一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应用
一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应 用。
【背景技术】
[0002] 实幡（Fruit Flies)属双翅目（Diptera)实幡科（Tephritidae)，全世界广泛分 布，多发生在热带和亚热带地区。实蝇科约有500属4500种，具有重要经济意义的实蝇达 250余种，有些实蝇对水果生产会造成毁灭性灾害。世界上具有经济重要性的实蝇主要有5 个属，分别是按实幡属（Anastrepha)、果实幡属（Bactrocera)、小条实幡属（Ceratitis)、 寡鬃实幡属（Dacus)和绕实幡属（Rhagoletis)。
[0003] 在我国现行的进境植物检疫性有害生物名录中，检疫性实蝇包含按实蝇属、果实 蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇（非中国种）、绕实蝇（非中国种）、欧非枣实蝇、枣实蝇、橘实 锤腹实蝇、甜瓜迷实蝇及番木瓜长尾实蝇等10个种属；全国农业检疫性实蝇及林业检疫性 实蝇分别各有1个种，即蜜柑大实蝇和枣实蝇；在农业部发布的国家重点管理外来入侵物 种名录中，包括3种实蝇类害虫，分别为橘小实蝇、瓜实蝇和枣实蝇。
[0004] 由于口岸截获的实蝇多为形态上难以区分的非成虫态，一般需经1-2周饲养为成 虫后才能被准确鉴定，极大降低了检疫工作的时效性。传统的实蝇鉴定工作主要依靠形态 学特征，但由于实蝇种类多，区分不同实蝇种类之间的形态学差别往往非常细微和复杂，有 的种类还需借助分布和寄主信息才能区分，有的种类的分类地位仍较为混乱，且实蝇新属 和新种的描述还在不断增加，特别是一些复合体种类的分类还存在争议，这些问题的存在 都给实蝇传统形态鉴定带来了极大的阻碍。随着国际果蔬贸易的发展，实蝇类害虫传入我 国的风险显著增加，其检疫鉴定特别是快速鉴定的需求愈发迫切。
[0005] 集成流路（Integrated Fluidic Circuit，IFC)芯片是一种利用具有高弹性的聚 二甲基硅氧烷材料，采用多层软刻蚀技术在芯片上设计并加工成高密度的微泵微阀结构， 通过控制微泵微阀的关闭和开启，快速准确地将反应液分成若干独立的纳升量级反应单 元，实现多步平行进行的通量高、体积小的PCR反应平台。
[0006] 集成流体通路技术自出现以来，受到了科学界的格外青睐，该领域内的全球各大 公司也相继推出了商业化产品。2006年，美国Fluidigm公司率先推出基于IFC技术的 BioMark?基因分析系统，该系统是集成IFC技术、Real-Time PCR技术和基因分析软件相结 合的技术平台，由BioMark? Real-Time PCR系统、IFC芯片、IFC控制器和数据分析软件4 部分构成。其中，48. 48IFC动态芯片可同时进行2304个实时荧光PCR反应。
[0007] 目前，以IFC芯片为反应平台的多种PCR技术已在医学诊断、基因分型、单细胞基 因表达、转基因检测、环境微生物检测、下一代测序等方面得到了广泛的应用，但其在昆虫 分子鉴定方面的应用未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的成套引物和探针。
[0009] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的成套引物和探针由27个引物探针组组成。
[0010] 上述成套引物和探针中，
[0011] 所述引物探针组1为SEQ ID No. 1所示的引物I-USEQ ID No. 2所示的引物1-2 和SEQ ID No. 3所示的探针1组成；
[0012] 所述引物探针组2为SEQ ID No. 4所示的引物2-l、SEQ ID No. 5所示的引物2-2 和SEQ ID No. 6所示的探针2组成；
[0013] 所述引物探针组3为SEQ ID No. 7所示的引物3-l、SEQ ID No. 8所示的引物3-2 和SEQ ID No. 9所示的探针3组成；
[0014] 所述引物探针组4为SEQ ID No. 10所示的引物4-1、SEQ ID No. 11所示的引物 4- 2和SEQ ID No. 12所示的探针4组成；
[0015] 所述引物探针组5为SEQ ID No. 13所示的引物5-1、SEQ ID No. 14所示的引物 5- 2和SEQ ID No. 15所示的探针5组成；
[0016] 所述引物探针组6为SEQ ID No. 16所示的引物6-1、SEQ ID No. 17所示的引物 6- 2和SEQ ID No. 18所示的探针6组成；
[0017] 所述引物探针组7为SEQ ID No. 19所示的引物7-1、SEQ ID No. 20所示的引物 7- 2和SEQ ID No. 21所示的探针7组成；
[0018] 所述引物探针组8为SEQ ID No. 22所示的引物8-1、SEQ ID No. 23所示的引物 8- 2和SEQ ID No. 24所示的探针8组成；
[0019] 所述引物探针组9为SEQ ID No. 25所示的引物9-1、SEQ ID No. 26所示的引物 9- 2和SEQ ID No. 27所示的探针9组成；
[0020] 所述引物探针组10为SEQ ID No. 28所示的引物IO-USEQ ID No. 29所示的引物 10- 2和SEQ ID No. 30所示的探针10组成；
[0021] 所述引物探针组11为SEQ ID No. 31所示的引物Il-USEQ ID No. 32所示的引物 11- 2和SEQ ID No. 33所示的探针11组成；
[0022] 所述引物探针组12为SEQ ID No. 34所示的引物12-1、SEQ ID No. 35所示的引物 12- 2和SEQ ID No. 36所示的探针12组成；
[0023] 所述引物探针组13为SEQ ID No. 37所示的引物13-1、SEQ ID No. 38所示的引物 13- 2和SEQ ID No. 39所示的探针13组成；
[0024] 所述引物探针组14为SEQ ID No. 40所示的引物14-1、SEQ ID No. 41所示的引物 14- 2和SEQ ID No. 42所示的探针14组成；
[0025] 所述引物探针组15为SEQ ID No. 43所示的引物15-1、SEQ ID No. 44所示的引物 15- 2和SEQ ID No. 45所示的探针15组成；
[0026] 所述引物探针组16为SEQ ID No. 46所示的引物16-1、SEQ ID No. 47所示的引物 16- 2和SEQ ID No. 48所示的探针16组成；
[0027] 所述引物探针组17为SEQ ID No. 49所示的引物17-1、SEQ ID No. 50所示的引物 17- 2和SEQ ID No. 51所示的探针17组成；
[0028] 所述引物探针组18为SEQ ID No. 52所示的引物18-1、SEQ ID No. 53所示的引物 18- 2和SEQ ID No. 54所示的探针18组成；
[0029] 所述引物探针组19为SEQ ID No. 55所示的引物19-1、SEQ ID No. 56所示的引物 19- 2和SEQ ID No. 57所示的探针19组成；
[0030] 所述引物探针组20为SEQ ID No. 58所示的引物20-l、SEQ ID No. 59所示的引物 20- 2和SEQ ID No. 60所示的探针20组成；
[0031] 所述引物探针组21为SEQ ID No. 61所示的引物21-1、SEQ ID No. 62所示的引物 21- 2和SEQ ID No. 63所示的探针21组成；
[0032] 所述引物探针组22为SEQ ID No. 64所示的引物22-l、SEQ ID No. 65所示的引物 22- 2和SEQ ID No. 66所示的探针22组成；
[0033] 所述引物探针组23为SEQ ID No. 67所示的引物23-l、SEQ ID No. 68所示的引物 23- 2和SEQ ID No. 69所示的探针23组成；
[0034] 所述引物探针组24为SEQ ID No. 70所示的引物24-l、SEQ ID No. 71所示的引物 24- 2和SEQ ID No. 72所示的探针24组成；
[0035] 所述引物探针组25为SEQ ID No. 73所示的引物25-l、SEQ ID No. 74所示的引物 25- 2和SEQ ID No. 75所示的探针25组成；
[0036] 所述引物探针组26为SEQ ID No. 76所示的引物26-l、SEQ ID No. 77所示的引物 26- 2和SEQ ID No. 78所示的探针26组成；
[0037] 所述引物探针组27为SEQ ID No. 79所示的引物27-l、SEQ ID No. 80所示的引物 27- 2和SEQ ID No. 81所示的探针27组成。
[0038] 上述成套引物和探针中，所述引物探针组中的引物与探针的物质的量比为9 :20。
[0039] 上述成套引物和探针中，所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西 印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、 昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、 萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实 蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
[0040] 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的PCR试剂。
[0041] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂 3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9、PCR试剂10、PCR 试剂11、PCR试剂12、PCR试剂13、PCR试剂14、PCR试剂15、PCR试剂16、PCR试剂17、PCR 试剂18、PCR试剂19、PCR试剂20、PCR试剂21、PCR试剂22、PCR试剂23、PCR试剂24、PCR 试剂25、PCR试剂26和PCR试剂27组成；
[0042] 所述PCR试剂1包括上述成套引物和探针中的引物探针组1 ;
[0043] 所述PCR试剂2包括上述成套引物和探针中的引物探针组2 ;
[0044] 所述PCR试剂3包括上述成套引物和探针中的引物探针组3 ;
[0045] 所述PCR试剂4包括上述成套引物和探针中的引物探针组4 ;
[0046] 所述PCR试剂5 包括上述成套引物和探针中的引物探针组5 ;
[0047] 所述PCR试剂6包括上述成套引物和探针中的引物探针组6 ;
[0048] 所述PCR试剂7包括上述成套引物和探针中的引物探针组7 ;
[0049] 所述PCR试剂8包括上述成套引物和探针中的引物探针组8 ;
[0050] 所述PCR试剂9包括上述成套引物和探针中的引物探针组9 ;
[0051] 所述PCR试剂10包括上述成套引物和探针中的引物探针组10 ;
[0052] 所述PCR试剂11包括上述成套引物和探针中的引物探针组11 ;
[0053] 所述PCR试剂12包括上述成套引物和探针中的引物探针组12 ;
[0054] 所述PCR试剂13包括上述成套引物和探针中的引物探针组13 ;
[0055] 所述PCR试剂14包括上述成套引物和探针中的引物探针组14 ;
[0056] 所述PCR试剂15包括上述成套引物和探针中的引物探针组15 ;
[0057] 所述PCR试剂16包括上述成套引物和探针中的引物探针组16 ;
[0058] 所述PCR试剂17包括上述成套引物和探针中的引物探针组17 ;
[0059] 所述PCR试剂18包括上述成套引物和探针中的引物探针组18 ;
[0060] 所述PCR试剂19包括上述成套引物和探针中的引物探针组19 ;
[0061] 所述PCR试剂20包括上述成套引物和探针中的引物探针组20 ;
[0062] 所述PCR试剂21包括上述成套引物和探针中的引物探针组21 ;
[0063] 所述PCR试剂22包括上述成套引物和探针中的引物探针组22 ;
[0064] 所述PCR试剂23包括上述成套引物和探针中的引物探针组23 ;
[0065] 所述PCR试剂24包括上述成套引物和探针中的引物探针组24 ;
[0066] 所述PCR试剂25包括上述成套引物和探针中的引物探针组25 ;
[0067] 所述PCR试剂26包括上述成套引物和探针中的引物探针组26 ;
[0068] 所述PCR试剂27包括上述成套引物和探针中的引物探针组27。
[0069] 上述各PCR试剂由Assays体系和Sample体系组成；每5ul所述Assays体系 由正向引物（100μΜ)0·45μ1、反向引物（100μΜ)0·45μ1、探针（10yM)lyl、2XAssay Loading Reagent2. 5 μ 1、50XR0X Reference Dye II 0· 25 μ 1 和 ddH20 0· 35 μ 1 组成；每 5ul 所述 Sample体系由 2XPremix Ex Taq 2· 5μ1 和 20XGE Sample Loading Reagent 0.25 μ I 组成。
[0070] 本发明还有一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的集成流路芯片。
[0071] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的集成流路芯片包括上述成套引物和探针或上 述PCR试剂。
[0072] 上述集成流路芯片中，所述集成流路芯片为将上述每一种PCR试剂分装在集成流 路芯片的各微反应室中，得到含有上述成套引物和探针或上述PCR试剂的集成流路芯片。
[0073] 本发明还有一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的试剂盒。
[0074] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的试剂盒包括上述成套引物和探针或上述PCR 试剂或上述集成流路芯片。
[0075] 上述成套引物和探针或上述PCR试剂或上述集成流路芯片或上述试剂盒在鉴定 或辅助鉴定待测实蝇是否为27种实蝇中任一种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0076] 上述成套引物和探针或上述PCR试剂或上述集成流路芯片或上述试剂盒在鉴定 或辅助鉴定待测实蝇为27种实蝇中哪一种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0077] 上述应用中，所述27种实蝇为墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴 果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包 果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、 宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃 实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
[0078] 本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测实蝇种类的方法。
[0079] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测实蝇种类的方法包括如下步骤：将待测实蝇的 基因组DNA加入上述集成流路芯片的各微反应室中，进行实时荧光PCR，检测各微反应室 PCR产物；
[0080] 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内进行阳性扩增，则待测 实蝇为或候选为该引物探针组对应的目标实蝇；
[0081] 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内为非阳性扩增，则待测 实蝇不为或候选不为该引物探针组对应的目标实蝇。
[0082] 上述方法中，所述阳性扩增为微反应室产生荧光且CT值< 20. 0 ;所述非阳性扩增 指微反应室不产生荧光或产荧光且CT值> 20. 0。
[0083] 上述方法中，
[0084] 所述引物探针组1对应的实蝇为墨西哥按实蝇；
[0085] 所述引物探针组2对应的实蝇为西印度按实蝇；
[0086] 所述引物探针组3对应的实蝇为蒲桃果实蝇；
[0087] 所述引物探针组4对应的实蝇为番石榴果实蝇；
[0088] 所述引物探针组5对应的实蝇为杨桃果实蝇；
[0089] 所述引物探针组6对应的实蝇为橘小实蝇；
[0090] 所述引物探针组7对应的实蝇为辣椒果实蝇；
[0091] 所述引物探针组8对应的实蝇为锈红果实蝇；
[0092] 所述引物探针组9对应的实蝇为昆士兰果实蝇；
[0093] 所述引物探针组10对应的实蝇为短尾果实蝇；
[0094] 所述引物探针组11对应的实蝇为面包果实蝇；
[0095] 所述引物探针组12对应的实蝇为桃果实蝇；
[0096] 所述引物探针组13对应的实蝇为油橄榄果实蝇；
[0097] 所述引物探针组14对应的实蝇为橘大实蝇；
[0098] 所述引物探针组15对应的实蝇为蜜柑大实蝇；
[0099] 所述引物探针组16对应的实蝇为萌瓜实蝇；
[0100] 所述引物探针组17对应的实蝇为两带果实蝇；
[0101] 所述引物探针组18对应的实蝇为瓜实蝇；
[0102] 所述引物探针组19对应的实蝇为宽带果实蝇；
[0103] 所述引物探针组20对应的实蝇为南亚果实蝇；
[0104] 所述引物探针组21对应的实蝇为枣实蝇；
[0105] 所述引物探针组22对应的实蝇为地中海实蝇；
[0106] 所述引物探针组23对应的实蝇为芒果小条实蝇；
[0107] 所述引物探针组24对应的实蝇为纳塔耳小条实蝇；
[0108] 所述引物探针组25对应的实蝇为萌芦寡鬃实蝇；
[0109] 所述引物探针组26对应的实蝇为樱桃绕实蝇；
[0110] 所述引物探针组27对应的实蝇为苹绕实蝇；
[0111] 所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、 番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实 蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、 瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌 芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
[0112] 上述方法中，所述实时荧光PCR的反应条件是95°C预变性30s ;40个循环的95°C 变性5s，60°C退火延伸34s ;60°C延伸lmin。
[0113] 本发明的优点：
[0114] (1)本发明所覆盖的检疫性实蝇种类范围广，可完全满足我国植物检疫工作的实 际需求。
[0115] (2)利用专门设计的流路和阀门，通过计算机控制，在芯片上自动完成生物样品和 反应试剂的分液，极大简化了移液操作，又可防止污染的发生。
[0116] (3)反应通量高，且其纳升量级的反应体系为高通量的检测分析节约了大量成本。
[0117] (4)可检测单拷贝的DNA分子，从根本上提高了检测的灵敏度和准确度。
[0118] (5)解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残体的种类鉴定问题。
[0119] (6)特异性强、效率高；比传统实时荧光PCR的操作流程简化至1/48 ;纳升级的反 应体系比传统PCR和实时荧光PCR反应的试剂耗费减少100倍。
[0120] 本发明在对6属179种2252条实蝇mtDNA COI条形码序列比对的基础上，针对27 种检疫性实蝇，即墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、 橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油 橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实 蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹 绕实蝇，设计并筛选种特异性引物和TaqMan-MGB探针，开发基于集成流路芯片的分子鉴定 技术。通过试验证明：本发明的基于集成流路芯片的分子鉴定技术可以快速实现对实蝇 种类的鉴定，并且特异性好、通量高、成本低、操作简单，解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残 体的种类鉴定问题，能够为进出境植物检疫和全国实蝇疫情监测提供快速鉴定的工具和技 术，可有效预防危险性实蝇的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发 展。
【附图说明】
[0121] 图1为48 · 48动态芯片。
[0122] 图2为27种实蝇引物和探针组合集成流路芯片特异性检测结果。
[0123] 图3为集成流路芯片鉴定非成虫态实蝇结果图。
【具体实施方式】
[0124] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0125] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0126] 下述实施例中的48. 48IFC动态芯片的名称为Dynamic Array IFCs ;型号为 48. 48 ;厂家为 Fluidigm(美国）。
[0127] Control Line Fluid 是 Fluidigm(美国）公司的产品；
[0128] 2 XPremix E x Taq和 50 X ROX Reference Dye II 是 TaKaRa 的产品，产品目录号： RR390A ；
[0129] 2XAssay Loading Reagent (PN 85000736)和 20XGE Sample Loading Reagent (PN 85000735)是 Fluidigm(美国）公司的产品。
[0130] 实施例1、鉴定27种实蝇的特异性引物对和探针的获得
[0131] 一、实蝇mtDNA COI基因序列的获得
[0132] 1、供试实蝇样品如表1所示，样品均置于无水乙醇中，-20°C保存备用。
[0133] 表1、供试实蝇样品种类及采集地信息
[0134]
[013
伯利兹圣伊格纳西奥 果实蝇属 蒲桃果实蝇 印度尼西亚万隆 Baciroccra B, (Baciroccra) alhislri^aia 番石植果实蝇 中国云南景洪 B. (Bactrocera) correcta 中国石南昆明 屮国云南芒市 中国南励腊 中国云南瑞丽 中国云南元江 中国广东广州 老挝琅勃拉邦 緬甸 泰国曼谷 泰国尖竹汶 泰国洁迈 泰国呵叻 泰国巴吞他尼 泰国沙缴 泰国西萨菊 越南 橘小实妮复合体5. ?/onyafe complex 杨桃果实蝇 印度尼西亚万隆 B. (Baclrocera) caramholae 苏里南帕拉马里博 橘小实蝇 中国云南景洪 B. (Bactrocera) dorsalis 中国广西凭祥 屮国上海 中国福建厦门 中国广东广州 中国海南白沙 中国海南海LJ 印度尼西亚万隆 布隆迪 肯尼亚 南非 辣椒果实蝇 中国云南景洪 B. (Baclrocera) Ialifmns ' b >|<: IjlI xIk 锈红果实蝇 中国z?南河口 B. (Bactrocera) rubigina 中国云南景洪 中国云南瑞丽 中国海南内沙
[0136] 昆士兰果实蝇 澳大利亚 5. (Bacirocera) tryoni 短尾果实蝇 ^ 屮国云南景洪 B. (Bacirocera) fuberculata 面包果实蝇 印度尼两亚万隆 D. (Baclrocera) umbrosa 办丨.丨-;1太卡 五指山果实臟 中国云南河口 B. (Baclrocera) wuzhishcwa 11111^I |4? 桃果实蝇 老挝琅勃拉邦 B. (Bacirocera) zonula 泰丨丨、:丨;丫1:辺 油橄榄果实蝇 意大利 B. (Daculus) oleae 异颜果实蝇 屮国云南景洪 B. (Paratridacus) diversa 中国 z?南芒市 何氏华实蝇 中国云南景洪 B, (Sinodacus) hochii 橘大实蝇 中国四川成都 B. (Tetradacus) minax 屮国四川宜宾 中国贵州六盘水 中国湖南桃源 蜜相大实蝇 中国四川宜宾 B. (Tetradacus) tsuneonis 中国贵州六盘水 深黑颜果实蝇 屮国云南河口 B. (Zeugodacus) atrifacies 中国 z?南景洪 中国广西凭祥 越南 葫瓜实M 中国河南汝州 B. (Zeugodacus) bezziana 屮国甘肃文县 中国湖北神农架 两带果实蝇 中国云南河口 B. (Zcugodacus) cilifera 中国 z?南景洪 瓜实蝇 中国云鹵景洪 B· (Zeugodacus) cucurbiiae 屮 _ 广两南宁 中国上海 中国福建福州 中国海南乐东 印度尼西亚万隆 宽带果实蝇 屮国河南罗山 B. (Zeugodacus) scutellata 中国河南汝州 __中国云南景洪
[0137]
[0138] 2、采用"血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒"（天根生化科技（北京）有限 公司）分别提取表1中的各个实蝇样品的基因组DNA(大部分样品取单足进行提取，少数样 品为单头提取），具体操作流程参照说明书，分别得到表1中的各个实蝇样品的基因组DNA。
[0139] 分别以表1中的各个实蝇样品的基因组DNA为模板，使用通用引物LC01490/ HC02198进行PCR扩增，分别得到表1中的各个实蝇样品的PCR扩增产物。
[0M0] PCR扩增总体系（25 μ I) :2 X Taq PCR MasterMix (天根生化科技（北京）有限公 司，目录号：ΚΤ201) 12.5 μ 1、上下游引物（10 μΜ，北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成）各 1 μ 1、CldH2O 9. 5 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 ;
[0141] PCR 扩增条件：94°C预变性 3min ;94°C变性 lmin，50°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 35个循环；72°C延伸lOmin。
[0142] 3、取5 μ I PCR扩增产物分别进行电泳检测，将检测合格的PCR扩增产物直接交由 北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化和双向测序。利用Chromas软件查看测序峰图， 用DNAMN软件对测序结果进行拼接。
[0143] 下载BOLD中已公开的经济实蝇属所有实蝇种类序列（截至2013年5月17日）， 并筛选出长度不短于600bp的mtDNA COI条形码序列。通过实验和BOLD中下载共获得6 属179种2252条的实蝇mtDNA COI条形码序列。
[0144] 二、27种特异性引物对和TaqMan-MGB探针的设计
[0145] 根据上述获得的6属179种2252条的实蝇mtDNA COI条形码序列设计引物和探 针，最后获得27对引物和探针，27对引物和对应的27个TaqMan-MGB探针（5 ' -FAM ; 3 ' -MGB) 如表2所示，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
[0146] 表2、27种检疫性实蝇特异引物和探针
[0147]
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[0150] 实施例2、鉴定27种实蝇的集成流路芯片的制备及其特异性检测
[0151] 一、集成流路芯片的制备
[0152] 1、48. 48动态芯片的初始化
[0153] (1)打开芯片包装，并在24h内使用；
[0154] (2)将Control Line Fluid分别注入48. 48动态芯片两端的收集器，注意勿将 Control Line Fluid 滴入 Assay Inlets 或 Sample Inlets ；
[0155] (3)去除IFC芯片底部的蓝色保护膜；
[0156] (4)将芯片转入IFC Controller，运行Primer (113x)程序对芯片进行初始化，初 始化时间为IOmin ;初始化完成后，在60min内完成上样操作。
[0157] 2、标准反应体系和样品混合液的配制
[0158] (1)按照表3所示的试验体系分别配制27种实蝇的lOXAssays，包括上下游引 物、探针、2XAssay Loading Reagent、50XR0X II Reference Dye II 和 ddH20,混勾并离 心。
[0159] 表3、试验体系
[0160] 10 X Assays
[0161] Forward Primer (100μΜ) 0.45μL Reverse Primer (1 ΟΟμΜ) 0·45μ1 Taqman-MGB Probe (ΙΟμΜ) 1μ 2χAssay Loading Reagent 2.5μ1 50χROX Reference Dye Il 0.25μL ddH20 0.35μ1 总体积 5μ1
[0162] (2)按照表4所示的样品体系分别配制每种实蝇样品混合液，包括2 XPremix Ex Taq、20XGE Sample Loading Reagent和每种实幡样品的DNA(表5)，混勾并离心。
[0163] 表4、样品体系
[0164] 2XPremix Ex Taq 2·5μ1 2〇χ〇Ε Sample Loading Reagent 0.25μ1 DNA (50ng/>l) 2·25μ1 总体积 5μ1
[0165] 表 5、Assay Inlets 和 Sample Inlets 对应的实幡物种
[0166]
[016:」
[0168] 3、芯片上样
[0169] (1)芯片初始化后，将其从IFC Controller中取出，向Assay Inlets和Sample Inlets的相应管道中分别注入已混勾的5 μ I IOXAssays试剂和实幡样品混合液；不用的 Assay Inlets，加入2· 5μ1 2XAssay Loading Reagent、0.25yl 50XR0X II 和 2· 25μ1 ddH20;不用的 Sample Inlets，加入 2·5μ I 2XPremix Ex Taq、0.25y I 20XGE Sample Loading Reagent和2. 25 μ I ddH20。上样过程中，应避免气泡的产生，使用移液器时缓慢 打液至第一档。
[0170] (2)将芯片放回 IFC Controller 中，运行 Load Mix(113x)程序，该程序将 assays 和samples自动导入到IFC芯片中进行分液，运行时间为Ih ;
[0171] (3) Load Mix程序结束后，将芯片从IFC Controller中取出，用胶带轻微粘除芯片 表面的灰尘等杂质，并在4h内开始芯片的实时荧光PCR。
[0172] 4、实时荧光PCR
[0173] (1)将芯片放入BioMark实时焚光PCR系统中，选择Gene Expression应用类型、 ROX参比荧光、FAM-MGB探针类型，按照建立的反应条件在自动曝光模式下运行实时荧光 PCR反应。反应条件如表5所示。
[0174] 表5、反应条件
[0175] 95°C预变性30s 95°C变性 5s , 60°C 退火延伸 34s eydeS 60°C 延伸 Imin
[0176] (2)实时荧光PCR反应结束后，将芯片从BioMark实时荧光PCR系统中取出，用 Fluidigm Real-Time PCR分析软件对实验数据进行分析。
[0177] 通过查看反应结果的Heat Map，判定所设计的27种检疫性实幡种特异性引物对 和探针在集成流路芯片的反应平台下的可应用性和特异性。在芯片上的2304个微反应室 中，有扩增反应的 微反应室则会产生荧光，在Heat Map中对应的微反应室会以彩色方点形 式呈现，且不同CT值的反应所发出的荧光颜色不同。
[0178] 二、集成流路芯片的特异性检测结果
[0179] 特异性验证的原则为每种实蝇的引物和探针组合只有在与其对应的目标实蝇的 微反应室内产生阳性荧光信号，而其他微反应室均无荧光信号产生或为非阳性扩增结果， 即该特异性引物和探针在所建立的检疫性实蝇集成流路芯片鉴定技术体系下，能特异性地 鉴定出目标实蝇物种，设定CT < 20. 0为阳性扩增。
[0180] 若某特异性引物和探针对应的微反应室产生荧光且CT值< 20. 0,则待测实蝇为 或候选为该特异性引物和探针对应的目标实蝇；
[0181] 若某特异性引物和探针对应的微反应室无荧光信号或产生荧光且CT值> 20. 0， 则待测实蝇不为或候选不为该特异性引物和探针对应的目标实蝇。
[0182] 引物1-1、引物1-2和探针1对应的目标实蝇为墨西哥按实蝇；
[0183] 引物2-1、引物2-2和探针2对应的目标实蝇为西印度按实蝇；
[0184] 引物3-1、引物3-2和探针3对应的目标实蝇为蒲桃果实蝇；
[0185] 引物4-1、引物4-2和探针4对应的目标实蝇为番石榴果实蝇；
[0186] 引物5-1、引物5-2和探针5对应的目标实蝇为实蝇为杨桃果实蝇；
[0187] 引物6-1、引物6-2和探针6对应的目标实蝇为橘小实蝇；
[0188] 引物7-1、引物7-2和探针7对应的目标实蝇为辣椒果实蝇；
[0189] 引物8-1、引物8-2和探针8对应的目标实蝇为锈红果实蝇；
[0190] 引物9-1、引物9-2和探针9对应的目标实蝇为昆士兰果实蝇；
[0191] 引物10-1、引物10-2和探针10对应的目标实蝇为短尾果实蝇；
[0192] 引物11-1、引物11-2和探针11对应的目标实蝇为面包果实蝇；
[0193] 引物12-1、引物12-2和探针12对应的目标实蝇为桃果实蝇；
[0194] 引物13-1、引物13-2和探针13对应的目标实蝇为油橄榄果实蝇；
[0195] 引物14-1、引物14-2和探针14对应的目标实蝇为橘大实蝇；
[0196] 引物15-1、引物15-2和探针15对应的目标实蝇为蜜柑大实蝇；
[0197] 引物16-1、引物16-2和探针16对应的目标实蝇为萌瓜实蝇；
[0198] 引物17-1、引物17-2和探针17对应的目标实蝇为两带果实蝇；
[0199] 引物18-1、引物18-2和探针18对应的目标实蝇为瓜实蝇；
[0200] 引物19-1、引物19-2和探针19对应的目标实蝇为宽带果实蝇；
[0201] 引物20-1、引物20-2和探针20对应的目标实蝇为南亚果实蝇；
[0202] 引物21-1、引物21-2和探针21对应的目标实蝇为枣实蝇；
[0203] 引物22-1、引物22-2和探针22对应的目标实蝇为地中海实蝇；
[0204] 引物23-1、引物23-2和探针23对应的目标实蝇为芒果小条实蝇；
[0205] 引物24-1、引物24-2和探针24对应的目标实蝇为纳塔耳小条实蝇；
[0206] 引物25-1、引物25-2和探针25对应的目标实蝇为萌芦寡鬃实蝇；
[0207] 引物26-1、引物26-2和探针26对应的目标实蝇为樱桃绕实蝇；
[0208] 引物27-1、引物27-2和探针27对应的目标实蝇为苹绕实蝇。
[0209] 特异性检测结果如图2所示：35种实蝇样品中，与27种实蝇（墨西哥按实蝇、西 印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、 昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、 萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实 蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇）的特异性引物和探针种类相 对应的实蝇样品的微反应室均发出了荧光信号且CT值< 20.0 ;不与27种实蝇的特异性引 物和探针种类对应的实蝇样品的微反应室内无荧光信号或产生荧光且CT值> 20. 0。通过 本发明的实蝇集成流路芯片可一次性实现27种检疫性实蝇的快速鉴定。
[0210] 实施例3、集成流路芯片在鉴定实蝇中的应用
[0211] 一、待测实蝇样品
[0212] 以下述非成虫态实蝇样品为例，应用实施例2所述的集成流路芯片鉴定其种类。
[0213] 2012年5月北京出入境检验检疫局从泰国进口的莲雾中截获的实蝇幼虫3头；
[0214] 2014年5月北京出入境检验检疫局从坦桑尼亚进口的芒果中截获的实蝇幼虫2 头；
[0215] 2009年7月采自我国广西壮族自治区南宁地区苦瓜烂果中的实蝇幼虫2头；
[0216] 2011年10月我国四川省成都市植保植检站送检的寄主为柑橘的实蝇蛹2个；
[0217] 2011年8月广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心国家实蝇检疫重点实验室 饲养的辣椒果实蝇卵3枚。
[0218] 二、鉴定方法
[0219] 采用试剂盒法提取上述步骤一中的待测实蝇样品的基因组DNA，提取过程参照说 明书进行。
[0220] 利用实施例2所述的集成流路芯片及其鉴定方法对上述待测实蝇样品的基因组 DNA进行检测。
[0221] 每个种特异性引物和探针组合的IOXAssays总体系为5 μ 1，其中包括上下游引 物（100 μ Μ)各 0.45 μ 1，探针（10 μ Μ)1 μ 1，2 X Assay Loading Reagent 2.5 μ 1，50 X ROX II 0· 25 μ 1，ddH20 0· 35 μ 1。
[0222] 每个样品的总体系为 5μ1，其中包括 2XPremix Ex Taq 2.5yl，20XGE Sample Loading Reagent 0· 25 μ 1，DNA 2·25 μ I0
[0223] 反应条件：95°C预变性30s ;40个循环的95°C变性5s，60°C退火延伸34s ;60°C延 伸 lmin〇
[0224] 反应结束后，通过直接观察Heat Map (CT < 20. 0为阳性扩增）判断结果。
[0225] 三、鉴定结果
[0226] 结果如图3所示：从泰国莲雾中截获的3头实蝇幼虫均在与其对应的番石榴果实 蝇引物和探针组合的微反应室内产生阳性荧光信号，CT值分别为17. 29、19. 77和14. 40,而 其他微反应室均无荧光信号产生或为CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定其种类为番石榴果 实蝇；从坦桑尼亚芒果中截获的2头实蝇幼虫均在与其对应的芒果小条实蝇引物和探针组 合的微反应室内产生阳性荧光信号，CT值分别为10. 69和12. 98,而其他微反应室均无荧光 信号产生或为CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定其种类为芒果小条实蝇；从我国广西南宁地 区苦瓜烂果中的2头实蝇幼虫均在与其对应的南亚果实蝇引物和探针组合的微反应室内 产生阳性荧光信号，CT值分别为11. 17和13. 33,而其他微反应室均无荧光信号产生或为CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定其种类为南亚果实蝇；从四川成都植保植检站送检的2个寄 主为柑橘的实蝇蛹均在与其对应的橘大实蝇引物和探针组合的微反应室内产生阳性荧光 信号，CT值分别为10. 98和11. 66,而其他微反应室均无荧光信号产生或为CT > 20. 0非阳 性扩增，因此鉴定其种类为橘大实蝇；从广东检验检疫技术中心国家实蝇检疫重点实验室 饲养的3枚辣椒果实蝇卵均在与其对应的辣椒果实蝇引物和探针组合的微反应室内产生 阳性荧光信号，CT值分别为13. 03、15. 41和17. 08,而其他微反应室均无荧光信号产生或为 CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定结果同为辣椒果实蝇，说明集成流路芯片技术可成功应用 于实蝇卵的分子鉴定。
[0227] 以上试验结果说明了基于集成流路芯片的实时荧光PCR技术鉴定非成虫态实蝇 样品种类的有效性。
【主权项】
1. 一种用于鉴定实蝇种类的成套引物和探针，由27个引物探针组组成； 所述引物探针组1为SEQIDNo. 1所示的引物1-1、SEQIDNo. 2所示的引物1-2和SEQIDNo. 3所示的探针1组成； 所述引物探针组2为SEQIDNo. 4所示的引物2-1、SEQIDNo. 5所示的引物2-2和SEQIDNo. 6所示的探针2组成； 所述引物探针组3为SEQIDNo. 7所示的引物3-1、SEQIDNo. 8所示的引物3-2和SEQIDNo. 9所示的探针3组成； 所述引物探针组4为SEQIDNo. 10所示的引物4-l、SEQIDNo. 11所示的引物4-2和SEQIDNo. 12所示的探针4组成； 所述引物探针组5为SEQIDNo. 13所示的引物5-l、SEQIDNo. 14所示的引物5-2和SEQIDNo. 15所示的探针5组成； 所述引物探针组6为SEQIDNo. 16所示的引物6-l、SEQIDNo. 17所示的引物6-2和SEQIDNo. 18所示的探针6组成； 所述引物探针组7为SEQIDNo. 19所示的引物7-l、SEQIDNo. 20所示的引物7-2和SEQIDNo. 21所示的探针21组成； 所述引物探针组8为SEQIDNo. 22所示的引物8-l、SEQIDNo. 23所示的引物8-2和SEQIDNo. 24所示的探针8组成； 所述引物探针组9为SEQIDNo. 25所示的引物9-l、SEQIDNo. 26所示的引物9-2和SEQIDNo. 27所示的探针9组成； 所述引物探针组10为SEQIDNo. 28所示的引物IO-USEQIDNo. 29所示的引物10-2 和SEQIDNo. 30所示的探针10组成； 所述引物探针组11为SEQIDNo. 31所示的引物Il-USEQIDNo. 32所示的引物11-2 和SEQIDNo. 33所示的探针11组成； 所述引物探针组12为SEQIDNo. 34所示的引物12-1、SEQIDNo. 35所示的引物12-2 和SEQIDNo. 36所示的探针12组成； 所述引物探针组13为SEQIDNo. 37所示的引物13-1、SEQIDNo. 38所示的引物13-2 和SEQIDNo. 39所示的探针13组成； 所述引物探针组14为SEQIDNo. 40所示的引物14-1、SEQIDNo. 41所示的引物14-2 和SEQIDNo. 42所示的探针14 组成； 所述引物探针组15为SEQIDNo. 43所示的引物15-1、SEQIDNo. 44所示的引物15-2 和SEQIDNo. 45所示的探针15组成； 所述引物探针组16为SEQIDNo. 46所示的引物16-1、SEQIDNo. 47所示的引物16-2 和SEQIDNo. 48所示的探针16组成； 所述引物探针组17为SEQIDNo. 49所示的引物17-1、SEQIDNo. 50所示的引物17-2 和SEQIDNo. 51所示的探针17组成； 所述引物探针组18为SEQIDNo. 52所示的引物18-1、SEQIDNo. 53所示的引物18-2 和SEQIDNo. 54所示的探针18组成； 所述引物探针组19为SEQIDNo. 55所示的引物19-1、SEQIDNo. 56所示的引物19-2 和SEQIDNo. 57所示的探针19组成； 所述引物探针组20为SEQIDNo. 58所示的引物20-l、SEQIDNo. 59所示的引物20-2 和SEQIDNo. 60所示的探针20组成； 所述引物探针组21为5￡〇10此.61所示的引物21-1、5￡〇10此.62所示的引物21-2 和SEQIDNo. 63所示的探针21组成； 所述引物探针组22为SEQIDNo. 64所示的引物22-l、SEQIDNo. 65所示的引物22-2 和SEQIDNo. 66所示的探针22组成； 所述引物探针组23为SEQIDNo. 67所示的引物23-l、SEQIDNo. 68所示的引物23-2 和SEQIDNo. 69所示的探针23组成； 所述引物探针组24为SEQIDNo. 70所示的引物24-l、SEQIDNo. 71所示的引物24-2 和SEQIDNo. 72所示的探针24组成； 所述引物探针组25为SEQIDNo. 73所示的引物25-l、SEQIDNo. 74所示的引物25-2 和SEQIDNo. 75所示的探针25组成； 所述引物探针组26为SEQIDNo. 76所示的引物26-l、SEQIDNo. 77所示的引物26-2 和SEQIDNo. 78所示的探针26组成； 所述引物探针组27为SEQIDNo. 79所示的引物27-l、SEQIDNo. 80所示的引物27-2 和SEQIDNo. 81所示的探针27组成。2. 根据权利要求1所述的成套引物和探针，其特征在于：所述引物探针组中的引物与 探针的物质的量比为9 :20。3. 根据权利要求1或2所述的成套引物和探针，其特征在于： 所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番 石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、 面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实 蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡 鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。4. 一种用于鉴定实蝇种类的PCR试剂，由PCR试剂UPCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂 4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9、PCR试剂KKPCR试剂IUPCR 试剂12、PCR试剂13、PCR试剂14、PCR试剂15、PCR试剂16、PCR试剂17、PCR试剂18、PCR 试剂19、PCR试剂20、PCR试剂21、PCR试剂22、PCR试剂23、PCR试剂24、PCR试剂25、PCR 试剂26和PCR试剂27组成； 所述PCR试剂1包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组1 ; 所述PCR试剂2包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组2 ; 所述PCR试剂3包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组3 ; 所述PCR试剂4包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组4 ; 所述PCR试剂5包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组5 ; 所述PCR试剂6包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组6 ; 所述PCR试剂7包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组7 ; 所述PCR试剂8包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组8 ; 所述PCR试剂9包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组9 ; 所述PCR试剂10包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组10 ; 所述PCR试剂11包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组11 ; 所述PCR试剂12包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组12 ; 所述PCR试剂13包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组13 ; 所述PCR试剂14包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组14 ; 所述PCR试剂15包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组15 ; 所述PCR试剂16包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组16 ; 所述PCR试剂17包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组17 ; 所述PCR试剂18包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组18 ; 所述PCR试剂19包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组19 ; 所述PCR试剂20包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组20 ; 所述PCR试剂21包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组21 ; 所述PCR试剂22包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组22 ; 所述PCR试剂23包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组23 ; 所述PCR试剂24包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组24 ; 所述PCR试剂25包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组25 ; 所述PCR试剂26包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组26 ; 所述PCR试剂27包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组27。5. -种用于鉴定实蝇种类的集成流路芯片，包括权利要求1-3中任一所述的成套引物 和探针或权利要求4所述的PCR试剂。6. 根据权利要求5所述的集成流路芯片，其特征在于：所述集成流路芯片为将权利要 求4中每一种PCR试剂分装在集成流路芯片的各微反应室中，得到含有权利要求1-3中任 一所述的成套引物和探针或权利要求4所述的PCR试剂的集成流路芯片。7. -种用于鉴定实蝇种类的试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的成套引物和探针 或权利要求4所述的PCR试剂或权利要求5或6所述的集成流路芯片。8. 权利要求1-3中任一所述的成套引物和探针或权利要求4所述的PCR试剂或权利要 求5或6所述的集成流路芯片或权利要求7所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测实蝇是否 为27种实蝇中任一种中的应用； 或权利要求1-3中任一所述的成套引物和探针或权利要求4所述的PCR试剂或权利要 求5或6所述的集成流路芯片或权利要求7所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测实蝇为27 种实蝇中哪一种中的应用； 所述27种实蝇为墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果 实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实 蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南 亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实 蝇和苹绕实蝇。9. 一种鉴定或辅助鉴定待测实蝇种类的方法，包括如下步骤：将待测实蝇的基因组 DNA加入权利要求5或6所述的集成流路芯片的各微反应室中，进行实时荧光PCR，检测各 微反应室PCR产物； 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内进行阳性扩增，则待测实蝇 为或候选为该引物探针组对应的目标实蝇； 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内为非阳性扩增，则待测实蝇 不为或候选不为该引物探针组对应的目标实蝇。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于： 所述阳性扩增为微反应室产生荧光且CT值< 20. 0 ;所述非阳性扩增指微反应室不产 生荧光或产荧光且CT值> 20. 0 ; 所述引物探针组1对应的实蝇为墨西哥按实蝇； 所述引物探针组2对应的实蝇为西印度按实蝇； 所述引物探针组3对应的实蝇为蒲桃果实蝇； 所述引物探针组4对应的实蝇为番石榴果实蝇； 所述引物探针组5对应的实蝇为杨桃果实蝇； 所述引物探针组6对应的实蝇为橘小实蝇； 所述引物探针组7对应的实蝇为辣椒果实蝇； 所述引物探针组8对应的实蝇为锈红果实蝇； 所述引物探针组9对应的实蝇为昆士兰果实蝇； 所述引物探针组10对应的实蝇为短尾果实蝇； 所述引物探针组11对应的实蝇为面包果实蝇； 所述引物探针组12对应的实蝇为桃果实蝇； 所述引物探针组13对应的实蝇为油橄榄果实蝇； 所述引物探针组14对应的实蝇为橘大实蝇； 所述引物探针组15对应的实蝇为蜜柑大实蝇； 所述引物探针组16对应的实蝇为萌瓜实蝇； 所述引物探针组17对应的实蝇为两带果实蝇； 所述引物探针组18对应的实蝇为瓜实蝇； 所述引物探针组19对应的实蝇为宽带果实蝇； 所述引物探针组20对应的实蝇为南亚果实蝇； 所述引物探针组21对应的实蝇为枣实蝇； 所述引物探针组22对应的实蝇为地中海实蝇； 所述引物探针组23对应的实蝇为芒果小条实蝇； 所述引物探针组24对应的实蝇为纳塔耳小条实蝇； 所述引物探针组25对应的实蝇为萌芦寡鬃实蝇； 所述引物探针组26对应的实蝇为樱桃绕实蝇； 所述引物探针组27对应的实蝇为苹绕实蝇； 所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番 石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、 面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实 蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡 鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应用。本发明设计了鉴定实蝇种类的特异性引物和TaqMan-MGB探针，并开发了基于集成流路芯片的实蝇种类的分子鉴定技术。通过试验证明：本发明的基于集成流路芯片的分子鉴定技术可以快速实现对实蝇种类的鉴定，并且特异性好、通量高、成本低、操作简单，解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残体的种类鉴定问题，能够为进出境植物检疫和全国实蝇疫情监测提供快速鉴定的工具和技术，可有效预防危险性实蝇的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发展。
【IPC分类】C40B40/06, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894237
【申请号】CN201510219803
【发明人】李志红, 姜帆, 朱水芳, 付伟
【申请人】中国农业大学, 中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应 用。
【背景技术】
[0002] 实幡（Fruit Flies)属双翅目（Diptera)实幡科（Tephritidae)，全世界广泛分 布，多发生在热带和亚热带地区。实蝇科约有500属4500种，具有重要经济意义的实蝇达 250余种，有些实蝇对水果生产会造成毁灭性灾害。世界上具有经济重要性的实蝇主要有5 个属，分别是按实幡属（Anastrepha)、果实幡属（Bactrocera)、小条实幡属（Ceratitis)、 寡鬃实幡属（Dacus)和绕实幡属（Rhagoletis)。
[0003] 在我国现行的进境植物检疫性有害生物名录中，检疫性实蝇包含按实蝇属、果实 蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇（非中国种）、绕实蝇（非中国种）、欧非枣实蝇、枣实蝇、橘实 锤腹实蝇、甜瓜迷实蝇及番木瓜长尾实蝇等10个种属；全国农业检疫性实蝇及林业检疫性 实蝇分别各有1个种，即蜜柑大实蝇和枣实蝇；在农业部发布的国家重点管理外来入侵物 种名录中，包括3种实蝇类害虫，分别为橘小实蝇、瓜实蝇和枣实蝇。
[0004] 由于口岸截获的实蝇多为形态上难以区分的非成虫态，一般需经1-2周饲养为成 虫后才能被准确鉴定，极大降低了检疫工作的时效性。传统的实蝇鉴定工作主要依靠形态 学特征，但由于实蝇种类多，区分不同实蝇种类之间的形态学差别往往非常细微和复杂，有 的种类还需借助分布和寄主信息才能区分，有的种类的分类地位仍较为混乱，且实蝇新属 和新种的描述还在不断增加，特别是一些复合体种类的分类还存在争议，这些问题的存在 都给实蝇传统形态鉴定带来了极大的阻碍。随着国际果蔬贸易的发展，实蝇类害虫传入我 国的风险显著增加，其检疫鉴定特别是快速鉴定的需求愈发迫切。
[0005] 集成流路（Integrated Fluidic Circuit，IFC)芯片是一种利用具有高弹性的聚 二甲基硅氧烷材料，采用多层软刻蚀技术在芯片上设计并加工成高密度的微泵微阀结构， 通过控制微泵微阀的关闭和开启，快速准确地将反应液分成若干独立的纳升量级反应单 元，实现多步平行进行的通量高、体积小的PCR反应平台。
[0006] 集成流体通路技术自出现以来，受到了科学界的格外青睐，该领域内的全球各大 公司也相继推出了商业化产品。2006年，美国Fluidigm公司率先推出基于IFC技术的 BioMark?基因分析系统，该系统是集成IFC技术、Real-Time PCR技术和基因分析软件相结 合的技术平台，由BioMark? Real-Time PCR系统、IFC芯片、IFC控制器和数据分析软件4 部分构成。其中，48. 48IFC动态芯片可同时进行2304个实时荧光PCR反应。
[0007] 目前，以IFC芯片为反应平台的多种PCR技术已在医学诊断、基因分型、单细胞基 因表达、转基因检测、环境微生物检测、下一代测序等方面得到了广泛的应用，但其在昆虫 分子鉴定方面的应用未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的成套引物和探针。
[0009] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的成套引物和探针由27个引物探针组组成。
[0010] 上述成套引物和探针中，
[0011] 所述引物探针组1为SEQ ID No. 1所示的引物I-USEQ ID No. 2所示的引物1-2 和SEQ ID No. 3所示的探针1组成；
[0012] 所述引物探针组2为SEQ ID No. 4所示的引物2-l、SEQ ID No. 5所示的引物2-2 和SEQ ID No. 6所示的探针2组成；
[0013] 所述引物探针组3为SEQ ID No. 7所示的引物3-l、SEQ ID No. 8所示的引物3-2 和SEQ ID No. 9所示的探针3组成；
[0014] 所述引物探针组4为SEQ ID No. 10所示的引物4-1、SEQ ID No. 11所示的引物 4- 2和SEQ ID No. 12所示的探针4组成；
[0015] 所述引物探针组5为SEQ ID No. 13所示的引物5-1、SEQ ID No. 14所示的引物 5- 2和SEQ ID No. 15所示的探针5组成；
[0016] 所述引物探针组6为SEQ ID No. 16所示的引物6-1、SEQ ID No. 17所示的引物 6- 2和SEQ ID No. 18所示的探针6组成；
[0017] 所述引物探针组7为SEQ ID No. 19所示的引物7-1、SEQ ID No. 20所示的引物 7- 2和SEQ ID No. 21所示的探针7组成；
[0018] 所述引物探针组8为SEQ ID No. 22所示的引物8-1、SEQ ID No. 23所示的引物 8- 2和SEQ ID No. 24所示的探针8组成；
[0019] 所述引物探针组9为SEQ ID No. 25所示的引物9-1、SEQ ID No. 26所示的引物 9- 2和SEQ ID No. 27所示的探针9组成；
[0020] 所述引物探针组10为SEQ ID No. 28所示的引物IO-USEQ ID No. 29所示的引物 10- 2和SEQ ID No. 30所示的探针10组成；
[0021] 所述引物探针组11为SEQ ID No. 31所示的引物Il-USEQ ID No. 32所示的引物 11- 2和SEQ ID No. 33所示的探针11组成；
[0022] 所述引物探针组12为SEQ ID No. 34所示的引物12-1、SEQ ID No. 35所示的引物 12- 2和SEQ ID No. 36所示的探针12组成；
[0023] 所述引物探针组13为SEQ ID No. 37所示的引物13-1、SEQ ID No. 38所示的引物 13- 2和SEQ ID No. 39所示的探针13组成；
[0024] 所述引物探针组14为SEQ ID No. 40所示的引物14-1、SEQ ID No. 41所示的引物 14- 2和SEQ ID No. 42所示的探针14组成；
[0025] 所述引物探针组15为SEQ ID No. 43所示的引物15-1、SEQ ID No. 44所示的引物 15- 2和SEQ ID No. 45所示的探针15组成；
[0026] 所述引物探针组16为SEQ ID No. 46所示的引物16-1、SEQ ID No. 47所示的引物 16- 2和SEQ ID No. 48所示的探针16组成；
[0027] 所述引物探针组17为SEQ ID No. 49所示的引物17-1、SEQ ID No. 50所示的引物 17- 2和SEQ ID No. 51所示的探针17组成；
[0028] 所述引物探针组18为SEQ ID No. 52所示的引物18-1、SEQ ID No. 53所示的引物 18- 2和SEQ ID No. 54所示的探针18组成；
[0029] 所述引物探针组19为SEQ ID No. 55所示的引物19-1、SEQ ID No. 56所示的引物 19- 2和SEQ ID No. 57所示的探针19组成；
[0030] 所述引物探针组20为SEQ ID No. 58所示的引物20-l、SEQ ID No. 59所示的引物 20- 2和SEQ ID No. 60所示的探针20组成；
[0031] 所述引物探针组21为SEQ ID No. 61所示的引物21-1、SEQ ID No. 62所示的引物 21- 2和SEQ ID No. 63所示的探针21组成；
[0032] 所述引物探针组22为SEQ ID No. 64所示的引物22-l、SEQ ID No. 65所示的引物 22- 2和SEQ ID No. 66所示的探针22组成；
[0033] 所述引物探针组23为SEQ ID No. 67所示的引物23-l、SEQ ID No. 68所示的引物 23- 2和SEQ ID No. 69所示的探针23组成；
[0034] 所述引物探针组24为SEQ ID No. 70所示的引物24-l、SEQ ID No. 71所示的引物 24- 2和SEQ ID No. 72所示的探针24组成；
[0035] 所述引物探针组25为SEQ ID No. 73所示的引物25-l、SEQ ID No. 74所示的引物 25- 2和SEQ ID No. 75所示的探针25组成；
[0036] 所述引物探针组26为SEQ ID No. 76所示的引物26-l、SEQ ID No. 77所示的引物 26- 2和SEQ ID No. 78所示的探针26组成；
[0037] 所述引物探针组27为SEQ ID No. 79所示的引物27-l、SEQ ID No. 80所示的引物 27- 2和SEQ ID No. 81所示的探针27组成。
[0038] 上述成套引物和探针中，所述引物探针组中的引物与探针的物质的量比为9 :20。
[0039] 上述成套引物和探针中，所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西 印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、 昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、 萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实 蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
[0040] 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的PCR试剂。
[0041] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂 3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9、PCR试剂10、PCR 试剂11、PCR试剂12、PCR试剂13、PCR试剂14、PCR试剂15、PCR试剂16、PCR试剂17、PCR 试剂18、PCR试剂19、PCR试剂20、PCR试剂21、PCR试剂22、PCR试剂23、PCR试剂24、PCR 试剂25、PCR试剂26和PCR试剂27组成；
[0042] 所述PCR试剂1包括上述成套引物和探针中的引物探针组1 ;
[0043] 所述PCR试剂2包括上述成套引物和探针中的引物探针组2 ;
[0044] 所述PCR试剂3包括上述成套引物和探针中的引物探针组3 ;
[0045] 所述PCR试剂4包括上述成套引物和探针中的引物探针组4 ;
[0046] 所述PCR试剂5 包括上述成套引物和探针中的引物探针组5 ;
[0047] 所述PCR试剂6包括上述成套引物和探针中的引物探针组6 ;
[0048] 所述PCR试剂7包括上述成套引物和探针中的引物探针组7 ;
[0049] 所述PCR试剂8包括上述成套引物和探针中的引物探针组8 ;
[0050] 所述PCR试剂9包括上述成套引物和探针中的引物探针组9 ;
[0051] 所述PCR试剂10包括上述成套引物和探针中的引物探针组10 ;
[0052] 所述PCR试剂11包括上述成套引物和探针中的引物探针组11 ;
[0053] 所述PCR试剂12包括上述成套引物和探针中的引物探针组12 ;
[0054] 所述PCR试剂13包括上述成套引物和探针中的引物探针组13 ;
[0055] 所述PCR试剂14包括上述成套引物和探针中的引物探针组14 ;
[0056] 所述PCR试剂15包括上述成套引物和探针中的引物探针组15 ;
[0057] 所述PCR试剂16包括上述成套引物和探针中的引物探针组16 ;
[0058] 所述PCR试剂17包括上述成套引物和探针中的引物探针组17 ;
[0059] 所述PCR试剂18包括上述成套引物和探针中的引物探针组18 ;
[0060] 所述PCR试剂19包括上述成套引物和探针中的引物探针组19 ;
[0061] 所述PCR试剂20包括上述成套引物和探针中的引物探针组20 ;
[0062] 所述PCR试剂21包括上述成套引物和探针中的引物探针组21 ;
[0063] 所述PCR试剂22包括上述成套引物和探针中的引物探针组22 ;
[0064] 所述PCR试剂23包括上述成套引物和探针中的引物探针组23 ;
[0065] 所述PCR试剂24包括上述成套引物和探针中的引物探针组24 ;
[0066] 所述PCR试剂25包括上述成套引物和探针中的引物探针组25 ;
[0067] 所述PCR试剂26包括上述成套引物和探针中的引物探针组26 ;
[0068] 所述PCR试剂27包括上述成套引物和探针中的引物探针组27。
[0069] 上述各PCR试剂由Assays体系和Sample体系组成；每5ul所述Assays体系 由正向引物（100μΜ)0·45μ1、反向引物（100μΜ)0·45μ1、探针（10yM)lyl、2XAssay Loading Reagent2. 5 μ 1、50XR0X Reference Dye II 0· 25 μ 1 和 ddH20 0· 35 μ 1 组成；每 5ul 所述 Sample体系由 2XPremix Ex Taq 2· 5μ1 和 20XGE Sample Loading Reagent 0.25 μ I 组成。
[0070] 本发明还有一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的集成流路芯片。
[0071] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的集成流路芯片包括上述成套引物和探针或上 述PCR试剂。
[0072] 上述集成流路芯片中，所述集成流路芯片为将上述每一种PCR试剂分装在集成流 路芯片的各微反应室中，得到含有上述成套引物和探针或上述PCR试剂的集成流路芯片。
[0073] 本发明还有一个目的是提供一种用于鉴定实蝇种类的试剂盒。
[0074] 本发明提供的用于鉴定实蝇种类的试剂盒包括上述成套引物和探针或上述PCR 试剂或上述集成流路芯片。
[0075] 上述成套引物和探针或上述PCR试剂或上述集成流路芯片或上述试剂盒在鉴定 或辅助鉴定待测实蝇是否为27种实蝇中任一种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0076] 上述成套引物和探针或上述PCR试剂或上述集成流路芯片或上述试剂盒在鉴定 或辅助鉴定待测实蝇为27种实蝇中哪一种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0077] 上述应用中，所述27种实蝇为墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴 果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包 果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、 宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃 实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
[0078] 本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测实蝇种类的方法。
[0079] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测实蝇种类的方法包括如下步骤：将待测实蝇的 基因组DNA加入上述集成流路芯片的各微反应室中，进行实时荧光PCR，检测各微反应室 PCR产物；
[0080] 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内进行阳性扩增，则待测 实蝇为或候选为该引物探针组对应的目标实蝇；
[0081] 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内为非阳性扩增，则待测 实蝇不为或候选不为该引物探针组对应的目标实蝇。
[0082] 上述方法中，所述阳性扩增为微反应室产生荧光且CT值< 20. 0 ;所述非阳性扩增 指微反应室不产生荧光或产荧光且CT值> 20. 0。
[0083] 上述方法中，
[0084] 所述引物探针组1对应的实蝇为墨西哥按实蝇；
[0085] 所述引物探针组2对应的实蝇为西印度按实蝇；
[0086] 所述引物探针组3对应的实蝇为蒲桃果实蝇；
[0087] 所述引物探针组4对应的实蝇为番石榴果实蝇；
[0088] 所述引物探针组5对应的实蝇为杨桃果实蝇；
[0089] 所述引物探针组6对应的实蝇为橘小实蝇；
[0090] 所述引物探针组7对应的实蝇为辣椒果实蝇；
[0091] 所述引物探针组8对应的实蝇为锈红果实蝇；
[0092] 所述引物探针组9对应的实蝇为昆士兰果实蝇；
[0093] 所述引物探针组10对应的实蝇为短尾果实蝇；
[0094] 所述引物探针组11对应的实蝇为面包果实蝇；
[0095] 所述引物探针组12对应的实蝇为桃果实蝇；
[0096] 所述引物探针组13对应的实蝇为油橄榄果实蝇；
[0097] 所述引物探针组14对应的实蝇为橘大实蝇；
[0098] 所述引物探针组15对应的实蝇为蜜柑大实蝇；
[0099] 所述引物探针组16对应的实蝇为萌瓜实蝇；
[0100] 所述引物探针组17对应的实蝇为两带果实蝇；
[0101] 所述引物探针组18对应的实蝇为瓜实蝇；
[0102] 所述引物探针组19对应的实蝇为宽带果实蝇；
[0103] 所述引物探针组20对应的实蝇为南亚果实蝇；
[0104] 所述引物探针组21对应的实蝇为枣实蝇；
[0105] 所述引物探针组22对应的实蝇为地中海实蝇；
[0106] 所述引物探针组23对应的实蝇为芒果小条实蝇；
[0107] 所述引物探针组24对应的实蝇为纳塔耳小条实蝇；
[0108] 所述引物探针组25对应的实蝇为萌芦寡鬃实蝇；
[0109] 所述引物探针组26对应的实蝇为樱桃绕实蝇；
[0110] 所述引物探针组27对应的实蝇为苹绕实蝇；
[0111] 所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、 番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实 蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、 瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌 芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
[0112] 上述方法中，所述实时荧光PCR的反应条件是95°C预变性30s ;40个循环的95°C 变性5s，60°C退火延伸34s ;60°C延伸lmin。
[0113] 本发明的优点：
[0114] (1)本发明所覆盖的检疫性实蝇种类范围广，可完全满足我国植物检疫工作的实 际需求。
[0115] (2)利用专门设计的流路和阀门，通过计算机控制，在芯片上自动完成生物样品和 反应试剂的分液，极大简化了移液操作，又可防止污染的发生。
[0116] (3)反应通量高，且其纳升量级的反应体系为高通量的检测分析节约了大量成本。
[0117] (4)可检测单拷贝的DNA分子，从根本上提高了检测的灵敏度和准确度。
[0118] (5)解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残体的种类鉴定问题。
[0119] (6)特异性强、效率高；比传统实时荧光PCR的操作流程简化至1/48 ;纳升级的反 应体系比传统PCR和实时荧光PCR反应的试剂耗费减少100倍。
[0120] 本发明在对6属179种2252条实蝇mtDNA COI条形码序列比对的基础上，针对27 种检疫性实蝇，即墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、 橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油 橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实 蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹 绕实蝇，设计并筛选种特异性引物和TaqMan-MGB探针，开发基于集成流路芯片的分子鉴定 技术。通过试验证明：本发明的基于集成流路芯片的分子鉴定技术可以快速实现对实蝇 种类的鉴定，并且特异性好、通量高、成本低、操作简单，解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残 体的种类鉴定问题，能够为进出境植物检疫和全国实蝇疫情监测提供快速鉴定的工具和技 术，可有效预防危险性实蝇的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发 展。
【附图说明】
[0121] 图1为48 · 48动态芯片。
[0122] 图2为27种实蝇引物和探针组合集成流路芯片特异性检测结果。
[0123] 图3为集成流路芯片鉴定非成虫态实蝇结果图。
【具体实施方式】
[0124] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0125] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0126] 下述实施例中的48. 48IFC动态芯片的名称为Dynamic Array IFCs ;型号为 48. 48 ;厂家为 Fluidigm(美国）。
[0127] Control Line Fluid 是 Fluidigm(美国）公司的产品；
[0128] 2 XPremix E x Taq和 50 X ROX Reference Dye II 是 TaKaRa 的产品，产品目录号： RR390A ；
[0129] 2XAssay Loading Reagent (PN 85000736)和 20XGE Sample Loading Reagent (PN 85000735)是 Fluidigm(美国）公司的产品。
[0130] 实施例1、鉴定27种实蝇的特异性引物对和探针的获得
[0131] 一、实蝇mtDNA COI基因序列的获得
[0132] 1、供试实蝇样品如表1所示，样品均置于无水乙醇中，-20°C保存备用。
[0133] 表1、供试实蝇样品种类及采集地信息
[0134]
[013
伯利兹圣伊格纳西奥 果实蝇属 蒲桃果实蝇 印度尼西亚万隆 Baciroccra B, (Baciroccra) alhislri^aia 番石植果实蝇 中国云南景洪 B. (Bactrocera) correcta 中国石南昆明 屮国云南芒市 中国南励腊 中国云南瑞丽 中国云南元江 中国广东广州 老挝琅勃拉邦 緬甸 泰国曼谷 泰国尖竹汶 泰国洁迈 泰国呵叻 泰国巴吞他尼 泰国沙缴 泰国西萨菊 越南 橘小实妮复合体5. ?/onyafe complex 杨桃果实蝇 印度尼西亚万隆 B. (Baclrocera) caramholae 苏里南帕拉马里博 橘小实蝇 中国云南景洪 B. (Bactrocera) dorsalis 中国广西凭祥 屮国上海 中国福建厦门 中国广东广州 中国海南白沙 中国海南海LJ 印度尼西亚万隆 布隆迪 肯尼亚 南非 辣椒果实蝇 中国云南景洪 B. (Baclrocera) Ialifmns ' b >|<: IjlI xIk 锈红果实蝇 中国z?南河口 B. (Bactrocera) rubigina 中国云南景洪 中国云南瑞丽 中国海南内沙
[0136] 昆士兰果实蝇 澳大利亚 5. (Bacirocera) tryoni 短尾果实蝇 ^ 屮国云南景洪 B. (Bacirocera) fuberculata 面包果实蝇 印度尼两亚万隆 D. (Baclrocera) umbrosa 办丨.丨-;1太卡 五指山果实臟 中国云南河口 B. (Baclrocera) wuzhishcwa 11111^I |4? 桃果实蝇 老挝琅勃拉邦 B. (Bacirocera) zonula 泰丨丨、:丨;丫1:辺 油橄榄果实蝇 意大利 B. (Daculus) oleae 异颜果实蝇 屮国云南景洪 B. (Paratridacus) diversa 中国 z?南芒市 何氏华实蝇 中国云南景洪 B, (Sinodacus) hochii 橘大实蝇 中国四川成都 B. (Tetradacus) minax 屮国四川宜宾 中国贵州六盘水 中国湖南桃源 蜜相大实蝇 中国四川宜宾 B. (Tetradacus) tsuneonis 中国贵州六盘水 深黑颜果实蝇 屮国云南河口 B. (Zeugodacus) atrifacies 中国 z?南景洪 中国广西凭祥 越南 葫瓜实M 中国河南汝州 B. (Zeugodacus) bezziana 屮国甘肃文县 中国湖北神农架 两带果实蝇 中国云南河口 B. (Zcugodacus) cilifera 中国 z?南景洪 瓜实蝇 中国云鹵景洪 B· (Zeugodacus) cucurbiiae 屮 _ 广两南宁 中国上海 中国福建福州 中国海南乐东 印度尼西亚万隆 宽带果实蝇 屮国河南罗山 B. (Zeugodacus) scutellata 中国河南汝州 __中国云南景洪
[0137]
[0138] 2、采用"血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒"（天根生化科技（北京）有限 公司）分别提取表1中的各个实蝇样品的基因组DNA(大部分样品取单足进行提取，少数样 品为单头提取），具体操作流程参照说明书，分别得到表1中的各个实蝇样品的基因组DNA。
[0139] 分别以表1中的各个实蝇样品的基因组DNA为模板，使用通用引物LC01490/ HC02198进行PCR扩增，分别得到表1中的各个实蝇样品的PCR扩增产物。
[0M0] PCR扩增总体系（25 μ I) :2 X Taq PCR MasterMix (天根生化科技（北京）有限公 司，目录号：ΚΤ201) 12.5 μ 1、上下游引物（10 μΜ，北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成）各 1 μ 1、CldH2O 9. 5 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 ;
[0141] PCR 扩增条件：94°C预变性 3min ;94°C变性 lmin，50°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 35个循环；72°C延伸lOmin。
[0142] 3、取5 μ I PCR扩增产物分别进行电泳检测，将检测合格的PCR扩增产物直接交由 北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化和双向测序。利用Chromas软件查看测序峰图， 用DNAMN软件对测序结果进行拼接。
[0143] 下载BOLD中已公开的经济实蝇属所有实蝇种类序列（截至2013年5月17日）， 并筛选出长度不短于600bp的mtDNA COI条形码序列。通过实验和BOLD中下载共获得6 属179种2252条的实蝇mtDNA COI条形码序列。
[0144] 二、27种特异性引物对和TaqMan-MGB探针的设计
[0145] 根据上述获得的6属179种2252条的实蝇mtDNA COI条形码序列设计引物和探 针，最后获得27对引物和探针，27对引物和对应的27个TaqMan-MGB探针（5 ' -FAM ; 3 ' -MGB) 如表2所示，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
[0146] 表2、27种检疫性实蝇特异引物和探针
[0147]
IS1 n λ λ λ r'Tnnr' f 由石|| in、
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[0150] 实施例2、鉴定27种实蝇的集成流路芯片的制备及其特异性检测
[0151] 一、集成流路芯片的制备
[0152] 1、48. 48动态芯片的初始化
[0153] (1)打开芯片包装，并在24h内使用；
[0154] (2)将Control Line Fluid分别注入48. 48动态芯片两端的收集器，注意勿将 Control Line Fluid 滴入 Assay Inlets 或 Sample Inlets ；
[0155] (3)去除IFC芯片底部的蓝色保护膜；
[0156] (4)将芯片转入IFC Controller，运行Primer (113x)程序对芯片进行初始化，初 始化时间为IOmin ;初始化完成后，在60min内完成上样操作。
[0157] 2、标准反应体系和样品混合液的配制
[0158] (1)按照表3所示的试验体系分别配制27种实蝇的lOXAssays，包括上下游引 物、探针、2XAssay Loading Reagent、50XR0X II Reference Dye II 和 ddH20,混勾并离 心。
[0159] 表3、试验体系
[0160] 10 X Assays
[0161] Forward Primer (100μΜ) 0.45μL Reverse Primer (1 ΟΟμΜ) 0·45μ1 Taqman-MGB Probe (ΙΟμΜ) 1μ 2χAssay Loading Reagent 2.5μ1 50χROX Reference Dye Il 0.25μL ddH20 0.35μ1 总体积 5μ1
[0162] (2)按照表4所示的样品体系分别配制每种实蝇样品混合液，包括2 XPremix Ex Taq、20XGE Sample Loading Reagent和每种实幡样品的DNA(表5)，混勾并离心。
[0163] 表4、样品体系
[0164] 2XPremix Ex Taq 2·5μ1 2〇χ〇Ε Sample Loading Reagent 0.25μ1 DNA (50ng/>l) 2·25μ1 总体积 5μ1
[0165] 表 5、Assay Inlets 和 Sample Inlets 对应的实幡物种
[0166]
[016:」
[0168] 3、芯片上样
[0169] (1)芯片初始化后，将其从IFC Controller中取出，向Assay Inlets和Sample Inlets的相应管道中分别注入已混勾的5 μ I IOXAssays试剂和实幡样品混合液；不用的 Assay Inlets，加入2· 5μ1 2XAssay Loading Reagent、0.25yl 50XR0X II 和 2· 25μ1 ddH20;不用的 Sample Inlets，加入 2·5μ I 2XPremix Ex Taq、0.25y I 20XGE Sample Loading Reagent和2. 25 μ I ddH20。上样过程中，应避免气泡的产生，使用移液器时缓慢 打液至第一档。
[0170] (2)将芯片放回 IFC Controller 中，运行 Load Mix(113x)程序，该程序将 assays 和samples自动导入到IFC芯片中进行分液，运行时间为Ih ;
[0171] (3) Load Mix程序结束后，将芯片从IFC Controller中取出，用胶带轻微粘除芯片 表面的灰尘等杂质，并在4h内开始芯片的实时荧光PCR。
[0172] 4、实时荧光PCR
[0173] (1)将芯片放入BioMark实时焚光PCR系统中，选择Gene Expression应用类型、 ROX参比荧光、FAM-MGB探针类型，按照建立的反应条件在自动曝光模式下运行实时荧光 PCR反应。反应条件如表5所示。
[0174] 表5、反应条件
[0175] 95°C预变性30s 95°C变性 5s , 60°C 退火延伸 34s eydeS 60°C 延伸 Imin
[0176] (2)实时荧光PCR反应结束后，将芯片从BioMark实时荧光PCR系统中取出，用 Fluidigm Real-Time PCR分析软件对实验数据进行分析。
[0177] 通过查看反应结果的Heat Map，判定所设计的27种检疫性实幡种特异性引物对 和探针在集成流路芯片的反应平台下的可应用性和特异性。在芯片上的2304个微反应室 中，有扩增反应的 微反应室则会产生荧光，在Heat Map中对应的微反应室会以彩色方点形 式呈现，且不同CT值的反应所发出的荧光颜色不同。
[0178] 二、集成流路芯片的特异性检测结果
[0179] 特异性验证的原则为每种实蝇的引物和探针组合只有在与其对应的目标实蝇的 微反应室内产生阳性荧光信号，而其他微反应室均无荧光信号产生或为非阳性扩增结果， 即该特异性引物和探针在所建立的检疫性实蝇集成流路芯片鉴定技术体系下，能特异性地 鉴定出目标实蝇物种，设定CT < 20. 0为阳性扩增。
[0180] 若某特异性引物和探针对应的微反应室产生荧光且CT值< 20. 0,则待测实蝇为 或候选为该特异性引物和探针对应的目标实蝇；
[0181] 若某特异性引物和探针对应的微反应室无荧光信号或产生荧光且CT值> 20. 0， 则待测实蝇不为或候选不为该特异性引物和探针对应的目标实蝇。
[0182] 引物1-1、引物1-2和探针1对应的目标实蝇为墨西哥按实蝇；
[0183] 引物2-1、引物2-2和探针2对应的目标实蝇为西印度按实蝇；
[0184] 引物3-1、引物3-2和探针3对应的目标实蝇为蒲桃果实蝇；
[0185] 引物4-1、引物4-2和探针4对应的目标实蝇为番石榴果实蝇；
[0186] 引物5-1、引物5-2和探针5对应的目标实蝇为实蝇为杨桃果实蝇；
[0187] 引物6-1、引物6-2和探针6对应的目标实蝇为橘小实蝇；
[0188] 引物7-1、引物7-2和探针7对应的目标实蝇为辣椒果实蝇；
[0189] 引物8-1、引物8-2和探针8对应的目标实蝇为锈红果实蝇；
[0190] 引物9-1、引物9-2和探针9对应的目标实蝇为昆士兰果实蝇；
[0191] 引物10-1、引物10-2和探针10对应的目标实蝇为短尾果实蝇；
[0192] 引物11-1、引物11-2和探针11对应的目标实蝇为面包果实蝇；
[0193] 引物12-1、引物12-2和探针12对应的目标实蝇为桃果实蝇；
[0194] 引物13-1、引物13-2和探针13对应的目标实蝇为油橄榄果实蝇；
[0195] 引物14-1、引物14-2和探针14对应的目标实蝇为橘大实蝇；
[0196] 引物15-1、引物15-2和探针15对应的目标实蝇为蜜柑大实蝇；
[0197] 引物16-1、引物16-2和探针16对应的目标实蝇为萌瓜实蝇；
[0198] 引物17-1、引物17-2和探针17对应的目标实蝇为两带果实蝇；
[0199] 引物18-1、引物18-2和探针18对应的目标实蝇为瓜实蝇；
[0200] 引物19-1、引物19-2和探针19对应的目标实蝇为宽带果实蝇；
[0201] 引物20-1、引物20-2和探针20对应的目标实蝇为南亚果实蝇；
[0202] 引物21-1、引物21-2和探针21对应的目标实蝇为枣实蝇；
[0203] 引物22-1、引物22-2和探针22对应的目标实蝇为地中海实蝇；
[0204] 引物23-1、引物23-2和探针23对应的目标实蝇为芒果小条实蝇；
[0205] 引物24-1、引物24-2和探针24对应的目标实蝇为纳塔耳小条实蝇；
[0206] 引物25-1、引物25-2和探针25对应的目标实蝇为萌芦寡鬃实蝇；
[0207] 引物26-1、引物26-2和探针26对应的目标实蝇为樱桃绕实蝇；
[0208] 引物27-1、引物27-2和探针27对应的目标实蝇为苹绕实蝇。
[0209] 特异性检测结果如图2所示：35种实蝇样品中，与27种实蝇（墨西哥按实蝇、西 印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、 昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、 萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实 蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇）的特异性引物和探针种类相 对应的实蝇样品的微反应室均发出了荧光信号且CT值< 20.0 ;不与27种实蝇的特异性引 物和探针种类对应的实蝇样品的微反应室内无荧光信号或产生荧光且CT值> 20. 0。通过 本发明的实蝇集成流路芯片可一次性实现27种检疫性实蝇的快速鉴定。
[0210] 实施例3、集成流路芯片在鉴定实蝇中的应用
[0211] 一、待测实蝇样品
[0212] 以下述非成虫态实蝇样品为例，应用实施例2所述的集成流路芯片鉴定其种类。
[0213] 2012年5月北京出入境检验检疫局从泰国进口的莲雾中截获的实蝇幼虫3头；
[0214] 2014年5月北京出入境检验检疫局从坦桑尼亚进口的芒果中截获的实蝇幼虫2 头；
[0215] 2009年7月采自我国广西壮族自治区南宁地区苦瓜烂果中的实蝇幼虫2头；
[0216] 2011年10月我国四川省成都市植保植检站送检的寄主为柑橘的实蝇蛹2个；
[0217] 2011年8月广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心国家实蝇检疫重点实验室 饲养的辣椒果实蝇卵3枚。
[0218] 二、鉴定方法
[0219] 采用试剂盒法提取上述步骤一中的待测实蝇样品的基因组DNA，提取过程参照说 明书进行。
[0220] 利用实施例2所述的集成流路芯片及其鉴定方法对上述待测实蝇样品的基因组 DNA进行检测。
[0221] 每个种特异性引物和探针组合的IOXAssays总体系为5 μ 1，其中包括上下游引 物（100 μ Μ)各 0.45 μ 1，探针（10 μ Μ)1 μ 1，2 X Assay Loading Reagent 2.5 μ 1，50 X ROX II 0· 25 μ 1，ddH20 0· 35 μ 1。
[0222] 每个样品的总体系为 5μ1，其中包括 2XPremix Ex Taq 2.5yl，20XGE Sample Loading Reagent 0· 25 μ 1，DNA 2·25 μ I0
[0223] 反应条件：95°C预变性30s ;40个循环的95°C变性5s，60°C退火延伸34s ;60°C延 伸 lmin〇
[0224] 反应结束后，通过直接观察Heat Map (CT < 20. 0为阳性扩增）判断结果。
[0225] 三、鉴定结果
[0226] 结果如图3所示：从泰国莲雾中截获的3头实蝇幼虫均在与其对应的番石榴果实 蝇引物和探针组合的微反应室内产生阳性荧光信号，CT值分别为17. 29、19. 77和14. 40,而 其他微反应室均无荧光信号产生或为CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定其种类为番石榴果 实蝇；从坦桑尼亚芒果中截获的2头实蝇幼虫均在与其对应的芒果小条实蝇引物和探针组 合的微反应室内产生阳性荧光信号，CT值分别为10. 69和12. 98,而其他微反应室均无荧光 信号产生或为CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定其种类为芒果小条实蝇；从我国广西南宁地 区苦瓜烂果中的2头实蝇幼虫均在与其对应的南亚果实蝇引物和探针组合的微反应室内 产生阳性荧光信号，CT值分别为11. 17和13. 33,而其他微反应室均无荧光信号产生或为CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定其种类为南亚果实蝇；从四川成都植保植检站送检的2个寄 主为柑橘的实蝇蛹均在与其对应的橘大实蝇引物和探针组合的微反应室内产生阳性荧光 信号，CT值分别为10. 98和11. 66,而其他微反应室均无荧光信号产生或为CT > 20. 0非阳 性扩增，因此鉴定其种类为橘大实蝇；从广东检验检疫技术中心国家实蝇检疫重点实验室 饲养的3枚辣椒果实蝇卵均在与其对应的辣椒果实蝇引物和探针组合的微反应室内产生 阳性荧光信号，CT值分别为13. 03、15. 41和17. 08,而其他微反应室均无荧光信号产生或为 CT > 20. 0非阳性扩增，因此鉴定结果同为辣椒果实蝇，说明集成流路芯片技术可成功应用 于实蝇卵的分子鉴定。
[0227] 以上试验结果说明了基于集成流路芯片的实时荧光PCR技术鉴定非成虫态实蝇 样品种类的有效性。
【主权项】
1. 一种用于鉴定实蝇种类的成套引物和探针，由27个引物探针组组成； 所述引物探针组1为SEQIDNo. 1所示的引物1-1、SEQIDNo. 2所示的引物1-2和SEQIDNo. 3所示的探针1组成； 所述引物探针组2为SEQIDNo. 4所示的引物2-1、SEQIDNo. 5所示的引物2-2和SEQIDNo. 6所示的探针2组成； 所述引物探针组3为SEQIDNo. 7所示的引物3-1、SEQIDNo. 8所示的引物3-2和SEQIDNo. 9所示的探针3组成； 所述引物探针组4为SEQIDNo. 10所示的引物4-l、SEQIDNo. 11所示的引物4-2和SEQIDNo. 12所示的探针4组成； 所述引物探针组5为SEQIDNo. 13所示的引物5-l、SEQIDNo. 14所示的引物5-2和SEQIDNo. 15所示的探针5组成； 所述引物探针组6为SEQIDNo. 16所示的引物6-l、SEQIDNo. 17所示的引物6-2和SEQIDNo. 18所示的探针6组成； 所述引物探针组7为SEQIDNo. 19所示的引物7-l、SEQIDNo. 20所示的引物7-2和SEQIDNo. 21所示的探针21组成； 所述引物探针组8为SEQIDNo. 22所示的引物8-l、SEQIDNo. 23所示的引物8-2和SEQIDNo. 24所示的探针8组成； 所述引物探针组9为SEQIDNo. 25所示的引物9-l、SEQIDNo. 26所示的引物9-2和SEQIDNo. 27所示的探针9组成； 所述引物探针组10为SEQIDNo. 28所示的引物IO-USEQIDNo. 29所示的引物10-2 和SEQIDNo. 30所示的探针10组成； 所述引物探针组11为SEQIDNo. 31所示的引物Il-USEQIDNo. 32所示的引物11-2 和SEQIDNo. 33所示的探针11组成； 所述引物探针组12为SEQIDNo. 34所示的引物12-1、SEQIDNo. 35所示的引物12-2 和SEQIDNo. 36所示的探针12组成； 所述引物探针组13为SEQIDNo. 37所示的引物13-1、SEQIDNo. 38所示的引物13-2 和SEQIDNo. 39所示的探针13组成； 所述引物探针组14为SEQIDNo. 40所示的引物14-1、SEQIDNo. 41所示的引物14-2 和SEQIDNo. 42所示的探针14 组成； 所述引物探针组15为SEQIDNo. 43所示的引物15-1、SEQIDNo. 44所示的引物15-2 和SEQIDNo. 45所示的探针15组成； 所述引物探针组16为SEQIDNo. 46所示的引物16-1、SEQIDNo. 47所示的引物16-2 和SEQIDNo. 48所示的探针16组成； 所述引物探针组17为SEQIDNo. 49所示的引物17-1、SEQIDNo. 50所示的引物17-2 和SEQIDNo. 51所示的探针17组成； 所述引物探针组18为SEQIDNo. 52所示的引物18-1、SEQIDNo. 53所示的引物18-2 和SEQIDNo. 54所示的探针18组成； 所述引物探针组19为SEQIDNo. 55所示的引物19-1、SEQIDNo. 56所示的引物19-2 和SEQIDNo. 57所示的探针19组成； 所述引物探针组20为SEQIDNo. 58所示的引物20-l、SEQIDNo. 59所示的引物20-2 和SEQIDNo. 60所示的探针20组成； 所述引物探针组21为5￡〇10此.61所示的引物21-1、5￡〇10此.62所示的引物21-2 和SEQIDNo. 63所示的探针21组成； 所述引物探针组22为SEQIDNo. 64所示的引物22-l、SEQIDNo. 65所示的引物22-2 和SEQIDNo. 66所示的探针22组成； 所述引物探针组23为SEQIDNo. 67所示的引物23-l、SEQIDNo. 68所示的引物23-2 和SEQIDNo. 69所示的探针23组成； 所述引物探针组24为SEQIDNo. 70所示的引物24-l、SEQIDNo. 71所示的引物24-2 和SEQIDNo. 72所示的探针24组成； 所述引物探针组25为SEQIDNo. 73所示的引物25-l、SEQIDNo. 74所示的引物25-2 和SEQIDNo. 75所示的探针25组成； 所述引物探针组26为SEQIDNo. 76所示的引物26-l、SEQIDNo. 77所示的引物26-2 和SEQIDNo. 78所示的探针26组成； 所述引物探针组27为SEQIDNo. 79所示的引物27-l、SEQIDNo. 80所示的引物27-2 和SEQIDNo. 81所示的探针27组成。2. 根据权利要求1所述的成套引物和探针，其特征在于：所述引物探针组中的引物与 探针的物质的量比为9 :20。3. 根据权利要求1或2所述的成套引物和探针，其特征在于： 所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番 石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、 面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实 蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡 鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。4. 一种用于鉴定实蝇种类的PCR试剂，由PCR试剂UPCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂 4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、PCR试剂8、PCR试剂9、PCR试剂KKPCR试剂IUPCR 试剂12、PCR试剂13、PCR试剂14、PCR试剂15、PCR试剂16、PCR试剂17、PCR试剂18、PCR 试剂19、PCR试剂20、PCR试剂21、PCR试剂22、PCR试剂23、PCR试剂24、PCR试剂25、PCR 试剂26和PCR试剂27组成； 所述PCR试剂1包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组1 ; 所述PCR试剂2包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组2 ; 所述PCR试剂3包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组3 ; 所述PCR试剂4包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组4 ; 所述PCR试剂5包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组5 ; 所述PCR试剂6包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组6 ; 所述PCR试剂7包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组7 ; 所述PCR试剂8包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组8 ; 所述PCR试剂9包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组9 ; 所述PCR试剂10包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组10 ; 所述PCR试剂11包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组11 ; 所述PCR试剂12包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组12 ; 所述PCR试剂13包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组13 ; 所述PCR试剂14包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组14 ; 所述PCR试剂15包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组15 ; 所述PCR试剂16包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组16 ; 所述PCR试剂17包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组17 ; 所述PCR试剂18包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组18 ; 所述PCR试剂19包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组19 ; 所述PCR试剂20包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组20 ; 所述PCR试剂21包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组21 ; 所述PCR试剂22包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组22 ; 所述PCR试剂23包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组23 ; 所述PCR试剂24包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组24 ; 所述PCR试剂25包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组25 ; 所述PCR试剂26包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组26 ; 所述PCR试剂27包括权利要求1所述的成套引物和探针中的引物探针组27。5. -种用于鉴定实蝇种类的集成流路芯片，包括权利要求1-3中任一所述的成套引物 和探针或权利要求4所述的PCR试剂。6. 根据权利要求5所述的集成流路芯片，其特征在于：所述集成流路芯片为将权利要 求4中每一种PCR试剂分装在集成流路芯片的各微反应室中，得到含有权利要求1-3中任 一所述的成套引物和探针或权利要求4所述的PCR试剂的集成流路芯片。7. -种用于鉴定实蝇种类的试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的成套引物和探针 或权利要求4所述的PCR试剂或权利要求5或6所述的集成流路芯片。8. 权利要求1-3中任一所述的成套引物和探针或权利要求4所述的PCR试剂或权利要 求5或6所述的集成流路芯片或权利要求7所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测实蝇是否 为27种实蝇中任一种中的应用； 或权利要求1-3中任一所述的成套引物和探针或权利要求4所述的PCR试剂或权利要 求5或6所述的集成流路芯片或权利要求7所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测实蝇为27 种实蝇中哪一种中的应用； 所述27种实蝇为墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番石榴果实蝇、杨桃果 实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、面包果实蝇、桃果实 蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实蝇、宽带果实蝇、南 亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡鬃实蝇、樱桃绕实 蝇和苹绕实蝇。9. 一种鉴定或辅助鉴定待测实蝇种类的方法，包括如下步骤：将待测实蝇的基因组 DNA加入权利要求5或6所述的集成流路芯片的各微反应室中，进行实时荧光PCR，检测各 微反应室PCR产物； 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内进行阳性扩增，则待测实蝇 为或候选为该引物探针组对应的目标实蝇； 若所述集成流路芯片上某个引物探针组所在的微反应室内为非阳性扩增，则待测实蝇 不为或候选不为该引物探针组对应的目标实蝇。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于： 所述阳性扩增为微反应室产生荧光且CT值< 20. 0 ;所述非阳性扩增指微反应室不产 生荧光或产荧光且CT值> 20. 0 ; 所述引物探针组1对应的实蝇为墨西哥按实蝇； 所述引物探针组2对应的实蝇为西印度按实蝇； 所述引物探针组3对应的实蝇为蒲桃果实蝇； 所述引物探针组4对应的实蝇为番石榴果实蝇； 所述引物探针组5对应的实蝇为杨桃果实蝇； 所述引物探针组6对应的实蝇为橘小实蝇； 所述引物探针组7对应的实蝇为辣椒果实蝇； 所述引物探针组8对应的实蝇为锈红果实蝇； 所述引物探针组9对应的实蝇为昆士兰果实蝇； 所述引物探针组10对应的实蝇为短尾果实蝇； 所述引物探针组11对应的实蝇为面包果实蝇； 所述引物探针组12对应的实蝇为桃果实蝇； 所述引物探针组13对应的实蝇为油橄榄果实蝇； 所述引物探针组14对应的实蝇为橘大实蝇； 所述引物探针组15对应的实蝇为蜜柑大实蝇； 所述引物探针组16对应的实蝇为萌瓜实蝇； 所述引物探针组17对应的实蝇为两带果实蝇； 所述引物探针组18对应的实蝇为瓜实蝇； 所述引物探针组19对应的实蝇为宽带果实蝇； 所述引物探针组20对应的实蝇为南亚果实蝇； 所述引物探针组21对应的实蝇为枣实蝇； 所述引物探针组22对应的实蝇为地中海实蝇； 所述引物探针组23对应的实蝇为芒果小条实蝇； 所述引物探针组24对应的实蝇为纳塔耳小条实蝇； 所述引物探针组25对应的实蝇为萌芦寡鬃实蝇； 所述引物探针组26对应的实蝇为樱桃绕实蝇； 所述引物探针组27对应的实蝇为苹绕实蝇； 所述实蝇种类为如下27种中任一种：墨西哥按实蝇、西印度按实蝇、蒲桃果实蝇、番 石榴果实蝇、杨桃果实蝇、橘小实蝇、辣椒果实蝇、锈红果实蝇、昆士兰果实蝇、短尾果实蝇、 面包果实蝇、桃果实蝇、油橄榄果实蝇、橘大实蝇、蜜柑大实蝇、萌瓜实蝇、两带果实蝇、瓜实 蝇、宽带果实蝇、南亚果实蝇、枣实蝇、地中海实蝇、芒果小条实蝇、纳塔耳小条实蝇、萌芦寡 鬃实蝇、樱桃绕实蝇和苹绕实蝇。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定实蝇种类的集成流路芯片及其应用。本发明设计了鉴定实蝇种类的特异性引物和TaqMan-MGB探针，并开发了基于集成流路芯片的实蝇种类的分子鉴定技术。通过试验证明：本发明的基于集成流路芯片的分子鉴定技术可以快速实现对实蝇种类的鉴定，并且特异性好、通量高、成本低、操作简单，解决了非成虫态实蝇及实蝇成虫残体的种类鉴定问题，能够为进出境植物检疫和全国实蝇疫情监测提供快速鉴定的工具和技术，可有效预防危险性实蝇的入侵和扩散、保护农业生产和生态安全、促进我国经济贸易发展。
【IPC分类】C40B40/06, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894237
【申请号】CN201510219803
【发明人】李志红, 姜帆, 朱水芳, 付伟
【申请人】中国农业大学, 中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日
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