Mtrr基因多态性检测引物体系及其试剂盒的制作方法
Mtrr基因多态性检测引物体系及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 叶酸代谢途径中的关键酶基因如甲硫氨酸合成还原酶（Methionine synthase reductase，MTRR)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因突变会导致叶酸利用能力下降、DNA遗传稳定性降低，从而导致胚胎发育异常 如神经管缺陷、唇腭裂、先天性心脏病、Down综合征等；并使妊娠期高血压和习惯性流产风 险增加。
[0003] 甲硫氨酸合成还原酶（MTRR)是一种黄素蛋白相关的酶，能维持甲硫氨酸合成酶 的活性状态，对维持体内蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸一一甲硫氨酸的循环起重要 的调节作用。甲硫氨酸的合成是由甲硫氨酸合酶（MTR编码）催化的，而甲硫氨酸合酶因为 辅助因子维生素 B12被氧化而最终失活；MTRR编码的甲硫氨酸合成还原酶能够通过还原型 甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺 乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。较常见的人类MTRR 基因多态性66A - G，使蛋氨酸被异亮氨酸替代，酶活性显著降低，导致体内同型半胱氨酸 堆积。MTRR基因检测是叶酸利用能力评估的关键项目，其检测结果为个体化（差异化）增 补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学依据。
[0004] 目前进行MTRR基因多态性检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦 磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测MTRR基 因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的MTRR基因多态性检测是非 常有必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的MTRR基因多态性检测试 剂盒，以及其检测引物和检测体系。
[0006] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTRR基因多态性检测 引物包括针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因 c. 66位点为G情 况的正向引物、对应MTRR基因 c. 66位点的反向通用引物、检测β-actin基因的正向引物 和检测β -actin基因的反向引物；所述针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对MTRR基因 c. 66位点为G情况的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述对应MTRRc. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述检测β -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所 述检测β -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0007] 各引物在反应体系中的终浓度为0. 4 μ M。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 MTRR基因多态性检测试剂盒。
[0009] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTRR基因多态性检测 体系，包括用于检测MTRR基因 c. 66位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTRR基因 c. 66位点为G情况的PCR反应体系B，以及用于检测β -actin基因作为内对照的PCR反应 体系C ;所述PCR反应体系A包括针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物、对应MTRR 基因 c. 66位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系B包括 针对MTRR基因 c. 66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基因 c. 66位点的反向通用引物、 SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系C包括检测β -actin基因的正向引物、 检测β -actin基因的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述针对MTRR基因 c. 66 位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对MTRR基因 c. 66位 点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述对应MTRR c. 66位点的反 向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述检测β-actin基因的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0010] 各PCR反应体系的体积为10 μ 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5 μ 1，各 引物的终浓度为0. 4 μ Μ，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/ μ 1，其余为纯水。
[0011] 上述SYBR Green混合液是两倍浓度的SYBR Green混合液。本发明为解决上述技 术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测体系的MTRR基因多态性检测试剂盒。
[0012] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的结果判定方法，具体步骤如下：
[0013] 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的β-actin基因，
[0014] 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测；
[0015] 若样本扩增CT值在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断；
[0016] 第二步，采用PCR反应体系A和B分别检测该样本，
[0017] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两个CT差值的绝对值< 2 时，样本判断为杂合基因型；当两个CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两个CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0018] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,则结果判断为不可信， 重新制备样本进行检测。
[0019] 本发明具有积极的效果：
[0020] (1)本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒，首创将等位基因特异PCR结合SYBR Green的检测策略应用于检测人MTRR基因 c. 66位点的多态性，具有检测快速方便，灵敏度 高，准确率高的特点，应用范围极广。
[0021] (2)本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒的检测结果与测序-结果进行比对，基 因型符合率彡99%，分子分型准确度高。
[0022] (3)本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒突破了现有常规检测手费时费力且花 费不菲的应用局限，特别地，巧妙取代花费甚高且制备过程繁琐的传统荧光探针检测方法， 使成本极大降低，其操作和设计的简便性及对仪器的普适性，使之利于推广应用，从而使得 MTRR基因多态性检测在批量检测中有更广泛的应用领域，能更迅速地获得分子检测结果， 使得个性化医疗过程更为顺畅。
【附图说明】
[0023] 图1采用实施例1的试剂盒检测样本1的扩增曲线；
[0024] 图2采用实施例1的试剂盒检测样本2的扩增曲线；
[0025] 图3采用实施例1的试剂盒检测样本3的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0027] 实施例1
[0028] 一、试剂盒的组成。
[0029] 本实施例的MTRR基因多态性检测试剂盒包括用于检测MTRR基因的c. 66位点 为A情况的反应液A，用于检测MTRR基因的c. 66位点为G情况的反应液B，以及用于检测 β -actin基因作为内对照的反应液C。
[0030] 反应液A、B、C的配制如下：
[0031] 1、反应液A (MIX A)的配制。
[0032] 反应液A为检测MTRR基因 c. 66位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTRR基 因的c. 66位为A的情况，包括针对MTRR基因的c. 66位点为A情况的正向arm引物（Primer F A66G For A)、对应MTRR基因的c. 66位点的反向通用引物（Primer R A66G Rev Gen)、 SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0033] 具体组分请见表1。
[0034] 表1反应液A的组分
[0035]
[0036] 2、反应液B (MIX B)的配制。
[0037] 反应液B为检测MTRR基因 c. 66位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTRR基 因的c. 66位为G的情况，包括针对MTRR基因的c. 66位点为G情况的正向arm引物（Primer F A66G For G)、对应MTRR基因 c.66位点的反向通用引物（Primer R A66G Rev Gen)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0038] 具体组分请见表2。
[0039] 表2反应液B的组分
[0040]
[0041] 3、反应液C (MIX C)的配制
[0042] 反应液C包括检测β -actin基因的正向引物（Primer F β -actin)、检测 β-actin基因的反向引物（Primer R 0_actin)、SYBR Green混合液（2XSYBR GREEN Mix) 和纯水（H2O)。
[0043] 反应液C为检测β -actin基因的反应混合液，作为反应模板的内对照用，具体组 分请见表3。
[0044] 表3反应液C的组分
[0045]
[0046] SYBR Green混合液供应商：杭州博日科技有限公司，商品号：Cat#B254Cl。
[0047] 各引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物的核苷酸序列见表4。
[0048] 表4引物特征表
[0049]
[0050] 反应液A、B、C每批次按100个反应量配制好后，-20°C存放。 '
[0051] 二、试剂盒的使用方法。
[005 2] 本实施例的MTRR基因多态性检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0053] UDNA 提取。
[0054] 米用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取样本DNA，具 体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0055] 2、样本DNA质量检测。
[0056] 获得样本DNA后，通过测定浓度和0D260/0D280的比值控制样本质量，最终加入 反应体系中的样本，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间的可获得最优反应结果，浓度为 10 ~50ng/ μ 1 〇
[0057] 3、PCR 反应。
[0058] 1)配制PCR反应体系。
[0059] 基于反应液A、B和C分别配制PCR反应体系A、B和C，即取适量的反应液与DNA 模板进行混合，最后加入适量的纯水补足反应总体积。各PCR反应体系的组分见表5至表 ?。
[0060] 表5 PCR反应体系A的组分
[0061]
[0062] 表6 PCR反应体系B的组分
[0063]
[0065] 表7 PCR反应体系C的组分
[0066]
[0067] 2) PCR汉胆程厅。
[0068] 随后在实时焚光定量 PCR仪（Roche Light Cycler-Nano thermo cycler)上进行 实时荧光PCR反应程序，最优反应程序为如表6所示的Touch down PCR反应程序。
[0069] 表6 PCR反应程序表
[0070]
[0071] 其中，在"变性-退火-延伸"的前14个PCR循环程序中，第一个循环退火温度为 62度，第二个循环退火温度为61. 5度，后面的循环依次每次退火温度降低0. 5度。
[0072] 4、PCR检测结果判定。
[0073] 根据已知的实验样品（对照）制定的判读标准为：
[0074] 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的β-actin基因，若样本扩增CT值在23~ 25范围内，判断为样品有效；否则判断为样品无效，需重新制备样本，使样本浓度为10~ 50ng/ μ I，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0075] 第二步，采用两种多态性ARMS引物的PCR反应体系A和B分别检测同一个样本。
[0076] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则：
[0077] 1)当两种ARMS引物扩增的CT值很接近，CT差值（Λ CT的绝对值）< 2,样本判 断为杂合基因型；
[0078] 2)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型。
[0079] 3)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡2且< 3时，样本判断为 结果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0080] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之 间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0081] 三、应用示例。
[0082] 1、应用例。
[0083] 1)采用实施例1的试剂盒检测样本1，扩增曲线如图1所示，检测结果为MTRR Α66Α (以下简称MTRR AA)基因型。
[0084] 当检测的样本为MTRR AA基因型时，A等位基因型引物扩增CT值小于G等位基因 型引物扩增CT值（即A等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且G等位基因型引物 扩增CT值与A等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTRR AA基因型样本的扩增曲线，从左 往右依次是A等位基因型引物扩增所对应的扩增曲线、G等位基因型引物扩增所对应的扩 增曲线。
[0085] 2)采用实施例1的试剂盒检测样本2,扩增曲线如图2所示，检测结果为MTRR G66G (以下简称MTRR GG)基因型。
[0086] 当检测的样本为MTRR GG基因型时，G等位基因型引物扩增CT值小于A等位基因 型的引物扩增CT值（即G等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且A等位基因型引 物扩增CT值与G等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTRR GG基因型样本的扩增曲线，从 左往右依次是G等位基因型引物扩增所对应的扩增曲线、A等位基因型引物扩增所对应的 扩增曲线。
[0087] 3)采用实施例1的试剂盒检测样本3,扩增曲线如图3所示，检测结果为MTRR A66G (以下简称MTRR AG)基因型。
[0088] 当检测的样本为MTRR AG杂合型时，A等位基因型引物和G等位基因型引物扩增 的CT值接近，且A等位基因型引物扩增CT值与G等位基因型引物扩增CT值之差的绝对值 <2。杂合基因型样本的扩增曲线，两条扩增曲线分别对应为A等位基因型引物和G等位基 因型引物扩增所对应的扩增曲线。
[0089] 2、PCR结果验证。
[0090] 采用测序方法检测各样本的MTRR基因的突变位点，测序结果与采用本试剂盒的 检测结果完全一致。
[0091] 四、试剂盒特性
[0092] 灵敏度分析：采用本实施例1的试剂盒可检测低至IOng的人基因组DNA。
[0093] 重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过 0.2个循环。
[0094] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发 明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种MTRR基因多态性检测引物，其特征在于： 包括针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因c. 66位点为G情 况的正向引物、对应MTRR基因c. 66位点的反向通用引物、检测0-actin基因的正向引物 和检测0-actin基因的反向引物； 所述针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所 示； 所述针对MTRR基因c. 66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 示； 所述对应MTRR基因c. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示； 所述检测0 -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示。2. 根据权利要求1所述的MTRR基因多态性检测引物，其特征在于：各引物应用于PCR 反应体系中的终浓度为0. 4剛。3. -种采用如权利要求1所述的检测引物的MTRR基因多态性检测试剂盒。4. 一种MTRR基因多态性检测体系，其特征在于： 包括用于检测MTRR基因c. 66位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTRR基因c. 66位点为G情况的PCR反应体系B，以及用于检测0 -actin基因作为内对照的PCR反应 体系C; 所述PCR反应体系A包括针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物、对应MTRR基 因c. 66位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系B包括针对MTRR基因c. 66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基 因c. 66位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系C包括检测0-actin基因的正向引物、检测0-actin基因的反向 引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所 示； 所述针对MTRR基因c. 66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 示； 所述对应MTRR基因c. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示； 所述检测0 -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示。5. 根据权利要求4所述的MTRR基因多态性检测体系，其特征在于：各PCR反应体系的 体积为10U1 ;其中，所述SYBRGreen混合液的体积是5W，各引物的终浓度为0. 4剛，所述 DNA模板的使用浓度为10~50ng/y1，其余为纯水。6. -种采用如权利要求4所述的检测体系的MTRR基因多态性检测试剂盒。7. -种采用如权利要求4所述的检测体系的结果判定方法，具体步骤如下： 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的|3 -actin基因， 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测； 若样本扩增CT值在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断； 第二步，采用PCR反应体系A和B分别检测该样本， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2时，样 本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应的 等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制备 样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测。
【专利摘要】本发明涉及一种MTRR基因多态性检测引物以及采用该引物的检测体系和试剂盒，包括针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物、检测β-actin基因的正向引物和检测β-actin基因的反向引物；针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；检测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒检测快速方便，灵敏度高，准确率高，成本低。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894241
【申请号】CN201510237229
【发明人】赵新泰, 王明, 张长顺
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 叶酸代谢途径中的关键酶基因如甲硫氨酸合成还原酶（Methionine synthase reductase，MTRR)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因突变会导致叶酸利用能力下降、DNA遗传稳定性降低，从而导致胚胎发育异常 如神经管缺陷、唇腭裂、先天性心脏病、Down综合征等；并使妊娠期高血压和习惯性流产风 险增加。
[0003] 甲硫氨酸合成还原酶（MTRR)是一种黄素蛋白相关的酶，能维持甲硫氨酸合成酶 的活性状态，对维持体内蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸一一甲硫氨酸的循环起重要 的调节作用。甲硫氨酸的合成是由甲硫氨酸合酶（MTR编码）催化的，而甲硫氨酸合酶因为 辅助因子维生素 B12被氧化而最终失活；MTRR编码的甲硫氨酸合成还原酶能够通过还原型 甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺 乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。较常见的人类MTRR 基因多态性66A - G，使蛋氨酸被异亮氨酸替代，酶活性显著降低，导致体内同型半胱氨酸 堆积。MTRR基因检测是叶酸利用能力评估的关键项目，其检测结果为个体化（差异化）增 补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学依据。
[0004] 目前进行MTRR基因多态性检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦 磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测MTRR基 因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的MTRR基因多态性检测是非 常有必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的MTRR基因多态性检测试 剂盒，以及其检测引物和检测体系。
[0006] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTRR基因多态性检测 引物包括针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因 c. 66位点为G情 况的正向引物、对应MTRR基因 c. 66位点的反向通用引物、检测β-actin基因的正向引物 和检测β -actin基因的反向引物；所述针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对MTRR基因 c. 66位点为G情况的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述对应MTRRc. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述检测β -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所 述检测β -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0007] 各引物在反应体系中的终浓度为0. 4 μ M。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 MTRR基因多态性检测试剂盒。
[0009] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTRR基因多态性检测 体系，包括用于检测MTRR基因 c. 66位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTRR基因 c. 66位点为G情况的PCR反应体系B，以及用于检测β -actin基因作为内对照的PCR反应 体系C ;所述PCR反应体系A包括针对MTRR基因 c. 66位点为A情况的正向引物、对应MTRR 基因 c. 66位点的反向通用引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系B包括 针对MTRR基因 c. 66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基因 c. 66位点的反向通用引物、 SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系C包括检测β -actin基因的正向引物、 检测β -actin基因的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述针对MTRR基因 c. 66 位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述针对MTRR基因 c. 66位 点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述对应MTRR c. 66位点的反 向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述检测β-actin基因的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0010] 各PCR反应体系的体积为10 μ 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5 μ 1，各 引物的终浓度为0. 4 μ Μ，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/ μ 1，其余为纯水。
[0011] 上述SYBR Green混合液是两倍浓度的SYBR Green混合液。本发明为解决上述技 术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测体系的MTRR基因多态性检测试剂盒。
[0012] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的结果判定方法，具体步骤如下：
[0013] 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的β-actin基因，
[0014] 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测；
[0015] 若样本扩增CT值在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断；
[0016] 第二步，采用PCR反应体系A和B分别检测该样本，
[0017] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两个CT差值的绝对值< 2 时，样本判断为杂合基因型；当两个CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两个CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0018] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,则结果判断为不可信， 重新制备样本进行检测。
[0019] 本发明具有积极的效果：
[0020] (1)本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒，首创将等位基因特异PCR结合SYBR Green的检测策略应用于检测人MTRR基因 c. 66位点的多态性，具有检测快速方便，灵敏度 高，准确率高的特点，应用范围极广。
[0021] (2)本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒的检测结果与测序-结果进行比对，基 因型符合率彡99%，分子分型准确度高。
[0022] (3)本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒突破了现有常规检测手费时费力且花 费不菲的应用局限，特别地，巧妙取代花费甚高且制备过程繁琐的传统荧光探针检测方法， 使成本极大降低，其操作和设计的简便性及对仪器的普适性，使之利于推广应用，从而使得 MTRR基因多态性检测在批量检测中有更广泛的应用领域，能更迅速地获得分子检测结果， 使得个性化医疗过程更为顺畅。
【附图说明】
[0023] 图1采用实施例1的试剂盒检测样本1的扩增曲线；
[0024] 图2采用实施例1的试剂盒检测样本2的扩增曲线；
[0025] 图3采用实施例1的试剂盒检测样本3的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0027] 实施例1
[0028] 一、试剂盒的组成。
[0029] 本实施例的MTRR基因多态性检测试剂盒包括用于检测MTRR基因的c. 66位点 为A情况的反应液A，用于检测MTRR基因的c. 66位点为G情况的反应液B，以及用于检测 β -actin基因作为内对照的反应液C。
[0030] 反应液A、B、C的配制如下：
[0031] 1、反应液A (MIX A)的配制。
[0032] 反应液A为检测MTRR基因 c. 66位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTRR基 因的c. 66位为A的情况，包括针对MTRR基因的c. 66位点为A情况的正向arm引物（Primer F A66G For A)、对应MTRR基因的c. 66位点的反向通用引物（Primer R A66G Rev Gen)、 SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0033] 具体组分请见表1。
[0034] 表1反应液A的组分
[0035]
[0036] 2、反应液B (MIX B)的配制。
[0037] 反应液B为检测MTRR基因 c. 66位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTRR基 因的c. 66位为G的情况，包括针对MTRR基因的c. 66位点为G情况的正向arm引物（Primer F A66G For G)、对应MTRR基因 c.66位点的反向通用引物（Primer R A66G Rev Gen)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0038] 具体组分请见表2。
[0039] 表2反应液B的组分
[0040]
[0041] 3、反应液C (MIX C)的配制
[0042] 反应液C包括检测β -actin基因的正向引物（Primer F β -actin)、检测 β-actin基因的反向引物（Primer R 0_actin)、SYBR Green混合液（2XSYBR GREEN Mix) 和纯水（H2O)。
[0043] 反应液C为检测β -actin基因的反应混合液，作为反应模板的内对照用，具体组 分请见表3。
[0044] 表3反应液C的组分
[0045]
[0046] SYBR Green混合液供应商：杭州博日科技有限公司，商品号：Cat#B254Cl。
[0047] 各引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物的核苷酸序列见表4。
[0048] 表4引物特征表
[0049]
[0050] 反应液A、B、C每批次按100个反应量配制好后，-20°C存放。 '
[0051] 二、试剂盒的使用方法。
[005 2] 本实施例的MTRR基因多态性检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0053] UDNA 提取。
[0054] 米用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取样本DNA，具 体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0055] 2、样本DNA质量检测。
[0056] 获得样本DNA后，通过测定浓度和0D260/0D280的比值控制样本质量，最终加入 反应体系中的样本，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间的可获得最优反应结果，浓度为 10 ~50ng/ μ 1 〇
[0057] 3、PCR 反应。
[0058] 1)配制PCR反应体系。
[0059] 基于反应液A、B和C分别配制PCR反应体系A、B和C，即取适量的反应液与DNA 模板进行混合，最后加入适量的纯水补足反应总体积。各PCR反应体系的组分见表5至表 ?。
[0060] 表5 PCR反应体系A的组分
[0061]
[0062] 表6 PCR反应体系B的组分
[0063]
[0065] 表7 PCR反应体系C的组分
[0066]
[0067] 2) PCR汉胆程厅。
[0068] 随后在实时焚光定量 PCR仪（Roche Light Cycler-Nano thermo cycler)上进行 实时荧光PCR反应程序，最优反应程序为如表6所示的Touch down PCR反应程序。
[0069] 表6 PCR反应程序表
[0070]
[0071] 其中，在"变性-退火-延伸"的前14个PCR循环程序中，第一个循环退火温度为 62度，第二个循环退火温度为61. 5度，后面的循环依次每次退火温度降低0. 5度。
[0072] 4、PCR检测结果判定。
[0073] 根据已知的实验样品（对照）制定的判读标准为：
[0074] 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的β-actin基因，若样本扩增CT值在23~ 25范围内，判断为样品有效；否则判断为样品无效，需重新制备样本，使样本浓度为10~ 50ng/ μ I，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0075] 第二步，采用两种多态性ARMS引物的PCR反应体系A和B分别检测同一个样本。
[0076] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则：
[0077] 1)当两种ARMS引物扩增的CT值很接近，CT差值（Λ CT的绝对值）< 2,样本判 断为杂合基因型；
[0078] 2)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型。
[0079] 3)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡2且< 3时，样本判断为 结果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0080] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之 间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0081] 三、应用示例。
[0082] 1、应用例。
[0083] 1)采用实施例1的试剂盒检测样本1，扩增曲线如图1所示，检测结果为MTRR Α66Α (以下简称MTRR AA)基因型。
[0084] 当检测的样本为MTRR AA基因型时，A等位基因型引物扩增CT值小于G等位基因 型引物扩增CT值（即A等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且G等位基因型引物 扩增CT值与A等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTRR AA基因型样本的扩增曲线，从左 往右依次是A等位基因型引物扩增所对应的扩增曲线、G等位基因型引物扩增所对应的扩 增曲线。
[0085] 2)采用实施例1的试剂盒检测样本2,扩增曲线如图2所示，检测结果为MTRR G66G (以下简称MTRR GG)基因型。
[0086] 当检测的样本为MTRR GG基因型时，G等位基因型引物扩增CT值小于A等位基因 型的引物扩增CT值（即G等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且A等位基因型引 物扩增CT值与G等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTRR GG基因型样本的扩增曲线，从 左往右依次是G等位基因型引物扩增所对应的扩增曲线、A等位基因型引物扩增所对应的 扩增曲线。
[0087] 3)采用实施例1的试剂盒检测样本3,扩增曲线如图3所示，检测结果为MTRR A66G (以下简称MTRR AG)基因型。
[0088] 当检测的样本为MTRR AG杂合型时，A等位基因型引物和G等位基因型引物扩增 的CT值接近，且A等位基因型引物扩增CT值与G等位基因型引物扩增CT值之差的绝对值 <2。杂合基因型样本的扩增曲线，两条扩增曲线分别对应为A等位基因型引物和G等位基 因型引物扩增所对应的扩增曲线。
[0089] 2、PCR结果验证。
[0090] 采用测序方法检测各样本的MTRR基因的突变位点，测序结果与采用本试剂盒的 检测结果完全一致。
[0091] 四、试剂盒特性
[0092] 灵敏度分析：采用本实施例1的试剂盒可检测低至IOng的人基因组DNA。
[0093] 重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过 0.2个循环。
[0094] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发 明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种MTRR基因多态性检测引物，其特征在于： 包括针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因c. 66位点为G情 况的正向引物、对应MTRR基因c. 66位点的反向通用引物、检测0-actin基因的正向引物 和检测0-actin基因的反向引物； 所述针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所 示； 所述针对MTRR基因c. 66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 示； 所述对应MTRR基因c. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示； 所述检测0 -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示。2. 根据权利要求1所述的MTRR基因多态性检测引物，其特征在于：各引物应用于PCR 反应体系中的终浓度为0. 4剛。3. -种采用如权利要求1所述的检测引物的MTRR基因多态性检测试剂盒。4. 一种MTRR基因多态性检测体系，其特征在于： 包括用于检测MTRR基因c. 66位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTRR基因c. 66位点为G情况的PCR反应体系B，以及用于检测0 -actin基因作为内对照的PCR反应 体系C; 所述PCR反应体系A包括针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物、对应MTRR基 因c. 66位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系B包括针对MTRR基因c. 66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基 因c. 66位点的反向通用引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系C包括检测0-actin基因的正向引物、检测0-actin基因的反向 引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述针对MTRR基因c. 66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所 示； 所述针对MTRR基因c. 66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 示； 所述对应MTRR基因c. 66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示； 所述检测0 -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示。5. 根据权利要求4所述的MTRR基因多态性检测体系，其特征在于：各PCR反应体系的 体积为10U1 ;其中，所述SYBRGreen混合液的体积是5W，各引物的终浓度为0. 4剛，所述 DNA模板的使用浓度为10~50ng/y1，其余为纯水。6. -种采用如权利要求4所述的检测体系的MTRR基因多态性检测试剂盒。7. -种采用如权利要求4所述的检测体系的结果判定方法，具体步骤如下： 第一步，采用PCR反应体系C检测样本的|3 -actin基因， 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测； 若样本扩增CT值在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断； 第二步，采用PCR反应体系A和B分别检测该样本， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2时，样 本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应的 等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制备 样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测。
【专利摘要】本发明涉及一种MTRR基因多态性检测引物以及采用该引物的检测体系和试剂盒，包括针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物、针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物、对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物、检测β-actin基因的正向引物和检测β-actin基因的反向引物；针对MTRR基因c.66位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对MTRR基因c.66位点为G情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；对应MTRR基因c.66位点的反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；检测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；检测β-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本发明的MTRR基因多态性检测试剂盒检测快速方便，灵敏度高，准确率高，成本低。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894241
【申请号】CN201510237229
【发明人】赵新泰, 王明, 张长顺
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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