Mthfr基因多态性检测引物体系及其试剂盒的制作方法
Mthfr基因多态性检测引物体系及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸 代谢系统中的关键酶，可以使5, 10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，从而作为甲 基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化，同时维持体内正常 的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因多态性可导致叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障 碍，从而导致多种遗传性疾病的发生，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生 儿缺陷如唐氏综合症（Down syndrome，DS)等最为严重。MTHFR基因检测是叶酸利用能力 评估的关键项目，其检测结果为个体化（差异化）增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学 依据。
[0003] 目前进行MTHFR基因多态性检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦 磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测MTHFR 基因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的MTHFR基因多态性检测是 非常有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的MTHFR基因多态性检测 试剂盒，以及其检测引物和检测体系。
[0005] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTHFR基因多态性检测 引物，包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点 为A情况的反向引物、针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物、对应 MTHFR基因 c. 677位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引 物、对应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反向引物、检测β -actin基因的正向引物和检 测β-actin基因的反向引物；所述针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述对应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述对应MTHFR基因 c. 677位点为C情况的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述对应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；所述检测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述检测β -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0006] 各引物应用于PCR反应体系中的终浓度为0. 4 μ M。
[0007] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 MTHFR基因多态性检测试剂盒。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTHFR基因多态性检测 体系包括用于检测MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的PCR反应体系Α，用于检测MTHFR基 因 c. 1298位点为C情况的PCR反应体系Β，用于检测MTHFR基因 c. 677位点为C情况的 PCR反应体系C，用于检测MTHFR基因 c. 677位点为T情况的PCR反应体系D，以及用于检 测β -actin基因作为内对照的PCR反应体系E ;所述PCR反应体系A包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系B包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的 正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模 板；所述PCR反应体系C包括针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物、对应MTHFR 基因 c. 677位点为C情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系 D包括针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 677位点为T 情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系E包括检测β -actin 基因的正向引物、检测β-actin基因的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述针 对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述对 应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述针 对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述对 应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述针 对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述对 应MTHFR基因 c. 677位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述针 对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述对 应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；所述检 测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述检测β-actin基因 的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0009] 各PCR反应体系的体积为10 μ 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5 μ 1，各 引物的终浓度为0. 4 μ Μ，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/ μ 1，其余为纯水。
[0010] 上述SYBR Green混合液是两倍浓度的SYBR Green混合液。
[0011] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的MTHFR基因多态性检测试剂盒。
[0012] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系的 结果判定方法，具体步骤如下：
[0013] 第一步，采用PCR反应体系E检测样本的β-actin基因，
[0014] 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测；
[0015] 若样本扩增CT值范围在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断；
[0016] 第二步，PCR反应体系A和B分别检测该样本的c. 1298位点情况，
[0017] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2 时，样本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0018] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，重新制备样本进行检测；
[0019] 第三步，PCR反应体系C和D分别检测该样本的c. 677位点情况，
[0020] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2 时， 样本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0021] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，重新制备样本进行检测。
[0022] 本发明具有积极的效果：
[0023] (1)本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒，首创将等位基因特异PCR结合SYBR Green的荧光检测策略应用于检测人MTHFR基因 c. 1298位点和c. 677位点的多态性，具有 检测快速方便，灵敏度高，准确率高的特点，应用范围极广。
[0024] (2)本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒的检测结果与测序结果进行比对，基 因型符合率彡99%，分子分型准确度高。
[0025] (3)本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒突破了现有常规检测手费时费力且花 费不菲的应用局限，特别地，巧妙取代花费甚高且制备过程繁琐的传统荧光探针检测方法， 使成本极大降低，其操作和设计的简便性及对仪器的普适性，使之利于推广应用，从而使得 MTHFR基因多态性检测在批量检测中有更广泛的应用领域，能更迅速地获得分子检测结果， 使得个性化医疗过程更为顺畅。
【附图说明】
[0026] 图1采用实施例1的试剂盒检测样本1的MTHFR基因 c. 1298位点的扩增曲线；
[0027] 图2采用实施例1的试剂盒检测样本2的MTHFR基因 c. 1298位点的扩增曲线；
[0028] 图3采用实施例1的试剂盒检测样本3的MTHFR基因 c. 1298位点的扩增曲线；
[0029] 图4采用实施例1的试剂盒检测样本4的MTHFR基因 c. 677位点的扩增曲线；
[0030] 图5采用实施例1的试剂盒检测样本5的MTHFR基因 C. 677位点的扩增曲线；
[0031] 图6采用实施例1的试剂盒检测样本6的MTHFR基因 c. 677位点的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0033] 实施例1
[0034] 一、试剂盒的组成。
[0035] 本实施例的MTHFR基因多态性检测试剂盒包括用于检测MTHFR基因 c. 1298位点 为A情况的反应液A，用于检测MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反应液B，用于检测MTHFR 基因 c. 677位点为C情况的反应液C，用于检测MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反应液 D，以及用于检测β -actin基因作为内对照的反应液E。
[0036] 反应液A、B、C、D、E的配制如下：
[0037] 1、反应液A (MIX A)的配制。
[0038] 反应液A为检测MTHFR基因 c. 1298位点的反应混合液，且所设计的引物针对 MTHFR基因 c. 1298位为A的情况，包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向arm引 物（Primer F A1298C For A)、对应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物（Primer R A1298C For A)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0039] 具体组分请见表1。
[0040] 表1反应液A的组分
[0041]
[0042] 2、反应液B (MIX B)的配制。
[0043] 反应液B为检测MTHFR基因 c. 1298位点的反应混合液，且所设计的引物针对 MTHFR基因 c. 1298位为C的情况，包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向arm引 物（Primer F A1298C For 〇、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的的反向引物（Primer R A1298C For C)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0044] 具体组分请见表2。
[0045] 表2反应液B的组分
[0046]
[0047] 3、反应液C (MIX C)的配制。
[0048] 反应液C为检测MTHFR基因 c. 677位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTHFR 基因 c. 677位为C的情况，包括针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向arm引物（Primer F C677T For 〇、对应MTHFR基因 c. 677位点为C情况的的反向引物（Primer R C677T For C)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O) 〇
[0049] 具体组分请见表3。
[0050] 表3反应液C的组分
[0051]
[0052] 4、反应液D (MIX D)的配制。
[0053] 反应液D为检测MTHFR基因 c. 677位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTHFR 基因 c. 677位为T的情况，包括针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向arm引物（Primer F C677T For T)、对应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的的反向引物（Primer R C677T For T)、SYBR Green 混合液（2XSYBR GREEN Mix)和纯水（H2O) 〇
[0054] 具体组分请见表4。
[0055] 表4反应液D的组分
[0058] 5、反应液E (MIX Ε)的配制
[0059] 反应液E包括检测β -actin基因的正向引物（Primer F|3 -actin)、检测β -actin 基因的反向引物（Primer R β-actin)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水 (H2O) 〇
[0060] 反应液E为检测β -actin基因的反应混合液，作为反应模板的内对照用，具体组 分请见表5。
[0061] 表5反应液E的组分
[0062]
[0063] SYBR Green混合液供应商：庄盟公司。
[0064] 各引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物的核苷酸序列见表6。
[0065] 表6引物特征表
[0066]
[0067] 反应液A、B、C、D、E每批次按100个反应量配制好后，_20°C存放。
[0068] 二、试剂盒的使用方法。
[0069] 本实施例的MTHFR基因多态性检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0070] UDNA 提取。
[0071] 米用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取样本DNA，具 体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0072] 2、样本DNA质量检测。
[0073] 获得样本DNA后，通过测定浓度和0D260/0D280的比值控制样本质量，最终加入 反应体系中的样本，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间的可获得最优反应结果，浓度为 10 ~50ng/ μ 1 〇
[0074] 3、PCR 反应。
[0075] 1)配制PCR反应体系，
[0076] 基于反应液A、B、C、D和E分别 配制PCR反应体系A、B、C、D和Ε，即取适量的反应 液与DNA模板进行混合，最后加入适量的纯水补足反应总体积。各PCR反应体系的组分见 表7至表11。
[0077] 表7 PCR反应体系A的组分
[0078]
[0079] 表8 PCR反应体系B的组分
[0080]
[0082] 表9 PCR反应体系C的组分
[0083]
[0084] 表10 PCR反应体系D的组分
[0085]
[0086] 表11 PCR反应体系E的组分
[0087]
[0088] 2) PCR反应程序：
[0089] 随后在实时焚光定量 PCR仪（Roche Light Cycler-Nano thermo cycler)上进行 实时荧光PCR反应程序，最优反应程序为如表12所示的Touch down PCR反应程序。
[0090] 表12 PCR反应程序表
[0091]
[0092] 其中，在"变性-退火-延伸"的前14个PCR循环程序中，第一个循环退火温度为 62度，第二个循环退火温度为61. 5度，后面的循环依次每次退火温度降低0. 5度。
[0093] 4、PCR检测结果判定：
[0094] 根据已知的实验样品（对照）制定的判读标准为：
[0095] 第一步，采用PCR反应体系E检测样本的β-actin基因，若样本扩增CT值在23~ 25范围内，判断为样品有效；否则判断为样品无效，需重新制备样本，使样本浓度为10~ 50ng/ μ I，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0096] 第二步，采用两种多态性ARMS引物的PCR反应体系A和B分别检测同一个样本的 MTHFR基因 c. 1298位点。
[0097] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则：
[0098] 1)当两种ARMS引物扩增的CT值很接近，且CT差值（Λ CT的绝对值）< 2,样本 判断为杂合基因型；
[0099] 2)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型。
[0100] 3)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡2且< 3时，样本判断为 结果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0101] 若两个反应体系扩增的扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结 果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0102] 第三步，采用两种多态性ARMS引物的PCR反应体系C和D分别检测同一个样本的 MTHFR基因 c. 677位点。
[0103] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则：
[0104] 1)当两种ARMS引物扩增的CT值很接近，且CT差值（Λ CT的绝对值）< 2,样本 判断为杂合基因型；
[0105] 2)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型。
[0106] 3)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡2且< 3时，样本判断为 结果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0107] 若两个反应体系扩增的扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结 果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/y 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0108] 三、应用示例。
[0109] 1、应用例。
[0110] A.检测样本的MTHFR基因的C. 1298位点。
[0111] 1)采用实施例1的试剂盒中反应液A和B检测样本1的MTHFR基因的c. 1298位 点时，扩增曲线如图1所示，检测结果为MTHFR A1298A(以下简称MTHFR AA)基因型。
[0112] 当检测的样本为MTHFR AA基因型时，A等位基因型引物扩增CT值小于C等位基 因型引物扩增CT值（即A等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且C等位基因型引 物扩增CT值与A等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR AA基因型样本的扩增曲线， 从左往右依次是A等位基因型引物扩增曲线、C等位基因型引物扩增曲线。
[0113] 2)采用实施例1的试剂盒中的反应液A和B检测样本2的MTHFR基因的c. 1298 位点时，扩增曲线如图2所示，检测结果为MTHFR C1298C(以下简称MTHFR CC)基因型。
[0114] 当检测的样本为MTHFR CC基因型时，C等位基因型引物扩增CT值小于A等位基 因型的引物扩增CT值（即C等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且A等位基因 型引物扩增CT值与C等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR CC基因型样本的扩增曲 线，从左往右依次是C等位基因型引物的扩增曲线、A等位基因型引物扩增曲线。
[0115] 3)采用实施例1的试剂盒中的反应液A和B检测样本3的MTHFR基因的c. 1298 位点时，扩增曲线如图3所示，检测结果为MTHFR A1298C(以下简称MTHFR AC)基因型。
[0116] 当检测的样本为MTHFR AC杂合型时，A等位基因型引物和C等位基因型引物扩增 的CT值接近，且A等位基因型引物扩增CT值与C等位基因型引物扩增CT值之差的绝对值 <2。杂合基因型样本的扩增曲线，两条扩增曲线分别对应为A等位基因型引物和C等位基 因型引物扩增曲线。
[0117] B.检测样本的MTHFR基因的c. 677位点。
[0118] 1)采用实施例1的试剂盒中反应液C和D检测样本4的MTHFR基因的c. 677位点 时，扩增曲线如图4所示，检测结果为MTHFR C677C(以下简称MTHFR CC)基因型。
[0119] 当检测的样本为MTHFR CC基因型时，C等位基因型引物扩增CT值小于T等位基 因型引物扩增CT值（即C等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且T等位基因型引 物扩增CT值与C等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR CC基因型样本的扩增曲线， 从左往右依次是C等位基因型引物扩增曲线、T等位基因型引物扩增曲线。
[0120] 2)采用实施例1的试剂盒中的反应液C和D检测样本5的MTHFR基因的c. 677位 点时，扩增曲线如图5所示，检测结果为MTHFR T677T(以下简称MTHFR TT)基因型。
[0121] 当检测的样本为MTHFR TT基因型时，T等位基因型引物扩增CT值小于C等位基 因型的引物扩增CT值（即T等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且C等位基因 型引物扩增CT值与T等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR TT基因型样本的扩增曲 线，从左往右依次是T等位基因型引物的扩增曲线、C等位基因型引物扩增曲线。
[0122] 3)采用实施例1的试剂盒中的反应液C和D检测样本6的MTHFR基因的c. 677位 点时，扩增曲线如图6所示，检测结果为MTHFR C677T(以下简称MTHFR CT)基因型。
[0123] 当检测的样本为MTHFR CT杂合型时，C等位基因型引物和T等位基因型引物扩增 的CT值接近，且C等位基因型引物扩增CT值与T等位基因型引物扩增CT值之差的绝对值 <2。杂合基因型样本的扩增曲线，两条扩增曲线分别对应为C等位基因型引物和T等位基 因型引物扩增曲线。
[0124] 2、PCR结果验证
[0125] 采用测序方法检测各样本的MTHFR基因的突变位点，测序结果与采用本试剂盒的 检测结果完全一致。[0126] 三、试剂盒特性
[0127] 灵敏度分析：采用本实施例1的试剂盒可检测低至IOng的人基因组DNA。
[0128] 重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过 0.2个循环。
[0129] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发 明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种MTHFR基因多态性检测引物，其特征在于： 包括针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 1298位点 为A情况的反向引物、针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物、对应 MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向 引物、对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物、检测0-actin基因的正向引物和 检测0-actin基因的反向引物； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4 所示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所 示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 7所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 8所 示； 所述检测0 -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 10所示。2. 根据权利要求1所述的MTHFR基因多态性检测引物，其特征在于：各引物应用于PCR 反应体系中的终浓度为0. 4剛。3. -种采用如权利要求1所述的检测引物的MTHFR基因多态性检测试剂盒。4. 一种MTHFR基因多态性检测体系，其特征在于： 包括用于检测MTHFR基因c. 1298位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTHFR基 因c. 1298位点为C情况的PCR反应体系B，用于检测MTHFR基因c. 677位点为C情况的 PCR反应体系C，用于检测MTHFR基因c. 677位点为T情况的PCR反应体系D，以及用于检测 0 -actin基因作为内对照的PCR反应体系E; 所述PCR反应体系A包括针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 1298位点为A情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系B包括针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 1298位点为C情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系C包括针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系D包括针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系E包括检测0-actin基因的正向引物、检测0-actin基因的反向 引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4 所示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所 示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 7所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 8所 示； 所述检测0-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 10所示。5. 根据权利要求4所述的MTHFR基因多态性检测体系，其特征在于：各PCR反应体系 的体积为10U1 ;其中，所述SYBRGreen混合液的体积是5W，各引物的终浓度为0. 4剛，所 述DNA模板的使用浓度为10~50ng/y1，其余为纯水。6. -种采用如权利要求4所述的检测体系的MTHFR基因多态性检测试剂盒。7. -种采用如权利要求4所述的检测体系的结果判定方法，具体步骤如下： 第一步，采用PCR反应体系E检测样本的|3-actin基因， 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测； 若样本扩增CT值范围在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断； 第二步，PCR反应体系A和B分别检测该样本的c. 1298位点情况， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2时，样 本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应的 等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制备 样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测； 第三步，PCR反应体系C和D分别检测该样本的c. 677位点情况， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2时，样 本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应的 等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制备 样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测。
【专利摘要】本发明涉及一种MTHFR基因多态性检测引物,包括针对MTHFR基因c.1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因c.1298位点为A情况的反向引物、针对MTHFR基因c.1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c.1298位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c.677位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c.677位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c.677位点为T情况的正向引物、对应MTHFR基因c.677位点为T情况的反向引物、检测β-actin基因的正向引物和检测β-actin基因的反向引物。本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒检测快速方便，灵敏度高，准确率高，成本低。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894242
【申请号】CN201510237230
【发明人】赵新泰, 王明, 张长顺
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸 代谢系统中的关键酶，可以使5, 10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，从而作为甲 基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化，同时维持体内正常 的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因多态性可导致叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障 碍，从而导致多种遗传性疾病的发生，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生 儿缺陷如唐氏综合症（Down syndrome，DS)等最为严重。MTHFR基因检测是叶酸利用能力 评估的关键项目，其检测结果为个体化（差异化）增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学 依据。
[0003] 目前进行MTHFR基因多态性检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦 磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测MTHFR 基因多态性的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的MTHFR基因多态性检测是 非常有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的MTHFR基因多态性检测 试剂盒，以及其检测引物和检测体系。
[0005] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTHFR基因多态性检测 引物，包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点 为A情况的反向引物、针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物、对应 MTHFR基因 c. 677位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引 物、对应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反向引物、检测β -actin基因的正向引物和检 测β-actin基因的反向引物；所述针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述对应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述对应MTHFR基因 c. 677位点为C情况的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述对应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；所述检测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述检测β -actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0006] 各引物应用于PCR反应体系中的终浓度为0. 4 μ M。
[0007] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测引物的 MTHFR基因多态性检测试剂盒。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种MTHFR基因多态性检测 体系包括用于检测MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的PCR反应体系Α，用于检测MTHFR基 因 c. 1298位点为C情况的PCR反应体系Β，用于检测MTHFR基因 c. 677位点为C情况的 PCR反应体系C，用于检测MTHFR基因 c. 677位点为T情况的PCR反应体系D，以及用于检 测β -actin基因作为内对照的PCR反应体系E ;所述PCR反应体系A包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系B包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的 正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模 板；所述PCR反应体系C包括针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物、对应MTHFR 基因 c. 677位点为C情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系 D包括针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 677位点为T 情况的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述PCR反应体系E包括检测β -actin 基因的正向引物、检测β-actin基因的反向引物、SYBR Green混合液和DNA模板；所述针 对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述对 应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述针 对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；所述对 应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述针 对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；所述对 应MTHFR基因 c. 677位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述针 对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；所述对 应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；所述检 测β-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；所述检测β-actin基因 的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0009] 各PCR反应体系的体积为10 μ 1 ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5 μ 1，各 引物的终浓度为0. 4 μ Μ，所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/ μ 1，其余为纯水。
[0010] 上述SYBR Green混合液是两倍浓度的SYBR Green混合液。
[0011] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系 的MTHFR基因多态性检测试剂盒。
[0012] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系的 结果判定方法，具体步骤如下：
[0013] 第一步，采用PCR反应体系E检测样本的β-actin基因，
[0014] 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测；
[0015] 若样本扩增CT值范围在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断；
[0016] 第二步，PCR反应体系A和B分别检测该样本的c. 1298位点情况，
[0017] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2 时，样本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0018] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，重新制备样本进行检测；
[0019] 第三步，PCR反应体系C和D分别检测该样本的c. 677位点情况，
[0020] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2 时， 样本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所 对应的等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测；
[0021] 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可 信，重新制备样本进行检测。
[0022] 本发明具有积极的效果：
[0023] (1)本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒，首创将等位基因特异PCR结合SYBR Green的荧光检测策略应用于检测人MTHFR基因 c. 1298位点和c. 677位点的多态性，具有 检测快速方便，灵敏度高，准确率高的特点，应用范围极广。
[0024] (2)本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒的检测结果与测序结果进行比对，基 因型符合率彡99%，分子分型准确度高。
[0025] (3)本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒突破了现有常规检测手费时费力且花 费不菲的应用局限，特别地，巧妙取代花费甚高且制备过程繁琐的传统荧光探针检测方法， 使成本极大降低，其操作和设计的简便性及对仪器的普适性，使之利于推广应用，从而使得 MTHFR基因多态性检测在批量检测中有更广泛的应用领域，能更迅速地获得分子检测结果， 使得个性化医疗过程更为顺畅。
【附图说明】
[0026] 图1采用实施例1的试剂盒检测样本1的MTHFR基因 c. 1298位点的扩增曲线；
[0027] 图2采用实施例1的试剂盒检测样本2的MTHFR基因 c. 1298位点的扩增曲线；
[0028] 图3采用实施例1的试剂盒检测样本3的MTHFR基因 c. 1298位点的扩增曲线；
[0029] 图4采用实施例1的试剂盒检测样本4的MTHFR基因 c. 677位点的扩增曲线；
[0030] 图5采用实施例1的试剂盒检测样本5的MTHFR基因 C. 677位点的扩增曲线；
[0031] 图6采用实施例1的试剂盒检测样本6的MTHFR基因 c. 677位点的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0033] 实施例1
[0034] 一、试剂盒的组成。
[0035] 本实施例的MTHFR基因多态性检测试剂盒包括用于检测MTHFR基因 c. 1298位点 为A情况的反应液A，用于检测MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反应液B，用于检测MTHFR 基因 c. 677位点为C情况的反应液C，用于检测MTHFR基因 c. 677位点为T情况的反应液 D，以及用于检测β -actin基因作为内对照的反应液E。
[0036] 反应液A、B、C、D、E的配制如下：
[0037] 1、反应液A (MIX A)的配制。
[0038] 反应液A为检测MTHFR基因 c. 1298位点的反应混合液，且所设计的引物针对 MTHFR基因 c. 1298位为A的情况，包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的正向arm引 物（Primer F A1298C For A)、对应MTHFR基因 c. 1298位点为A情况的反向引物（Primer R A1298C For A)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0039] 具体组分请见表1。
[0040] 表1反应液A的组分
[0041]
[0042] 2、反应液B (MIX B)的配制。
[0043] 反应液B为检测MTHFR基因 c. 1298位点的反应混合液，且所设计的引物针对 MTHFR基因 c. 1298位为C的情况，包括针对MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的正向arm引 物（Primer F A1298C For 〇、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的的反向引物（Primer R A1298C For C)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O)。
[0044] 具体组分请见表2。
[0045] 表2反应液B的组分
[0046]
[0047] 3、反应液C (MIX C)的配制。
[0048] 反应液C为检测MTHFR基因 c. 677位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTHFR 基因 c. 677位为C的情况，包括针对MTHFR基因 c. 677位点为C情况的正向arm引物（Primer F C677T For 〇、对应MTHFR基因 c. 677位点为C情况的的反向引物（Primer R C677T For C)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水（H2O) 〇
[0049] 具体组分请见表3。
[0050] 表3反应液C的组分
[0051]
[0052] 4、反应液D (MIX D)的配制。
[0053] 反应液D为检测MTHFR基因 c. 677位点的反应混合液，且所设计的引物针对MTHFR 基因 c. 677位为T的情况，包括针对MTHFR基因 c. 677位点为T情况的正向arm引物（Primer F C677T For T)、对应MTHFR基因 c. 677位点为T情况的的反向引物（Primer R C677T For T)、SYBR Green 混合液（2XSYBR GREEN Mix)和纯水（H2O) 〇
[0054] 具体组分请见表4。
[0055] 表4反应液D的组分
[0058] 5、反应液E (MIX Ε)的配制
[0059] 反应液E包括检测β -actin基因的正向引物（Primer F|3 -actin)、检测β -actin 基因的反向引物（Primer R β-actin)、SYBR Green 混合液（2 X SYBR GREEN Mix)和纯水 (H2O) 〇
[0060] 反应液E为检测β -actin基因的反应混合液，作为反应模板的内对照用，具体组 分请见表5。
[0061] 表5反应液E的组分
[0062]
[0063] SYBR Green混合液供应商：庄盟公司。
[0064] 各引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物的核苷酸序列见表6。
[0065] 表6引物特征表
[0066]
[0067] 反应液A、B、C、D、E每批次按100个反应量配制好后，_20°C存放。
[0068] 二、试剂盒的使用方法。
[0069] 本实施例的MTHFR基因多态性检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0070] UDNA 提取。
[0071] 米用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取样本DNA，具 体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0072] 2、样本DNA质量检测。
[0073] 获得样本DNA后，通过测定浓度和0D260/0D280的比值控制样本质量，最终加入 反应体系中的样本，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间的可获得最优反应结果，浓度为 10 ~50ng/ μ 1 〇
[0074] 3、PCR 反应。
[0075] 1)配制PCR反应体系，
[0076] 基于反应液A、B、C、D和E分别 配制PCR反应体系A、B、C、D和Ε，即取适量的反应 液与DNA模板进行混合，最后加入适量的纯水补足反应总体积。各PCR反应体系的组分见 表7至表11。
[0077] 表7 PCR反应体系A的组分
[0078]
[0079] 表8 PCR反应体系B的组分
[0080]
[0082] 表9 PCR反应体系C的组分
[0083]
[0084] 表10 PCR反应体系D的组分
[0085]
[0086] 表11 PCR反应体系E的组分
[0087]
[0088] 2) PCR反应程序：
[0089] 随后在实时焚光定量 PCR仪（Roche Light Cycler-Nano thermo cycler)上进行 实时荧光PCR反应程序，最优反应程序为如表12所示的Touch down PCR反应程序。
[0090] 表12 PCR反应程序表
[0091]
[0092] 其中，在"变性-退火-延伸"的前14个PCR循环程序中，第一个循环退火温度为 62度，第二个循环退火温度为61. 5度，后面的循环依次每次退火温度降低0. 5度。
[0093] 4、PCR检测结果判定：
[0094] 根据已知的实验样品（对照）制定的判读标准为：
[0095] 第一步，采用PCR反应体系E检测样本的β-actin基因，若样本扩增CT值在23~ 25范围内，判断为样品有效；否则判断为样品无效，需重新制备样本，使样本浓度为10~ 50ng/ μ I，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0096] 第二步，采用两种多态性ARMS引物的PCR反应体系A和B分别检测同一个样本的 MTHFR基因 c. 1298位点。
[0097] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则：
[0098] 1)当两种ARMS引物扩增的CT值很接近，且CT差值（Λ CT的绝对值）< 2,样本 判断为杂合基因型；
[0099] 2)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型。
[0100] 3)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡2且< 3时，样本判断为 结果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0101] 若两个反应体系扩增的扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结 果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0102] 第三步，采用两种多态性ARMS引物的PCR反应体系C和D分别检测同一个样本的 MTHFR基因 c. 677位点。
[0103] 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，则：
[0104] 1)当两种ARMS引物扩增的CT值很接近，且CT差值（Λ CT的绝对值）< 2,样本 判断为杂合基因型；
[0105] 2)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡3时，样本判断为CT值小 的一方所对应的等位基因纯合型。
[0106] 3)当两种ARMS引物扩增CT差值（Λ CT的绝对值）彡2且< 3时，样本判断为 结果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/ μ 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0107] 若两个反应体系扩增的扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结 果不可信，需重新制备样本，使样本浓度为10~50ng/y 1，0D260/0D280的比值在1. 8~ 2. 0之间，再重新用该试剂盒进行检测。
[0108] 三、应用示例。
[0109] 1、应用例。
[0110] A.检测样本的MTHFR基因的C. 1298位点。
[0111] 1)采用实施例1的试剂盒中反应液A和B检测样本1的MTHFR基因的c. 1298位 点时，扩增曲线如图1所示，检测结果为MTHFR A1298A(以下简称MTHFR AA)基因型。
[0112] 当检测的样本为MTHFR AA基因型时，A等位基因型引物扩增CT值小于C等位基 因型引物扩增CT值（即A等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且C等位基因型引 物扩增CT值与A等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR AA基因型样本的扩增曲线， 从左往右依次是A等位基因型引物扩增曲线、C等位基因型引物扩增曲线。
[0113] 2)采用实施例1的试剂盒中的反应液A和B检测样本2的MTHFR基因的c. 1298 位点时，扩增曲线如图2所示，检测结果为MTHFR C1298C(以下简称MTHFR CC)基因型。
[0114] 当检测的样本为MTHFR CC基因型时，C等位基因型引物扩增CT值小于A等位基 因型的引物扩增CT值（即C等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且A等位基因 型引物扩增CT值与C等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR CC基因型样本的扩增曲 线，从左往右依次是C等位基因型引物的扩增曲线、A等位基因型引物扩增曲线。
[0115] 3)采用实施例1的试剂盒中的反应液A和B检测样本3的MTHFR基因的c. 1298 位点时，扩增曲线如图3所示，检测结果为MTHFR A1298C(以下简称MTHFR AC)基因型。
[0116] 当检测的样本为MTHFR AC杂合型时，A等位基因型引物和C等位基因型引物扩增 的CT值接近，且A等位基因型引物扩增CT值与C等位基因型引物扩增CT值之差的绝对值 <2。杂合基因型样本的扩增曲线，两条扩增曲线分别对应为A等位基因型引物和C等位基 因型引物扩增曲线。
[0117] B.检测样本的MTHFR基因的c. 677位点。
[0118] 1)采用实施例1的试剂盒中反应液C和D检测样本4的MTHFR基因的c. 677位点 时，扩增曲线如图4所示，检测结果为MTHFR C677C(以下简称MTHFR CC)基因型。
[0119] 当检测的样本为MTHFR CC基因型时，C等位基因型引物扩增CT值小于T等位基 因型引物扩增CT值（即C等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且T等位基因型引 物扩增CT值与C等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR CC基因型样本的扩增曲线， 从左往右依次是C等位基因型引物扩增曲线、T等位基因型引物扩增曲线。
[0120] 2)采用实施例1的试剂盒中的反应液C和D检测样本5的MTHFR基因的c. 677位 点时，扩增曲线如图5所示，检测结果为MTHFR T677T(以下简称MTHFR TT)基因型。
[0121] 当检测的样本为MTHFR TT基因型时，T等位基因型引物扩增CT值小于C等位基 因型的引物扩增CT值（即T等位基因型引物扩增所对应的CT曲线靠左），且C等位基因 型引物扩增CT值与T等位基因型引物扩增CT值之差彡3。MTHFR TT基因型样本的扩增曲 线，从左往右依次是T等位基因型引物的扩增曲线、C等位基因型引物扩增曲线。
[0122] 3)采用实施例1的试剂盒中的反应液C和D检测样本6的MTHFR基因的c. 677位 点时，扩增曲线如图6所示，检测结果为MTHFR C677T(以下简称MTHFR CT)基因型。
[0123] 当检测的样本为MTHFR CT杂合型时，C等位基因型引物和T等位基因型引物扩增 的CT值接近，且C等位基因型引物扩增CT值与T等位基因型引物扩增CT值之差的绝对值 <2。杂合基因型样本的扩增曲线，两条扩增曲线分别对应为C等位基因型引物和T等位基 因型引物扩增曲线。
[0124] 2、PCR结果验证
[0125] 采用测序方法检测各样本的MTHFR基因的突变位点，测序结果与采用本试剂盒的 检测结果完全一致。[0126] 三、试剂盒特性
[0127] 灵敏度分析：采用本实施例1的试剂盒可检测低至IOng的人基因组DNA。
[0128] 重复性分析：上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过 0.2个循环。
[0129] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发 明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种MTHFR基因多态性检测引物，其特征在于： 包括针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 1298位点 为A情况的反向引物、针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因 c. 1298位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物、对应 MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向 引物、对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物、检测0-actin基因的正向引物和 检测0-actin基因的反向引物； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4 所示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所 示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 7所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 8所 示； 所述检测0 -actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 10所示。2. 根据权利要求1所述的MTHFR基因多态性检测引物，其特征在于：各引物应用于PCR 反应体系中的终浓度为0. 4剛。3. -种采用如权利要求1所述的检测引物的MTHFR基因多态性检测试剂盒。4. 一种MTHFR基因多态性检测体系，其特征在于： 包括用于检测MTHFR基因c. 1298位点为A情况的PCR反应体系A，用于检测MTHFR基 因c. 1298位点为C情况的PCR反应体系B，用于检测MTHFR基因c. 677位点为C情况的 PCR反应体系C，用于检测MTHFR基因c. 677位点为T情况的PCR反应体系D，以及用于检测 0 -actin基因作为内对照的PCR反应体系E; 所述PCR反应体系A包括针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 1298位点为A情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系B包括针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 1298位点为C情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系C包括针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系D包括针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向引物、对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述PCR反应体系E包括检测0-actin基因的正向引物、检测0-actin基因的反向 引物、SYBRGreen混合液和DNA模板； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为A情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为A情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示； 所述针对MTHFR基因c. 1298位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 3 所示； 所述对应MTHFR基因c. 1298位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 4 所示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为C情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为C情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所 示； 所述针对MTHFR基因c. 677位点为T情况的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 7所 示； 所述对应MTHFR基因c. 677位点为T情况的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 8所 示； 所述检测0-actin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 9所示； 所述检测0-actin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo. 10所示。5. 根据权利要求4所述的MTHFR基因多态性检测体系，其特征在于：各PCR反应体系 的体积为10U1 ;其中，所述SYBRGreen混合液的体积是5W，各引物的终浓度为0. 4剛，所 述DNA模板的使用浓度为10~50ng/y1，其余为纯水。6. -种采用如权利要求4所述的检测体系的MTHFR基因多态性检测试剂盒。7. -种采用如权利要求4所述的检测体系的结果判定方法，具体步骤如下： 第一步，采用PCR反应体系E检测样本的|3-actin基因， 若样本扩增CT值小于23或大于25,判断为样品无效，重新制备样本进行检测； 若样本扩增CT值范围在23~25范围内，判断为样品有效，进行下一步判断； 第二步，PCR反应体系A和B分别检测该样本的c. 1298位点情况， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2时，样 本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应的 等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制备 样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测； 第三步，PCR反应体系C和D分别检测该样本的c. 677位点情况， 若两个反应体系扩增的CT值都在20~30范围内，当两者CT差值的绝对值< 2时，样 本判断为杂合基因型；当两者CT差值的绝对值多3时，样本判断为CT值小的一方所对应的 等位基因纯合型；当两者CT差值的绝对值多2且< 3时，样本判断为结果不可信，重新制备 样本进行检测； 若两个反应体系扩增的CT值中至少一个小于20或大于30,样本判断为结果不可信，重 新制备样本进行检测。
【专利摘要】本发明涉及一种MTHFR基因多态性检测引物,包括针对MTHFR基因c.1298位点为A情况的正向引物、对应MTHFR基因c.1298位点为A情况的反向引物、针对MTHFR基因c.1298位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c.1298位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c.677位点为C情况的正向引物、对应MTHFR基因c.677位点为C情况的反向引物、针对MTHFR基因c.677位点为T情况的正向引物、对应MTHFR基因c.677位点为T情况的反向引物、检测β-actin基因的正向引物和检测β-actin基因的反向引物。本发明的MTHFR基因多态性检测试剂盒检测快速方便，灵敏度高，准确率高，成本低。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104894242
【申请号】CN201510237230
【发明人】赵新泰, 王明, 张长顺
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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