用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用
用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤诊治技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探 针、装置及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上使其对其生 长的正常的调控，导致克隆性异常增生。肿瘤临床上可分为实体瘤和非实体瘤，实体瘤及有 形瘤可通过临床检查如CT扫描，B超等影像学方法或触诊扪及到的有形肿块。非实体瘤如 血液病中的白血病就无法通过触诊或常规影像学方法直接诊断。肿瘤不仅生长失控，细胞 还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，严重 威胁人类健康。90%以上的癌症相关死亡都是与肿瘤的转移相关的。肿瘤细胞的检测，尤其 是从原生肿瘤组织上脱落下来进入人体外周血液及组织中的循环肿瘤细胞，对于癌症的早 期诊断、治疗效果的评估有极其重要的意义。循环肿瘤细胞是癌症转移及复发的主要原因 之一。在过去的几十年间，人们开发了很多种用以检测肿瘤细胞的方法，如：荧光免疫法、 磁性免疫法等。其中Veridex公司的CellSearch循环肿瘤细胞检测装置是我国食品药品 监督管理局（SFDA)唯一批准使用的循环肿瘤细胞检测装置。然而，这些技术所需的仪器昂 贵，且无法实现肿瘤细胞的示踪及杀伤。
[0003] 核酸适配体（aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术（SELEX)筛选得到 的，能特异结合祀物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA)。核酸适体具有类似抗体对革巴标 高特异性和高亲和力的特点，且在许多方面优于抗体，如：分子量小、无免疫原性、靶标种 类丰富（包括离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质、完整的肿瘤细胞甚至组织等）、合成方法 简单且重复性好、修饰灵活以及便于长期贮存和常温运输等等。这些特性使得核酸适体作 为肿瘤诊断探针得到了广泛的关注和认可，因此基于核酸适体正逐渐成为一种可用于为肿 瘤分型、诊断和治疗的工具。
[0004] 在目前常规的肿瘤细胞，尤其是循环肿瘤细胞及非实体瘤细胞的检测方法，存在 操作复杂，耗时长，成本高等问题。核酸适配体探针可提供一种低成本、操作方便的肿瘤细 胞诊断探针。并且由于核酸适配体易修饰的特性，不仅可以对肿瘤细胞进行诊断，还可实现 肿瘤细胞的追踪与杀伤。针对现阶段的肿瘤治疗方法，大多需要药物在血液中达到较高的 浓度才能起到治疗的作用。如果将药物固定在一个装置内，通过肿瘤细胞的刺激使药物释 放，有望用于抑制肿瘤的转移，并降低药物使用总量，缓解大剂量使用抗肿瘤药物而引发的 副作用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种仪器要求低、普适性 强、成本低、操作简单易于推广的核酸适配体探针及装置，可应用于肿瘤细胞的检测、示踪 和杀伤。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方法是： 一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针，包括固定探针和可与肿瘤细胞结合的识别 探针；所述固定探针与所述识别探针部分杂交互补。
[0007] 上述的核酸适配体探针，优选的，所述固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；所述识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列。
[0008] 上述的核酸适配体探针，优选的，所述识别探针修饰有荧光基团、药物、光敏剂或 医学造影剂，所述固定探针修饰有生物素。
[0009] 上述的核酸适配体探针，优选的，所述荧光基团为荧光素、罗丹明、Alexa488、 Atto550、Atto647、Cy3、Cy5和Cy5. 5中的一种或多种；药物为焦脱镁叶绿酸-a、尿嘧啶、阿 霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗中的一种或多种； 所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸_a、卟啉、亚甲基蓝、二氢卟吩e6、维替泊芬、5-氨基酮戊酸、替 莫泊芬、他拉泊芬、酞菁和藻胆蛋白中的一种或多种；所述医学造影剂为焦脱镁叶绿酸_a、 卟啉、碘苯酯、碘苯六醇、钆-卟啉复合物和 64Cu-卟啉复合物中的一种或多种。
[0010] 优选的，荧光素为FAM和/或FITC。
[0011] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了一种用于肿瘤细胞检测的装置， 包括上述的核酸适配体探针和载体，所述核酸适配体探针的固定探针通过共价或非共价交 联于所述载体表面。
[0012] 上述的装置，优选的，所述载体为磁颗粒、微流控芯片、血管支架或人造血管。
[0013] 上述的装置，优选的，所述磁颗粒为表面包被链霉亲和素的磁颗粒。
[0014] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了上述的核酸适配体探针或装置 在肿瘤细胞检测中的应用。
[0015] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了上述的核酸适配体探针或装置 在肿瘤细胞示踪中的应用。
[0016] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了上述的核酸适配体探针或装置 在制备治疗肿瘤药物、制备杀伤肿瘤装置中的应用。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，具有仪器要求低、普 适性强、成本低、操作简单易于推广的优点。
[0018] (2)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，在没有肿瘤细 胞的刺激作用下，固定探针与识别探针杂交，识别探针处于关闭的状态；当肿瘤细胞刺激 时，识别探针被激活，释放结合于肿瘤细胞的表面。避免了现有基于单一核酸适体的检测方 法中，为克服非特异性吸附信号而进行的繁琐的洗涤过程，缩短了检测时间。同时可拓展应 用于肿瘤细胞的追踪与杀伤。
[0019] (3)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，固定核酸适配 体探针装置可以根据需求采用纳米及微米颗粒、微流控芯片、人造血管及血管支架等装置， 从而进一步拓宽了肿瘤细胞刺激核酸探针释放的装置在肿瘤诊治方面的应用。
[0020] (4)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，提供了一种全 新的非实体瘤细胞的示踪与杀伤策略。通过将识别探针携带的造影剂、药物固定于装置的 方法，避免将造影剂、药物直接注射进入循环系统。此方法通过肿瘤细胞激活识别探针，可 以在较低的造影剂、药物总量的情况下，实现非实体瘤细胞的追踪与杀伤，从而降低大剂量 摄入造影剂、药物所引发的副作用。
【附图说明】
[0021] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0022] 图1为本发明实施例1的核酸适配体探针及装置结构示意图。
[0023] 图2为本发明实施例1的核酸适配体探针固定于磁颗粒上时，用于肿瘤细胞检测 的示意图。
[0024] 图3为本发明实施例1的核酸适配体探针及装置在检测人急性淋巴细胞白血病T 淋巴细胞（CCRF-CEM)的实验结果图。
[0025] 图4为本发明实施例1的核酸适配体探针及装置在检测人B淋巴细胞瘤细胞 (Ramos)对照实验结果图。
[0026] 图5为本发明实施例2的核酸适配体探针及装置在检测人肝癌细胞（SMMC-7721) 的实验结果图。
[0027] 图6为本发明实施例2的核酸适配体探针及装置在检测人肝癌细胞（BEL-7404)的 对照实验结果图。
[0028] 图7为本发明实施例3的核酸适配体探针及装置用于肿瘤细胞示踪的原理图。
[0029] 图8为本发明实施例3的核酸适配体探针及装置在用于人肝癌细胞（SMMC-7721) 的示踪的实验结果图。
[0030] 图9为本发明实施例4的核酸适配体探针及装置用于肿瘤细胞杀伤的原理图。
[0031] 图10为本发明实施例4的核酸适配体探针及装置在用于人肝癌细胞（SMMC-7721) 的杀伤的实验结果图。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。 实施例
[0033] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中芯片SU-8阳膜为大连化物所 加工的蛇形微流控芯片阳膜；sygard 184固化剂购于美国道康宁公司。[0034] 实施例1 参见图1 :本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适体探针和载体，其中核 酸适配体探针包括固定探针、识别探针，固定探针3'端修饰有生物素、5'端修饰有淬灭基团 BHQ1，识别探针3'端修饰有荧光基团FAM ;载体为包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒。
[0035] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-CEM :5' -BHQl-TCT AAC CGT ATT TTT TTT TT -biotin-3'。
[0036] 识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列；具体为： 识别探针-CEM :5' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-FAM-3'。
[0037] 固定探针-CEM的TCT AAC CGT A片段与识别探针-CEM中的TA CGG TTA GA片段 杂交互补连接。其中核酸适配体探针中固定探针末端修饰的生物素与超顺磁磁颗粒上的链 霉亲和素特异性作用，使固定探针固定在超顺磁磁颗粒表面。
[0038] 参照图2 :将用于肿瘤细胞检测的装置检测肿瘤细胞，当待测物中不存在目标肿 瘤细胞时，识别探针处理关闭状态；当待测物中存在目标肿瘤细胞时，目标肿瘤细胞与识别 探针结合，形成发夹结构，并与固定探针脱离。然后利用磁分离其对磁颗粒进行分离，利用 识别探针修饰的荧光基团对肿瘤细胞进行检测。
[0039] 一种实施例1的用于肿瘤细胞检测的装置在人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞 (CCRF-CEM)检测中的应用，采用人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞（CCRF-CEM)作为目标细 胞，以本发明实施例1所提供的装置进行检测。本实施例为避免假阳性信号的干扰，在固定 定探针5'端修饰了淬灭基团BHQ1。同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的 序列作为对照探针，用于分辨阳性信号。
[0040] 对照探针的的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列；具体为： 对照探针-CEM :5' -TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA CGG TTA GA-FAM-3'。
[0041] 其应用方法具体包括以下步骤： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' S PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0042] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4. 5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0043] 包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒：将浓度为10 mg/mL的链霉亲和素包被磁颗粒 得到包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒(本申请中包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒为市售商 品，购于 Invitrogen，规格为 Dynabeads MyOne Streptavidin CL )〇
[0044] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为I. 5 mM固定探针-CEM与终浓度为1. 0 mM 识别探针-CEM，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本 实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0045] (3 )制备对照探针：将终浓度为1. 5 mM固定探针-CEM与终浓度为1. 0 mM对照探 针-CEM，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本实施例 所需的阴性对照探针。
[0046] (4)取30 mL包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒，用杂交缓冲溶液洗涤三次，然后等 分成六份。取其中的三份包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒分别与50 mL的阳性核酸适配体 探针在室温下进行孵育(孵育缓冲溶液为杂交缓冲溶液)。孵育1小时后，通过磁分离吸去 上清，剩下的磁颗粒再用杂交缓冲溶液清洗三次，得到用于肿瘤细胞检测的装置。三份阴性 对照探针处理方法同阳性核酸适配体探针。
[0047] (5)将CCRF-CEM细胞分散于200 mL的结合缓冲液中，使CCRF-CEM细胞浓度为IO6 个/mL，然后加入到三份用于肿瘤细胞检测的装置的溶液中，分别在4°C，20°C，37°C条件下 孵育30分钟。孵育完成后，磁分离5分钟，吸取细胞上清液，沉淀再加入200 mL结合缓冲 溶液洗涤磁珠一次，再次磁分离5分钟，吸取上清液并与上一次的细胞上清液合并，用于流 式细胞仪的检测。
[0048] 检测结果如图3所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针都可以在肿瘤细胞的刺 激下与细胞结合，且与对照探针结合情况有所差异。因此，本实施例中用于肿瘤细胞检测的 装置可以在不同温度下，对目标细胞CCRF-CEM进行检测。
[0049] 实施例1仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针3'端修饰的荧光基团 还可以替换为荧光素、罗丹明、Alexa488、Atto550、Atto647、Cy3、Cy5或Cy5. 5中的一种或 多种，并达到相同或相似的技术效果。
[0050] 对比例1 一种实施例1的用于肿瘤细胞检测的装置在人B淋巴细胞瘤细胞（Ramos)检测中的应 用，采用人B淋巴细胞瘤细胞（Ramos)作为目标细胞，以本发明实施例1所提供的核酸适配 体探针进行检测。检测方法与实施例1相同。
[0051] 检测结果如图4所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针与对照肿瘤细胞结合并 无差异，说明两种探针均未与对照肿瘤细胞结合。
[0052] 实施例2 本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适配体探针和载体，其中核酸适配 体探针包括固定探针和识别探针，固定探针3'端修饰有生物素，识别探针5'端修饰有荧光 基团FAM ;载体为包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒。
[0053] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-7721 :5' -CGC GCG CTT TTT TTT TTT -biotin-3'。
[0054] 识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；具体为： 识别探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GCG CGC ATA GCG CGC TGA GCT GAA GAT CGT ACC GTG AGC GCG CT-3'。
[0055] 固定探针的CGC GCG CTT T片段与识别探针中的AAA GCG CGC G片段杂交互补连 接，固定探针末端修饰的生物素与载体上的链霉亲和素特异性作用，使固定探针固定在超 顺磁磁颗粒表面。
[0056] 当待测物中不存在目标肿瘤细胞时，识别探针处理关闭状态；当待测物中存在目 标肿瘤细胞时，目标肿瘤细胞与识别探针结合，形成发夹结构，并与固定探针脱离。然后利 用磁分离其对磁颗粒进行分离，利用识别探针修饰的荧光基团FAM对肿瘤细胞进行检测。
[0057] 同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的序列作为对照探针，用于 分辨阳性信号。
[0058] 对照探针的的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列；具体为： 对照探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT ΤΤΤ τττ TTT TTT TT-3\
[0059] -种实施例2的用于肿瘤细胞检测的装置在人肝癌细胞（SMMC-7721))检测中的 应用，具体的应用方法为： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0060] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4.5g/L葡萄糖， O.lmg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0061] 包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒：将浓度为10 mg/mL的链霉亲和素包被磁颗粒 得到包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒(本申请中包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒为市售商 品，购于 Invitrogen,规格为 Dynabeads MyOne Streptavidin CL )〇
[0062] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为I. 5 mM固定探针-7721与终浓度为1.0 mM 识别探针-7721 ，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为 本实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0063] (3)制备对照探针：将终浓度为I. 5 mM固定探针-7721与终浓度为1.0 mM对照 探针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本实 施例所需的阴性对照探针。
[0064] (4)取30 mL包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒，用杂交缓冲溶液洗涤三次，然后等 分成六份。取其中的三份包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒分别与50 mL的阳性核酸适配体 探针在室温下进行孵育(孵育缓冲溶液为杂交缓冲溶液)。孵育1小时后，通过磁分离吸去 上清，剩下的磁颗粒再用杂交缓冲溶液清洗三次，得到用于肿瘤细胞检测的装置。三份阴性 对照探针处理方法同阳性核酸适配体探针。
[0065] (5)将传代24小时以上，处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用细胞消化液消 化，用结合缓冲溶液洗涤，分散为浓度为IO 6个/mL的SMMC-7721细胞分散液。取200 mL SMMC-7721细胞分散液分别加入到每份用于肿瘤细胞检测的装置中，分别在4°C，20 °C， 37 °C条件下孵育30分钟。孵育完成后，磁分离5分钟，吸取细胞上清液，沉淀再加入200 mL 结合缓冲溶液洗涤磁珠一次，再次磁分离5分钟，吸取上清液并与上一次的细胞上清液合 并，用于流式细胞仪的检测。
[0066] 检测结果如图5所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针都可以在肿瘤细胞的刺 激下与细胞结合，且与对照探针结合情况有所差异。因此，本实施例中用于肿瘤细胞检测的 装置可以在不同温度下，对目标细胞SMMC-7721进行检测。
[0067] 实施例2仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针5'端修饰的荧光基团 还可以替换为荧光素、罗丹明、Alexa488、Atto550、Atto647、Cy3、Cy5或Cy5. 5中的一种或 多种，并达到相同或相似的技术效果。
[0068] 对比例2 一种实施例2的用于肿瘤细胞检测的装置在人肝癌细胞（BEL-7404)检测中的应用，采 用人肝癌细胞（BEL-7404)作为目标细胞，以本发明实施例2所提供的装置进行检测。检测 方法与实施例2相同。
[0069] 检测结果如图6所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针与对照肿瘤细胞结合并 无差异，说明两种探针均未与对照肿瘤细胞结合。
[0070] 实施例3 参见图7 :本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适配体探针和载体，其中 核酸适配体探针包括固定探针和识别探针，固定探针3'端修饰有生物素，识别探针携带有 医学造影剂；载体为微流控芯片(载体还可以是人造血管、血管支架等其他微通道)。本实施 例采用的医学造影剂为焦脱镁叶绿酸-a，微流控芯片为PDMS聚合物与玻璃键合的微流控 芯片。
[0071] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-7721 :5' -CGC GCG CTT TTT TTT TTT -biotin-3'。
[0072] 识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；具体为： 识别探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GCG CGC ATA GCG CGC TGA GCT GAA GAT CGT ACC GTG AGC GCG CT-3'。
[0073] 固定探针的CGC GCG CTT T片段与识别探针中的AAA GCG CGC G片段杂交互补连 接，固定探针末端修饰的生物素与载体上的亲和素作用，使固定探针固定在微流控芯片表 面。
[0074] 目标肿瘤细胞流入通道时，目标肿瘤细胞与识别探针结合，识别探针不再继续被 固定探针固定；目标细胞流出通道时，可通过识别探针携带医学造影剂，用于肿瘤细胞的追 踪。此装置可作为体外肿瘤细胞检测装置及体内肿瘤细胞追踪装置。
[0075] 同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的序列作为对照探针，用于 分辨阳性信号。
[0076] 对照探针的的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列；具体为： 对照探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT ΤΤΤ τττ TTT TTT TT-3\
[0077] -种实施例3的核酸适配体探针在人肝癌细胞（SMMC-7721)示踪中的应用，具体 的应用方法为： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0078] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4. 5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0079] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为60 mM固定探针-7721与终浓度为40 mM识 别探针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本 实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0080] (3)制备对照探针：将终浓度为60 mM固定探针-7721与终浓度为40 mM对照探 针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本实施 例所需的阴性对照探针。
[0081] (4)制备微流控芯片：将PDMS前聚体与sygard 184固化剂(美国道康宁公司）按 10 : 1比例混合，搅拌混匀后，置于真空箱内脱除气泡，然后在SU-8阳模板上浇注，厚度控 制6 mm。然后置于80°C烘箱固化约2小时后，小心地将PDMS基片从模板上剥离，在微通 道两端进样口和出样口部位用冲压打孔器做成直径为2 mm的小孔。将50mmX30mm的玻 璃基片用去离子水冲洗并在氮气中干燥。最后，PDMS芯片和洁净的玻璃基片直接进行可逆 贴合。
[0082] (5)制备阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片：以杂交缓冲溶液配制的浓度为1 mg/mL的亲和素溶液，通入芯片并充满芯片，在37°C下孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲 洗通道三次。继续通入阳性核酸适配体探针，于7°C孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲洗 通道三次得到阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片。阴性对照探针修饰的微流控芯片操 作与阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片相同。
[0083] (6)将传代24小时以上，处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用细胞消化液消化， 用结合缓冲溶液洗涤，分散为浓度为IO 6个/mL的SMMC-7721细胞分散液。将200 mL的 SMMC-7721细胞分散液通入阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片的通道内，收集从通道 流出的细胞。再以结合缓冲溶液冲洗通道两次，合并流出液与收集的流出细胞。采用流式 细胞仪，对细胞进行分析。
[0084] 检测结果如图8所示，在37°C条件下，阳性核酸适配体探针可以在肿瘤细胞的刺 激下与SMMC-7721细胞结合，且与对照探针结合情况有所差异。因此，此装置可用于目标细 胞SMMC-7721的示踪。
[0085] 实施例3仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针携带的医学造影剂还 可以替换为卟啉、碘苯酯、碘苯六醇、钆-卟啉复合物、 64Cu-卟啉复合物，并达到相同或相似 的技术效果。
[0086] 实施例4 参见图9 :本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适配体探针和载体，其中 核酸适配体探针包括固定探针和识别探针，固定探针3'端修饰有生物素，识别探针携带有 光敏剂。本实施例采用的光敏剂为焦脱镁叶绿酸-a (Pa，CAS: 15664-29-6);载体为微流 控芯片(还可以是人造血管、血管支架等其他微通道)。
[0087] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-7721 :5' -CGC GCG CTT TTT TTT TTT -biotin-3'。
[0088] 杀伤探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；具体为： 杀伤探针-7721 :5' -Pa-AAA GCG CGC GCG CGC ATA GCG CGC TGA GCT GAA GAT CGT ACC GTG AGC GCG CT- 3'。
[0089] 固定探针的CGC GCG CTT T片段与杀伤探针中的AAA GCG CGC G片段杂交互补连 接，固定探针末端修饰的生物素与载体上的亲和素作用，使固定探针固定在微流控芯片表 面。
[0090] 目标细胞流入通道时，目标肿瘤细胞与识别探针结合，识别探针不再继续被固定 探针固定；目标细胞流出通道时，识别探针及所携带的光敏剂结合与肿瘤细胞的表面。在光 照的作用下，光敏剂产生单线态氧，破坏细胞结构促使细胞凋亡。此装置可发展为植入式装 置，当目标细胞被识别探针识别后，流经体表血管时在光照下即可促使与识别探针结合的 目标细胞死亡同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的序列作为对照探针， 用于分辨阳性信号。
[0091] 一种实施例4的核酸适配体探针在人肝癌细胞（SMMC-7721)杀伤中的应用，具体 的应用方法为： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0092] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4. 5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0093] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为60 mM固定探针-7721与终浓度为40 mM识 别探针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本 实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0094] (3)制备微流控芯片：将PDMS前聚体与sygard 184固化剂(美国道康宁公司）按 10 : 1比例混合，搅拌混匀后，置于真空箱内脱除气泡，然后在SU-8阳模板上浇注，厚度控 制6 mm。然后置于80°C烘箱固化约2小时后，小心地将PDMS基片从模板上剥离，在微通 道两端进样口和出样口部位用冲压打孔器做成直径为2 mm的小孔。将50mmX30mm的玻 璃基片用去离子水冲洗并在氮气中干燥。最后，PDMS芯片和洁净的玻璃基片直接进行可逆 贴合。
[0095] (4)制备阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片：以杂交缓冲溶液配制的浓度为1 mg/mL的亲和素溶液，通入芯片并充满芯片，在37°C下孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲 洗通道三次。继续通入阳性核酸适配体探针，于7°C孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲洗 通道三次得到阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片。
[0096] (5)以单独修饰固定探针的芯片，作为本实验的对照细胞芯片。
[0097] (6)将传代24小时以上，处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用细胞消化液消化， 用结合缓冲溶液洗涤，分散为浓度为IO 6个/mL的SMMC-7721细胞分散液。将200 mL的 SMMC-7721细胞分散液通入阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片的通道内，收集从通道 流出的细胞。再以400 mL的结合缓冲溶液冲洗通道两次，合并流出液与收集的流出细胞。
[0098] 将收集的细胞加样于96孔板中，每孔加入50mL细胞悬液(细胞悬液即从微流控芯 片通道流出收集获得的细胞)，加10个孔，再加入200 mL的细胞培养液(细胞培养液成分为 RPMI 1640培基，加入终浓度为15%新生小牛血清，终浓度为100 IU/mL链霉素及100 IU/ mL青霉素)。其中五个孔不进行光照，另外五个孔用IOW的LED光源，光照10 min。从修饰 固定探针的芯片中收集的细胞，加样于96孔板中，每孔加入50mL细胞悬浊液，加5个孔，再 加入200 mL的细胞培养液，作为假定存活率为100%。将96孔板置于细胞培养箱中37 °C、 5% CO2条件下培育24 h后，每孔加入20 μL MTS溶液，继续孵育4 h，终止培养。震荡孵育 10 min，使结晶物充分溶解。选定吸收波长为570 nm，使用酶标仪测量各孔的吸光度值，其 中从修饰对照探针芯片流出来的细胞的孔细胞存活率假定为100%，不加细胞的孔细胞存活 率假定为〇,每个相同的处理组做5孔。以下列公式计算细胞存活率，结果见图10。
[0099] 由图10可见，光照的作用下，目标细胞死亡近50%，显著区别与没光照的细胞。因 此，说明本装置具有特异性杀伤目标细胞的特性。
[0100] 实施例4仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针携带的光敏剂还可以 替换为焦脱镁叶绿酸_a、卟啉、亚甲基蓝、二氢卟吩e6、维替泊芬、5-氨基酮戊酸、替莫泊 芬、他拉泊芬、酞菁和藻胆蛋白中的一种或多种，并达到相同或相似的技术效果。
[0101] 以上实施例仅是本发明的优选实施例，在本发明中，核酸适配体或装置中的识别 探针还可修饰药物，药物为焦脱镁叶绿酸-a、尿嘧啶、阿霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、 表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗中的一种或多种。当识别探针中修饰药物时，可应用于 制备治疗肿瘤药物。
[0102] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽 然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人 员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内 容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此， 凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单 修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针，其特征在于，包括固定探针和可与肿瘤 细胞结合的识别探针；所述固定探针与所述识别探针部分杂交互补。2. 根据权利要求1所述的核酸适配体探针，其特征在于，所述固定探针的核苷酸序列 为具有SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 3所述的核苷酸序列；所述识别探针的核苷酸序列为具 有SEQIDNO. 2或SEQIDNO. 4所述的核苷酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的核酸适配体探针，其特征在于，所述识别探针修饰有荧光 基团、药物、光敏剂或医学造影剂，所述固定探针修饰有生物素。4. 根据权利要求3所述的核酸适配体探针，其特征在于，所述荧光基团为荧光素、罗 丹明、Alexa488、Atto550、Atto647、Cy3、Cy5或Cy5. 5中的一种或多种；药物为焦脱镁叶 绿酸_a、尿嘧啶、阿霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗 中的一种或多种；所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸_a、卟啉、亚甲基蓝、二氢卟吩e6、维替泊芬、 5_氨基酮戊酸、替莫泊芬、他拉泊芬、酞菁和藻胆蛋白中的一种或多种；所述医学造影剂为 焦脱镁叶绿酸_a、扑啉、碘苯酯、碘苯六醇、钆-卟啉复合物和64Cu-卟啉复合物中的一种或 多种。5. -种用于肿瘤细胞检测的装置，其特征在于，包括权利要求1至4中任一项所述的核 酸适配体探针和载体，所述核酸适配体探针的固定探针通过共价或非共价交联于所述载体 表面。6. 根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述载体为磁颗粒、微流控芯片、血管支 架或人造血管。7. 根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述磁颗粒为表面包被链霉亲和素的磁 颗粒。8. -种权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体探针或权利要求5至7中任一项所 述的装置在肿瘤细胞检测中的应用。9. 一种权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体探针或权利要求5至7中任一项所 述的装置在肿瘤细胞示踪中的应用。10. -种权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体探针或权利要求5至7中任一项 所述的装置在制备治疗肿瘤药物、制备杀伤肿瘤装置中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用，其中核酸适配体探针包括固定探针和可与肿瘤细胞结合的识别探针；固定探针与识别探针部分杂交互补；装置包括核酸适配体探针和载体，核酸适配体探针的固定探针通过共价或非共价交联于载体表面。本发明的核酸适配体探针仪器要求低、普适性强、成本低、操作简单易于推广，可应用于肿瘤细胞的检测、示踪和杀伤。
【IPC分类】C12N15/11, C12M1/00, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104894243
【申请号】CN201510238290
【发明人】王柯敏, 陈南迪, 羊小海, 翦立新, 王青
【申请人】湖南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤诊治技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探 针、装置及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上使其对其生 长的正常的调控，导致克隆性异常增生。肿瘤临床上可分为实体瘤和非实体瘤，实体瘤及有 形瘤可通过临床检查如CT扫描，B超等影像学方法或触诊扪及到的有形肿块。非实体瘤如 血液病中的白血病就无法通过触诊或常规影像学方法直接诊断。肿瘤不仅生长失控，细胞 还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，严重 威胁人类健康。90%以上的癌症相关死亡都是与肿瘤的转移相关的。肿瘤细胞的检测，尤其 是从原生肿瘤组织上脱落下来进入人体外周血液及组织中的循环肿瘤细胞，对于癌症的早 期诊断、治疗效果的评估有极其重要的意义。循环肿瘤细胞是癌症转移及复发的主要原因 之一。在过去的几十年间，人们开发了很多种用以检测肿瘤细胞的方法，如：荧光免疫法、 磁性免疫法等。其中Veridex公司的CellSearch循环肿瘤细胞检测装置是我国食品药品 监督管理局（SFDA)唯一批准使用的循环肿瘤细胞检测装置。然而，这些技术所需的仪器昂 贵，且无法实现肿瘤细胞的示踪及杀伤。
[0003] 核酸适配体（aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术（SELEX)筛选得到 的，能特异结合祀物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA)。核酸适体具有类似抗体对革巴标 高特异性和高亲和力的特点，且在许多方面优于抗体，如：分子量小、无免疫原性、靶标种 类丰富（包括离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质、完整的肿瘤细胞甚至组织等）、合成方法 简单且重复性好、修饰灵活以及便于长期贮存和常温运输等等。这些特性使得核酸适体作 为肿瘤诊断探针得到了广泛的关注和认可，因此基于核酸适体正逐渐成为一种可用于为肿 瘤分型、诊断和治疗的工具。
[0004] 在目前常规的肿瘤细胞，尤其是循环肿瘤细胞及非实体瘤细胞的检测方法，存在 操作复杂，耗时长，成本高等问题。核酸适配体探针可提供一种低成本、操作方便的肿瘤细 胞诊断探针。并且由于核酸适配体易修饰的特性，不仅可以对肿瘤细胞进行诊断，还可实现 肿瘤细胞的追踪与杀伤。针对现阶段的肿瘤治疗方法，大多需要药物在血液中达到较高的 浓度才能起到治疗的作用。如果将药物固定在一个装置内，通过肿瘤细胞的刺激使药物释 放，有望用于抑制肿瘤的转移，并降低药物使用总量，缓解大剂量使用抗肿瘤药物而引发的 副作用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种仪器要求低、普适性 强、成本低、操作简单易于推广的核酸适配体探针及装置，可应用于肿瘤细胞的检测、示踪 和杀伤。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方法是： 一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针，包括固定探针和可与肿瘤细胞结合的识别 探针；所述固定探针与所述识别探针部分杂交互补。
[0007] 上述的核酸适配体探针，优选的，所述固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；所述识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列。
[0008] 上述的核酸适配体探针，优选的，所述识别探针修饰有荧光基团、药物、光敏剂或 医学造影剂，所述固定探针修饰有生物素。
[0009] 上述的核酸适配体探针，优选的，所述荧光基团为荧光素、罗丹明、Alexa488、 Atto550、Atto647、Cy3、Cy5和Cy5. 5中的一种或多种；药物为焦脱镁叶绿酸-a、尿嘧啶、阿 霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗中的一种或多种； 所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸_a、卟啉、亚甲基蓝、二氢卟吩e6、维替泊芬、5-氨基酮戊酸、替 莫泊芬、他拉泊芬、酞菁和藻胆蛋白中的一种或多种；所述医学造影剂为焦脱镁叶绿酸_a、 卟啉、碘苯酯、碘苯六醇、钆-卟啉复合物和 64Cu-卟啉复合物中的一种或多种。
[0010] 优选的，荧光素为FAM和/或FITC。
[0011] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了一种用于肿瘤细胞检测的装置， 包括上述的核酸适配体探针和载体，所述核酸适配体探针的固定探针通过共价或非共价交 联于所述载体表面。
[0012] 上述的装置，优选的，所述载体为磁颗粒、微流控芯片、血管支架或人造血管。
[0013] 上述的装置，优选的，所述磁颗粒为表面包被链霉亲和素的磁颗粒。
[0014] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了上述的核酸适配体探针或装置 在肿瘤细胞检测中的应用。
[0015] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了上述的核酸适配体探针或装置 在肿瘤细胞示踪中的应用。
[0016] 作为一个总的技术构思，优选的，本发明还提供了上述的核酸适配体探针或装置 在制备治疗肿瘤药物、制备杀伤肿瘤装置中的应用。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，具有仪器要求低、普 适性强、成本低、操作简单易于推广的优点。
[0018] (2)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，在没有肿瘤细 胞的刺激作用下，固定探针与识别探针杂交，识别探针处于关闭的状态；当肿瘤细胞刺激 时，识别探针被激活，释放结合于肿瘤细胞的表面。避免了现有基于单一核酸适体的检测方 法中，为克服非特异性吸附信号而进行的繁琐的洗涤过程，缩短了检测时间。同时可拓展应 用于肿瘤细胞的追踪与杀伤。
[0019] (3)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，固定核酸适配 体探针装置可以根据需求采用纳米及微米颗粒、微流控芯片、人造血管及血管支架等装置， 从而进一步拓宽了肿瘤细胞刺激核酸探针释放的装置在肿瘤诊治方面的应用。
[0020] (4)本发明提供了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体及其装置，提供了一种全 新的非实体瘤细胞的示踪与杀伤策略。通过将识别探针携带的造影剂、药物固定于装置的 方法，避免将造影剂、药物直接注射进入循环系统。此方法通过肿瘤细胞激活识别探针，可 以在较低的造影剂、药物总量的情况下，实现非实体瘤细胞的追踪与杀伤，从而降低大剂量 摄入造影剂、药物所引发的副作用。
【附图说明】
[0021] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0022] 图1为本发明实施例1的核酸适配体探针及装置结构示意图。
[0023] 图2为本发明实施例1的核酸适配体探针固定于磁颗粒上时，用于肿瘤细胞检测 的示意图。
[0024] 图3为本发明实施例1的核酸适配体探针及装置在检测人急性淋巴细胞白血病T 淋巴细胞（CCRF-CEM)的实验结果图。
[0025] 图4为本发明实施例1的核酸适配体探针及装置在检测人B淋巴细胞瘤细胞 (Ramos)对照实验结果图。
[0026] 图5为本发明实施例2的核酸适配体探针及装置在检测人肝癌细胞（SMMC-7721) 的实验结果图。
[0027] 图6为本发明实施例2的核酸适配体探针及装置在检测人肝癌细胞（BEL-7404)的 对照实验结果图。
[0028] 图7为本发明实施例3的核酸适配体探针及装置用于肿瘤细胞示踪的原理图。
[0029] 图8为本发明实施例3的核酸适配体探针及装置在用于人肝癌细胞（SMMC-7721) 的示踪的实验结果图。
[0030] 图9为本发明实施例4的核酸适配体探针及装置用于肿瘤细胞杀伤的原理图。
[0031] 图10为本发明实施例4的核酸适配体探针及装置在用于人肝癌细胞（SMMC-7721) 的杀伤的实验结果图。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。 实施例
[0033] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中芯片SU-8阳膜为大连化物所 加工的蛇形微流控芯片阳膜；sygard 184固化剂购于美国道康宁公司。[0034] 实施例1 参见图1 :本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适体探针和载体，其中核 酸适配体探针包括固定探针、识别探针，固定探针3'端修饰有生物素、5'端修饰有淬灭基团 BHQ1，识别探针3'端修饰有荧光基团FAM ;载体为包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒。
[0035] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-CEM :5' -BHQl-TCT AAC CGT ATT TTT TTT TT -biotin-3'。
[0036] 识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列；具体为： 识别探针-CEM :5' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-FAM-3'。
[0037] 固定探针-CEM的TCT AAC CGT A片段与识别探针-CEM中的TA CGG TTA GA片段 杂交互补连接。其中核酸适配体探针中固定探针末端修饰的生物素与超顺磁磁颗粒上的链 霉亲和素特异性作用，使固定探针固定在超顺磁磁颗粒表面。
[0038] 参照图2 :将用于肿瘤细胞检测的装置检测肿瘤细胞，当待测物中不存在目标肿 瘤细胞时，识别探针处理关闭状态；当待测物中存在目标肿瘤细胞时，目标肿瘤细胞与识别 探针结合，形成发夹结构，并与固定探针脱离。然后利用磁分离其对磁颗粒进行分离，利用 识别探针修饰的荧光基团对肿瘤细胞进行检测。
[0039] 一种实施例1的用于肿瘤细胞检测的装置在人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞 (CCRF-CEM)检测中的应用，采用人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞（CCRF-CEM)作为目标细 胞，以本发明实施例1所提供的装置进行检测。本实施例为避免假阳性信号的干扰，在固定 定探针5'端修饰了淬灭基团BHQ1。同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的 序列作为对照探针，用于分辨阳性信号。
[0040] 对照探针的的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列；具体为： 对照探针-CEM :5' -TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA CGG TTA GA-FAM-3'。
[0041] 其应用方法具体包括以下步骤： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' S PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0042] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4. 5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0043] 包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒：将浓度为10 mg/mL的链霉亲和素包被磁颗粒 得到包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒(本申请中包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒为市售商 品，购于 Invitrogen，规格为 Dynabeads MyOne Streptavidin CL )〇
[0044] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为I. 5 mM固定探针-CEM与终浓度为1. 0 mM 识别探针-CEM，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本 实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0045] (3 )制备对照探针：将终浓度为1. 5 mM固定探针-CEM与终浓度为1. 0 mM对照探 针-CEM，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本实施例 所需的阴性对照探针。
[0046] (4)取30 mL包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒，用杂交缓冲溶液洗涤三次，然后等 分成六份。取其中的三份包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒分别与50 mL的阳性核酸适配体 探针在室温下进行孵育(孵育缓冲溶液为杂交缓冲溶液)。孵育1小时后，通过磁分离吸去 上清，剩下的磁颗粒再用杂交缓冲溶液清洗三次，得到用于肿瘤细胞检测的装置。三份阴性 对照探针处理方法同阳性核酸适配体探针。
[0047] (5)将CCRF-CEM细胞分散于200 mL的结合缓冲液中，使CCRF-CEM细胞浓度为IO6 个/mL，然后加入到三份用于肿瘤细胞检测的装置的溶液中，分别在4°C，20°C，37°C条件下 孵育30分钟。孵育完成后，磁分离5分钟，吸取细胞上清液，沉淀再加入200 mL结合缓冲 溶液洗涤磁珠一次，再次磁分离5分钟，吸取上清液并与上一次的细胞上清液合并，用于流 式细胞仪的检测。
[0048] 检测结果如图3所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针都可以在肿瘤细胞的刺 激下与细胞结合，且与对照探针结合情况有所差异。因此，本实施例中用于肿瘤细胞检测的 装置可以在不同温度下，对目标细胞CCRF-CEM进行检测。
[0049] 实施例1仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针3'端修饰的荧光基团 还可以替换为荧光素、罗丹明、Alexa488、Atto550、Atto647、Cy3、Cy5或Cy5. 5中的一种或 多种，并达到相同或相似的技术效果。
[0050] 对比例1 一种实施例1的用于肿瘤细胞检测的装置在人B淋巴细胞瘤细胞（Ramos)检测中的应 用，采用人B淋巴细胞瘤细胞（Ramos)作为目标细胞，以本发明实施例1所提供的核酸适配 体探针进行检测。检测方法与实施例1相同。
[0051] 检测结果如图4所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针与对照肿瘤细胞结合并 无差异，说明两种探针均未与对照肿瘤细胞结合。
[0052] 实施例2 本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适配体探针和载体，其中核酸适配 体探针包括固定探针和识别探针，固定探针3'端修饰有生物素，识别探针5'端修饰有荧光 基团FAM ;载体为包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒。
[0053] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-7721 :5' -CGC GCG CTT TTT TTT TTT -biotin-3'。
[0054] 识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；具体为： 识别探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GCG CGC ATA GCG CGC TGA GCT GAA GAT CGT ACC GTG AGC GCG CT-3'。
[0055] 固定探针的CGC GCG CTT T片段与识别探针中的AAA GCG CGC G片段杂交互补连 接，固定探针末端修饰的生物素与载体上的链霉亲和素特异性作用，使固定探针固定在超 顺磁磁颗粒表面。
[0056] 当待测物中不存在目标肿瘤细胞时，识别探针处理关闭状态；当待测物中存在目 标肿瘤细胞时，目标肿瘤细胞与识别探针结合，形成发夹结构，并与固定探针脱离。然后利 用磁分离其对磁颗粒进行分离，利用识别探针修饰的荧光基团FAM对肿瘤细胞进行检测。
[0057] 同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的序列作为对照探针，用于 分辨阳性信号。
[0058] 对照探针的的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列；具体为： 对照探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT ΤΤΤ τττ TTT TTT TT-3\
[0059] -种实施例2的用于肿瘤细胞检测的装置在人肝癌细胞（SMMC-7721))检测中的 应用，具体的应用方法为： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0060] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4.5g/L葡萄糖， O.lmg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0061] 包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒：将浓度为10 mg/mL的链霉亲和素包被磁颗粒 得到包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒(本申请中包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒为市售商 品，购于 Invitrogen,规格为 Dynabeads MyOne Streptavidin CL )〇
[0062] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为I. 5 mM固定探针-7721与终浓度为1.0 mM 识别探针-7721 ，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为 本实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0063] (3)制备对照探针：将终浓度为I. 5 mM固定探针-7721与终浓度为1.0 mM对照 探针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本实 施例所需的阴性对照探针。
[0064] (4)取30 mL包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒，用杂交缓冲溶液洗涤三次，然后等 分成六份。取其中的三份包被链霉亲和素的超顺磁磁颗粒分别与50 mL的阳性核酸适配体 探针在室温下进行孵育(孵育缓冲溶液为杂交缓冲溶液)。孵育1小时后，通过磁分离吸去 上清，剩下的磁颗粒再用杂交缓冲溶液清洗三次，得到用于肿瘤细胞检测的装置。三份阴性 对照探针处理方法同阳性核酸适配体探针。
[0065] (5)将传代24小时以上，处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用细胞消化液消 化，用结合缓冲溶液洗涤，分散为浓度为IO 6个/mL的SMMC-7721细胞分散液。取200 mL SMMC-7721细胞分散液分别加入到每份用于肿瘤细胞检测的装置中，分别在4°C，20 °C， 37 °C条件下孵育30分钟。孵育完成后，磁分离5分钟，吸取细胞上清液，沉淀再加入200 mL 结合缓冲溶液洗涤磁珠一次，再次磁分离5分钟，吸取上清液并与上一次的细胞上清液合 并，用于流式细胞仪的检测。
[0066] 检测结果如图5所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针都可以在肿瘤细胞的刺 激下与细胞结合，且与对照探针结合情况有所差异。因此，本实施例中用于肿瘤细胞检测的 装置可以在不同温度下，对目标细胞SMMC-7721进行检测。
[0067] 实施例2仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针5'端修饰的荧光基团 还可以替换为荧光素、罗丹明、Alexa488、Atto550、Atto647、Cy3、Cy5或Cy5. 5中的一种或 多种，并达到相同或相似的技术效果。
[0068] 对比例2 一种实施例2的用于肿瘤细胞检测的装置在人肝癌细胞（BEL-7404)检测中的应用，采 用人肝癌细胞（BEL-7404)作为目标细胞，以本发明实施例2所提供的装置进行检测。检测 方法与实施例2相同。
[0069] 检测结果如图6所示，在4°C，20°C，37°C条件下，识别探针与对照肿瘤细胞结合并 无差异，说明两种探针均未与对照肿瘤细胞结合。
[0070] 实施例3 参见图7 :本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适配体探针和载体，其中 核酸适配体探针包括固定探针和识别探针，固定探针3'端修饰有生物素，识别探针携带有 医学造影剂；载体为微流控芯片(载体还可以是人造血管、血管支架等其他微通道)。本实施 例采用的医学造影剂为焦脱镁叶绿酸-a，微流控芯片为PDMS聚合物与玻璃键合的微流控 芯片。
[0071] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-7721 :5' -CGC GCG CTT TTT TTT TTT -biotin-3'。
[0072] 识别探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；具体为： 识别探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GCG CGC ATA GCG CGC TGA GCT GAA GAT CGT ACC GTG AGC GCG CT-3'。
[0073] 固定探针的CGC GCG CTT T片段与识别探针中的AAA GCG CGC G片段杂交互补连 接，固定探针末端修饰的生物素与载体上的亲和素作用，使固定探针固定在微流控芯片表 面。
[0074] 目标肿瘤细胞流入通道时，目标肿瘤细胞与识别探针结合，识别探针不再继续被 固定探针固定；目标细胞流出通道时，可通过识别探针携带医学造影剂，用于肿瘤细胞的追 踪。此装置可作为体外肿瘤细胞检测装置及体内肿瘤细胞追踪装置。
[0075] 同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的序列作为对照探针，用于 分辨阳性信号。
[0076] 对照探针的的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列；具体为： 对照探针-7721 :5' -FAM-AAA GCG CGC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT ΤΤΤ τττ TTT TTT TT-3\
[0077] -种实施例3的核酸适配体探针在人肝癌细胞（SMMC-7721)示踪中的应用，具体 的应用方法为： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0078] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4. 5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0079] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为60 mM固定探针-7721与终浓度为40 mM识 别探针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本 实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0080] (3)制备对照探针：将终浓度为60 mM固定探针-7721与终浓度为40 mM对照探 针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本实施 例所需的阴性对照探针。
[0081] (4)制备微流控芯片：将PDMS前聚体与sygard 184固化剂(美国道康宁公司）按 10 : 1比例混合，搅拌混匀后，置于真空箱内脱除气泡，然后在SU-8阳模板上浇注，厚度控 制6 mm。然后置于80°C烘箱固化约2小时后，小心地将PDMS基片从模板上剥离，在微通 道两端进样口和出样口部位用冲压打孔器做成直径为2 mm的小孔。将50mmX30mm的玻 璃基片用去离子水冲洗并在氮气中干燥。最后，PDMS芯片和洁净的玻璃基片直接进行可逆 贴合。
[0082] (5)制备阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片：以杂交缓冲溶液配制的浓度为1 mg/mL的亲和素溶液，通入芯片并充满芯片，在37°C下孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲 洗通道三次。继续通入阳性核酸适配体探针，于7°C孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲洗 通道三次得到阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片。阴性对照探针修饰的微流控芯片操 作与阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片相同。
[0083] (6)将传代24小时以上，处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用细胞消化液消化， 用结合缓冲溶液洗涤，分散为浓度为IO 6个/mL的SMMC-7721细胞分散液。将200 mL的 SMMC-7721细胞分散液通入阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片的通道内，收集从通道 流出的细胞。再以结合缓冲溶液冲洗通道两次，合并流出液与收集的流出细胞。采用流式 细胞仪，对细胞进行分析。
[0084] 检测结果如图8所示，在37°C条件下，阳性核酸适配体探针可以在肿瘤细胞的刺 激下与SMMC-7721细胞结合，且与对照探针结合情况有所差异。因此，此装置可用于目标细 胞SMMC-7721的示踪。
[0085] 实施例3仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针携带的医学造影剂还 可以替换为卟啉、碘苯酯、碘苯六醇、钆-卟啉复合物、 64Cu-卟啉复合物，并达到相同或相似 的技术效果。
[0086] 实施例4 参见图9 :本发明的一种用于肿瘤细胞检测的装置，包括核酸适配体探针和载体，其中 核酸适配体探针包括固定探针和识别探针，固定探针3'端修饰有生物素，识别探针携带有 光敏剂。本实施例采用的光敏剂为焦脱镁叶绿酸-a (Pa，CAS: 15664-29-6);载体为微流 控芯片(还可以是人造血管、血管支架等其他微通道)。
[0087] 固定探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；具体为： 固定探针-7721 :5' -CGC GCG CTT TTT TTT TTT -biotin-3'。
[0088] 杀伤探针的核苷酸序列为具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列；具体为： 杀伤探针-7721 :5' -Pa-AAA GCG CGC GCG CGC ATA GCG CGC TGA GCT GAA GAT CGT ACC GTG AGC GCG CT- 3'。
[0089] 固定探针的CGC GCG CTT T片段与杀伤探针中的AAA GCG CGC G片段杂交互补连 接，固定探针末端修饰的生物素与载体上的亲和素作用，使固定探针固定在微流控芯片表 面。
[0090] 目标细胞流入通道时，目标肿瘤细胞与识别探针结合，识别探针不再继续被固定 探针固定；目标细胞流出通道时，识别探针及所携带的光敏剂结合与肿瘤细胞的表面。在光 照的作用下，光敏剂产生单线态氧，破坏细胞结构促使细胞凋亡。此装置可发展为植入式装 置，当目标细胞被识别探针识别后，流经体表血管时在光照下即可促使与识别探针结合的 目标细胞死亡同时设计可与固定探针杂交，但是不能识别目标细胞的序列作为对照探针， 用于分辨阳性信号。
[0091] 一种实施例4的核酸适配体探针在人肝癌细胞（SMMC-7721)杀伤中的应用，具体 的应用方法为： (1)材料准备： 杂交缓冲液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM的MgCl2。
[0092] 结合缓冲溶液：以Dulbecco' s PBS为溶剂，包括5 mM MgCl2,4. 5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA，lmg/mL牛血清白蛋白。
[0093] (2)制备核酸适配体探针：将终浓度为60 mM固定探针-7721与终浓度为40 mM识 别探针-7721，杂交于杂交缓冲溶液中，95°C变性5min后，缓慢降至室温过夜备用，作为本 实施例所需的阳性核酸适配体探针。
[0094] (3)制备微流控芯片：将PDMS前聚体与sygard 184固化剂(美国道康宁公司）按 10 : 1比例混合，搅拌混匀后，置于真空箱内脱除气泡，然后在SU-8阳模板上浇注，厚度控 制6 mm。然后置于80°C烘箱固化约2小时后，小心地将PDMS基片从模板上剥离，在微通 道两端进样口和出样口部位用冲压打孔器做成直径为2 mm的小孔。将50mmX30mm的玻 璃基片用去离子水冲洗并在氮气中干燥。最后，PDMS芯片和洁净的玻璃基片直接进行可逆 贴合。
[0095] (4)制备阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片：以杂交缓冲溶液配制的浓度为1 mg/mL的亲和素溶液，通入芯片并充满芯片，在37°C下孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲 洗通道三次。继续通入阳性核酸适配体探针，于7°C孵育1小时，然后用杂交缓冲溶液冲洗 通道三次得到阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片。
[0096] (5)以单独修饰固定探针的芯片，作为本实验的对照细胞芯片。
[0097] (6)将传代24小时以上，处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用细胞消化液消化， 用结合缓冲溶液洗涤，分散为浓度为IO 6个/mL的SMMC-7721细胞分散液。将200 mL的 SMMC-7721细胞分散液通入阳性核酸适配体探针修饰的微流控芯片的通道内，收集从通道 流出的细胞。再以400 mL的结合缓冲溶液冲洗通道两次，合并流出液与收集的流出细胞。
[0098] 将收集的细胞加样于96孔板中，每孔加入50mL细胞悬液(细胞悬液即从微流控芯 片通道流出收集获得的细胞)，加10个孔，再加入200 mL的细胞培养液(细胞培养液成分为 RPMI 1640培基，加入终浓度为15%新生小牛血清，终浓度为100 IU/mL链霉素及100 IU/ mL青霉素)。其中五个孔不进行光照，另外五个孔用IOW的LED光源，光照10 min。从修饰 固定探针的芯片中收集的细胞，加样于96孔板中，每孔加入50mL细胞悬浊液，加5个孔，再 加入200 mL的细胞培养液，作为假定存活率为100%。将96孔板置于细胞培养箱中37 °C、 5% CO2条件下培育24 h后，每孔加入20 μL MTS溶液，继续孵育4 h，终止培养。震荡孵育 10 min，使结晶物充分溶解。选定吸收波长为570 nm，使用酶标仪测量各孔的吸光度值，其 中从修饰对照探针芯片流出来的细胞的孔细胞存活率假定为100%，不加细胞的孔细胞存活 率假定为〇,每个相同的处理组做5孔。以下列公式计算细胞存活率，结果见图10。
[0099] 由图10可见，光照的作用下，目标细胞死亡近50%，显著区别与没光照的细胞。因 此，说明本装置具有特异性杀伤目标细胞的特性。
[0100] 实施例4仅为本发明的优选实施例，在本发明中，识别探针携带的光敏剂还可以 替换为焦脱镁叶绿酸_a、卟啉、亚甲基蓝、二氢卟吩e6、维替泊芬、5-氨基酮戊酸、替莫泊 芬、他拉泊芬、酞菁和藻胆蛋白中的一种或多种，并达到相同或相似的技术效果。
[0101] 以上实施例仅是本发明的优选实施例，在本发明中，核酸适配体或装置中的识别 探针还可修饰药物，药物为焦脱镁叶绿酸-a、尿嘧啶、阿霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、 表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗中的一种或多种。当识别探针中修饰药物时，可应用于 制备治疗肿瘤药物。
[0102] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽 然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人 员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内 容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此， 凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单 修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针，其特征在于，包括固定探针和可与肿瘤 细胞结合的识别探针；所述固定探针与所述识别探针部分杂交互补。2. 根据权利要求1所述的核酸适配体探针，其特征在于，所述固定探针的核苷酸序列 为具有SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 3所述的核苷酸序列；所述识别探针的核苷酸序列为具 有SEQIDNO. 2或SEQIDNO. 4所述的核苷酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的核酸适配体探针，其特征在于，所述识别探针修饰有荧光 基团、药物、光敏剂或医学造影剂，所述固定探针修饰有生物素。4. 根据权利要求3所述的核酸适配体探针，其特征在于，所述荧光基团为荧光素、罗 丹明、Alexa488、Atto550、Atto647、Cy3、Cy5或Cy5. 5中的一种或多种；药物为焦脱镁叶 绿酸_a、尿嘧啶、阿霉素、喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、表柔比星、利妥昔单抗和曲妥珠单抗 中的一种或多种；所述光敏剂为焦脱镁叶绿酸_a、卟啉、亚甲基蓝、二氢卟吩e6、维替泊芬、 5_氨基酮戊酸、替莫泊芬、他拉泊芬、酞菁和藻胆蛋白中的一种或多种；所述医学造影剂为 焦脱镁叶绿酸_a、扑啉、碘苯酯、碘苯六醇、钆-卟啉复合物和64Cu-卟啉复合物中的一种或 多种。5. -种用于肿瘤细胞检测的装置，其特征在于，包括权利要求1至4中任一项所述的核 酸适配体探针和载体，所述核酸适配体探针的固定探针通过共价或非共价交联于所述载体 表面。6. 根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述载体为磁颗粒、微流控芯片、血管支 架或人造血管。7. 根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述磁颗粒为表面包被链霉亲和素的磁 颗粒。8. -种权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体探针或权利要求5至7中任一项所 述的装置在肿瘤细胞检测中的应用。9. 一种权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体探针或权利要求5至7中任一项所 述的装置在肿瘤细胞示踪中的应用。10. -种权利要求1至4中任一项所述的核酸适配体探针或权利要求5至7中任一项 所述的装置在制备治疗肿瘤药物、制备杀伤肿瘤装置中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于肿瘤细胞检测的核酸适配体探针、装置及其应用，其中核酸适配体探针包括固定探针和可与肿瘤细胞结合的识别探针；固定探针与识别探针部分杂交互补；装置包括核酸适配体探针和载体，核酸适配体探针的固定探针通过共价或非共价交联于载体表面。本发明的核酸适配体探针仪器要求低、普适性强、成本低、操作简单易于推广，可应用于肿瘤细胞的检测、示踪和杀伤。
【IPC分类】C12N15/11, C12M1/00, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN104894243
【申请号】CN201510238290
【发明人】王柯敏, 陈南迪, 羊小海, 翦立新, 王青
【申请人】湖南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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