0104] 将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基 中，37 °C，5%C02培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加 入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置 (Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（l)4°C，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2) 0. 45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3) 4000g离心，10-15min，至需要的病毒 浓缩体积；（4)离心结束后，将过滤杯和下面 的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收 集杯上，离心2min离心力不超过1000 g ; (5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中 的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的SiRNA 的第一链的序列如SEQ ID NO: 15所示。对照慢病毒的包装过程同C0PB2-siRNA慢病毒，仅 以 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 载体代替 pGCSIL-GFP-C0PB2-siRNA 载体。
[0105] 实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测C0PB2基因的沉默效率
[0106] 处于对数生长期的人肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞 悬液(细胞数约为5 X IOVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复 数（M0I，H1299:1 ;RK0 :2)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基， 待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总 RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见 表7,42°C反应lh，然后在70°C水浴锅中水浴IOmin使逆转录酶失活)。
[0107] 采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA)进行实时定量检测。C0PB2基 因的引物如下：上游引物5 ' -GTGGGGACAAGCCATACCTC-3 '（ SEQ ID NO : 18 )和下游引 物 5' -GTGCTCTCAAGCCGGTAGG-3'（SEQ ID NO :19)。以管家基因 GAPDH 为内参，引物 序列如下：上游引物 5' -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'（SEQ ID NO :20)和下游引物 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'（SEQ ID N0:21)。按表 8 中的比例配置反应体系。
[0108] 表7逆转录反应体系
[0109]
[0110] 表 8Real_time PCR 反应体系
[0111]
[0112] 设定程序为两步法Real-time PCR :预变性95°C，15s ;之后每一步变性95°C，5s ; 退火延伸60°C，3〇S;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95°C变 性lmin，然后冷却至55°C，使DNA双链充分结合。从55°C开始到95°C，每一步增加0. 5°C， 保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔα分析法计算侵染了 C0PB2mRNA的表 达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果（图2)表明，人肺癌 H1299细胞和结肠癌RKO细胞中C0PB2mRNA的表达水平下调了 82. 0%和75. 5%。
[0113] 实施例3检测侵染C0PB2_siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
[0114] 处于对数生长期的人肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞 悬液(细胞数约为5 X IOVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复 数（MOI，H1299:1 ;RK0 :2)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5 天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2X10 4/ml)，以 细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100 μ 1。铺好板后，置37°C、 5%C02培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（Thermo Fisher)检测读 板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每 次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果 如图3-图4所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著 减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度。
[0115] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出 若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种分离的人C0PB2基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、结肠癌之任一。3. -种降低肿瘤细胞中C0PB2基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含： a) 双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸序列； 或者 b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与C0PB2基因杂交的核苷酸序列。4. 如权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第 二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与C0PB2 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与C0PB2基因中的靶序列基本相同。5. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述C0PB2基因的靶序列含有 SEQIDNO: 1-10 中任一序列。6. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA， 该小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO:22所示。7. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQID NO:23所示。8. -种C0PB2基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。9. 如权利要求8所述C0PB2基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述C0PB2基因干扰核 酸构建体为干扰慢病毒载体。10. 如权利要求9所述C0PB2基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体 由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自： pLKO. 1-pur。、pLKO?卜CMV-tGFP、pLKO. 1-puro-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、pLKO.l-Neo、pLK0.l-Ne〇-CMV-tGFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、 pLKO.l-pur〇-CMV-TagRFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagFP635、pLK0. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.l-pur〇-UbC_TagFP635、pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、 pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、 pcDNAL2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5_GW/lacZ中的任一。11. 一种C0PB2基因干扰慢病毒，由权利要求9-10任一权利要求所述干扰慢病毒载体 在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。12. -种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一权利 要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述C0PB2基因干扰核酸构建 体，和/或权利要求11所述的C0PB2基因干扰慢病毒。13. 权利要求12所述药物组合物在制备治疗胃癌、肺癌、结肠癌或胶质瘤的肿瘤治疗 药物中的应用。14. 一种用于降低肿瘤细胞中C0PB2基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括：存在于容器中的，权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任
【专利摘要】本发明公开了人COPB2基因的用途及其相关药物。本发明公开了人COPB2基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人COPB2基因小分子干扰RNA、人COPB2基因干扰核酸构建体、人COPB2基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人COPB2基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中COPB2基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/867, A61P35/00, C12N15/113, C12N7/01, C12Q1/68, A61K48/00
【公开号】CN104894223
【申请号】CN201410081471
【发明人】朱向莹, 孙琴, 高博, 张晓慧, 金杨晟, 瞿红花, 曹跃琼
【申请人】上海吉凯基因化学技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月7日
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