用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒的制作方法
用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。全世界每年约 有20万人死于食管癌，我国是食管癌高发区，因食管癌死亡者仅次于胃癌居第二位，发病 年龄多在40岁以上，男性多于女性，但近年来40岁以下发病者有增长趋势。食管癌的发生 与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。
[0003] 基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列， 预测罹患多种疾病的可能性，从而实现提前预防和治疗。
[0004] 中国专利申请200810039260. 4提供了一种检测食管癌遗传风险的试剂盒。该试 剂盒包括检测细胞色素 P4501A1基因（CYPlAl)、细胞色素 P4502E1基因（CYP2E1)、谷胱甘 肽硫转移酶Ml基因（GSTMl)、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR)、还原型辅酶I醌 类氧化还原酶基因（NQOl)、肿瘤蛋白53基因（P53)、X射线交错互补修复基因 I(XRCCl)、着 色性干皮病互补组A基因（XPA)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性 荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。
[0005] 上述技术方案的缺陷在于，相关基因的独立性差，存在连锁不平衡。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于辅助评价待测者食管 癌遗传风险性的试剂盒，以及其检测结果的评估方法。
[0007] 为实现上述目的，一方面，本发明提供一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险 性的试剂盒，该试剂盒包括：
[0008] 针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物，以及
[0009] 针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物。
[0010] 本发明的试剂盒通过检测与食管癌发生密切相关的单核苷酸多态性位点，来评 估受试者食管癌患病风险级别，并最终根据每个受试者的基因检测结果，从基因层面指导 受试者有针对性地预防和早期诊断食管癌，降低食管癌的发病率，进行早期治疗，提高生存 率。
[0011] 本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独 立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。
[0012] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点 rs9288520 的引物。
[0013] 根据本发明另一【具体实施方式】，针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物包括：
[0014] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0015] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
[0016] 根据本发明另一【具体实施方式】，针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物包 括：
[0017] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0018] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4)。
[0019] 根据本发明另一【具体实施方式】，针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物包 括：
[0020] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0021] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
[0022] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rsl7761864的引物。该针对单核苷酸多态性位点rsl7761864的引物包括，例如， rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7) ;rsl7761864 下游引物： CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)〇
[0023] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2847281的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物包括，例如， rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9) ;rs2847281 下游引物： TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10)。
[0024] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs8030672的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs8030672的引物包括，例如， rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:ll) ;rs8030672 下游引物： CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)。
[0025] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rsl0484761的引物。该针对单核苷酸多态性位点rsl0484761的引物包括，例如， rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13) ;rsl0484761 下游引物： TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14)。
[0026] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2239612的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2239612的引物包括，例如， rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15) ;rs2239612 下游引物： CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)。
[0027] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs6503659的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物包括，例如， rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17) ;rs6503659 下游引物： CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)。
[0028] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs100 52657的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs100 52657的引物包括，例如， rs 10052657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO: 19) ;rs 10052657 下游引物： ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID N0:20)。
[0029] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2274223的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物包括，例如， rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21) ;rs2274223 下游引物： CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22)。
[0030] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs4785204的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物包括，例如， rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23) ;rs4785204 下游引物： GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)。
[0031] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2014300的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物包括，例如， rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25) ;rs2014300 下游引物： CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)。
[0032] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2074356的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物包括，例如， rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27) ;rs2074356 下游引物： ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)。
[0033] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rsl229984的引物。该针对单核苷酸多态性位点rsl229984的引物包括，例如， rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29) ;rsl229984 下游引物： AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID N0:30)。
[0034] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒的组分和含量包括：PCR反应体系、PCR产 物纯化体系、测序反应体系。其中，前述引物属于PCR反应体系；PCR产物纯化体系用于PCR 扩增产物纯化；测序反应体系用于DNA测序，进而确定单核苷酸多态性位点的基因型。例 如，PCR反应体系包括10XPCR反应缓冲液2. 5ul ;25mM dNTP混合液0. 2ul ;5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul ;20uM引物对，每条引物0. 25ul ;ddH20 19. 175ul。例如，PCR产物纯化体系 包括：lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0· 375ul ;ddH20 3. 875ul。例如，测序反应体系 包括：25% BigDye mix Iul ;3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mM EDTA 溶液 Iul ;100% 乙醇溶 液15ul ;70%乙醇溶液30ul ;HIDI溶液8ul ;ddH202ul。值得注意的是，这里的DNA测序引 物可为现有技术已公开或披露的多种引物，在此不再赘述。
[0035] 另一方面，本发明提供了上述试剂盒的检测结果的评估方法，其包括如下步骤：
[0036] A、将单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的不同基因型进行 风险度赋值；
[0037] B、提取受检者的DNA ;
[0038] C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
[0039] (I) rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG ;
[0040] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG ;
[0041] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT ;
[0042] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT ;
[0043] (3) rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC ;
[0044] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC ;
[0045] D、PCR扩增产物纯化；
[0046] E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的基因 型；
[0047] F、根据步骤A，确定 步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、 rs9288520 的基因型的风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs100 58728)、Risk(rs9288520);
[0048] G、根据步骤 F 得到的三个风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs 10058728)、 Risk(rs9288520)判断受检者的风险级别。
[0049] 进一步地，步骤G具体包括如下步骤：
[0050] Gl、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
[0051] 总风险值 R = Risk(rs738722) XRisk(rs100 58728) XRisk(rs9288520);
[0052] G2、根据如下标准判断风险级别：
[0053] 总风险值R〈0. 91 风险较低
[0054] 0· 91彡总风险值R彡L 08风险一般
[0055] 总风险值R>1.08 风险较高。
[0056] 本发明所采用的方法是口腔粘膜细胞采样，无痛、无创、避免交叉感染。检测方法 简单，检测结果准确、可靠，方法易普及、推广。
[0057] 与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
[0058] 本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独 立、不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。
【具体实施方式】
[0059] 实施例1
[0060] 本实施例提供了一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，该试剂盒 包括：PCR反应体系、PCR产物纯化体系、测序反应体系。
[0061] 其中，PCR反应体系包括如下引物：
[0062] (1)针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物：
[0063] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0064] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
[0065] (2)针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物：
[0066] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0067] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4)。
[0068] (3)针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物：
[0069] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0070] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
[0071] PCR反应体系进一步包括10XPCR反应缓冲液2. 5ul ;25mM dNTP混合液0. 2ul ; 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0· 125ul ;20uM 引物对，每条引物 0· 25ul ;ddH2019. 175ul。
[0072] PCR产物纯化体系用于PCR扩增产物纯化，其包括：lU/ul SAP酶0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0· 375ul ;ddH20 3.875ul。
[0073] 测序反应体系用于DNA测序，进而确定单核苷酸多态性位点的基因型，其包括： 25%BigDye mix Iul ;3.2uM DNA测序引物 Iul ;125mM EDTA溶液 Iul ;100% 乙醇溶液 15ul ; 70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。
[0074] 本实施例试剂盒的检测结果的评估方法包括如下步骤：
[0075] A、将单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的不同基因型进行 风险度赋值；具体风险值如表1所示，
[0076] 表 1
[0077]
[0078] B、提取受检者的DNA ;
[0079] C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
[0080] (I) rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG ;
[0081] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG ;
[0082] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT ;
[0083] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT ;
[0084] (3) rs928852〇 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC ;
[0085] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC ;
[0086] D、PCR扩增产物纯化；
[0087] E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的基因 型；
[0088] F、根据步骤A，确定步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、 rs9288520 的基因型的风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs100 58728)、Risk(rs9288520);
[0089] G、根据步骤 F 得到的三个风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs 10058728)、 Risk(rs9288520)判断受检者的风险级别。步骤G具体包括如下步骤：
[0090] Gl、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
[0091] 总风险值 R = Risk(rs738722) XRisk(rs100 58728) XRisk(rs9288520);
[0092] G2、根据如下标准判断风险级别：
[0093] 总风险值R〈0. 91 风险较低
[0094] 0· 91彡总风险值R彡L 08风险一般
[0095] 总风险值R>1.08 风险较高。
[0096] 按照上述方法采集五个样本，每个样本各个位点的基因型及风险值、总风险值、风 险级别如表2所示，
[0097] 表 2
[0098]
[0099] 实施例2
[0100] 本实施例与实施例1的区别在于，PCR反应体系包括如下引物，
[0101] (1)针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物：
[0102] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0103] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2);
[0104] (2)针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物：
[0105] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0106] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4);
[0107] (3)针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物：
[0108] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0109] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6);
[0110] (4)针对单核苷酸多态性位点rsl7761864的引物：
[0111] rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7);
[0112] rsl7761864 下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8);
[0113] (5)针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物：
[0114] rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9);
[0115] rs2847281 下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10);
[0116] (6)针对单核苷酸多态性位点rs8030672的引物：
[0117] rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID ΝΟ:11);
[0118] rs8030672 下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12);
[0119] (7)针对单核苷酸多态性位点rsl0484761的引物：
[0120] rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13);
[0121] rsl0484761 下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14);
[0122] (8)针对单核苷酸多态性位点rs2239612的引物：
[0123] rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15);
[0124] rs2239612 下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16);
[0125] (9)针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物：
[0126] rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17);
[0127] rs6503659 下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18);
[0128] (10)针对单核苷酸多态性位点rs100 52657的引物：
[0129] rs 10052657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO: 19);
[0130] rs 10052657 下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20);
[0131] (11)针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物：
[0132] rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21);
[0133] rs2274223 下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22);
[0134] (12)针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物：
[0135] rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID N0:23);
[0136] rs4785204 下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID N0:24);
[0137] (13)针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物：
[0138] rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID N0:25);
[0139] rs2014300 下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID N0:26);
[0140] (14)针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物：
[0141] rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SE Q ID N0:27);
[0142] rs2074356 下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID N0:28);
[0143] (15)针对单核苷酸多态性位点rsl229984的引物：
[0144] rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID N0:29);
[0145] rs 1229984 下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO :30)。
[0146] 本实施例试剂盒的检测结果的评估方法包括如下步骤：
[0147] A、将每个单核苷酸多态性位点的不同基因型进行风险度赋值，具体风险值如表3 所示；
[0148] 表 3
[0149]
[0150] B、提取受检者的DNA ;
[0151] C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
[0152] (l)rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID N0:1);
[0153] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID N0:2);
[0154] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0155] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4);
[0156] (3)rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0157] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6);
[0158] (4)rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7);
[0159] rsl7761864 下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8);
[0160] (5)rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9);
[0161] rs2847281 下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10);
[0162] (6)rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:ll);
[0163] rs8030672 下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12);
[0164] (7)rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13);
[0165] rsl0484761 下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14);
[0166] (8)rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15);
[0167] rs2239612 下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16);
[0168] (9)rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17);
[0169] rs6503659 下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18);
[0170] (10)rs100 52657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19);
[0171] rs 10052657 下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO :20);
[0172] (ll)rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21);
[0173] rs2274223 下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22);
[0174] (12)rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID N0:23);
[0175] rs4785204 下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID N0:24);
[0176] (13)rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID N0:25);
[0177] rs2014300 下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID N0:26);
[0178] (14)rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID N0:27);
[0179] rs2074356 下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID N0:28);
[0180] (15)rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID N0:29);
[0181] rs 1229984 下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO :30)。
[0182] D、PCR扩增产物纯化；
[0183] E、DNA测序，确定十五个单核苷酸多态性位点的基因型；
[0184] F、根据步骤A，确定步骤E所测得的十五个单核苷酸多态性位点的基因型的 风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs100 58728)、Risk(rs9288520)、Risk(rsl7761864)、 Risk(rs2847281) , Risk(rs8030672) , Risk(rs10484761) , Risk(rs2239612), Risk(rs6503659) , Risk(rs10052657) , Risk(rs2274223) , Risk(rs4785204), Risk (rs2014300), Risk (rs2074356), Risk (rsl229984)；
[0185] G、根据步骤F得到的十五个风险值判断受检者的风险级别，其具体包括如下步 骤：
[0186] Gl、计算十五个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
[0187] 总风险值 R = Risk(rs738722) XRisk(rs100 58728) XRisk(rs9288520) XRisk(r sl7761864)X Risk(rs2847281)X Risk(rs8030672)X Risk(rsl0484761)X Risk(rs223961 2) XRisk(rs6503659) XRisk(rs100 52657) XRisk(rs2274223) XRisk(rs4785204) XRisk (rs2014300)XRisk(rs2074356)XRisk(rsl229984)；
[0188] G2、根据如下标准判断风险级别：
[0189] 总风险值R〈0. 57 风险较低
[0190] 0· 57彡总风险值R彡L 74风险一般
[0191] 总风险值R>1.74 风险较高。
[0192] 按照上述方法采集五个样本，每个样本各个位点的基因型及风险值、总风险值、风 险级别如表4所示，
[0193] 表 4
[0194]
[0195] 虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本 领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发 明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。
【主权项】
1. 一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，其中，所述试剂盒包括： 针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物，以及 针对单核苷酸多态性位点rsl0058728的引物。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs9288520的引物。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物 包括： rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG;rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAGo4. 如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述针对单核苷酸多态性位点rsl0058728的引 物包括： rsl0058728 上游引物：CATGTCTTGATAITTACCAAT;rsl0058728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT。5. 如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物 包括： rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGITCTTC;rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC。6. 权利要求1-5之一所述试剂盒的检测结果的评估方法，其包括如下步骤： A、 将单核苷酸多态性位点rs738722、rsl0058728、rs9288520的不同基因型进行风险 度赋值； B、 提取受检者的DNA; C、 使用以下引物对进行PCR扩增反应： (1)rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG; rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG; (2)rsl0058728 上游引物：CATGTCTTGATAITTACCAAT; rsl0058728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT; (3) rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGITCTTC; rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC; D、PCR扩增产物纯化； E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs738722、rsl0058728、rs9288520的基因型； F、 根据步骤A，确定步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs738722、rs10058728、 rs9288520 的基因型的风险值Risk(rs738722)、Risk(rsl0058728)、Risk(rs9288520); G、 根据步骤F得到的三个风险值Risk(rs738722)、Risk(rsl0058728)、 Risk(rs9288520)判断受检者的风险级别。7. 如权利要求6所述的评估方法，其中，所述步骤G具体包括如下步骤： G1、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为 总风险值R=Risk(rs738722)XRisk(rsl0058728)XRisk(rs9288520); G2、根据如下标准判断风险级别： 总风险值R〈0.91 风险较低 0. 91 <总风险值R<I. 08风险一般 总风险值R>1.08 风险较高。
【专利摘要】本发明提供一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，该试剂盒包括：针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物，以及针对单核苷酸多态性位点rs10058728的引物。本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独立、不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。本发明同时提供了上述试剂盒检测结果的评估方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894238
【申请号】CN201510220995
【发明人】由晓斌, 兰兆吉
【申请人】广州拓普基因科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月4日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。全世界每年约 有20万人死于食管癌，我国是食管癌高发区，因食管癌死亡者仅次于胃癌居第二位，发病 年龄多在40岁以上，男性多于女性，但近年来40岁以下发病者有增长趋势。食管癌的发生 与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。
[0003] 基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列， 预测罹患多种疾病的可能性，从而实现提前预防和治疗。
[0004] 中国专利申请200810039260. 4提供了一种检测食管癌遗传风险的试剂盒。该试 剂盒包括检测细胞色素 P4501A1基因（CYPlAl)、细胞色素 P4502E1基因（CYP2E1)、谷胱甘 肽硫转移酶Ml基因（GSTMl)、5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR)、还原型辅酶I醌 类氧化还原酶基因（NQOl)、肿瘤蛋白53基因（P53)、X射线交错互补修复基因 I(XRCCl)、着 色性干皮病互补组A基因（XPA)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性 荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。
[0005] 上述技术方案的缺陷在于，相关基因的独立性差，存在连锁不平衡。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于辅助评价待测者食管 癌遗传风险性的试剂盒，以及其检测结果的评估方法。
[0007] 为实现上述目的，一方面，本发明提供一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险 性的试剂盒，该试剂盒包括：
[0008] 针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物，以及
[0009] 针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物。
[0010] 本发明的试剂盒通过检测与食管癌发生密切相关的单核苷酸多态性位点，来评 估受试者食管癌患病风险级别，并最终根据每个受试者的基因检测结果，从基因层面指导 受试者有针对性地预防和早期诊断食管癌，降低食管癌的发病率，进行早期治疗，提高生存 率。
[0011] 本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独 立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。
[0012] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位点 rs9288520 的引物。
[0013] 根据本发明另一【具体实施方式】，针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物包括：
[0014] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0015] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
[0016] 根据本发明另一【具体实施方式】，针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物包 括：
[0017] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0018] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4)。
[0019] 根据本发明另一【具体实施方式】，针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物包 括：
[0020] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0021] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
[0022] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rsl7761864的引物。该针对单核苷酸多态性位点rsl7761864的引物包括，例如， rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7) ;rsl7761864 下游引物： CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)〇
[0023] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2847281的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物包括，例如， rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9) ;rs2847281 下游引物： TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10)。
[0024] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs8030672的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs8030672的引物包括，例如， rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:ll) ;rs8030672 下游引物： CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)。
[0025] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rsl0484761的引物。该针对单核苷酸多态性位点rsl0484761的引物包括，例如， rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13) ;rsl0484761 下游引物： TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14)。
[0026] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2239612的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2239612的引物包括，例如， rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15) ;rs2239612 下游引物： CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)。
[0027] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs6503659的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物包括，例如， rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17) ;rs6503659 下游引物： CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)。
[0028] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs100 52657的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs100 52657的引物包括，例如， rs 10052657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO: 19) ;rs 10052657 下游引物： ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID N0:20)。
[0029] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2274223的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物包括，例如， rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21) ;rs2274223 下游引物： CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22)。
[0030] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs4785204的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物包括，例如， rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23) ;rs4785204 下游引物： GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)。
[0031] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2014300的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物包括，例如， rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25) ;rs2014300 下游引物： CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)。
[0032] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs2074356的引物。该针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物包括，例如， rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27) ;rs2074356 下游引物： ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)。
[0033] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rsl229984的引物。该针对单核苷酸多态性位点rsl229984的引物包括，例如， rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29) ;rsl229984 下游引物： AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID N0:30)。
[0034] 根据本发明另一【具体实施方式】，试剂盒的组分和含量包括：PCR反应体系、PCR产 物纯化体系、测序反应体系。其中，前述引物属于PCR反应体系；PCR产物纯化体系用于PCR 扩增产物纯化；测序反应体系用于DNA测序，进而确定单核苷酸多态性位点的基因型。例 如，PCR反应体系包括10XPCR反应缓冲液2. 5ul ;25mM dNTP混合液0. 2ul ;5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul ;20uM引物对，每条引物0. 25ul ;ddH20 19. 175ul。例如，PCR产物纯化体系 包括：lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0· 375ul ;ddH20 3. 875ul。例如，测序反应体系 包括：25% BigDye mix Iul ;3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mM EDTA 溶液 Iul ;100% 乙醇溶 液15ul ;70%乙醇溶液30ul ;HIDI溶液8ul ;ddH202ul。值得注意的是，这里的DNA测序引 物可为现有技术已公开或披露的多种引物，在此不再赘述。
[0035] 另一方面，本发明提供了上述试剂盒的检测结果的评估方法，其包括如下步骤：
[0036] A、将单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的不同基因型进行 风险度赋值；
[0037] B、提取受检者的DNA ;
[0038] C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
[0039] (I) rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG ;
[0040] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG ;
[0041] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT ;
[0042] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT ;
[0043] (3) rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC ;
[0044] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC ;
[0045] D、PCR扩增产物纯化；
[0046] E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的基因 型；
[0047] F、根据步骤A，确定 步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、 rs9288520 的基因型的风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs100 58728)、Risk(rs9288520);
[0048] G、根据步骤 F 得到的三个风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs 10058728)、 Risk(rs9288520)判断受检者的风险级别。
[0049] 进一步地，步骤G具体包括如下步骤：
[0050] Gl、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
[0051] 总风险值 R = Risk(rs738722) XRisk(rs100 58728) XRisk(rs9288520);
[0052] G2、根据如下标准判断风险级别：
[0053] 总风险值R〈0. 91 风险较低
[0054] 0· 91彡总风险值R彡L 08风险一般
[0055] 总风险值R>1.08 风险较高。
[0056] 本发明所采用的方法是口腔粘膜细胞采样，无痛、无创、避免交叉感染。检测方法 简单，检测结果准确、可靠，方法易普及、推广。
[0057] 与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
[0058] 本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独 立、不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。
【具体实施方式】
[0059] 实施例1
[0060] 本实施例提供了一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，该试剂盒 包括：PCR反应体系、PCR产物纯化体系、测序反应体系。
[0061] 其中，PCR反应体系包括如下引物：
[0062] (1)针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物：
[0063] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0064] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
[0065] (2)针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物：
[0066] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0067] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4)。
[0068] (3)针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物：
[0069] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0070] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
[0071] PCR反应体系进一步包括10XPCR反应缓冲液2. 5ul ;25mM dNTP混合液0. 2ul ; 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0· 125ul ;20uM 引物对，每条引物 0· 25ul ;ddH2019. 175ul。
[0072] PCR产物纯化体系用于PCR扩增产物纯化，其包括：lU/ul SAP酶0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0· 375ul ;ddH20 3.875ul。
[0073] 测序反应体系用于DNA测序，进而确定单核苷酸多态性位点的基因型，其包括： 25%BigDye mix Iul ;3.2uM DNA测序引物 Iul ;125mM EDTA溶液 Iul ;100% 乙醇溶液 15ul ; 70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。
[0074] 本实施例试剂盒的检测结果的评估方法包括如下步骤：
[0075] A、将单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的不同基因型进行 风险度赋值；具体风险值如表1所示，
[0076] 表 1
[0077]
[0078] B、提取受检者的DNA ;
[0079] C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
[0080] (I) rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG ;
[0081] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG ;
[0082] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT ;
[0083] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT ;
[0084] (3) rs928852〇 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC ;
[0085] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC ;
[0086] D、PCR扩增产物纯化；
[0087] E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、rs9288520的基因 型；
[0088] F、根据步骤A，确定步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs738722、rs100 58728、 rs9288520 的基因型的风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs100 58728)、Risk(rs9288520);
[0089] G、根据步骤 F 得到的三个风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs 10058728)、 Risk(rs9288520)判断受检者的风险级别。步骤G具体包括如下步骤：
[0090] Gl、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
[0091] 总风险值 R = Risk(rs738722) XRisk(rs100 58728) XRisk(rs9288520);
[0092] G2、根据如下标准判断风险级别：
[0093] 总风险值R〈0. 91 风险较低
[0094] 0· 91彡总风险值R彡L 08风险一般
[0095] 总风险值R>1.08 风险较高。
[0096] 按照上述方法采集五个样本，每个样本各个位点的基因型及风险值、总风险值、风 险级别如表2所示，
[0097] 表 2
[0098]
[0099] 实施例2
[0100] 本实施例与实施例1的区别在于，PCR反应体系包括如下引物，
[0101] (1)针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物：
[0102] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0103] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2);
[0104] (2)针对单核苷酸多态性位点rs100 58728的引物：
[0105] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0106] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4);
[0107] (3)针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物：
[0108] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0109] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6);
[0110] (4)针对单核苷酸多态性位点rsl7761864的引物：
[0111] rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7);
[0112] rsl7761864 下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8);
[0113] (5)针对单核苷酸多态性位点rs2847281的引物：
[0114] rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9);
[0115] rs2847281 下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10);
[0116] (6)针对单核苷酸多态性位点rs8030672的引物：
[0117] rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID ΝΟ:11);
[0118] rs8030672 下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12);
[0119] (7)针对单核苷酸多态性位点rsl0484761的引物：
[0120] rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13);
[0121] rsl0484761 下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14);
[0122] (8)针对单核苷酸多态性位点rs2239612的引物：
[0123] rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15);
[0124] rs2239612 下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16);
[0125] (9)针对单核苷酸多态性位点rs6503659的引物：
[0126] rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17);
[0127] rs6503659 下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18);
[0128] (10)针对单核苷酸多态性位点rs100 52657的引物：
[0129] rs 10052657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO: 19);
[0130] rs 10052657 下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO:20);
[0131] (11)针对单核苷酸多态性位点rs2274223的引物：
[0132] rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21);
[0133] rs2274223 下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22);
[0134] (12)针对单核苷酸多态性位点rs4785204的引物：
[0135] rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID N0:23);
[0136] rs4785204 下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID N0:24);
[0137] (13)针对单核苷酸多态性位点rs2014300的引物：
[0138] rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID N0:25);
[0139] rs2014300 下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID N0:26);
[0140] (14)针对单核苷酸多态性位点rs2074356的引物：
[0141] rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SE Q ID N0:27);
[0142] rs2074356 下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID N0:28);
[0143] (15)针对单核苷酸多态性位点rsl229984的引物：
[0144] rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID N0:29);
[0145] rs 1229984 下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO :30)。
[0146] 本实施例试剂盒的检测结果的评估方法包括如下步骤：
[0147] A、将每个单核苷酸多态性位点的不同基因型进行风险度赋值，具体风险值如表3 所示；
[0148] 表 3
[0149]
[0150] B、提取受检者的DNA ;
[0151] C、使用以下引物对进行PCR扩增反应：
[0152] (l)rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID N0:1);
[0153] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID N0:2);
[0154] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0155] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4);
[0156] (3)rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0157] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6);
[0158] (4)rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7);
[0159] rsl7761864 下游引物：CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8);
[0160] (5)rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9);
[0161] rs2847281 下游引物：TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10);
[0162] (6)rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:ll);
[0163] rs8030672 下游引物：CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12);
[0164] (7)rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13);
[0165] rsl0484761 下游引物：TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14);
[0166] (8)rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15);
[0167] rs2239612 下游引物：CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16);
[0168] (9)rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17);
[0169] rs6503659 下游引物：CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18);
[0170] (10)rs100 52657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO:19);
[0171] rs 10052657 下游引物：ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID NO :20);
[0172] (ll)rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21);
[0173] rs2274223 下游引物：CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22);
[0174] (12)rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID N0:23);
[0175] rs4785204 下游引物：GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID N0:24);
[0176] (13)rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID N0:25);
[0177] rs2014300 下游引物：CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID N0:26);
[0178] (14)rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID N0:27);
[0179] rs2074356 下游引物：ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID N0:28);
[0180] (15)rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID N0:29);
[0181] rs 1229984 下游引物：AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID NO :30)。
[0182] D、PCR扩增产物纯化；
[0183] E、DNA测序，确定十五个单核苷酸多态性位点的基因型；
[0184] F、根据步骤A，确定步骤E所测得的十五个单核苷酸多态性位点的基因型的 风险值 Risk(rs738722)、Risk(rs100 58728)、Risk(rs9288520)、Risk(rsl7761864)、 Risk(rs2847281) , Risk(rs8030672) , Risk(rs10484761) , Risk(rs2239612), Risk(rs6503659) , Risk(rs10052657) , Risk(rs2274223) , Risk(rs4785204), Risk (rs2014300), Risk (rs2074356), Risk (rsl229984)；
[0185] G、根据步骤F得到的十五个风险值判断受检者的风险级别，其具体包括如下步 骤：
[0186] Gl、计算十五个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为
[0187] 总风险值 R = Risk(rs738722) XRisk(rs100 58728) XRisk(rs9288520) XRisk(r sl7761864)X Risk(rs2847281)X Risk(rs8030672)X Risk(rsl0484761)X Risk(rs223961 2) XRisk(rs6503659) XRisk(rs100 52657) XRisk(rs2274223) XRisk(rs4785204) XRisk (rs2014300)XRisk(rs2074356)XRisk(rsl229984)；
[0188] G2、根据如下标准判断风险级别：
[0189] 总风险值R〈0. 57 风险较低
[0190] 0· 57彡总风险值R彡L 74风险一般
[0191] 总风险值R>1.74 风险较高。
[0192] 按照上述方法采集五个样本，每个样本各个位点的基因型及风险值、总风险值、风 险级别如表4所示，
[0193] 表 4
[0194]
[0195] 虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本 领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发 明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。
【主权项】
1. 一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，其中，所述试剂盒包括： 针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物，以及 针对单核苷酸多态性位点rsl0058728的引物。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括针对单核苷酸多态性位 点rs9288520的引物。3. 如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物 包括： rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG;rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAGo4. 如权利要求1所述的试剂盒，其中，所述针对单核苷酸多态性位点rsl0058728的引 物包括： rsl0058728 上游引物：CATGTCTTGATAITTACCAAT;rsl0058728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT。5. 如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述针对单核苷酸多态性位点rs9288520的引物 包括： rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGITCTTC;rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC。6. 权利要求1-5之一所述试剂盒的检测结果的评估方法，其包括如下步骤： A、 将单核苷酸多态性位点rs738722、rsl0058728、rs9288520的不同基因型进行风险 度赋值； B、 提取受检者的DNA; C、 使用以下引物对进行PCR扩增反应： (1)rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG; rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG; (2)rsl0058728 上游引物：CATGTCTTGATAITTACCAAT; rsl0058728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT; (3) rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGITCTTC; rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC; D、PCR扩增产物纯化； E、DNA测序，确定单核苷酸多态性位点rs738722、rsl0058728、rs9288520的基因型； F、 根据步骤A，确定步骤E所测得的单核苷酸多态性位点rs738722、rs10058728、 rs9288520 的基因型的风险值Risk(rs738722)、Risk(rsl0058728)、Risk(rs9288520); G、 根据步骤F得到的三个风险值Risk(rs738722)、Risk(rsl0058728)、 Risk(rs9288520)判断受检者的风险级别。7. 如权利要求6所述的评估方法，其中，所述步骤G具体包括如下步骤： G1、计算三个单核苷酸多态性位点的总风险值R，计算公式为 总风险值R=Risk(rs738722)XRisk(rsl0058728)XRisk(rs9288520); G2、根据如下标准判断风险级别： 总风险值R〈0.91 风险较低 0. 91 <总风险值R<I. 08风险一般 总风险值R>1.08 风险较高。
【专利摘要】本发明提供一种用于辅助评价待测者食管癌遗传风险性的试剂盒，该试剂盒包括：针对单核苷酸多态性位点rs738722的引物，以及针对单核苷酸多态性位点rs10058728的引物。本发明所选取的单核苷酸多态性位点在亚洲人群中具有显著相关性，并且彼此独立、不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性。本发明同时提供了上述试剂盒检测结果的评估方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894238
【申请号】CN201510220995
【发明人】由晓斌, 兰兆吉
【申请人】广州拓普基因科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月4日
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