人类cyp2d6和sult1a1基因多态性检测试剂盒的制作方法
人类cyp2d6和sult1a1基因多态性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测的试剂盒，尤其涉及一种 快速有效地检测少量样本的CYP2D6和SULT1A1基因多态性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 他莫昔芬（Tamoxifen)是一种选择性雌激素受体调节剂，可与雌激素竞争雌激素 受体，从而抑制雌激素介导的乳腺癌细胞增殖。1977年在美国获FDA批准上市，经过30年的 临床应用，被证实可以有效减少乳腺癌的复发，提高患者的生存率。手术后服用他莫昔芬5 年是雌激素受体（ER)阳性乳腺癌患者辅助内分泌治疗的金标准。在体内他莫西芬的代谢有 多种药物代谢酶参与，其经CYP3A代谢产生的N-去甲基他莫昔芬（N-desmethyItamoxifen) 是主要的代谢产物，约占他莫昔芬初级代谢产物的90 % ;经CYP2D6 (细胞色素 P4502D， 家族2,亚家族D，多肽6,细胞色素 P450家族2D6)代谢产生的4-羟基他莫昔芬 (4-hydroxytamoxifen)占他莫昔芬初级代谢产物的10%。N-去甲基他莫昔芬仅能由CYP2D 进一步代谢为 4_轻-N-去甲基他莫昔芬（4-hydroxy-N-desmethyltamoxifen，Endoxifen)。 Endoxifen和4-羟基他莫昔芬与雌激素受体亲和力都较强，是他莫西芬在体内代谢后的主 要活性成分，可以有效抑制雌激素介导的乳腺癌细胞扩增。
[0003] CYP2D6属于细胞色素 P450超级家族，参与临床上约25%药物的代谢。其编码基 因位于22号染色体长链ql3. 1区带，由9个外显子和8个内含子组成。CYP2D6基因具有高 度多态性，目前已报道有超过100种不同的等位基因，其编码的蛋白有酶活性升高、降低、 丧失或不变四种情况，等位基因的多态性决定了表型的多态性，按代谢活性可以将表型分 为快代谢（Um)、泛代谢（EM)、慢代谢（PM)和中等代谢（頂）四种类型。亚洲最常见的等位 基因型是CYP2D6*10,突变率约为50%。单个碱基的突变（1000 T)使得CYP2D6*10编码的 酶不稳定，催化药物的活性降低。研宄证实CYP2D6基因多态性与他莫西芬治疗患者血液内 活性成分浓度密切相关，显著影响患者复发率和生存期。一项大型研宄结果显示，293名接 受治疗的乳腺癌患者中，携带CYP2D6*10等位基因的T/T型患者与C/T型或C/C型患者相 比，血中4-羟-他莫西芬较低，且临床结果较差。美国FDA已于2006年建议患者在接受他 莫昔芬治疗前首先对CYP2D6的基因型进行检测。
[0004] SULT1A1 (磺基转移酶家族，细胞质的，苯酚偏好的，成员1，人磺基转移酶1A1)催 化酚类和雌激素类化合物磺基化，介导他莫西芬进一步转化成无活性产物排出体外。等位 基因 SULT1A1*2(638G>A)导致酶活性降低。白种人SULT1A1*1和SULT1A1*2等位基因频率 分别为65. 5%和33. 2%，中国人为91. 4%和8%，非裔美洲人为47. 7%和29. 4%。Nowell 等发现用他莫昔芬进行治疗的SULT1A1*2突变纯合子乳腺癌患者的死亡率是非突变纯合 子患者的3倍。携带高活性SULT1A1基因女性5年生存率是88%，而携带低活性基因女性 只有64%，即使排除了年龄、种族、诊断时病情阶段等影响因素，也同样如此。因此SULT1A1 的多态性在他莫昔芬的治疗中也起着重要的作用。
[0005] 表1 :CYP2D6和SULT1A1基因多态性
[0006]
[0007] 目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶 解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常 见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备 要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛， 但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多 态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一 种快速有效的检测少量样本的CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种CYP2D6和SULT1A1基因多态 性的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果 不理想的问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性， 其灵敏度高，特异性强，可适用于EDTA、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组 DNA的检测。
[0009] 本发明提供了一种CYP2D6和SULT1A1基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括 PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统。
[0010] 在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性引物序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 与 SEQ ID NO:4 ;SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 与 SEQ ID NO: 7。
[0011] 在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性探针序列分别为SEQ ID NO: 8与SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10与SEQ ID NO: 11，且所述特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端 修饰有NFQ-MGB。
[0012] 在本发明的一些实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标 引物序列为SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13,所述内标探针序列为SEQ ID NO: 14。在一些 实施方案中，所述内标探针5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所 述阳性对照液含有4种质粒DNA混合液，所述4种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2D6等 位基因和2种不同的SULT1A1等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
[0014] 本发明的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒可以简单快速检测基因多态 性，并且所述检测包括以下步骤：（1)设计并筛选含有CYP2D6和SULT1A1的检测探针，ARMS 引物，通用引物；⑵从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA ; (3)进行 实时荧光定量PCR扩增：每个样本的CYP2D6基因多态性和SULT1A1基因多态性检测分2管 进行PCR反应。
[0015] 本发明CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了在 同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，本发明CYP2D6和 SULT1A1基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性检测 目的模板方法，对特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证，同时引入内标系统和UNG 酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点： 1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测Ing基因组DNA的基因型；3.针对 CYP2D6和SULT1A1的基因型设计ARMS引物和SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应的多 态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加 入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操 作简便，能在90分钟内完成检测，结果判读方法简单客观，便于分析。
【附图说明】
[0016] 图1是CYP2D6*10C/C纯合野生样本的一个检测结果图；
[0017] 图2是CYP2D6*10T/T纯合突变样本的一个检测结果图；
[0018] 图3是CYP2D6*10C/T杂合突变样本的一个检测结果图；
[0019] 图4是SULT1A1*2G/G纯合野生样本的一个检测结果图；
[0020] 图5是SULT1A1*2G/G纯合野生样本的一个检测结果图。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的【具体实施方式】仅仅 用以解释本发明，并不限制本发明。
[0022] 本发明的一个实施方案提供了一种CYP2D6和SULT1A1基因多态性的检测试剂盒， 该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内 标系统。
[0023] 在一些具体实施方案中，所述PCR缓冲液中含有1.0~5. OmM的MgCl2,1.0~ 5. OmM 的 dNTP，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 0 ~5. OmM。
[0024] 在一些具体实施方案中，所述2组特异性引物序列为SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 与 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 与 SEQ ID N0:7;其中 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2与 SEQ ID N0:5、 SEQ ID N0:6为普通PCR引物，分别扩增包含CYP2D6*10 和 SULT1A1*2 基因多态性的 DNA 片段；其中 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 与 SEQ ID N0:7 为ARMS引物，用于分别特异性扩增含有CYP2D6*10C密码子CCT，CYP2D6*10T密码子TCT， SULT1A1*2G密码子CGC的DNA片段。3条ARMS引物分别在3'模板碱基与待扩增类型的碱 基配对，同时在其3'末端倒数第2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强特异性。
[0025] 各引物序列列举如下：
[0026] CYP2D6*10上游引物5'-GGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGG-3' SEQ ID NO: 1
[0027] CYP2D6*10 下游引物 5'-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGA-3， SEQ ID NO:2
[0028] CYP2D6*10C ARMS 引物 5'-CAGTGGCAGGGGGCCTGGTAC-3' SEQ ID NO:3
[0029] CYP2D6*10T ARMS 引物 5'-CAGTGCAGGGGGCCTGGTAT-3' SEQ ID NO:4
[0030] SULT1A1*2 上游引物 5'-TTTCTAGGAGAAGTGGCCAGAT-3' SEQ ID NO:5
[0031] SULT1A1*2 下游引物 5'-GTTCTTCTTCATCTCCTTGAA-3' SEQ ID NO:6
[0032] SULT1A1*2G ARMS 引物 5'-CCACGGTCTCCTCTGGCAGGGTCC-3' SEQ ID NO:7
[0033] 在一些具体实施方案中，所述特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端修饰有非 焚光淬灭基团NFQ (Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生焚光，因此可以大大降 低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提 高10°C左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在 识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
[0034] 在一些具体实施方案中，，所述2组特异性探针序列分别为SEQ ID NO: 8与SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10 与 SEQ ID NO: 11，且其中 SEQ ID N0:8 与 SEQ ID N0:9 探针分别特异 性检测 CYP2D6*10T、CYP2D6*10C 模板 DNA，SEQ ID NO: 10 与 SEQ ID NO: 11 探针分别特异性 检测 SULT1A1*2G、SULT1A1*2A 模板 DNA ;
[0035] 各探针序列列举如下：
[0036] CYP2D6*10C 检测探针 5'-FAM-GCTGCACGCTACCCAC-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO:8
[0037] CYP2D6*10T 检测探针 5'-VIC-GGGCCTGGTGAG-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO:9
[0038] SULT1A1*2G检测探针5'-FAM-GTTTGTGGGGCGC-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO: 10
[0039] SULT1A1*2A 检测探针 5'-VIC-GTTTGTGGGGCAC-NFQ-MGB-3' SEQ ID NO: 11
[0040] 在一些具体实施方案中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制， 由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可 能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导 致假阴性结果的出现，因此本发明在一些具体实施方案中采用内标系统来消除上述隐患， 保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物、内标探针，本发明实施例中个可 采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。
[0041] 在一些具体实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物 序列为SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13,所述内标探针序列为SEQ ID NO: 14;所述内标探针 5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。
[0042] 在一些具体实施方案中，所述内标系统针对人类基因组保守区域设计，具有高度 的灵敏性和扩增特异性，其中包含的内标引物序列如下所示：
[0043] 内标正向引物 F:5' -CGCGAACTCACCCGT-3' SEQ ID NO: 12
[0044] 内标反向引物 R:5' -CACTAGGCGCTCACTGT-3' SEQ ID NO: 13
[0045] 在一些具体实施方案中，内标探针Y端标记有报告基团，如R0X、FAM、VIC等，3' 端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能 量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到 与模板结合的探针，其5' -3'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭 基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。
[0046] 在一些具体实施方案中，所述内标探针为：
[0047] R0X-5'-CACCTTCCCCATGGTGTCT-3' -BHQ2 SEQ ID NO: 14
[0048] 在一些具体实施方案中，酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液 还含有UNG酶，其中UNG酶（uracil-N-glycosylase)为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最 佳活性温度为50°C，95°C灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中 的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性 PCR扩增和污染。
[0049] 在一些具体实施方案中，本发明检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设 置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发 明中涉及的 CYP2D6 两种多态性CYP2D6*10T，CYP2D6*10C，SULT1A1 两种多态性 SULT1A1*2A， SULT1A1*2G的4种质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这4种质粒浓 度相同，均为2500拷贝/ μ 1 ;所述空白对照液为Tris-HCl (IOmM)缓冲液。
[0050] 本发明的另一目的在于提供一种用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法， 该方法包括以下步骤：
[0051] (1)设计并筛选特异性扩增与检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的引物组合和探 针组合；制备本发明的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒。
[0052] (2)获得待测样品基因组DNA ;
[0053] (3)进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测CYP2D6和SULT1A1 基因的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系 统，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。
[0054] 在一些具体实施方案中，以25 μ 1反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后 得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：
[0055] PCR 缓冲液 12. 5-15 μ 1 各条引物 0.2 μ M-I μ M 各条探针 0. 1 μ Μ-0. 5 μ M Taq 酶 0· 5 U-L 0 U UNG 酶 0.1 U-0· 5 U 样品DNA 2 μ 1 加水至 25 μ 1。
[0056] 上述体系仅为示例性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其 中各组分含量。
[0057] 具体地，在上述25 μ 1反应体系中，所述各对引物包括上述步骤（1)中的7条特异 性引物，1对内标引物，所述各条探针包括上述步骤（1)中的特异性探针，所述样品为基因 组 DNA。
[0058] 具体地，在步骤（3)中的荧光定量PCR反应条件为：
[0059] 37 °C处理10分钟，95 °C预变性5分钟，
[0060] 40个循环：95°C 15秒，60°C 60秒并收集焚光信号。
[0061] 在上述PCR反应后，所得结果按表1进行结果判定：
[0062] 表1.结果判定
[0063]
[0064] 本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方 法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
[0065] 以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。
[0066] 实施例1
[0067] 制备本发明的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：
[0068] 1.引物及探针合成：
[0069] 设计并合成 2 组特异性引物 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 与 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 与 SEQ ID N0:7;2 组特异性探针 SEQ ID N0:8 与 SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10 与 SEQ ID NO: 11，并在 SEQ ID N0:8 和 SEQ ID NO: 10 的 5'端标记 FAM 荧光基团，3'端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 11的5'端标 记VIC荧光基团，3'端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100 μΜ的 母液储存。
[0070] 2.制备内标系统：设计并合成针对人类基因组设计的1对内标引物，该引物对序 列为SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13;设计并合成内标探针，该探针为SEQ ID NO: 14。将该 内标引物分别配制成100 μM的母液储存，内标探针配制成100 μM的母液储存。
[0071] 3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0 mM的MgCl2, dATP、dUTP、dGTP和 dCTP 各 1.0 mM ;制备酶混合液，其中含有 Taq 酶 0· 5 X 103U/ml，UNG 酶 0· I X 103U/ml。
[0072] 4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有4种质粒DNA，这些质粒 DNA 中分别含有本发明试剂盒涉及的 CYP2D6*10C、CYP2D6*10T、SULT1A1*2G、SULT1A1*2A 基 因4种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500拷贝/ μ 1 ;该空白对照液为Tris-HCl (IOmM)缓冲液。
[0073] 5. PCR反应液配制：按照下表进行两个不同体系PCR反应液配制
[0074]
[0075] 6.组装试剂盒：试剂盒中包含2管分别检测CYP2D6和SULT1A1的基因多态性检 测PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使 用量，配制试剂盒各管中成分并组装。
[0076] 实施例2
[0077] 用实施例1制备的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检 测。
[0078] 本实施例中收集30例乳腺癌患者的抗凝全血样品，从其中提取基因组DNA，用 实施例1中得到的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒检测待检样品的CYP2D6和 SULT1A1的基因多态性情况。
[0079] 1.血液样品基因组DNA提取
[0080] 取全血300 μ 1，加入900 μ 1的细胞裂解液CL，颠倒混勾，静置5min， 10, 000rpm(ll，500Xg)离心lmin，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中 加200 μ 1缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20 μ I Proteinase K溶液，混匀。加200 μ 1 缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置lOmin，其间颠倒混匀数次，直至溶液变清亮（如溶液 未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。加200 μ 1无水乙醇，充分颠倒混匀，此 时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附 柱CB3放入收集管中），12, OOOrpm(13, 400 X g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入 无水乙醇），12, OOOrpm(13, 400 X g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收 集管中。向吸附柱CB3中加入600 μ 1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重 复操作步骤7。12,000rpm(13,400Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置 数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入I. 5ml离心管中，向吸附 膜中间位置悬空滴加100 μ 1洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12, OOOrpm(13, 400 Xg)离心 2min，将溶液收集到离心管中。取2 μ 1所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA 稀释到IOng/ μ 1，分别取2 μ 1加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反 应。
[0081] 2.样本的荧光定量PCR检测
[0082] 将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2 μ 1分别加入到23 μ 1的实施例1的试剂 盒的CYP2D6*10检测反应体系和SULT1A1*2检测反应体系中，使两种反应体系总体积均为 25 μ 1，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
[0083] 37〇C IOmin ；
[0084] 95 °C 5min ；
[0085] 95°0 158,60°0 6〇8,40个循环；每个循环后收集？41^1(：和1^的荧光信号。
[0086] 3.样本的检测结果分析：30例样品的检测结果如下：
[0087] CYP2D6*10C/C纯合野生样本7例，其中一个检测结果如图1所示；
[0088] CYP2D6*10T/T纯合突变样本4例，其中一个检测结果如图2所示；
[0089] CYP2D6*10C/T杂合突变样本19例，其中一个检测结果如图3所示；
[0090] SULT1A1*2G/G纯合野生样本20例，其中一个检测结果如图4所示；
[0091] SULT1A1*2G/A杂合突变样本10例，其中一个检测结果如图5所示；
[0092] 上述30例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明提 供的检测试剂盒用于人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率 达到100%，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。 [0093] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液， HotStartTaq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统，其中，所述2组特异 性引物序列分别为SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3与SEQIDN0:4;SEQIDN0:5、 SEQIDNO:6 与SEQIDNO:7。2. 如权利要求I所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述 2 组特异性探针序列分别为SEQIDNO: 8 与SEQIDNO: 9,SEQIDNO: 10 与SEQIDNO: 11， 且所述特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端修饰有NFQ-MGB。3. 如权利要求1或2所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在 于，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQIDNO: 12和SEQID NO: 13,所述内标探针序列为SEQIDNO: 14。4. 如权利要求3所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述 内标探针5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。5. 如权利要求1至4任一项所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特 征在于，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有4种质粒DNA 混合液，所述4种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2D6等位基因和2种不同的SULT1A1等 位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。6. -种用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤： (1) 设计并筛选含有CYP2D6和SULT1A1的检测探针，ARMS引物，通用引物； (2) 使用从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA; (3) 进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的CYP2D6基因多态性和SULT1A1基因多态 性检测分2管进行PCR反应。7. -种用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤： (1) 设计并筛选特异性扩增与检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的引物组合和探针组 合；制备如权利要求1至5任选一项所述试剂盒； (2) 获得待测样品基因组DNA; (3) 进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测CYP2D6和SULT1A1基因 的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统， 将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。
【专利摘要】本发明提供了一种人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，MgCl2，2组特异性引物，2组特异性探针，内标系统，HotStart Taq酶、UNG酶。本发明用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894236
【申请号】CN201510219734
【发明人】张喆, 叶婷, 张 浩, 周鹏飞
【申请人】武汉友芝友医疗科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测的试剂盒，尤其涉及一种 快速有效地检测少量样本的CYP2D6和SULT1A1基因多态性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 他莫昔芬（Tamoxifen)是一种选择性雌激素受体调节剂，可与雌激素竞争雌激素 受体，从而抑制雌激素介导的乳腺癌细胞增殖。1977年在美国获FDA批准上市，经过30年的 临床应用，被证实可以有效减少乳腺癌的复发，提高患者的生存率。手术后服用他莫昔芬5 年是雌激素受体（ER)阳性乳腺癌患者辅助内分泌治疗的金标准。在体内他莫西芬的代谢有 多种药物代谢酶参与，其经CYP3A代谢产生的N-去甲基他莫昔芬（N-desmethyItamoxifen) 是主要的代谢产物，约占他莫昔芬初级代谢产物的90 % ;经CYP2D6 (细胞色素 P4502D， 家族2,亚家族D，多肽6,细胞色素 P450家族2D6)代谢产生的4-羟基他莫昔芬 (4-hydroxytamoxifen)占他莫昔芬初级代谢产物的10%。N-去甲基他莫昔芬仅能由CYP2D 进一步代谢为 4_轻-N-去甲基他莫昔芬（4-hydroxy-N-desmethyltamoxifen，Endoxifen)。 Endoxifen和4-羟基他莫昔芬与雌激素受体亲和力都较强，是他莫西芬在体内代谢后的主 要活性成分，可以有效抑制雌激素介导的乳腺癌细胞扩增。
[0003] CYP2D6属于细胞色素 P450超级家族，参与临床上约25%药物的代谢。其编码基 因位于22号染色体长链ql3. 1区带，由9个外显子和8个内含子组成。CYP2D6基因具有高 度多态性，目前已报道有超过100种不同的等位基因，其编码的蛋白有酶活性升高、降低、 丧失或不变四种情况，等位基因的多态性决定了表型的多态性，按代谢活性可以将表型分 为快代谢（Um)、泛代谢（EM)、慢代谢（PM)和中等代谢（頂）四种类型。亚洲最常见的等位 基因型是CYP2D6*10,突变率约为50%。单个碱基的突变（1000 T)使得CYP2D6*10编码的 酶不稳定，催化药物的活性降低。研宄证实CYP2D6基因多态性与他莫西芬治疗患者血液内 活性成分浓度密切相关，显著影响患者复发率和生存期。一项大型研宄结果显示，293名接 受治疗的乳腺癌患者中，携带CYP2D6*10等位基因的T/T型患者与C/T型或C/C型患者相 比，血中4-羟-他莫西芬较低，且临床结果较差。美国FDA已于2006年建议患者在接受他 莫昔芬治疗前首先对CYP2D6的基因型进行检测。
[0004] SULT1A1 (磺基转移酶家族，细胞质的，苯酚偏好的，成员1，人磺基转移酶1A1)催 化酚类和雌激素类化合物磺基化，介导他莫西芬进一步转化成无活性产物排出体外。等位 基因 SULT1A1*2(638G>A)导致酶活性降低。白种人SULT1A1*1和SULT1A1*2等位基因频率 分别为65. 5%和33. 2%，中国人为91. 4%和8%，非裔美洲人为47. 7%和29. 4%。Nowell 等发现用他莫昔芬进行治疗的SULT1A1*2突变纯合子乳腺癌患者的死亡率是非突变纯合 子患者的3倍。携带高活性SULT1A1基因女性5年生存率是88%，而携带低活性基因女性 只有64%，即使排除了年龄、种族、诊断时病情阶段等影响因素，也同样如此。因此SULT1A1 的多态性在他莫昔芬的治疗中也起着重要的作用。
[0005] 表1 :CYP2D6和SULT1A1基因多态性
[0006]
[0007] 目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶 解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常 见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备 要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛， 但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多 态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一 种快速有效的检测少量样本的CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种CYP2D6和SULT1A1基因多态 性的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果 不理想的问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性， 其灵敏度高，特异性强，可适用于EDTA、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组 DNA的检测。
[0009] 本发明提供了一种CYP2D6和SULT1A1基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括 PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统。
[0010] 在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性引物序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 与 SEQ ID NO:4 ;SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6 与 SEQ ID NO: 7。
[0011] 在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性探针序列分别为SEQ ID NO: 8与SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10与SEQ ID NO: 11，且所述特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端 修饰有NFQ-MGB。
[0012] 在本发明的一些实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标 引物序列为SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13,所述内标探针序列为SEQ ID NO: 14。在一些 实施方案中，所述内标探针5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所 述阳性对照液含有4种质粒DNA混合液，所述4种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2D6等 位基因和2种不同的SULT1A1等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
[0014] 本发明的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒可以简单快速检测基因多态 性，并且所述检测包括以下步骤：（1)设计并筛选含有CYP2D6和SULT1A1的检测探针，ARMS 引物，通用引物；⑵从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA ; (3)进行 实时荧光定量PCR扩增：每个样本的CYP2D6基因多态性和SULT1A1基因多态性检测分2管 进行PCR反应。
[0015] 本发明CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了在 同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，本发明CYP2D6和 SULT1A1基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性检测 目的模板方法，对特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证，同时引入内标系统和UNG 酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点： 1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测Ing基因组DNA的基因型；3.针对 CYP2D6和SULT1A1的基因型设计ARMS引物和SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应的多 态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加 入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操 作简便，能在90分钟内完成检测，结果判读方法简单客观，便于分析。
【附图说明】
[0016] 图1是CYP2D6*10C/C纯合野生样本的一个检测结果图；
[0017] 图2是CYP2D6*10T/T纯合突变样本的一个检测结果图；
[0018] 图3是CYP2D6*10C/T杂合突变样本的一个检测结果图；
[0019] 图4是SULT1A1*2G/G纯合野生样本的一个检测结果图；
[0020] 图5是SULT1A1*2G/G纯合野生样本的一个检测结果图。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的【具体实施方式】仅仅 用以解释本发明，并不限制本发明。
[0022] 本发明的一个实施方案提供了一种CYP2D6和SULT1A1基因多态性的检测试剂盒， 该试剂盒包括PCR缓冲液，HotStart Taq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内 标系统。
[0023] 在一些具体实施方案中，所述PCR缓冲液中含有1.0~5. OmM的MgCl2,1.0~ 5. OmM 的 dNTP，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 0 ~5. OmM。
[0024] 在一些具体实施方案中，所述2组特异性引物序列为SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:3 与 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 与 SEQ ID N0:7;其中 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2与 SEQ ID N0:5、 SEQ ID N0:6为普通PCR引物，分别扩增包含CYP2D6*10 和 SULT1A1*2 基因多态性的 DNA 片段；其中 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 与 SEQ ID N0:7 为ARMS引物，用于分别特异性扩增含有CYP2D6*10C密码子CCT，CYP2D6*10T密码子TCT， SULT1A1*2G密码子CGC的DNA片段。3条ARMS引物分别在3'模板碱基与待扩增类型的碱 基配对，同时在其3'末端倒数第2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强特异性。
[0025] 各引物序列列举如下：
[0026] CYP2D6*10上游引物5'-GGCCATCTTCCTGCTCCTGGTGG-3' SEQ ID NO: 1
[0027] CYP2D6*10 下游引物 5'-TCGAAGCAGTATGGTGTGTTCTGGA-3， SEQ ID NO:2
[0028] CYP2D6*10C ARMS 引物 5'-CAGTGGCAGGGGGCCTGGTAC-3' SEQ ID NO:3
[0029] CYP2D6*10T ARMS 引物 5'-CAGTGCAGGGGGCCTGGTAT-3' SEQ ID NO:4
[0030] SULT1A1*2 上游引物 5'-TTTCTAGGAGAAGTGGCCAGAT-3' SEQ ID NO:5
[0031] SULT1A1*2 下游引物 5'-GTTCTTCTTCATCTCCTTGAA-3' SEQ ID NO:6
[0032] SULT1A1*2G ARMS 引物 5'-CCACGGTCTCCTCTGGCAGGGTCC-3' SEQ ID NO:7
[0033] 在一些具体实施方案中，所述特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端修饰有非 焚光淬灭基团NFQ (Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生焚光，因此可以大大降 低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提 高10°C左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在 识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
[0034] 在一些具体实施方案中，，所述2组特异性探针序列分别为SEQ ID NO: 8与SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10 与 SEQ ID NO: 11，且其中 SEQ ID N0:8 与 SEQ ID N0:9 探针分别特异 性检测 CYP2D6*10T、CYP2D6*10C 模板 DNA，SEQ ID NO: 10 与 SEQ ID NO: 11 探针分别特异性 检测 SULT1A1*2G、SULT1A1*2A 模板 DNA ;
[0035] 各探针序列列举如下：
[0036] CYP2D6*10C 检测探针 5'-FAM-GCTGCACGCTACCCAC-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO:8
[0037] CYP2D6*10T 检测探针 5'-VIC-GGGCCTGGTGAG-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO:9
[0038] SULT1A1*2G检测探针5'-FAM-GTTTGTGGGGCGC-NFQ-MGB-3， SEQ ID NO: 10
[0039] SULT1A1*2A 检测探针 5'-VIC-GTTTGTGGGGCAC-NFQ-MGB-3' SEQ ID NO: 11
[0040] 在一些具体实施方案中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制， 由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可 能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导 致假阴性结果的出现，因此本发明在一些具体实施方案中采用内标系统来消除上述隐患， 保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物、内标探针，本发明实施例中个可 采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。
[0041] 在一些具体实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物 序列为SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13,所述内标探针序列为SEQ ID NO: 14;所述内标探针 5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。
[0042] 在一些具体实施方案中，所述内标系统针对人类基因组保守区域设计，具有高度 的灵敏性和扩增特异性，其中包含的内标引物序列如下所示：
[0043] 内标正向引物 F:5' -CGCGAACTCACCCGT-3' SEQ ID NO: 12
[0044] 内标反向引物 R:5' -CACTAGGCGCTCACTGT-3' SEQ ID NO: 13
[0045] 在一些具体实施方案中，内标探针Y端标记有报告基团，如R0X、FAM、VIC等，3' 端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能 量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到 与模板结合的探针，其5' -3'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭 基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。
[0046] 在一些具体实施方案中，所述内标探针为：
[0047] R0X-5'-CACCTTCCCCATGGTGTCT-3' -BHQ2 SEQ ID NO: 14
[0048] 在一些具体实施方案中，酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液 还含有UNG酶，其中UNG酶（uracil-N-glycosylase)为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最 佳活性温度为50°C，95°C灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中 的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性 PCR扩增和污染。
[0049] 在一些具体实施方案中，本发明检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设 置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发 明中涉及的 CYP2D6 两种多态性CYP2D6*10T，CYP2D6*10C，SULT1A1 两种多态性 SULT1A1*2A， SULT1A1*2G的4种质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这4种质粒浓 度相同，均为2500拷贝/ μ 1 ;所述空白对照液为Tris-HCl (IOmM)缓冲液。
[0050] 本发明的另一目的在于提供一种用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法， 该方法包括以下步骤：
[0051] (1)设计并筛选特异性扩增与检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的引物组合和探 针组合；制备本发明的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒。
[0052] (2)获得待测样品基因组DNA ;
[0053] (3)进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测CYP2D6和SULT1A1 基因的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系 统，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。
[0054] 在一些具体实施方案中，以25 μ 1反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后 得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：
[0055] PCR 缓冲液 12. 5-15 μ 1 各条引物 0.2 μ M-I μ M 各条探针 0. 1 μ Μ-0. 5 μ M Taq 酶 0· 5 U-L 0 U UNG 酶 0.1 U-0· 5 U 样品DNA 2 μ 1 加水至 25 μ 1。
[0056] 上述体系仅为示例性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其 中各组分含量。
[0057] 具体地，在上述25 μ 1反应体系中，所述各对引物包括上述步骤（1)中的7条特异 性引物，1对内标引物，所述各条探针包括上述步骤（1)中的特异性探针，所述样品为基因 组 DNA。
[0058] 具体地，在步骤（3)中的荧光定量PCR反应条件为：
[0059] 37 °C处理10分钟，95 °C预变性5分钟，
[0060] 40个循环：95°C 15秒，60°C 60秒并收集焚光信号。
[0061] 在上述PCR反应后，所得结果按表1进行结果判定：
[0062] 表1.结果判定
[0063]
[0064] 本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方 法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。
[0065] 以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。
[0066] 实施例1
[0067] 制备本发明的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：
[0068] 1.引物及探针合成：
[0069] 设计并合成 2 组特异性引物 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 与 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 与 SEQ ID N0:7;2 组特异性探针 SEQ ID N0:8 与 SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10 与 SEQ ID NO: 11，并在 SEQ ID N0:8 和 SEQ ID NO: 10 的 5'端标记 FAM 荧光基团，3'端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 11的5'端标 记VIC荧光基团，3'端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100 μΜ的 母液储存。
[0070] 2.制备内标系统：设计并合成针对人类基因组设计的1对内标引物，该引物对序 列为SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13;设计并合成内标探针，该探针为SEQ ID NO: 14。将该 内标引物分别配制成100 μM的母液储存，内标探针配制成100 μM的母液储存。
[0071] 3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0 mM的MgCl2, dATP、dUTP、dGTP和 dCTP 各 1.0 mM ;制备酶混合液，其中含有 Taq 酶 0· 5 X 103U/ml，UNG 酶 0· I X 103U/ml。
[0072] 4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有4种质粒DNA，这些质粒 DNA 中分别含有本发明试剂盒涉及的 CYP2D6*10C、CYP2D6*10T、SULT1A1*2G、SULT1A1*2A 基 因4种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500拷贝/ μ 1 ;该空白对照液为Tris-HCl (IOmM)缓冲液。
[0073] 5. PCR反应液配制：按照下表进行两个不同体系PCR反应液配制
[0074]
[0075] 6.组装试剂盒：试剂盒中包含2管分别检测CYP2D6和SULT1A1的基因多态性检 测PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使 用量，配制试剂盒各管中成分并组装。
[0076] 实施例2
[0077] 用实施例1制备的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检 测。
[0078] 本实施例中收集30例乳腺癌患者的抗凝全血样品，从其中提取基因组DNA，用 实施例1中得到的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒检测待检样品的CYP2D6和 SULT1A1的基因多态性情况。
[0079] 1.血液样品基因组DNA提取
[0080] 取全血300 μ 1，加入900 μ 1的细胞裂解液CL，颠倒混勾，静置5min， 10, 000rpm(ll，500Xg)离心lmin，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中 加200 μ 1缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20 μ I Proteinase K溶液，混匀。加200 μ 1 缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置lOmin，其间颠倒混匀数次，直至溶液变清亮（如溶液 未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。加200 μ 1无水乙醇，充分颠倒混匀，此 时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附 柱CB3放入收集管中），12, OOOrpm(13, 400 X g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入 无水乙醇），12, OOOrpm(13, 400 X g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收 集管中。向吸附柱CB3中加入600 μ 1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12, 000rpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重 复操作步骤7。12,000rpm(13,400Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置 数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入I. 5ml离心管中，向吸附 膜中间位置悬空滴加100 μ 1洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12, OOOrpm(13, 400 Xg)离心 2min，将溶液收集到离心管中。取2 μ 1所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA 稀释到IOng/ μ 1，分别取2 μ 1加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反 应。
[0081] 2.样本的荧光定量PCR检测
[0082] 将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2 μ 1分别加入到23 μ 1的实施例1的试剂 盒的CYP2D6*10检测反应体系和SULT1A1*2检测反应体系中，使两种反应体系总体积均为 25 μ 1，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
[0083] 37〇C IOmin ；
[0084] 95 °C 5min ；
[0085] 95°0 158,60°0 6〇8,40个循环；每个循环后收集？41^1(：和1^的荧光信号。
[0086] 3.样本的检测结果分析：30例样品的检测结果如下：
[0087] CYP2D6*10C/C纯合野生样本7例，其中一个检测结果如图1所示；
[0088] CYP2D6*10T/T纯合突变样本4例，其中一个检测结果如图2所示；
[0089] CYP2D6*10C/T杂合突变样本19例，其中一个检测结果如图3所示；
[0090] SULT1A1*2G/G纯合野生样本20例，其中一个检测结果如图4所示；
[0091] SULT1A1*2G/A杂合突变样本10例，其中一个检测结果如图5所示；
[0092] 上述30例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明提 供的检测试剂盒用于人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率 达到100%，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。 [0093] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液， HotStartTaq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统，其中，所述2组特异 性引物序列分别为SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3与SEQIDN0:4;SEQIDN0:5、 SEQIDNO:6 与SEQIDNO:7。2. 如权利要求I所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述 2 组特异性探针序列分别为SEQIDNO: 8 与SEQIDNO: 9,SEQIDNO: 10 与SEQIDNO: 11， 且所述特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端修饰有NFQ-MGB。3. 如权利要求1或2所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在 于，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQIDNO: 12和SEQID NO: 13,所述内标探针序列为SEQIDNO: 14。4. 如权利要求3所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述 内标探针5'端修饰有R0X，3'端修饰有BHQ2。5. 如权利要求1至4任一项所述的CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，其特 征在于，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有4种质粒DNA 混合液，所述4种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2D6等位基因和2种不同的SULT1A1等 位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。6. -种用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤： (1) 设计并筛选含有CYP2D6和SULT1A1的检测探针，ARMS引物，通用引物； (2) 使用从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA; (3) 进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的CYP2D6基因多态性和SULT1A1基因多态 性检测分2管进行PCR反应。7. -种用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤： (1) 设计并筛选特异性扩增与检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的引物组合和探针组 合；制备如权利要求1至5任选一项所述试剂盒； (2) 获得待测样品基因组DNA; (3) 进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测CYP2D6和SULT1A1基因 的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统， 将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。
【专利摘要】本发明提供了一种人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，MgCl2，2组特异性引物，2组特异性探针，内标系统，HotStart Taq酶、UNG酶。本发明用于检测CYP2D6和SULT1A1基因多态性的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894236
【申请号】CN201510219734
【发明人】张喆, 叶婷, 张 浩, 周鹏飞
【申请人】武汉友芝友医疗科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
最新回复(0)