同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测引物、试剂盒及方法
同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及纺织品中同时检测山羊绒和绵羊毛成分的检测 试剂盒及其检测方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC技术进行山羊绒和绵羊毛检测的检测方法 及所使用的试剂。
【背景技术】
[0002] 现行的纤维检验方法不像检查其他元素一样可以通过仪器精确检定，即便在国际 上，也是采用传统的感官检验方法，测试人员通过视觉、触觉来识别其属性。对羊毛和羊绒 纤维的鉴别是公认的技术难度最大的检测项目。大量的纤维检测工作者长期以来一直致力 于羊毛与羊绒纤维的鉴别技术的研宄。目前，鉴别羊绒、羊毛纤维的通用方法是光学投影 显微镜法、扫描电镜法和溶液法等物理方法，都是从纤维的外观形态和微观结构上进行辨 另IJ。但随着羊毛剥鳞及拉伸等先进技术的应用，即便是经验丰富的资深检验人员有时也难 以准确辨别羊绒和羊毛。采用化学方法通过动物纤维中氨基酸、多肽及脂肪的分析结果差 异来鉴别鉴别羊绒、羊毛纤维的研宄也有较多的文献报道，但是这些方法也各有特点，也不 能完全准确鉴定，因为羊绒、羊毛纤维中氨基酸、多肽及脂肪的含量随加工处理过程、动物 生长环境和喂养饲料的变化而不同。。显微镜法的缺点是检验结果受检验人员专业水准影 响较大，传统的以经验为主的鉴别方法已不能满足科学监管的需要，对检测机构而言，建立 科学、准确的轻纺产品快速鉴别方法已迫在眉睫。
【发明内容】
[0003] 为了解决上述实际问题，本发明即旨在利用不同动物纤维的遗传物质DNA存在差 异的特性，采用聚合酶链式反应PCR和变性高效液相色谱DHPLC技术，针对纺织品中山羊绒 和绵羊毛的建立特异性引物对，以及灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检 测试剂盒。涉及同时检测山羊绒和绵羊毛两种纤维，应用本发明的试剂盒，两种纤维成分可 以经过一次PCR反应、一个PCR体系就检测出来。在一次操作过程中同时检测羊毛和羊绒 两种纤维，使得检测时间、检测数量和检测水平上都发生了很大的飞跃。本发明运用变性高 效液相色谱（DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，通过使用特殊的耐高温液相色 谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离。其快速高通量、全自 动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。 与传统的显微镜法相比，本发明建立的方法及试剂盒，极大缩短了操作的时间，而且大大降 低人为经验因素的影响，使得结果更加准确、可靠。
[0004] 本发明采用的技术方案为：提取样品DNA，以DNA为模板，同时采用山羊绒和绵羊 毛的特异性检测引物进行PCR扩增，再用DHPLC技术采集目的基因的图谱信息，直接从图谱 信息读取检测结果，在此基础上，本发明还对此方法进行了特异性和灵敏度检测；其具体操 作步骤如下：
[0005] 本发明的一方面在于：提供一种鉴别山羊绒的检测引物，一种鉴别绵羊毛的检测 引物，具体为以下喊基序列：
[0006]
[0007] 本发明的一方面在于：提供一种同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测试剂盒，其 包括权利上文所述的引物SEQ ID NO. 1~4。
[0008] 对于上述技术方案中所述的同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测试剂盒，包括 5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；分别独立包装；其中，所述的PCR反应液为混合液， 包含上文所述的SEQ ID NO. 1~4各ΙΟμΜ之外、还包括IOmM Tris，Cl、50mM KCl、25mM MgC12、dNTP 各 2.5mM。
[0009] 本发明的另一方面在于：提供一种纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测 方法，其利用上述技术方案所述的检测试剂盒，对纺织品DNA进行PCR方法检测。
[0010] 对于上述技术方案中所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测方法， 其包括以下操作步骤：分别对样品按下述方法进行PCR检测：
[0011] ① PCR反应体系为50 μ 1，其中：样品DNA 4 μ 1、5U/μ 1的Taq DNA聚合酶0.4 μ 1、 PCR反应液24 μ 1、灭菌超纯水21. 6 μ 1。
[0012] ②PCR反应条件：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，7min。
[0013] 对于上述技术方案中所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测方法， 其操作步骤中，还可以包括如下步骤：
[0014] 对上文所述的山羊绒和绵羊毛成分PCR检测方法获得的PCR扩增产物进行DHPLC 分析。
[0015] DHPLC工作原理：DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液 携带下流过待测DNA样品分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下 实现对待测DNA样品不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品。
[0016] DHPLC分析步骤：
[0017] 色谱柱：PS-DVB&C18DNAS印色谱柱（4. 6mmX 50mm，粒度 3 μ m);
[0018] 柱温：50°C ;
[0019] 流动相（体积比）：0· Omin，48. 0 %缓冲溶液A，52. 0 %缓冲溶液B ;
[0020] 0.511^11，42.9%缓冲溶液六，57.1%缓冲溶液8;
[0021] 3. 6min，38. 8%缓冲溶液 Α，61· 2%缓冲溶液 B ;
[0022] 6. 8min，36. 6 %缓冲溶液 Α，63. 4%缓冲溶液 B
[0023] 9. 9min，35. 2 %缓冲溶液 A，64. 8 %缓冲溶液 B ;
[0024] 1311^11，34.3%缓冲溶液4,65.7%缓冲溶液8;
[0025] 其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250 μ 1乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml 所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml所得 溶液；
[0026] 流速：0· QmT ,/mi η ；
[0027] 检测器：荧光检测器（光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽： 15. 3nm ;检测灵敏度：在波长350nm积分2s ;
[0028] 上样量：PCR产物5yL。
[0029] 检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形，保留时间以及与阳性对 照图谱的对照，来确定样品中是否含有山羊绒和绵羊毛。
[0030] 检测过程中可以设阳性对照和阴性对照。阳性对照为山羊绒DNA和绵羊毛DNA，阴 性对照为非目标纤维的DNA。
[0031] 阴性对照：在上述DHPLC条件下，无吸收峰出现；
[0032] 阳性对照：在上述DHPLC分析条件下，绵羊毛在约4. Omin出现PCR产物吸收峰；山 羊绒在约6. 7min出现PCR吸收峰。且以上典型的PCR产物吸收峰值大于2mV ;
[0033] 在上述DHPLC分析条件下，约4. Omin出现PCR产物吸收峰，为样品中含有绵羊毛 成分；约6. 7min出现PCR吸收峰，为样品中含有山羊绒成分。
[0034] 有益效果：使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地鉴别纺织品中 的山羊绒和绵羊毛成分，检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力物力，适合快速检测 的要求。该方法的研制成功及推广应用对提高动物纤维的鉴别效率及灵敏度，提高检验技 术具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0035] 图1为山羊绒的特异性试验结果图。
[0036] 图2为绵羊毛的特异性试验结果图；
[0037] 图3为样品中同时含有山羊绒和绵羊毛的特异性试验结果图。
【具体实施方式】
[0038] 下述非限制性实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，可以使本领 域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0039] 若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器均由商业途径获得，部分商品来源 为：DNA提取试剂盒（组织和毛发提取试剂盒，Promega公司）；Taq酶及PCR反应液等试剂 均购自宝生物工程（大连）有限公司；三乙胺乙酰盐（TEAA，色谱纯）购自Transgenomic公 司；乙腈（色谱纯）购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000 (PerkinElmer公司，美国）；变 性高效液相色谱仪NAV-99-4500 (Transgenomic公司，美国）。
[0040] 实施例1
[0041] 1.模板的制备
[0042] 下述模板DNA提取方法，均为本领域技术人员的常规操作，所有试剂及溶液均 为 常规途径制备或者由商业途径获得。
[0043] ①在装有样品的I. 5mL离心管中加入400 μ L DNA抽提缓冲液和75 μ L蛋白酶K， 混匀后在56 °C下温浴过夜；
[0044] ②加350 μ L裂解液，离心2min，上清液移入新的I. 5mL离心管中；
[0045] ③加7 μ L完全悬浮的DNA IQ?树脂，振荡，室温放置IOmin ;
[0046] ④将离心管高速涡旋振荡2s，置于磁分离架上，吸去溶液，加入100 μ L裂解液，再 次振荡，磁分离；吸去裂解液，洗涤液洗涤三次，风干；
[0047] ⑤加入70 μ L洗脱液，高速振荡，65°C温浴5min，置于磁分离架上，小心吸取溶液， 即为含有DNA的模板溶液，-20°C保存备用。
[0048] 2. PCR-DHPLC 检测
[0049] ①山羊绒和绵羊毛成分扩增用引物及PCR检测方法：
[0050] 山羊绒和绵羊毛特异性引物SEQ ID NO. 1~4,均由宝生物工程（大连）有限公司 合成；扩增片段分别为293bp和174bp。
[0051] ②在此基础上设计用于PCR-DHPLC检测的试剂盒。该试剂盒中包括：浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；所述的PCR反应液中含IOmM Tris · HCl、50mM KC1、 25mM MgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM)及两种纤维特异性检测引物对（SEQ ID NO. 1~4)各10 μ Μ。使用时，分别提取待测样品成分DNA，按下述比例添加反应物并进 行PCR反应：
[0052] PCR反应体系中含：4 μ 1待测样品DNA溶液，加入24 μ I PCR反应液，0. 4 μ 1的Taq DNA聚合酶及灭菌超纯水21. 6 μ 1，总体积50 μ I ;5000r/min离心10s，然后按下列参数进 行PCR扩增：
[0053] ③PCR反应参数：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，7min ;
[0054] PCR 产物 4°C 保存；
[0055] ④ DHPLC 分析。
[0056] 将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：
[0057] 色谱柱：PS-DVB&C18DNAS印色谱柱（4. 6mmX 50mm，粒度 3 μ m);
[0058] 柱温：50°C ;
[0059] 流动相（体积比）：0· Omin，48. 0 %缓冲溶液A，52. 0 %缓冲溶液B ;
[0060] 0.511^11，42.9%缓冲溶液4,57.1%缓冲溶液8;
[0061] 3. 6min，38. 8%缓冲溶液 Α，61· 2%缓冲溶液 B ;
[0062] 6. 8min，36. 6 %缓冲溶液 Α，63. 4%缓冲溶液 B
[0063] 9. 9min，35. 2 %缓冲溶液 A，64. 8 %缓冲溶液 B ;
[0064] 1311^11，34.3%缓冲溶液八，65.7%缓冲溶液8;
[0065] 其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250 μ 1乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml 所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml所得 溶液；
[0066] 流速：0· QmT ,/mi η ；
[0067] 检测器：荧光检测器（光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽： 15. 3nm ;检测灵敏度：在波长350nm积分2s ;
[0068] 上样量：PCR产物5yL。
[0069] ⑤实验结果以【附图说明】中图谱形式输出，PCR-DHPLC结果判定标准为：
[0070] 检测结束后，检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品中不含有山羊绒和绵羊毛 成分；检测样品约4. Omin出现PCR产物吸收峰，且吸收峰大于2mV时，可判定样品中含有绵 羊毛成分；检测样品约6. 7min出现PCR产物吸收峰，且吸收峰大于2mV时，可判定为样品中 含有山羊绒成分；检测样品在约4. Omin和6. 7min处都出现PCR产物吸收峰，且吸收峰大于 2mV时，可判定样品中即含有山羊绒成分又含有绵羊毛成分。
[0071] ⑥本实施例的PCR-DHPLC检测结果如附图1所示，可判定为样品中含有山羊绒成 分；如图2所示，可判定样品中含有绵羊毛成分；如图3所示，可判定样品中即含有山羊绒 成分又含有绵羊毛成分。
[0072] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种鉴别山羊绒PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，包括碱基序列：SEQIDNO. 1~ 2〇2. -种鉴别绵羊毛PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，包括碱基序列：SEQIDNO. 3~ 4〇3. -种同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测试剂盒，其特征在于：包括权 利要求1和2所述引物SEQIDNO. 1~4。4. 根据权利要求3所述的同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测试剂盒，其 特征在于：包括5U/y1的TaqDNA聚合酶和PCR反应液； 其中，所述的PCR反应液由权利要求1和2所述引物SEQIDNO. 1~4各10yMUOmM Tris?Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各 2. 5mM组成。5. -种纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于： 包括利用权利要求3所述的检测试剂盒，对纺织品DNA进行PCR方法检测。6. 根据权利要求5所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测方 法，其特征在于：所述对样品DNA进行PCR方法检测的步骤包括： ①PCR反应体系为50y1，其中：样品DNA4yl、5U/y1的TaqDNA聚合酶0.4y1、PCR 反应液24y1、灭菌超纯水21. 6yI; ②PCR反应条件：预变性：94°C，3min;进入循环：94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延 伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，7min。7. 根据权利要求6所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测方 法，其特征在于：还包括以下操作步骤： 对权利要求6所述方法获得的PCR扩增产物进行DHPLC分析，条件如下： 色谱柱：PS-DVB&C18DNAS印色谱柱（4. 6mmX50mm，粒度 3ym); 柱温：50°C; 流动相（体积比）：〇?Omin，48. 0%缓冲溶液A，52. 0%缓冲溶液B; 0.51^11，42.9%缓冲溶液4,57.1%缓冲溶液8; 3. 6min，38. 8%缓冲溶液A，61. 2%缓冲溶液B; 6. 8min，36. 6 %缓冲溶液A，63. 4 %缓冲溶液B 9. 9min，35. 2 %缓冲溶液A，64. 8 %缓冲溶液B; 131^11，34.3%缓冲溶液4,65.7%缓冲溶液8; 其中，缓冲溶液A为50mlTEAA和250y1乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml;缓 冲溶液B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml; 流速：〇? 9mL/min; 检测器：荧光检测器，光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽：15. 3nm; 检测灵敏度：在波长350nm积分2s; 上样量：PCR产物5yL。
【专利摘要】本发明公开了一种同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测引物、试剂盒及方法，具体是纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测鉴别方法。首先针对山羊和绵羊线粒体DNA序列，分别设计了检测用引物对SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4，采用PCR-DHPLC法对纺织品中的山羊绒和绵羊毛成分同时进行鉴别。本发明所述试剂盒中包括PCR反应液、dNTP各2.5mM Taq DNA聚合酶5U/μl及引物对各10μM。本发明的引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，可快速鉴别纺织品中是否含有山羊绒及绵羊毛，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894245
【申请号】CN201510240326
【发明人】王秋艳, 赵昕, 于灵, 程根武
【申请人】王秋艳
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及纺织品中同时检测山羊绒和绵羊毛成分的检测 试剂盒及其检测方法，尤其涉及利用PCR-DHPLC技术进行山羊绒和绵羊毛检测的检测方法 及所使用的试剂。
【背景技术】
[0002] 现行的纤维检验方法不像检查其他元素一样可以通过仪器精确检定，即便在国际 上，也是采用传统的感官检验方法，测试人员通过视觉、触觉来识别其属性。对羊毛和羊绒 纤维的鉴别是公认的技术难度最大的检测项目。大量的纤维检测工作者长期以来一直致力 于羊毛与羊绒纤维的鉴别技术的研宄。目前，鉴别羊绒、羊毛纤维的通用方法是光学投影 显微镜法、扫描电镜法和溶液法等物理方法，都是从纤维的外观形态和微观结构上进行辨 另IJ。但随着羊毛剥鳞及拉伸等先进技术的应用，即便是经验丰富的资深检验人员有时也难 以准确辨别羊绒和羊毛。采用化学方法通过动物纤维中氨基酸、多肽及脂肪的分析结果差 异来鉴别鉴别羊绒、羊毛纤维的研宄也有较多的文献报道，但是这些方法也各有特点，也不 能完全准确鉴定，因为羊绒、羊毛纤维中氨基酸、多肽及脂肪的含量随加工处理过程、动物 生长环境和喂养饲料的变化而不同。。显微镜法的缺点是检验结果受检验人员专业水准影 响较大，传统的以经验为主的鉴别方法已不能满足科学监管的需要，对检测机构而言，建立 科学、准确的轻纺产品快速鉴别方法已迫在眉睫。
【发明内容】
[0003] 为了解决上述实际问题，本发明即旨在利用不同动物纤维的遗传物质DNA存在差 异的特性，采用聚合酶链式反应PCR和变性高效液相色谱DHPLC技术，针对纺织品中山羊绒 和绵羊毛的建立特异性引物对，以及灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检 测试剂盒。涉及同时检测山羊绒和绵羊毛两种纤维，应用本发明的试剂盒，两种纤维成分可 以经过一次PCR反应、一个PCR体系就检测出来。在一次操作过程中同时检测羊毛和羊绒 两种纤维，使得检测时间、检测数量和检测水平上都发生了很大的飞跃。本发明运用变性高 效液相色谱（DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，通过使用特殊的耐高温液相色 谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离。其快速高通量、全自 动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。 与传统的显微镜法相比，本发明建立的方法及试剂盒，极大缩短了操作的时间，而且大大降 低人为经验因素的影响，使得结果更加准确、可靠。
[0004] 本发明采用的技术方案为：提取样品DNA，以DNA为模板，同时采用山羊绒和绵羊 毛的特异性检测引物进行PCR扩增，再用DHPLC技术采集目的基因的图谱信息，直接从图谱 信息读取检测结果，在此基础上，本发明还对此方法进行了特异性和灵敏度检测；其具体操 作步骤如下：
[0005] 本发明的一方面在于：提供一种鉴别山羊绒的检测引物，一种鉴别绵羊毛的检测 引物，具体为以下喊基序列：
[0006]
[0007] 本发明的一方面在于：提供一种同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测试剂盒，其 包括权利上文所述的引物SEQ ID NO. 1~4。
[0008] 对于上述技术方案中所述的同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测试剂盒，包括 5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；分别独立包装；其中，所述的PCR反应液为混合液， 包含上文所述的SEQ ID NO. 1~4各ΙΟμΜ之外、还包括IOmM Tris，Cl、50mM KCl、25mM MgC12、dNTP 各 2.5mM。
[0009] 本发明的另一方面在于：提供一种纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测 方法，其利用上述技术方案所述的检测试剂盒，对纺织品DNA进行PCR方法检测。
[0010] 对于上述技术方案中所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测方法， 其包括以下操作步骤：分别对样品按下述方法进行PCR检测：
[0011] ① PCR反应体系为50 μ 1，其中：样品DNA 4 μ 1、5U/μ 1的Taq DNA聚合酶0.4 μ 1、 PCR反应液24 μ 1、灭菌超纯水21. 6 μ 1。
[0012] ②PCR反应条件：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，7min。
[0013] 对于上述技术方案中所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测方法， 其操作步骤中，还可以包括如下步骤：
[0014] 对上文所述的山羊绒和绵羊毛成分PCR检测方法获得的PCR扩增产物进行DHPLC 分析。
[0015] DHPLC工作原理：DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液 携带下流过待测DNA样品分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下 实现对待测DNA样品不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品。
[0016] DHPLC分析步骤：
[0017] 色谱柱：PS-DVB&C18DNAS印色谱柱（4. 6mmX 50mm，粒度 3 μ m);
[0018] 柱温：50°C ;
[0019] 流动相（体积比）：0· Omin，48. 0 %缓冲溶液A，52. 0 %缓冲溶液B ;
[0020] 0.511^11，42.9%缓冲溶液六，57.1%缓冲溶液8;
[0021] 3. 6min，38. 8%缓冲溶液 Α，61· 2%缓冲溶液 B ;
[0022] 6. 8min，36. 6 %缓冲溶液 Α，63. 4%缓冲溶液 B
[0023] 9. 9min，35. 2 %缓冲溶液 A，64. 8 %缓冲溶液 B ;
[0024] 1311^11，34.3%缓冲溶液4,65.7%缓冲溶液8;
[0025] 其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250 μ 1乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml 所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml所得 溶液；
[0026] 流速：0· QmT ,/mi η ；
[0027] 检测器：荧光检测器（光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽： 15. 3nm ;检测灵敏度：在波长350nm积分2s ;
[0028] 上样量：PCR产物5yL。
[0029] 检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形，保留时间以及与阳性对 照图谱的对照，来确定样品中是否含有山羊绒和绵羊毛。
[0030] 检测过程中可以设阳性对照和阴性对照。阳性对照为山羊绒DNA和绵羊毛DNA，阴 性对照为非目标纤维的DNA。
[0031] 阴性对照：在上述DHPLC条件下，无吸收峰出现；
[0032] 阳性对照：在上述DHPLC分析条件下，绵羊毛在约4. Omin出现PCR产物吸收峰；山 羊绒在约6. 7min出现PCR吸收峰。且以上典型的PCR产物吸收峰值大于2mV ;
[0033] 在上述DHPLC分析条件下，约4. Omin出现PCR产物吸收峰，为样品中含有绵羊毛 成分；约6. 7min出现PCR吸收峰，为样品中含有山羊绒成分。
[0034] 有益效果：使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地鉴别纺织品中 的山羊绒和绵羊毛成分，检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力物力，适合快速检测 的要求。该方法的研制成功及推广应用对提高动物纤维的鉴别效率及灵敏度，提高检验技 术具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0035] 图1为山羊绒的特异性试验结果图。
[0036] 图2为绵羊毛的特异性试验结果图；
[0037] 图3为样品中同时含有山羊绒和绵羊毛的特异性试验结果图。
【具体实施方式】
[0038] 下述非限制性实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，可以使本领 域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0039] 若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器均由商业途径获得，部分商品来源 为：DNA提取试剂盒（组织和毛发提取试剂盒，Promega公司）；Taq酶及PCR反应液等试剂 均购自宝生物工程（大连）有限公司；三乙胺乙酰盐（TEAA，色谱纯）购自Transgenomic公 司；乙腈（色谱纯）购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000 (PerkinElmer公司，美国）；变 性高效液相色谱仪NAV-99-4500 (Transgenomic公司，美国）。
[0040] 实施例1
[0041] 1.模板的制备
[0042] 下述模板DNA提取方法，均为本领域技术人员的常规操作，所有试剂及溶液均 为 常规途径制备或者由商业途径获得。
[0043] ①在装有样品的I. 5mL离心管中加入400 μ L DNA抽提缓冲液和75 μ L蛋白酶K， 混匀后在56 °C下温浴过夜；
[0044] ②加350 μ L裂解液，离心2min，上清液移入新的I. 5mL离心管中；
[0045] ③加7 μ L完全悬浮的DNA IQ?树脂，振荡，室温放置IOmin ;
[0046] ④将离心管高速涡旋振荡2s，置于磁分离架上，吸去溶液，加入100 μ L裂解液，再 次振荡，磁分离；吸去裂解液，洗涤液洗涤三次，风干；
[0047] ⑤加入70 μ L洗脱液，高速振荡，65°C温浴5min，置于磁分离架上，小心吸取溶液， 即为含有DNA的模板溶液，-20°C保存备用。
[0048] 2. PCR-DHPLC 检测
[0049] ①山羊绒和绵羊毛成分扩增用引物及PCR检测方法：
[0050] 山羊绒和绵羊毛特异性引物SEQ ID NO. 1~4,均由宝生物工程（大连）有限公司 合成；扩增片段分别为293bp和174bp。
[0051] ②在此基础上设计用于PCR-DHPLC检测的试剂盒。该试剂盒中包括：浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶和PCR反应液；所述的PCR反应液中含IOmM Tris · HCl、50mM KC1、 25mM MgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM)及两种纤维特异性检测引物对（SEQ ID NO. 1~4)各10 μ Μ。使用时，分别提取待测样品成分DNA，按下述比例添加反应物并进 行PCR反应：
[0052] PCR反应体系中含：4 μ 1待测样品DNA溶液，加入24 μ I PCR反应液，0. 4 μ 1的Taq DNA聚合酶及灭菌超纯水21. 6 μ 1，总体积50 μ I ;5000r/min离心10s，然后按下列参数进 行PCR扩增：
[0053] ③PCR反应参数：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，7min ;
[0054] PCR 产物 4°C 保存；
[0055] ④ DHPLC 分析。
[0056] 将PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：
[0057] 色谱柱：PS-DVB&C18DNAS印色谱柱（4. 6mmX 50mm，粒度 3 μ m);
[0058] 柱温：50°C ;
[0059] 流动相（体积比）：0· Omin，48. 0 %缓冲溶液A，52. 0 %缓冲溶液B ;
[0060] 0.511^11，42.9%缓冲溶液4,57.1%缓冲溶液8;
[0061] 3. 6min，38. 8%缓冲溶液 Α，61· 2%缓冲溶液 B ;
[0062] 6. 8min，36. 6 %缓冲溶液 Α，63. 4%缓冲溶液 B
[0063] 9. 9min，35. 2 %缓冲溶液 A，64. 8 %缓冲溶液 B ;
[0064] 1311^11，34.3%缓冲溶液八，65.7%缓冲溶液8;
[0065] 其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250 μ 1乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml 所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml所得 溶液；
[0066] 流速：0· QmT ,/mi η ；
[0067] 检测器：荧光检测器（光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽： 15. 3nm ;检测灵敏度：在波长350nm积分2s ;
[0068] 上样量：PCR产物5yL。
[0069] ⑤实验结果以【附图说明】中图谱形式输出，PCR-DHPLC结果判定标准为：
[0070] 检测结束后，检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品中不含有山羊绒和绵羊毛 成分；检测样品约4. Omin出现PCR产物吸收峰，且吸收峰大于2mV时，可判定样品中含有绵 羊毛成分；检测样品约6. 7min出现PCR产物吸收峰，且吸收峰大于2mV时，可判定为样品中 含有山羊绒成分；检测样品在约4. Omin和6. 7min处都出现PCR产物吸收峰，且吸收峰大于 2mV时，可判定样品中即含有山羊绒成分又含有绵羊毛成分。
[0071] ⑥本实施例的PCR-DHPLC检测结果如附图1所示，可判定为样品中含有山羊绒成 分；如图2所示，可判定样品中含有绵羊毛成分；如图3所示，可判定样品中即含有山羊绒 成分又含有绵羊毛成分。
[0072] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种鉴别山羊绒PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，包括碱基序列：SEQIDNO. 1~ 2〇2. -种鉴别绵羊毛PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，包括碱基序列：SEQIDNO. 3~ 4〇3. -种同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测试剂盒，其特征在于：包括权 利要求1和2所述引物SEQIDNO. 1~4。4. 根据权利要求3所述的同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测试剂盒，其 特征在于：包括5U/y1的TaqDNA聚合酶和PCR反应液； 其中，所述的PCR反应液由权利要求1和2所述引物SEQIDNO. 1~4各10yMUOmM Tris?Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各 2. 5mM组成。5. -种纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于： 包括利用权利要求3所述的检测试剂盒，对纺织品DNA进行PCR方法检测。6. 根据权利要求5所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测方 法，其特征在于：所述对样品DNA进行PCR方法检测的步骤包括： ①PCR反应体系为50y1，其中：样品DNA4yl、5U/y1的TaqDNA聚合酶0.4y1、PCR 反应液24y1、灭菌超纯水21. 6yI; ②PCR反应条件：预变性：94°C，3min;进入循环：94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延 伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，7min。7. 根据权利要求6所述的纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测方 法，其特征在于：还包括以下操作步骤： 对权利要求6所述方法获得的PCR扩增产物进行DHPLC分析，条件如下： 色谱柱：PS-DVB&C18DNAS印色谱柱（4. 6mmX50mm，粒度 3ym); 柱温：50°C; 流动相（体积比）：〇?Omin，48. 0%缓冲溶液A，52. 0%缓冲溶液B; 0.51^11，42.9%缓冲溶液4,57.1%缓冲溶液8; 3. 6min，38. 8%缓冲溶液A，61. 2%缓冲溶液B; 6. 8min，36. 6 %缓冲溶液A，63. 4 %缓冲溶液B 9. 9min，35. 2 %缓冲溶液A，64. 8 %缓冲溶液B; 131^11，34.3%缓冲溶液4,65.7%缓冲溶液8; 其中，缓冲溶液A为50mlTEAA和250y1乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000 ml;缓 冲溶液B为50mlTEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml; 流速：〇? 9mL/min; 检测器：荧光检测器，光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽：15. 3nm; 检测灵敏度：在波长350nm积分2s; 上样量：PCR产物5yL。
【专利摘要】本发明公开了一种同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的检测引物、试剂盒及方法，具体是纺织品中同时鉴别山羊绒和绵羊毛成分的PCR-DHPLC检测引物、试剂盒及检测鉴别方法。首先针对山羊和绵羊线粒体DNA序列，分别设计了检测用引物对SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4，采用PCR-DHPLC法对纺织品中的山羊绒和绵羊毛成分同时进行鉴别。本发明所述试剂盒中包括PCR反应液、dNTP各2.5mM Taq DNA聚合酶5U/μl及引物对各10μM。本发明的引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，可快速鉴别纺织品中是否含有山羊绒及绵羊毛，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894245
【申请号】CN201510240326
【发明人】王秋艳, 赵昕, 于灵, 程根武
【申请人】王秋艳
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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