检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法及其检测试剂盒的制作方法
检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学领域。涉及检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污 染的方法，具体涉及检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染 的方法；尤其涉及检测结核分枝杆菌RD2区，该区域Rvl980c基因相关的检测具有很高的灵 敏性与特异性。本发明还涉及检测Rvl980c基因的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 据报道，从事传染性病原微生物诊断与研究的工作人员，在实验室内进行大量活 细菌培养或接触感染动物的操作过程中，因实验操作不可避免形成感染性气溶胶而造成实 验区台面、个人防护装备的表面等微环境的污染，从而形成工作人员职业暴露，容易造成实 验室获得性感染（laboratory acquired infection)。
[0003] 结核病是对人类公共卫生、人类健康及经济社会具有很大挑战的严重且古老的传 染病，WHO统计报道全球结核病年发病数900万，其中传染性结核病人390万，每年约有 220万死于结核病。我国结核病的年发病数占全球14. 3%，位居第二位，2010年结核病流行 病学抽样调查结果估算，全国活动性肺结核患病率为392/10万，其中传染性肺结核患病率 为122/10万。控制结核病发展的有效方案是早期诊断和早期治疗，自患者痰标本分离培养 M. tb是诊断结核病诊断的金标准之一，同时M. tb药敏试验的结果是指导临床用药的依据， 因此实验室操作人员经常接触含有大量活的结核分枝杆菌的实验标本。
[0004] 研究显示,结核分枝杆菌iMercWiasis, M. tb)是引起结核病的 主要病原，其细胞壁含有大量的分枝菌酸，对干燥、理化等因素抵抗能力强，在环境中长时 间保持活性与毒力，处于阴暗灰尘中可存活90-120天、痰中可存活6~8个月。少量M. tb的 吸入（1-10个细菌）即可造成肺内感染。M.tb在卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名 录》中（2006)，属第二类高致病性病原微生物，其活菌培养及动物感染实验均需在BSL-3实 验室中进行，临床样本的检测在医学检验实验室内开展。目前M.tb实验室获得性感染仍时 有发生，提示在进行M. tb相关活动中实验室环境存在一定程度的污染尚未得到有效控制， 为保障实验室生物安全，因此实验室环境存在的污染环节及感染概率尚待重视。
[0005] 据调查，实验室M. tb相关的从业人员处于抗击结核病的第一线，实验室获得性结 核感染（laboratory acquired M.tb infection)发生率高，主要感染方式大多是由于实验 操作不当导致M. tb感染性气溶胶扩散于微环境表面从而造成操作人员的吸入。Tiantao Cheng等利用大量程的粒子计数器实时检测了进行M.tb感染动物的BSL-3实验室空气污染 情况，结果显示：实验室核心区空气中未检测到感染性M. tb粒子。目前对M. tb实验室污染 的关键部位，及操作中可能发生较为严重的污染环节尚未见明确报道，对于M. tb实验室微 表面环境污染及操作中导致污染潜在可能性有待研究。
[0006] 综上所述，为了控制结核分枝杆菌实验室获得性感染，本领域迫切需要寻求实验 室微环境污染检测的技术，并开发检测微环境表面污染的检测的方法、试剂盒，以及相关的 控制措施。
[0007] 与本发明相关的现有技术：
[1] . RILEY, R. L. , et al. , Air hygiene in tuberculosis: quantitative studies of infectivity and control in a pilot ward. Am Rev Tuberc, 1957. 75(3): p. 420-31.
[2] . Singh, K. , Laboratory-acquired infections. Clin Infect Dis, 2009. 49(1): p. 142-7.
[3] , WHO, WHO Global Tuberculosis Control WHO Report 2010. 2010.
[4] .卫生部发布全国第五次结核病流行病学抽样调查结果，2011.。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，具体涉及 检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法；尤其涉及检 测结核分枝杆菌RD2区，该区域Rvl980c基因相关的检测具有很高的灵敏性与特异性。本 发明还涉及检测Rvl980c基因的方法和试剂盒。
[0009] 本发明提供了一种生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面 污染的方法，即检测结核分枝杆菌RD2区的Rvl980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等 污染。
[0010] 为了特异的检测实验室微环境表面M. tb的污染，需要选择M. tb基因组特异性的 基因作为检测的祀基因。本发明根据在线数据库http://www. tbdb. org的全基因组比对软 件Synteny MAP对M. tb、BCG、M. S全基因组序列进行比对，选择M. tb基因组DNA差异区 (Region of difference，RD)作为检测 M. tb DNA 的祀基因。
[0011] 本发明中，所述的RV1980C基因位于RD2区序列中，扩增的片段为结核分枝杆菌复合群 所特有的区域，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等非结核分枝杆菌的污染。
[0012] 本发明的检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法,其包括：检测样本中 RD2区域Rvl980c基因的相对量，以此判断所采样区域结核分枝感染污染的严重程度。
[0013] 更具体的，本发明的检测方法，其特征在于，其包括步骤：（a)抽提样品的基因组 DNA，扩增获得Rvl980c基因序列中部分片段区域；（b)检测步骤（a)扩增片段的荧光值与 标准品荧光值比较，从而判断生物实验室微环境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。
[0014] 本发明的检测方法尤其适用于检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝 杆菌微环境表面污染。
[0015] 本发明中，所述的扩增Rvl980c基因片段引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
[0016] 上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操 作方法。例如，所述的扩增可以采用实时定量PCR反应；其中，退火的温度是60摄氏度。循 环数为30。
[0017] 在本发明的一个实施例中，与特异性扩增RD2区Rvl980c片段引物的序列如SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示。
[0018] 本发明证实了 RD2区Rv980c基因检测可用于生物安全实验室及医学检验实验室 结核分枝杆菌微环境表面污染的检测，并且具有高特异性与灵敏性。在此基础上完成了本 发明。
[0019] 本发明提供了一种检测样品是否存在结核分枝杆菌污染及污染严重程度的方法， 包括步骤： (a) 用Rvl980c基因序列特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和 (b) 与提供的标准重组质粒标准品扩增产物荧光值对照从而检测样品中结核分枝杆菌 的相对量。
[0020] 结核分枝杆菌RD2区域基因 Rvl980c位点的详细序列可参见网址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/中登录号为NC_000962. 3的核苷酸序列。
[0021] 本发明提供了一种检测结核分枝杆菌基因片段的方法，它包括检测结核 分枝杆菌RD2 区的Rvl980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等污染。
[0022] 本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增Rvl980c基因片段的引 物。利用本发明检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染，方 法简单易行，快速高效，成本低廉，为实验室生物安全控制及预防实验室获得性感染提供了 一个简捷的新途径。
【附图说明】
[0023] 图1是M. tb、BCG、M. S全基因组比较。
[0024] 图2是Rvl980c基因检测的特异性与灵敏性。
[0025] 图3是一份重组质粒标准品Rvl980c实时定量检测的曲线。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 实施例1荧光PCR检测 一、实验材料 7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液（TaqMan EXPress Master Mix)由美国应用生物系统公司（ABI)定制合成。
[0028] 二、引物及探针设计与合成： 以Rvl980c基因序列为模板，使用0LIG0 7软件分析引物位置，并由生工生物工程(上 海）股份有限公司公司定制合成。
[0029] 检测用引物： Rvl980c 基因检测上游引物序列：5 ' - CCGTGGTGCTCAAGGTCTA -3 ' (SEQ ID NO 1) Rvl980c 基因检测下游引物序列：5 ' - GGTGATTGGCTTGCGATAGG -3 ' (SEQ ID NO 2) 三、样本检测： 实验共检测结核生物安全实验室微环境米样标本160例，每例米集微环境表面5X5平 方厘米范围样本，用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒抽取基因组DNA。
[0030] 按如下反应体系与程序进行荧光PCR扩增，根据与重组质粒标准品对照得出该区 域污染的程度。
[0031] 反应体系：
反应程序 Stage 1 :预变性，95°C 30 sec，Reps 1 ; 5七&86 2屮〇?反应95。〇5 86。，60。〇34 86。，1?印8 40; Dissociation Stage 四、生物安全实验室微环境污染检测情况分析： 微环境表面污染样本采集点的选取主要是与病原微生物操作直接接触的部位，即M. tb 实验活动中表面污染风险相对较高的区域，主要包括排风HEPA过滤器、BSC、换笼柜、个人 防护装备（PPE)、动物饲养笼具（IVC)及离心机等仪器。生物安全实验室所从事的M. tb实 验活动一般分为感染动物的实验活动与细菌的纯培养，一类是与M. tb感染动物相关的实 验活动，一类是M. tb传代培养相关的实验活动。
[0032] 应用real-time PCR方法对样品进行了检测，靶基因为Rvl980c，检测结果显示， 安全柜的栅板处、侧壁、实验区均可检测到M. tb细菌的污染；个人防护装备中手套及反穿 衣的前臂易被M. tb污染，污染的严重程度跟所操作的M. tb的数量存在相关性。由于qPCR 可检测的最低DNA为5个copies，根据qPCR反应体系，那么微环境表面区域检测到DNA拷 贝数>100才有意义，qPCR检测结果显示：微环境表面污染大部分区域的M.tb CFU处于 ΚΚΓ1000之间，提示在实验结束后必须对生物安全柜表面及个人防护装备表面喷洒足够的 消毒液进行处理，外层反穿衣经表面消毒后需在BSL-3核心区内脱去。
[0033] 通过对生物安全实验室微环境表面污染的进行检测，检测结果显示：在Μ. tb纯培 养操作过程中个人防护用品各采样点中，手套结核分枝杆菌DNA检出率高，左右手均有检 出，前胸及大腿前部可检测到细菌DNA但检出率低于手套，而其他部位均未检出；BSC实验 操作台面：未铺设台布的操作面以及污染废弃物区均可检出结核分枝杆菌DNA ;如铺设台 布，台布的操作面则未检出细菌DNA ;此外，生物安全柜的通风栅板处检测到细菌的DNA，这 与BSC的气流组织相关； 在进行M.tb感染动物的灌胃及垫料更换操作中，换笼柜的台面及个人防护用品都可 检测到M. tb的污染。在进行M. tb感染动物的解剖及采血操作中个人防护用品各采样点中， 手套结核分枝杆菌DNA检出率高，左右手均有检出，前胸及大腿前部可检测到细菌DNA但检 出率低于手套，而其他部位均未检出；BSC实验操作台面：未铺设台布的操作面以及污染废 弃物区均可检出结核分枝杆菌DNA ;如铺设台布，台布的操作面则未检出细菌DNA ;此外，生 物安全柜的通风栅板处检测到细菌的DNA，这与BSC的气流组织相关。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作 为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本 发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，其特征在于，通过下述步骤， 检测结核分枝杆菌Rvl980c基因： 步骤（a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得Rvl980c基因序列中部分片段区域； 步骤（b)检测步骤（a)扩增片段的荧光值与标准品荧光值比较，从而判断实验室微环 境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的Rvl980c基因位于结核分枝杆菌 RD2 区。3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增Rvl980c基因片段引物序列 如SEQIDNOl和SEQIDN02 所示。4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增采用的是实时荧光定量PCR 反应；其中，退火的温度是60摄氏度。5. -种检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的检测试剂盒，其特征在于，它含有 结核分枝杆菌RD2区Rvl980c基因的重组质粒标准品。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，它还包括特异性扩增Rvl980c基因序列区 域的引物。7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，特异性扩增Rvl980c基因区域的引物 序列如SEQIDNO:1 和SEQIDNO:2 所示。8. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的实验室是生物安全实验室与医 学检验实验室。
【专利摘要】本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法及其检测试剂盒。本发明提供了一种检测结核分枝杆菌基因片段的方法，它包括检测结核分枝杆菌RD2区的Rv1980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等污染。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增Rv1980c基因片段的引物。利用本发明检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为实验室生物安全控制及预防实验室获得性感染提供了一个简捷的新途径。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/32, C12Q1/04
【公开号】CN104894226
【申请号】CN201410082821
【发明人】韩文东, 瞿涤, 孙志平, 丁悦娜
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月7日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学领域。涉及检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污 染的方法，具体涉及检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染 的方法；尤其涉及检测结核分枝杆菌RD2区，该区域Rvl980c基因相关的检测具有很高的灵 敏性与特异性。本发明还涉及检测Rvl980c基因的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 据报道，从事传染性病原微生物诊断与研究的工作人员，在实验室内进行大量活 细菌培养或接触感染动物的操作过程中，因实验操作不可避免形成感染性气溶胶而造成实 验区台面、个人防护装备的表面等微环境的污染，从而形成工作人员职业暴露，容易造成实 验室获得性感染（laboratory acquired infection)。
[0003] 结核病是对人类公共卫生、人类健康及经济社会具有很大挑战的严重且古老的传 染病，WHO统计报道全球结核病年发病数900万，其中传染性结核病人390万，每年约有 220万死于结核病。我国结核病的年发病数占全球14. 3%，位居第二位，2010年结核病流行 病学抽样调查结果估算，全国活动性肺结核患病率为392/10万，其中传染性肺结核患病率 为122/10万。控制结核病发展的有效方案是早期诊断和早期治疗，自患者痰标本分离培养 M. tb是诊断结核病诊断的金标准之一，同时M. tb药敏试验的结果是指导临床用药的依据， 因此实验室操作人员经常接触含有大量活的结核分枝杆菌的实验标本。
[0004] 研究显示,结核分枝杆菌iMercWiasis, M. tb)是引起结核病的 主要病原，其细胞壁含有大量的分枝菌酸，对干燥、理化等因素抵抗能力强，在环境中长时 间保持活性与毒力，处于阴暗灰尘中可存活90-120天、痰中可存活6~8个月。少量M. tb的 吸入（1-10个细菌）即可造成肺内感染。M.tb在卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名 录》中（2006)，属第二类高致病性病原微生物，其活菌培养及动物感染实验均需在BSL-3实 验室中进行，临床样本的检测在医学检验实验室内开展。目前M.tb实验室获得性感染仍时 有发生，提示在进行M. tb相关活动中实验室环境存在一定程度的污染尚未得到有效控制， 为保障实验室生物安全，因此实验室环境存在的污染环节及感染概率尚待重视。
[0005] 据调查，实验室M. tb相关的从业人员处于抗击结核病的第一线，实验室获得性结 核感染（laboratory acquired M.tb infection)发生率高，主要感染方式大多是由于实验 操作不当导致M. tb感染性气溶胶扩散于微环境表面从而造成操作人员的吸入。Tiantao Cheng等利用大量程的粒子计数器实时检测了进行M.tb感染动物的BSL-3实验室空气污染 情况，结果显示：实验室核心区空气中未检测到感染性M. tb粒子。目前对M. tb实验室污染 的关键部位，及操作中可能发生较为严重的污染环节尚未见明确报道，对于M. tb实验室微 表面环境污染及操作中导致污染潜在可能性有待研究。
[0006] 综上所述，为了控制结核分枝杆菌实验室获得性感染，本领域迫切需要寻求实验 室微环境污染检测的技术，并开发检测微环境表面污染的检测的方法、试剂盒，以及相关的 控制措施。
[0007] 与本发明相关的现有技术：
[1] . RILEY, R. L. , et al. , Air hygiene in tuberculosis: quantitative studies of infectivity and control in a pilot ward. Am Rev Tuberc, 1957. 75(3): p. 420-31.
[2] . Singh, K. , Laboratory-acquired infections. Clin Infect Dis, 2009. 49(1): p. 142-7.
[3] , WHO, WHO Global Tuberculosis Control WHO Report 2010. 2010.
[4] .卫生部发布全国第五次结核病流行病学抽样调查结果，2011.。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，具体涉及 检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法；尤其涉及检 测结核分枝杆菌RD2区，该区域Rvl980c基因相关的检测具有很高的灵敏性与特异性。本 发明还涉及检测Rvl980c基因的方法和试剂盒。
[0009] 本发明提供了一种生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面 污染的方法，即检测结核分枝杆菌RD2区的Rvl980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等 污染。
[0010] 为了特异的检测实验室微环境表面M. tb的污染，需要选择M. tb基因组特异性的 基因作为检测的祀基因。本发明根据在线数据库http://www. tbdb. org的全基因组比对软 件Synteny MAP对M. tb、BCG、M. S全基因组序列进行比对，选择M. tb基因组DNA差异区 (Region of difference，RD)作为检测 M. tb DNA 的祀基因。
[0011] 本发明中，所述的RV1980C基因位于RD2区序列中，扩增的片段为结核分枝杆菌复合群 所特有的区域，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等非结核分枝杆菌的污染。
[0012] 本发明的检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法,其包括：检测样本中 RD2区域Rvl980c基因的相对量，以此判断所采样区域结核分枝感染污染的严重程度。
[0013] 更具体的，本发明的检测方法，其特征在于，其包括步骤：（a)抽提样品的基因组 DNA，扩增获得Rvl980c基因序列中部分片段区域；（b)检测步骤（a)扩增片段的荧光值与 标准品荧光值比较，从而判断生物实验室微环境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。
[0014] 本发明的检测方法尤其适用于检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝 杆菌微环境表面污染。
[0015] 本发明中，所述的扩增Rvl980c基因片段引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
[0016] 上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操 作方法。例如，所述的扩增可以采用实时定量PCR反应；其中，退火的温度是60摄氏度。循 环数为30。
[0017] 在本发明的一个实施例中，与特异性扩增RD2区Rvl980c片段引物的序列如SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示。
[0018] 本发明证实了 RD2区Rv980c基因检测可用于生物安全实验室及医学检验实验室 结核分枝杆菌微环境表面污染的检测，并且具有高特异性与灵敏性。在此基础上完成了本 发明。
[0019] 本发明提供了一种检测样品是否存在结核分枝杆菌污染及污染严重程度的方法， 包括步骤： (a) 用Rvl980c基因序列特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和 (b) 与提供的标准重组质粒标准品扩增产物荧光值对照从而检测样品中结核分枝杆菌 的相对量。
[0020] 结核分枝杆菌RD2区域基因 Rvl980c位点的详细序列可参见网址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/中登录号为NC_000962. 3的核苷酸序列。
[0021] 本发明提供了一种检测结核分枝杆菌基因片段的方法，它包括检测结核 分枝杆菌RD2 区的Rvl980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等污染。
[0022] 本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增Rvl980c基因片段的引 物。利用本发明检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染，方 法简单易行，快速高效，成本低廉，为实验室生物安全控制及预防实验室获得性感染提供了 一个简捷的新途径。
【附图说明】
[0023] 图1是M. tb、BCG、M. S全基因组比较。
[0024] 图2是Rvl980c基因检测的特异性与灵敏性。
[0025] 图3是一份重组质粒标准品Rvl980c实时定量检测的曲线。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 实施例1荧光PCR检测 一、实验材料 7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液（TaqMan EXPress Master Mix)由美国应用生物系统公司（ABI)定制合成。
[0028] 二、引物及探针设计与合成： 以Rvl980c基因序列为模板，使用0LIG0 7软件分析引物位置，并由生工生物工程(上 海）股份有限公司公司定制合成。
[0029] 检测用引物： Rvl980c 基因检测上游引物序列：5 ' - CCGTGGTGCTCAAGGTCTA -3 ' (SEQ ID NO 1) Rvl980c 基因检测下游引物序列：5 ' - GGTGATTGGCTTGCGATAGG -3 ' (SEQ ID NO 2) 三、样本检测： 实验共检测结核生物安全实验室微环境米样标本160例，每例米集微环境表面5X5平 方厘米范围样本，用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒抽取基因组DNA。
[0030] 按如下反应体系与程序进行荧光PCR扩增，根据与重组质粒标准品对照得出该区 域污染的程度。
[0031] 反应体系：
反应程序 Stage 1 :预变性，95°C 30 sec，Reps 1 ; 5七&86 2屮〇?反应95。〇5 86。，60。〇34 86。，1?印8 40; Dissociation Stage 四、生物安全实验室微环境污染检测情况分析： 微环境表面污染样本采集点的选取主要是与病原微生物操作直接接触的部位，即M. tb 实验活动中表面污染风险相对较高的区域，主要包括排风HEPA过滤器、BSC、换笼柜、个人 防护装备（PPE)、动物饲养笼具（IVC)及离心机等仪器。生物安全实验室所从事的M. tb实 验活动一般分为感染动物的实验活动与细菌的纯培养，一类是与M. tb感染动物相关的实 验活动，一类是M. tb传代培养相关的实验活动。
[0032] 应用real-time PCR方法对样品进行了检测，靶基因为Rvl980c，检测结果显示， 安全柜的栅板处、侧壁、实验区均可检测到M. tb细菌的污染；个人防护装备中手套及反穿 衣的前臂易被M. tb污染，污染的严重程度跟所操作的M. tb的数量存在相关性。由于qPCR 可检测的最低DNA为5个copies，根据qPCR反应体系，那么微环境表面区域检测到DNA拷 贝数>100才有意义，qPCR检测结果显示：微环境表面污染大部分区域的M.tb CFU处于 ΚΚΓ1000之间，提示在实验结束后必须对生物安全柜表面及个人防护装备表面喷洒足够的 消毒液进行处理，外层反穿衣经表面消毒后需在BSL-3核心区内脱去。
[0033] 通过对生物安全实验室微环境表面污染的进行检测，检测结果显示：在Μ. tb纯培 养操作过程中个人防护用品各采样点中，手套结核分枝杆菌DNA检出率高，左右手均有检 出，前胸及大腿前部可检测到细菌DNA但检出率低于手套，而其他部位均未检出；BSC实验 操作台面：未铺设台布的操作面以及污染废弃物区均可检出结核分枝杆菌DNA ;如铺设台 布，台布的操作面则未检出细菌DNA ;此外，生物安全柜的通风栅板处检测到细菌的DNA，这 与BSC的气流组织相关； 在进行M.tb感染动物的灌胃及垫料更换操作中，换笼柜的台面及个人防护用品都可 检测到M. tb的污染。在进行M. tb感染动物的解剖及采血操作中个人防护用品各采样点中， 手套结核分枝杆菌DNA检出率高，左右手均有检出，前胸及大腿前部可检测到细菌DNA但检 出率低于手套，而其他部位均未检出；BSC实验操作台面：未铺设台布的操作面以及污染废 弃物区均可检出结核分枝杆菌DNA ;如铺设台布，台布的操作面则未检出细菌DNA ;此外，生 物安全柜的通风栅板处检测到细菌的DNA，这与BSC的气流组织相关。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作 为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本 发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，其特征在于，通过下述步骤， 检测结核分枝杆菌Rvl980c基因： 步骤（a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得Rvl980c基因序列中部分片段区域； 步骤（b)检测步骤（a)扩增片段的荧光值与标准品荧光值比较，从而判断实验室微环 境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的Rvl980c基因位于结核分枝杆菌 RD2 区。3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增Rvl980c基因片段引物序列 如SEQIDNOl和SEQIDN02 所示。4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增采用的是实时荧光定量PCR 反应；其中，退火的温度是60摄氏度。5. -种检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的检测试剂盒，其特征在于，它含有 结核分枝杆菌RD2区Rvl980c基因的重组质粒标准品。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，它还包括特异性扩增Rvl980c基因序列区 域的引物。7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，特异性扩增Rvl980c基因区域的引物 序列如SEQIDNO:1 和SEQIDNO:2 所示。8. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的实验室是生物安全实验室与医 学检验实验室。
【专利摘要】本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法及其检测试剂盒。本发明提供了一种检测结核分枝杆菌基因片段的方法，它包括检测结核分枝杆菌RD2区的Rv1980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等污染。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增Rv1980c基因片段的引物。利用本发明检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为实验室生物安全控制及预防实验室获得性感染提供了一个简捷的新途径。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/32, C12Q1/04
【公开号】CN104894226
【申请号】CN201410082821
【发明人】韩文东, 瞿涤, 孙志平, 丁悦娜
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月7日
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