一种羊奶中掺杂牛奶或豆浆的快速检测试剂盒的制作方法
一种羊奶中掺杂牛奶或豆浆的快速检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全检测技术领域，具体是羊奶中掺杂牛奶或豆浆的快速检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 据营养学专家介绍，羊奶在国际营养学界被称为"奶中之王"，羊奶中含有的维生 素和微量元素都明显的高于牛奶，美国、欧洲的部分国家均把羊奶视为营养佳品，在欧洲鲜 羊奶的售价是牛奶的7倍。羊奶的蛋白质结构构成与人奶的基本相同，含有大量的乳清蛋 白，且不含牛奶中的某些可致过敏的异性蛋白。因此，任何体质的婴儿，特别是胃肠较弱、体 质较差的婴儿都可以接受羊奶。近年来，羊奶制品在市场上得到了消费者的认可，不少消费 者选择了喝羊奶，且羊奶制品的价格也高于普通的牛奶制品。在市场利益的驱动下，一些没 有羊奶资源的企业也纷纷推出了羊奶制品，一时间市场上真假羊奶制品难辨。有些企业在 羊奶中掺入牛奶或者豆浆，冒充羊奶，严重侵害了消费者的利益。我国乳品工业与发达国家 的差距仍然十分明显，质量参差不齐，尤其是液态奶、奶粉及奶制品中掺假现象非常普遍， 掺假手段多种多样，不断变换，而我国掺假检测环节十分薄弱。在这样严峻的情况下，我国 奶业想得到健康的发展，就迫切需要解决上述问题，需要对大量的液态奶，奶粉及奶制品等 进行实时快速的掺假测定。所以开发一种快速有效的检测掺假问题的试剂盒势在必行。
[0003] 目前常用的检测技术主要有：感官鉴评、传统实验、近红外光谱技术检测、ELISA 法等。这些方法存在灵敏度低、准确率不高、重复性差等缺点。以聚合酶链式反应（PCR)为 基础的技术已逐步成为了食品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR 技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得成分含量的定量溯源 成为可能。在目标基因选择方面，动物细胞线粒体基因组DNA序列既具有高度物种特异性 可变区，又具有保守性的保守区，这样只需在相对保守区设计一对通用引物，在可变区设计 相应特异探针，能够保证检测过程中不会出现物种间非特异性扩增而导致交叉和干扰，此 外目前对羊奶中同时检测牛奶和豆浆成分的荧光定量PCR检测研究还没报到，因此，建立 一种带有扩增内标的羊奶和牛奶及豆浆源性荧光定量PCR检测方法将对羊奶、牛奶及奶制 品安全的快速监管具有重要的创新性实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的检测试剂 盒。
[0005] 为实现上述目的，该试剂盒包括一对羊奶和牛奶共用引物，豆浆特异引物及对应 的3种检测探针，其中还有一条人工合成外源性内参序列及相应引物和探针。
[0006] 本发明从牛、山羊或绵羊及豆浆的线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因序列 的物种特异性出发，探索并完善一种快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的检测试剂 盒。
[0007] 分子信标具有高灵敏性，高特异性、相较于TaqMan探针荧光本底低，不仅可以用 于基因的定量、定性检测，还可以应用到基因点突变等分析，基于这些优点，本试剂盒采用 分子信标探针（MB)法4重多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测牛奶，羊奶及豆浆三种 成分，而且本试剂盒中加入外源性内参作为内标，可有效避免因样本含有PCR抑制物而产 生的假阴性结果。
[0008] 本试剂盒包括：PCR缓冲液、MgC12和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特 异性扩增的牛、羊及大豆引物混合物，对上述物种进行特异检测的探针混合物，以及内标引 物，人工构建内标质粒及探针混合物。
[0009] 本试剂盒在引物设计方面：根据NCBI数据库中查找牛、山羊和绵羊线粒体基因 组上的16SrRNA基因序列，以及大豆kti-s(GI :510514)基因序列，应用同源分析工具 Clastaw软件对其同源性比对，利用引物设计软件Primerf. 0根据筛选出的核心片段两端 相似序列设计一对通用引物，使用BeaconDesigner2. 0设计特异分子信标（MB)探针，将 设计好的探针和引物在NCBI数据库中BLAST分析其特异性，进一步用在线软件（http:// mfold. rna. albany. edu/ ? q = mfold)确定其二级结构。探针分别采用4种不同发光基团 对各个探针的5'端进行荧光素修饰，牛奶探针（NP)用CY3标记，羊奶探针（YP)用JOE标 记，豆楽探针LectinP用FAM标记，内标探针（IACP)用ROX标记，3'端的淬灭基团用Dabcyl 修饰。
[0010]用于快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的引物为：
[0011] 大豆特异引物：
[0012] LectinF :5' CTCTACTCCACCCCCATCCACAT-3'
[0013] LectinR :5, AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG-3'
[0014] 牛奶、羊奶通用特异引物：
[0015] UF : 5，AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA-3 '
[0016] UR : 5，GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3 '
[0017] 内参引物：
[0018] IACF: 5，AgACCACCAAATgCCCCTATC-3 '
[0019] IACR: 5，CgAgATTgAgATCTTCTgCgAC-3，
[0020] 用于快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的探针为：
[0021] 牛奶（NP):
[0022] 5, CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG-3'
[0023] 羊奶（YP) :5' CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG-3'
[0024] 豆浆（LectinP) :5, CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3'
[0025] 内参（IACP) :5, -gCgAggTCCCCTAgAAgAAgAACTCCCTCgC-3，
[0026] 本发明所用PCR复合扩增反应的条件：优先选用20ul的PCR扩增体系包括pH值 为8. 9,镁离子浓度为2. 5mM，4种dNTP的终浓度各为250 μ M，Taq酶的用量为0. 2U/μ L，引 物探针混合物中的引物、探针的终浓度为0. 4μΜ，及lpg/ul的内标DNA。
[0027] 20ul反应体系如下：
[0028] 试剂名称 I浓度 I用量UlT
[0029] 使用所述的试剂i进行PCR扩'时，扩增k段反应可任何型号的荧光定量PCR 仪上进行，扩增程序：95°C Imin ;45个循环，95°C 5s，60°C 34s，在此收集荧光信号。
[0030] 其中所检测牛奶，羊奶及奶粉的基因组DNA提取方法首次采用Chelex-IOO加热释 放DNA及玻璃奶纯化基因组DNA的办法进行提取，具体实施步骤如下
[0031] 1、白细胞收集
[0032] ①取牛奶或羊奶2ml，或者奶粉20mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4°C 离心30分钟；
[0033] ②弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加 lmLPH7. 4
[0034] 灭菌的PBS (磷酸缓冲液），将底部沉淀吹打悬浮并转移至I. 5mL的离心管中，在 3500r/min，常温（20-25°C )下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；
[0035] 2、弃上清后，加入 5% 的 Chelex-100280ul 及 20mg/ml 蛋白酶K20ul，56°C保温 30min以上。
[0036] 3、高速震荡 5-10s，100°C煮沸 8min ;
[0037] 4、高速震荡5_10s，13000r/min离心3min,将上清转移至离心柱中，13000r/min离 心Imin，收集液体
[0038] 5、向收集液体中加入 GlassMilk20ul,加 600ulgDNABindingBuffer,充分混匀， 65°水浴15min，中间要反转几次；
[0039] 6、室温放置5min，中间反转几次；
[0040] 7、4000rpm离心Imin,弃上清，留管底；
[0041] 8、70%酒精5 00ul洗漆8000r/min离心Imin,重复此步骤2次；
[0042] 9、加入500ul无水乙醇，；吹打悬浮，洗涤8000r/min离心lmin，弃上清；
[0043] 10、8000r/min离心30S，用IOul枪头吸走残余液体，室温干燥IOmin ;
[0044] 11、加100ulTE(PH7. 0)70° 5min水浴，离心，吸取上清转移至新的离心管中，-20 度保存。
[0045] 本发明中应用的DNA提取方法属首次应用，使用该方法提取的基因组DNA产量高， 纯度好，可以消除对后续荧光定量PCR反应条件的抑制，可以应用于更高级别分子生物学 实验检测，如DNA测序，基因克隆等。
[0046] 本发明与现有的检测技术相比其优点在于：本试剂盒采用分子信标探针（MB)4重 多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测牛奶，羊奶及豆浆三种成分，而且本试剂盒中加入 外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。本发明 检测方法具有良好的针对目标物种的特异性的同时，牛奶及羊奶共用一对引物，可以大大 降低多对引物对荧光定量PCR体系干扰的风险，通过实时监控PCR反应避免了假阴性检测 结果的产生，为羊奶中掺杂牛奶或豆浆等成分的鉴定探索了新的途径，四重多色荧光定量 PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高、特异性 强等有益效果。
【附图说明】
[0047] 图1 :纯羊奶、纯牛奶和纯豆浆的实时荧光定量PCR扩增曲线。A :纯牛奶，B :纯羊 奶，C :纯豆浆。
[0048] 图2 :掺假奶类的实时荧光定量PCR扩增曲线。A :羊奶中掺豆楽，B :羊奶中掺牛 奶。
[0049] 图3 :市售样本的实时荧光定量PCR扩增曲线。A :某品牌羊奶中检测到牛源成份， B :某品牌牛奶中同时检测牛源及大豆成份。 图4:牛源性探针特异性摸索实验结果.A: NPl-第一对探针，B: NP2-第二对探针。 图5:羊源性探针特异性摸索实验结果.A:YP1-第一对探针，B:YP2-第二对探针。
【具体实施方式】
[0050] 1.特异性试验
[0051] 分别以山羊肉、绵羊肉、玉米、牛肉、鸭肉、狐狸肉、鸡肉、水貂肉和猪肉中提取的基 因组DNA和牛奶、羊奶、豆浆中提取的基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应 条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性。20ul反应体系包含（表1):
[0052] 表 1 :
[0053]
[0054] 结果显示，山羊肉；牛肉、豆浆、牛奶和羊奶均有扩增曲线，而其他样本没有扩增。 结果见表2。可见本试剂盒中的引物及探针特异性良好。
[0055] 表 2 :
[0056]
[0057] 2.灵敏度试验：
[0058] (1)基因组DNA灵敏度试验
[0059] 将提取的纯羊奶，牛奶，及豆楽目标基因组DNA用Nanodrop定量到IOOng,做IOX 梯度稀释（10-1，10-2,10-3,10-4)，每个梯度均取2ul为模板量，按照上述方法分别对纯羊 奶，纯牛奶，及豆浆考察方法的灵敏度。
[0060] 结果显示（图1)，当荧光定量模板用量为〇.2ng时，存在明显的扩增曲线，此时纯 羊奶，牛奶，及豆浆模板检测到的Ct值分别为33. 64+0. 02, 35. 51+0. 018, 34. 87+0. 03,则该 荧光定量PCR检测的下限为0. 2ng。
[0061] (2)羊奶中掺杂牛奶或豆浆灵敏度试验
[0062] 将豆浆和羊奶以一定比例混合，制成豆浆含量分别为0%、0. 5%、10%和20%的混合奶样品；将牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分别为0%、 0· 1%、0· 5%、1%、5%、10%和20%的混合奶样本。
[0063] 结果显示（图2)，当牛奶或豆浆以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的比例（体 积比）掺入至羊奶中时，通过本试剂盒均能检测出来，且牛奶或豆浆掺入的比例越高Ct值 越小，表明本试剂盒检测灵敏度可达到0. 1%。
[0064] 3、重复性试验
[0065] 分别取纯羊奶，牛奶，及豆浆DNA各3份，按照上述优化好的体系、PCR条件进行实 时定量PCR，每个样品进行3次复孔的独立重复，考察方法的稳定性，结果见表2。结果显示 每个样品的3次独立重复实验Ct值得标准方差均小于0. 5。说明检测结果重复性好，检测 稳定性好。
[0066] 表3:重复性试验结果
[0067]
[0068] 4、市售样本的实际检测
[0069] 使用优化后的荧光定量PCR方法，对市售羊奶，羊奶粉，牛奶，牛奶粉进行鉴定， 验证方法的使用价值。样本的分类与检测结果见表3及图3。由表中可见，用牛奶和豆浆 掺假羊奶及羊奶粉的现象较为严重。对于羊奶，羊奶粉检出多为牛奶成分，少数也有大豆成 分，对于牛奶及牛奶粉检出多为大豆成分。
[0070] 表4 :市售样本的实际检测结果显示
[0071]
[0072] 5、对比试验
[0073] 牛源性探针设计如下：
[0074] NPl:5'CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG3'
[0075] NP2 :5'CGGCGGTAACTAACCAACCCAAAGAGAATCCGCCG3'
[0076] 羊源性探针设计如下：
[0077] YPl:5'CGCCGGAACCACCAAGGGATAACAACACCGGCG3'
[0078] YP2 :5'CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG3'
[0079] 相同PCR条件下比较：扩增程序：95°C Imin ;45个循环，95°C 5s，60°C 34s，在此收 集荧光信号。实验结果参见图4、图5。
[0080] 结果表明，本发明所用探针优于其他探针。
【主权项】
1. 一种试剂盒，其特征在于，包括一对羊奶牛奶共用引物，豆浆特异引物及对应的3种 检测探针，还包括一条人工合成外源性内参序列及相应引物和探针。2. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的羊奶牛奶共用引物为： UF:5'AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA-3， UR:5'GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3'。3. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的豆浆特异引物为： LectinF:5'CTCTACTCCACCCCCATCCACAT-3' LectinR:5'AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG-3'。4. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的内源引物为： IACF: 5，AgACCACCAAATgCCCCTATC-3 ' IACR:5'CgAgATTgAgATCTTCTgCgAC-3'。5. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于， 所述牛奶探针为：NP: 5 'CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG-3 ' 所述羊奶探针为：YP: 5 'CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG-3， 所述豆浆探针为：LectinP: 5 'CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3 ' 所述内标探针为：IACP: 5, -gCgAggTCCCCTAgAAgAAgAACTCCCTCgC-3,。
【专利摘要】本发明从牛、山羊或绵羊及豆浆的线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因序列的物种特异性出发，探索并完善一种快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的检测试剂盒。本试剂盒包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增的牛、羊及大豆引物混合物，对上述物种进行特异检测的探针混合物,以及人工合成外源性内参序列及相应引物和探针。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894227
【申请号】CN201410515598
【发明人】张全芳, 步迅, 刘艳艳
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年9月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全检测技术领域，具体是羊奶中掺杂牛奶或豆浆的快速检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 据营养学专家介绍，羊奶在国际营养学界被称为"奶中之王"，羊奶中含有的维生 素和微量元素都明显的高于牛奶，美国、欧洲的部分国家均把羊奶视为营养佳品，在欧洲鲜 羊奶的售价是牛奶的7倍。羊奶的蛋白质结构构成与人奶的基本相同，含有大量的乳清蛋 白，且不含牛奶中的某些可致过敏的异性蛋白。因此，任何体质的婴儿，特别是胃肠较弱、体 质较差的婴儿都可以接受羊奶。近年来，羊奶制品在市场上得到了消费者的认可，不少消费 者选择了喝羊奶，且羊奶制品的价格也高于普通的牛奶制品。在市场利益的驱动下，一些没 有羊奶资源的企业也纷纷推出了羊奶制品，一时间市场上真假羊奶制品难辨。有些企业在 羊奶中掺入牛奶或者豆浆，冒充羊奶，严重侵害了消费者的利益。我国乳品工业与发达国家 的差距仍然十分明显，质量参差不齐，尤其是液态奶、奶粉及奶制品中掺假现象非常普遍， 掺假手段多种多样，不断变换，而我国掺假检测环节十分薄弱。在这样严峻的情况下，我国 奶业想得到健康的发展，就迫切需要解决上述问题，需要对大量的液态奶，奶粉及奶制品等 进行实时快速的掺假测定。所以开发一种快速有效的检测掺假问题的试剂盒势在必行。
[0003] 目前常用的检测技术主要有：感官鉴评、传统实验、近红外光谱技术检测、ELISA 法等。这些方法存在灵敏度低、准确率不高、重复性差等缺点。以聚合酶链式反应（PCR)为 基础的技术已逐步成为了食品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR 技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得成分含量的定量溯源 成为可能。在目标基因选择方面，动物细胞线粒体基因组DNA序列既具有高度物种特异性 可变区，又具有保守性的保守区，这样只需在相对保守区设计一对通用引物，在可变区设计 相应特异探针，能够保证检测过程中不会出现物种间非特异性扩增而导致交叉和干扰，此 外目前对羊奶中同时检测牛奶和豆浆成分的荧光定量PCR检测研究还没报到，因此，建立 一种带有扩增内标的羊奶和牛奶及豆浆源性荧光定量PCR检测方法将对羊奶、牛奶及奶制 品安全的快速监管具有重要的创新性实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的检测试剂 盒。
[0005] 为实现上述目的，该试剂盒包括一对羊奶和牛奶共用引物，豆浆特异引物及对应 的3种检测探针，其中还有一条人工合成外源性内参序列及相应引物和探针。
[0006] 本发明从牛、山羊或绵羊及豆浆的线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因序列 的物种特异性出发，探索并完善一种快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的检测试剂 盒。
[0007] 分子信标具有高灵敏性，高特异性、相较于TaqMan探针荧光本底低，不仅可以用 于基因的定量、定性检测，还可以应用到基因点突变等分析，基于这些优点，本试剂盒采用 分子信标探针（MB)法4重多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测牛奶，羊奶及豆浆三种 成分，而且本试剂盒中加入外源性内参作为内标，可有效避免因样本含有PCR抑制物而产 生的假阴性结果。
[0008] 本试剂盒包括：PCR缓冲液、MgC12和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特 异性扩增的牛、羊及大豆引物混合物，对上述物种进行特异检测的探针混合物，以及内标引 物，人工构建内标质粒及探针混合物。
[0009] 本试剂盒在引物设计方面：根据NCBI数据库中查找牛、山羊和绵羊线粒体基因 组上的16SrRNA基因序列，以及大豆kti-s(GI :510514)基因序列，应用同源分析工具 Clastaw软件对其同源性比对，利用引物设计软件Primerf. 0根据筛选出的核心片段两端 相似序列设计一对通用引物，使用BeaconDesigner2. 0设计特异分子信标（MB)探针，将 设计好的探针和引物在NCBI数据库中BLAST分析其特异性，进一步用在线软件（http:// mfold. rna. albany. edu/ ? q = mfold)确定其二级结构。探针分别采用4种不同发光基团 对各个探针的5'端进行荧光素修饰，牛奶探针（NP)用CY3标记，羊奶探针（YP)用JOE标 记，豆楽探针LectinP用FAM标记，内标探针（IACP)用ROX标记，3'端的淬灭基团用Dabcyl 修饰。
[0010]用于快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的引物为：
[0011] 大豆特异引物：
[0012] LectinF :5' CTCTACTCCACCCCCATCCACAT-3'
[0013] LectinR :5, AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG-3'
[0014] 牛奶、羊奶通用特异引物：
[0015] UF : 5，AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA-3 '
[0016] UR : 5，GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3 '
[0017] 内参引物：
[0018] IACF: 5，AgACCACCAAATgCCCCTATC-3 '
[0019] IACR: 5，CgAgATTgAgATCTTCTgCgAC-3，
[0020] 用于快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的探针为：
[0021] 牛奶（NP):
[0022] 5, CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG-3'
[0023] 羊奶（YP) :5' CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG-3'
[0024] 豆浆（LectinP) :5, CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3'
[0025] 内参（IACP) :5, -gCgAggTCCCCTAgAAgAAgAACTCCCTCgC-3，
[0026] 本发明所用PCR复合扩增反应的条件：优先选用20ul的PCR扩增体系包括pH值 为8. 9,镁离子浓度为2. 5mM，4种dNTP的终浓度各为250 μ M，Taq酶的用量为0. 2U/μ L，引 物探针混合物中的引物、探针的终浓度为0. 4μΜ，及lpg/ul的内标DNA。
[0027] 20ul反应体系如下：
[0028] 试剂名称 I浓度 I用量UlT
[0029] 使用所述的试剂i进行PCR扩'时，扩增k段反应可任何型号的荧光定量PCR 仪上进行，扩增程序：95°C Imin ;45个循环，95°C 5s，60°C 34s，在此收集荧光信号。
[0030] 其中所检测牛奶，羊奶及奶粉的基因组DNA提取方法首次采用Chelex-IOO加热释 放DNA及玻璃奶纯化基因组DNA的办法进行提取，具体实施步骤如下
[0031] 1、白细胞收集
[0032] ①取牛奶或羊奶2ml，或者奶粉20mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4°C 离心30分钟；
[0033] ②弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加 lmLPH7. 4
[0034] 灭菌的PBS (磷酸缓冲液），将底部沉淀吹打悬浮并转移至I. 5mL的离心管中，在 3500r/min，常温（20-25°C )下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；
[0035] 2、弃上清后，加入 5% 的 Chelex-100280ul 及 20mg/ml 蛋白酶K20ul，56°C保温 30min以上。
[0036] 3、高速震荡 5-10s，100°C煮沸 8min ;
[0037] 4、高速震荡5_10s，13000r/min离心3min,将上清转移至离心柱中，13000r/min离 心Imin，收集液体
[0038] 5、向收集液体中加入 GlassMilk20ul,加 600ulgDNABindingBuffer,充分混匀， 65°水浴15min，中间要反转几次；
[0039] 6、室温放置5min，中间反转几次；
[0040] 7、4000rpm离心Imin,弃上清，留管底；
[0041] 8、70%酒精5 00ul洗漆8000r/min离心Imin,重复此步骤2次；
[0042] 9、加入500ul无水乙醇，；吹打悬浮，洗涤8000r/min离心lmin，弃上清；
[0043] 10、8000r/min离心30S，用IOul枪头吸走残余液体，室温干燥IOmin ;
[0044] 11、加100ulTE(PH7. 0)70° 5min水浴，离心，吸取上清转移至新的离心管中，-20 度保存。
[0045] 本发明中应用的DNA提取方法属首次应用，使用该方法提取的基因组DNA产量高， 纯度好，可以消除对后续荧光定量PCR反应条件的抑制，可以应用于更高级别分子生物学 实验检测，如DNA测序，基因克隆等。
[0046] 本发明与现有的检测技术相比其优点在于：本试剂盒采用分子信标探针（MB)4重 多色荧光定量PCR检测技术，同时能检测牛奶，羊奶及豆浆三种成分，而且本试剂盒中加入 外源性内参作为内标，可检测和避免因样本含有PCR抑制物而产生的假阴性结果。本发明 检测方法具有良好的针对目标物种的特异性的同时，牛奶及羊奶共用一对引物，可以大大 降低多对引物对荧光定量PCR体系干扰的风险，通过实时监控PCR反应避免了假阴性检测 结果的产生，为羊奶中掺杂牛奶或豆浆等成分的鉴定探索了新的途径，四重多色荧光定量 PCR是在同一管内检测，无需开盖，不易污染，具有准确稳定、操作简单，灵敏度极高、特异性 强等有益效果。
【附图说明】
[0047] 图1 :纯羊奶、纯牛奶和纯豆浆的实时荧光定量PCR扩增曲线。A :纯牛奶，B :纯羊 奶，C :纯豆浆。
[0048] 图2 :掺假奶类的实时荧光定量PCR扩增曲线。A :羊奶中掺豆楽，B :羊奶中掺牛 奶。
[0049] 图3 :市售样本的实时荧光定量PCR扩增曲线。A :某品牌羊奶中检测到牛源成份， B :某品牌牛奶中同时检测牛源及大豆成份。 图4:牛源性探针特异性摸索实验结果.A: NPl-第一对探针，B: NP2-第二对探针。 图5:羊源性探针特异性摸索实验结果.A:YP1-第一对探针，B:YP2-第二对探针。
【具体实施方式】
[0050] 1.特异性试验
[0051] 分别以山羊肉、绵羊肉、玉米、牛肉、鸭肉、狐狸肉、鸡肉、水貂肉和猪肉中提取的基 因组DNA和牛奶、羊奶、豆浆中提取的基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应 条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性。20ul反应体系包含（表1):
[0052] 表 1 :
[0053]
[0054] 结果显示，山羊肉；牛肉、豆浆、牛奶和羊奶均有扩增曲线，而其他样本没有扩增。 结果见表2。可见本试剂盒中的引物及探针特异性良好。
[0055] 表 2 :
[0056]
[0057] 2.灵敏度试验：
[0058] (1)基因组DNA灵敏度试验
[0059] 将提取的纯羊奶，牛奶，及豆楽目标基因组DNA用Nanodrop定量到IOOng,做IOX 梯度稀释（10-1，10-2,10-3,10-4)，每个梯度均取2ul为模板量，按照上述方法分别对纯羊 奶，纯牛奶，及豆浆考察方法的灵敏度。
[0060] 结果显示（图1)，当荧光定量模板用量为〇.2ng时，存在明显的扩增曲线，此时纯 羊奶，牛奶，及豆浆模板检测到的Ct值分别为33. 64+0. 02, 35. 51+0. 018, 34. 87+0. 03,则该 荧光定量PCR检测的下限为0. 2ng。
[0061] (2)羊奶中掺杂牛奶或豆浆灵敏度试验
[0062] 将豆浆和羊奶以一定比例混合，制成豆浆含量分别为0%、0. 5%、10%和20%的混合奶样品；将牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分别为0%、 0· 1%、0· 5%、1%、5%、10%和20%的混合奶样本。
[0063] 结果显示（图2)，当牛奶或豆浆以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的比例（体 积比）掺入至羊奶中时，通过本试剂盒均能检测出来，且牛奶或豆浆掺入的比例越高Ct值 越小，表明本试剂盒检测灵敏度可达到0. 1%。
[0064] 3、重复性试验
[0065] 分别取纯羊奶，牛奶，及豆浆DNA各3份，按照上述优化好的体系、PCR条件进行实 时定量PCR，每个样品进行3次复孔的独立重复，考察方法的稳定性，结果见表2。结果显示 每个样品的3次独立重复实验Ct值得标准方差均小于0. 5。说明检测结果重复性好，检测 稳定性好。
[0066] 表3:重复性试验结果
[0067]
[0068] 4、市售样本的实际检测
[0069] 使用优化后的荧光定量PCR方法，对市售羊奶，羊奶粉，牛奶，牛奶粉进行鉴定， 验证方法的使用价值。样本的分类与检测结果见表3及图3。由表中可见，用牛奶和豆浆 掺假羊奶及羊奶粉的现象较为严重。对于羊奶，羊奶粉检出多为牛奶成分，少数也有大豆成 分，对于牛奶及牛奶粉检出多为大豆成分。
[0070] 表4 :市售样本的实际检测结果显示
[0071]
[0072] 5、对比试验
[0073] 牛源性探针设计如下：
[0074] NPl:5'CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG3'
[0075] NP2 :5'CGGCGGTAACTAACCAACCCAAAGAGAATCCGCCG3'
[0076] 羊源性探针设计如下：
[0077] YPl:5'CGCCGGAACCACCAAGGGATAACAACACCGGCG3'
[0078] YP2 :5'CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG3'
[0079] 相同PCR条件下比较：扩增程序：95°C Imin ;45个循环，95°C 5s，60°C 34s，在此收 集荧光信号。实验结果参见图4、图5。
[0080] 结果表明，本发明所用探针优于其他探针。
【主权项】
1. 一种试剂盒，其特征在于，包括一对羊奶牛奶共用引物，豆浆特异引物及对应的3种 检测探针，还包括一条人工合成外源性内参序列及相应引物和探针。2. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的羊奶牛奶共用引物为： UF:5'AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA-3， UR:5'GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3'。3. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的豆浆特异引物为： LectinF:5'CTCTACTCCACCCCCATCCACAT-3' LectinR:5'AGAAAGAAGGCAAGCCCATCTG-3'。4. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的内源引物为： IACF: 5，AgACCACCAAATgCCCCTATC-3 ' IACR:5'CgAgATTgAgATCTTCTgCgAC-3'。5. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于， 所述牛奶探针为：NP: 5 'CGAGCGATAGAGTGATTTGACTTGTGGGTCGCTCG-3 ' 所述羊奶探针为：YP: 5 'CGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTGGACG-3， 所述豆浆探针为：LectinP: 5 'CGCCGCTTCCTTCAACTTCACGCGGCG-3 ' 所述内标探针为：IACP: 5, -gCgAggTCCCCTAgAAgAAgAACTCCCTCgC-3,。
【专利摘要】本发明从牛、山羊或绵羊及豆浆的线粒体基因组DNA(mtDNA)的16SrRNA基因序列的物种特异性出发，探索并完善一种快速准确检测羊奶中是否掺杂牛奶或豆浆的检测试剂盒。本试剂盒包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增的牛、羊及大豆引物混合物，对上述物种进行特异检测的探针混合物,以及人工合成外源性内参序列及相应引物和探针。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894227
【申请号】CN201410515598
【发明人】张全芳, 步迅, 刘艳艳
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年9月29日
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