弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒的制作方法
弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]弗氏梓檬酸杆菌(Ci trobacter freundi?)是革兰氏阴性短杆菌，在土壤、水体、污水、食物中广泛存在，为人和动物肠道的正常菌群，该菌是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症[1_3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鋳鱼、以及大鲵。随着冷水鱼养殖场(户)集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前报道的病害报道主要集中在鋳鱼、虾、中华鳖，鳟鞋鱼、大鲷报道较少，感染该菌的鋳鱼、好、中华鳖、鳟鞋鱼和大鲷出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状，随后死亡+7]。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果，从而对症下药。应用荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。提供一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它可以快速检测弗氏柠檬酸杆菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
[0004]本发明是这样实现的:弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它包括250 μ L荧光定量PCR反应混合液；上游引物20 μ L、浓度为1nmol/μ L、下游引物20 μ L、浓度为1nmol/ μ L ;荧光核酸染料25 μ L、浓度为25mmol/ μ L ；40 μ L阳性对照；40 μ L阴性对照；170 μ L超纯水；上游引物的序列为:5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，下游引物的序列为:5，-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3，。
[0005]阴性对照为超纯水。
[0006]阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD_18T阳性质粒样品。
[0007]荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/ μ L的氯化镁，100pmol/ μ L的dNTP4.0 μ L，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成。
[0008]试剂盒的保存期检测
试剂盒保存期:将试剂盒各组份于室温、4 °C, -20 °C，保存时间I周、3月、6月、I年，对标准阳性样品进行检测。4°C保存I年阳性拷贝数降低100倍，-20°C保存I月、3月、6月、I年对阳性拷贝数无影响。
[0009]本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计I对特异性的引物，通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，T克隆到pMD_18T载体上作为标准阳性样品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，再以建立的诊断方法研制出试剂盒。试剂盒对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，扩增产物的熔解曲线只出现I个特异性峰值，无引物二聚体，灵敏度可达1.0X101拷贝/>L，结果表明，研制的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒适合于弗氏柠檬酸杆菌临床疑似病料样品的快速诊断。
[0010]为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验:
弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断方法的建立
I材料与方法 1.1试验材料
菌株:弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌，由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。
[0011]主要试剂:MIXPCR 酶、pMD-18T、SYBR Green I 荧光定量 PCR 酶、I X TAE电泳缓冲液、DI2Xm、DH5a ’琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒、PBS缓冲液等购自上海捷瑞生物工程公司，引物为上海捷瑞生物工程公司合成，其他为国产试剂。
[0012]主要仪器:i^7/7<9/?￡/or/Mastercyclerep realplex 4 实时焚光定量 PCR 仪。
[0013]试验方法 1.2.1引物设计
根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA序列，设计I对引物，上游引物:5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，下游引物:5’ -TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3’，预计扩增产物大小为117bp。
[0014]核酸的提取
(I)组织样品:取患病大鲵肝脏组织约1.0 g，加入0.lmol/L PBS缓冲液2 mL进行研磨，然后置-70°C低温冰箱反复冻融3次，5000 r/min离心，取上清液970μ?加入10%SDS20μ?，蛋白酶K ΙΟμ? (20mg/mL)，55°C反应30 min, 5000 r/min离心，取上清液用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组，提取的基因组置_20°C保存。
[0015](2)细菌样品:细菌样品DNA提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，提取的基因组置-20°C保存。
[0016]/re阳性标准品的制备
通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，PCR反应程序为:94°C 5 min ；94°C 30 s，退火温度55°C 30s, 72°C 30s，30个循环；最后72°C延伸lOmin。将扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞重组体命名为PMD-18T- /re，同时送上海捷瑞生物工程公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒PMD-18T- /?在D 26(lmi/D28(lmi处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。
[0017]荧光定量PCR反应条件的优化
荧光定量PCR反应体系25 41^，对退火温度(50°0、55°0、60°0，引物浓度(5、10、20Mmol/L),荧光定量的反应时间、体系，进行优化以确定最佳反应条件。
[0018]反应体系为:上下游引物(5、10、20Mmol/L)各 ?μ?，Premix Ex Taq 12.5μ?, ROXReference Dye 0.5μ?，模板I μ?，用超纯水补足至25 μ?，同时以超纯水作为空白对照。
[0019]反应条件为:94°C10s -MV 5s、退火温度(50°C、55°C、60°C)10s、72°C 10s，40 个循环。
[0020]荧光定量PCR反应标准曲线的构建
用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-/re，计算出重组质粒的浓度和纯度，以及DNA拷贝数；将标准阳性样本连续10倍倍比稀释，以1.2.4的优化好的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
[0021]敏感性试验
计算出重组质粒pMD-18T-/re DNA拷贝数，10倍倍比稀释后分别进行荧光定量PCR反应，每个稀释倍数3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断的敏感性。
[0022]特异性试验
分别以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。
[0023]重复性试验
应用建立的荧光定量PCR方法重复检测弗氏柠檬酸杆菌DNA样品3次，以考察检验结果的可靠性。
[0024]试剂盒的研制
以建立的荧光定量PCR方法为基础，组装成试剂盒。试剂盒组成:①荧光定量PCR反应混合液Ex Taq);②引物ROX Reference Dye 裂解液；⑤阳性对照；⑥阴性对照；⑦超纯水。将试剂盒储存于室温、4 °0和-20 °C保存，保存时间I周、3月、6月、I年，对标准阳性样品进行检测。
[0025]荧光定量PCR试剂盒对临床样品的检测
对2013年I月至2014年12月贵州省贵阳市、黔西南、铜仁地区几个规模化鳟鲑鱼、大鲵养殖场以及散养户采集的156份疑似鳟鲑鱼、大鲵病料(肝脏)，85头份大鲵饵料鱼病料，36份发病鳟鲑鱼、大鲵养殖场水样，应用研制的荧光定量PCR试剂盒进行检测，传统的细菌分离鉴定进行检测，比对结果。
[0026]结果与分析
2.1 pMD-18T-/re阳性标准品的制备
扩增的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA，片段大小为117bp，无非特异性片段产生(图1)。将上海捷瑞生物工程公司测序结果与GenBank中的16S rRNA基因序列比对，核苷酸相似度为98.9% ?100%ο
[0027]荧光定量PCR反应条件的优化
通过荧光定量PCR反应条件的优化，在25 PL反应体系中，最佳反应条件为:Premix ExTaq 12.5PL，R0X Reference Dye 0.5μ?，引物浓度 10 MmoI/L ?μ?，反应条件为:94°C 1s ；94°C 5s、退火温度 55°C 10s、72°C 10s，40 个循环。
[0028]焚光定量PCR反应标准曲线的构建
将标准样品进行10倍倍比稀释，分别取1.0XlO1U.0X102、1.0X103、1.0X 104、1.0X 15拷贝/μ?的重组质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，得到扩增反应的标准曲线(图2)，线性回归方程为
Ct = -2.980X Igcopies + 9.27 (R2=0.999)。
[0029]熔解曲线分析如图3所示熔解曲线，扩增产物的溶解温度TmS 84.6°C?85.4°C，无引物二聚体和非特异性产物等峰值出现。
[0030]敏感性试验
将标准样品进行10倍倍比稀释，分别取1.0XlO0U.0XlO1U.0XlO2U.0XlO3,1.0 X 104、1.0 X 15拷贝/μ?重组质粒作为模板，进行荧光定量PCR扩增，结果显示其灵敏度为1.0X 11拷贝/μι (图4)0
[0031]特异性试验
以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性，结果弗氏柠檬酸杆菌为阳性，而弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌为阴性(图5)。
[0032]重复性试验
应用建立的荧光定量PCR方法检测弗氏柠檬酸杆菌DNA，样品重复3次，以检验结果的可靠性，结果均一致。
[0033]试剂盒研制
(I)试剂盒组成20头份:①荧光定量PCR反应混合液(作挪办Ex 7^)250 μ? ;②引物25μ? ;@R0X Reference Dye 25μ? 裂解液 ΙΟΟΟμ? ;⑤阳性对照 40μ? ;⑥阴性对照 40μ? ；⑦超纯水200μ?。
[0034](2)试剂盒保存期:将试剂盒各组份于室温、4 V、-20 °C，保存时间I周、3月、6月、I年，对标准阳性样品进行检测。4°C保存I年阳性拷贝数降低100倍，-20°C保存I月、3月、6月、I年对阳性拷贝数无影响。
[0035]试剂盒对临床样品的检测
对2013年I月至2014年12月贵州省贵阳市、黔西南、铜仁地区几个规模化鳟鲑鱼、大鲵养殖场以及散养户采集的156份疑似鳟鲑鱼、大鲵病料(肝脏)，85头份大鲵饵料鱼病料，36份发病鳟鲑鱼、大鲵养殖场水样，应用研制的荧光定量PCR试剂盒进行检测，传统的细菌分离鉴定进行检测，比对结果。156份疑似病料(肝脏)荧光定量检测阳性率23/156(14.74%)，细菌分离鉴定阳性率14/156 (9.0%)；85头份大鲵饵料鱼病料荧光定量检测阳性率16/85 (18.82%)，细菌分离鉴定阳性率8/85 (9.4%) ;36份发病鳟鲑鱼、大鲵大鲵养殖场水样荧光定量检测阳性率11/36 (30.55%)，细菌分离鉴定阳性率2/36 (5.5%)。
[0036]讨论
目前，临床常用的病原菌鉴定方法主要有传统平板分离培养及生化鉴定，以及在此基础上纯化菌落后进行PCR扩增、测序、比对，普通PCR和实时荧光定量PCR等。随着生物技术的快速发展，基于SYBR Green I的实时荧光定量PCR技术与传统鉴定方法相比，具有快速、准确的优势；与普通PCR相比，具有准确、灵敏、特异性高的特点；该技术无需探针，且价格较TaqMan探针低廉，适合于临床样品的快速诊断。
[0037]余波等M利用传统鉴定方法结合PCR测序对大鲵细菌性败血症病原进行分离鉴定，从对病原菌分离、培养、纯化，到生化鉴定整个过程最快需要一周时间。胡秀彩等[9]采用弗氏柠檬酸杆菌16S rDNA V3区的PCR-SSCP图谱进行菌株鉴别效果良好。余波等[1°]研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速等特点，敏感度达到1.0X 11拷贝/μ?。
[0038]本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计I对引物，将PCR扩增获得的基因片段克隆到PMD-18T载体上作为阳性标准品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，以此为基础研制出诊断试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现I个单特异峰，无引物二聚体，对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，灵敏度可达1.0XlO1拷贝/>L。传统细菌分离和荧光定量均监测到养殖用水和饵料鱼中存在弗氏柠檬酸杆菌，提示该菌是一种条件致病菌，人工养殖的水和饵料均含有弗氏柠檬酸杆菌，由于规模化养殖，当养殖密度提高以及鳟鲑鱼、大鲵大鲵免疫力下降时就出现发病。因此，应用本试剂盒开展鳟鲑鱼、大鲵大鲵养殖场弗氏柠檬酸杆菌早期感染检测对饵料和养殖用水进行检测，有利于弗氏柠檬酸杆菌的防治。
【附图说明】
[0039]图1为弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因PCR扩增结果；
图1中，M:DL2000 ；1:弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因PCR产物；2:阴性对照；
图2为SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线；
图3为SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线；
图4为SYBR Green I荧光定量PCR敏感性试验结果；
图4中，I?6:重组质粒DNA 1.0X 15?10 °拷贝/μ?稀释的荧光定量PCR结果；
图5为SYBR Green I荧光定量PCR特异性试验
图5中，1:弗氏柠檬酸杆菌；2:致病性嗜水气单胞菌；3:荧光假单胞菌；4:黄杆菌；5:迟缓爱德华菌。
【具体实施方式】
[0040]本发明的实施例:弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:250 μ L荧光定量PCR反应混合液(作挪办Ex 7^);上下游引物各20 μ L ;25 μ L荧光核酸染料、浓度为25mmol/ μ L ;40 μ L阳性对照；40 μ L阴性对照；170 μ L超纯水；20 μ L上游引物，上游引物的序列为5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，20 μ L下游引物，下游引物的序列为:5’ -TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3’ ；阴性对照为超纯水；阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR产物。
【主权项】
1.一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:它包括250 μ L荧光定量PCR反应混合液；上游引物20 μ L、浓度为1nmol/μ L、下游引物20 μ L、浓度为1nmol/μ L ;荧光核酸染料25 μ L、浓度为25mmol/ μ L ；40 μ L阳性对照；40 μ L阴性对照;170 μ L超纯水；上游引物的序列为:5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，下游引物的序列为:5’ -TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3’ 。2.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:阴性对照为超纯水。3.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD_18T阳性质粒样品。4.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/yL的氯化镁，100pmol/yL的dNTP 4.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成。
【专利摘要】本发明公开了一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。本发明根据GenBank中的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计了1对引物，通过对荧光定量PCR反应条件进行优化，研制出弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR诊断试剂盒，以期对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为该病的防制提供科学依据。根据以上研究设计的引物，将其应用在荧光定量PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出弗氏柠檬酸杆菌，并且具有良好的特异性及敏感性。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/10, C12Q1/68
【公开号】CN104894232
【申请号】CN201510157826
【发明人】余波, 徐景峨, 罗永成
【申请人】贵州省畜牧兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月3日
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]弗氏梓檬酸杆菌(Ci trobacter freundi?)是革兰氏阴性短杆菌，在土壤、水体、污水、食物中广泛存在，为人和动物肠道的正常菌群，该菌是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症[1_3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鋳鱼、以及大鲵。随着冷水鱼养殖场(户)集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前报道的病害报道主要集中在鋳鱼、虾、中华鳖，鳟鞋鱼、大鲷报道较少，感染该菌的鋳鱼、好、中华鳖、鳟鞋鱼和大鲷出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状，随后死亡+7]。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果，从而对症下药。应用荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。提供一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它可以快速检测弗氏柠檬酸杆菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
[0004]本发明是这样实现的:弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，它包括250 μ L荧光定量PCR反应混合液；上游引物20 μ L、浓度为1nmol/μ L、下游引物20 μ L、浓度为1nmol/ μ L ;荧光核酸染料25 μ L、浓度为25mmol/ μ L ；40 μ L阳性对照；40 μ L阴性对照；170 μ L超纯水；上游引物的序列为:5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，下游引物的序列为:5，-TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3，。
[0005]阴性对照为超纯水。
[0006]阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD_18T阳性质粒样品。
[0007]荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/ μ L的氯化镁，100pmol/ μ L的dNTP4.0 μ L，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成。
[0008]试剂盒的保存期检测
试剂盒保存期:将试剂盒各组份于室温、4 °C, -20 °C，保存时间I周、3月、6月、I年，对标准阳性样品进行检测。4°C保存I年阳性拷贝数降低100倍，-20°C保存I月、3月、6月、I年对阳性拷贝数无影响。
[0009]本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计I对特异性的引物，通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，T克隆到pMD_18T载体上作为标准阳性样品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，再以建立的诊断方法研制出试剂盒。试剂盒对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，扩增产物的熔解曲线只出现I个特异性峰值，无引物二聚体，灵敏度可达1.0X101拷贝/>L，结果表明，研制的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒适合于弗氏柠檬酸杆菌临床疑似病料样品的快速诊断。
[0010]为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验:
弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断方法的建立
I材料与方法 1.1试验材料
菌株:弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌，由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。
[0011]主要试剂:MIXPCR 酶、pMD-18T、SYBR Green I 荧光定量 PCR 酶、I X TAE电泳缓冲液、DI2Xm、DH5a ’琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒、PBS缓冲液等购自上海捷瑞生物工程公司，引物为上海捷瑞生物工程公司合成，其他为国产试剂。
[0012]主要仪器:i^7/7<9/?￡/or/Mastercyclerep realplex 4 实时焚光定量 PCR 仪。
[0013]试验方法 1.2.1引物设计
根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA序列，设计I对引物，上游引物:5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，下游引物:5’ -TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3’，预计扩增产物大小为117bp。
[0014]核酸的提取
(I)组织样品:取患病大鲵肝脏组织约1.0 g，加入0.lmol/L PBS缓冲液2 mL进行研磨，然后置-70°C低温冰箱反复冻融3次，5000 r/min离心，取上清液970μ?加入10%SDS20μ?，蛋白酶K ΙΟμ? (20mg/mL)，55°C反应30 min, 5000 r/min离心，取上清液用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组，提取的基因组置_20°C保存。
[0015](2)细菌样品:细菌样品DNA提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，提取的基因组置-20°C保存。
[0016]/re阳性标准品的制备
通过PCR扩增获得弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因片段，PCR反应程序为:94°C 5 min ；94°C 30 s，退火温度55°C 30s, 72°C 30s，30个循环；最后72°C延伸lOmin。将扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞重组体命名为PMD-18T- /re，同时送上海捷瑞生物工程公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒PMD-18T- /?在D 26(lmi/D28(lmi处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。
[0017]荧光定量PCR反应条件的优化
荧光定量PCR反应体系25 41^，对退火温度(50°0、55°0、60°0，引物浓度(5、10、20Mmol/L),荧光定量的反应时间、体系，进行优化以确定最佳反应条件。
[0018]反应体系为:上下游引物(5、10、20Mmol/L)各 ?μ?，Premix Ex Taq 12.5μ?, ROXReference Dye 0.5μ?，模板I μ?，用超纯水补足至25 μ?，同时以超纯水作为空白对照。
[0019]反应条件为:94°C10s -MV 5s、退火温度(50°C、55°C、60°C)10s、72°C 10s，40 个循环。
[0020]荧光定量PCR反应标准曲线的构建
用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-/re，计算出重组质粒的浓度和纯度，以及DNA拷贝数；将标准阳性样本连续10倍倍比稀释，以1.2.4的优化好的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
[0021]敏感性试验
计算出重组质粒pMD-18T-/re DNA拷贝数，10倍倍比稀释后分别进行荧光定量PCR反应，每个稀释倍数3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断的敏感性。
[0022]特异性试验
分别以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。
[0023]重复性试验
应用建立的荧光定量PCR方法重复检测弗氏柠檬酸杆菌DNA样品3次，以考察检验结果的可靠性。
[0024]试剂盒的研制
以建立的荧光定量PCR方法为基础，组装成试剂盒。试剂盒组成:①荧光定量PCR反应混合液Ex Taq);②引物ROX Reference Dye 裂解液；⑤阳性对照；⑥阴性对照；⑦超纯水。将试剂盒储存于室温、4 °0和-20 °C保存，保存时间I周、3月、6月、I年，对标准阳性样品进行检测。
[0025]荧光定量PCR试剂盒对临床样品的检测
对2013年I月至2014年12月贵州省贵阳市、黔西南、铜仁地区几个规模化鳟鲑鱼、大鲵养殖场以及散养户采集的156份疑似鳟鲑鱼、大鲵病料(肝脏)，85头份大鲵饵料鱼病料，36份发病鳟鲑鱼、大鲵养殖场水样，应用研制的荧光定量PCR试剂盒进行检测，传统的细菌分离鉴定进行检测，比对结果。
[0026]结果与分析
2.1 pMD-18T-/re阳性标准品的制备
扩增的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA，片段大小为117bp，无非特异性片段产生(图1)。将上海捷瑞生物工程公司测序结果与GenBank中的16S rRNA基因序列比对，核苷酸相似度为98.9% ?100%ο
[0027]荧光定量PCR反应条件的优化
通过荧光定量PCR反应条件的优化，在25 PL反应体系中，最佳反应条件为:Premix ExTaq 12.5PL，R0X Reference Dye 0.5μ?，引物浓度 10 MmoI/L ?μ?，反应条件为:94°C 1s ；94°C 5s、退火温度 55°C 10s、72°C 10s，40 个循环。
[0028]焚光定量PCR反应标准曲线的构建
将标准样品进行10倍倍比稀释，分别取1.0XlO1U.0X102、1.0X103、1.0X 104、1.0X 15拷贝/μ?的重组质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，得到扩增反应的标准曲线(图2)，线性回归方程为
Ct = -2.980X Igcopies + 9.27 (R2=0.999)。
[0029]熔解曲线分析如图3所示熔解曲线，扩增产物的溶解温度TmS 84.6°C?85.4°C，无引物二聚体和非特异性产物等峰值出现。
[0030]敏感性试验
将标准样品进行10倍倍比稀释，分别取1.0XlO0U.0XlO1U.0XlO2U.0XlO3,1.0 X 104、1.0 X 15拷贝/μ?重组质粒作为模板，进行荧光定量PCR扩增，结果显示其灵敏度为1.0X 11拷贝/μι (图4)0
[0031]特异性试验
以弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌DNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以考察建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性，结果弗氏柠檬酸杆菌为阳性，而弗氏柠檬酸杆菌、致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌为阴性(图5)。
[0032]重复性试验
应用建立的荧光定量PCR方法检测弗氏柠檬酸杆菌DNA，样品重复3次，以检验结果的可靠性，结果均一致。
[0033]试剂盒研制
(I)试剂盒组成20头份:①荧光定量PCR反应混合液(作挪办Ex 7^)250 μ? ;②引物25μ? ;@R0X Reference Dye 25μ? 裂解液 ΙΟΟΟμ? ;⑤阳性对照 40μ? ;⑥阴性对照 40μ? ；⑦超纯水200μ?。
[0034](2)试剂盒保存期:将试剂盒各组份于室温、4 V、-20 °C，保存时间I周、3月、6月、I年，对标准阳性样品进行检测。4°C保存I年阳性拷贝数降低100倍，-20°C保存I月、3月、6月、I年对阳性拷贝数无影响。
[0035]试剂盒对临床样品的检测
对2013年I月至2014年12月贵州省贵阳市、黔西南、铜仁地区几个规模化鳟鲑鱼、大鲵养殖场以及散养户采集的156份疑似鳟鲑鱼、大鲵病料(肝脏)，85头份大鲵饵料鱼病料，36份发病鳟鲑鱼、大鲵养殖场水样，应用研制的荧光定量PCR试剂盒进行检测，传统的细菌分离鉴定进行检测，比对结果。156份疑似病料(肝脏)荧光定量检测阳性率23/156(14.74%)，细菌分离鉴定阳性率14/156 (9.0%)；85头份大鲵饵料鱼病料荧光定量检测阳性率16/85 (18.82%)，细菌分离鉴定阳性率8/85 (9.4%) ;36份发病鳟鲑鱼、大鲵大鲵养殖场水样荧光定量检测阳性率11/36 (30.55%)，细菌分离鉴定阳性率2/36 (5.5%)。
[0036]讨论
目前，临床常用的病原菌鉴定方法主要有传统平板分离培养及生化鉴定，以及在此基础上纯化菌落后进行PCR扩增、测序、比对，普通PCR和实时荧光定量PCR等。随着生物技术的快速发展，基于SYBR Green I的实时荧光定量PCR技术与传统鉴定方法相比，具有快速、准确的优势；与普通PCR相比，具有准确、灵敏、特异性高的特点；该技术无需探针，且价格较TaqMan探针低廉，适合于临床样品的快速诊断。
[0037]余波等M利用传统鉴定方法结合PCR测序对大鲵细菌性败血症病原进行分离鉴定，从对病原菌分离、培养、纯化，到生化鉴定整个过程最快需要一周时间。胡秀彩等[9]采用弗氏柠檬酸杆菌16S rDNA V3区的PCR-SSCP图谱进行菌株鉴别效果良好。余波等[1°]研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速等特点，敏感度达到1.0X 11拷贝/μ?。
[0038]本发明根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计I对引物，将PCR扩增获得的基因片段克隆到PMD-18T载体上作为阳性标准品。通过优化SYBR Green I荧光定量PCR反应条件，建立了弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，以此为基础研制出诊断试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现I个单特异峰，无引物二聚体，对致病性嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、黄杆菌、迟缓爱德华菌均无阳性信号扩增，重复性好，灵敏度可达1.0XlO1拷贝/>L。传统细菌分离和荧光定量均监测到养殖用水和饵料鱼中存在弗氏柠檬酸杆菌，提示该菌是一种条件致病菌，人工养殖的水和饵料均含有弗氏柠檬酸杆菌，由于规模化养殖，当养殖密度提高以及鳟鲑鱼、大鲵大鲵免疫力下降时就出现发病。因此，应用本试剂盒开展鳟鲑鱼、大鲵大鲵养殖场弗氏柠檬酸杆菌早期感染检测对饵料和养殖用水进行检测，有利于弗氏柠檬酸杆菌的防治。
【附图说明】
[0039]图1为弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因PCR扩增结果；
图1中，M:DL2000 ；1:弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因PCR产物；2:阴性对照；
图2为SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线；
图3为SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线；
图4为SYBR Green I荧光定量PCR敏感性试验结果；
图4中，I?6:重组质粒DNA 1.0X 15?10 °拷贝/μ?稀释的荧光定量PCR结果；
图5为SYBR Green I荧光定量PCR特异性试验
图5中，1:弗氏柠檬酸杆菌；2:致病性嗜水气单胞菌；3:荧光假单胞菌；4:黄杆菌；5:迟缓爱德华菌。
【具体实施方式】
[0040]本发明的实施例:弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:250 μ L荧光定量PCR反应混合液(作挪办Ex 7^);上下游引物各20 μ L ;25 μ L荧光核酸染料、浓度为25mmol/ μ L ;40 μ L阳性对照；40 μ L阴性对照；170 μ L超纯水；20 μ L上游引物，上游引物的序列为5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，20 μ L下游引物，下游引物的序列为:5’ -TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3’ ；阴性对照为超纯水；阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR产物。
【主权项】
1.一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:它包括250 μ L荧光定量PCR反应混合液；上游引物20 μ L、浓度为1nmol/μ L、下游引物20 μ L、浓度为1nmol/μ L ;荧光核酸染料25 μ L、浓度为25mmol/ μ L ；40 μ L阳性对照；40 μ L阴性对照;170 μ L超纯水；上游引物的序列为:5’ -CTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGG-3’，下游引物的序列为:5’ -TCTTTGGTCTTGCGACGTTATGC-3’ 。2.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:阴性对照为超纯水。3.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒，其特征在于:阳性对照为标准弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因pMD_18T阳性质粒样品。4.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:荧光定量PCR反应混合液由5 mmol/yL的氯化镁，100pmol/yL的dNTP 4.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成。
【专利摘要】本发明公开了一种弗氏柠檬酸杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒。本发明根据GenBank中的弗氏柠檬酸杆菌16S rRNA基因序列，设计了1对引物，通过对荧光定量PCR反应条件进行优化，研制出弗氏柠檬酸杆菌的荧光定量PCR诊断试剂盒，以期对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为该病的防制提供科学依据。根据以上研究设计的引物，将其应用在荧光定量PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出弗氏柠檬酸杆菌，并且具有良好的特异性及敏感性。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/10, C12Q1/68
【公开号】CN104894232
【申请号】CN201510157826
【发明人】余波, 徐景峨, 罗永成
【申请人】贵州省畜牧兽医研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月3日
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